Cпосіб одержання гангліозиду gmз

Изобретение относится к химии природных соединение, а именно к способам получения индивидуальных ганглиозидов, которые могут быть использованы при изучении структуры и функций клеточных мембран, а также при приготовлении лекарственных и диагностических средств. Известен способ получения ганглиозида GМ3 из печени крупного рогатого скота путем экстракции суммарных ганглиозидов хлороформом и метанолом, диализом, гельфильтрацией через сефадекс G-50 с последующим выделением GМ3 препаративной тонкослойной хроматографией на силикагеле [1]. Данный способ имеет ряд существенных недостатков: длительность процесса, низкий выход целевого продукта, невозможность промышленного производства поданному способу в связи с использованием препаративной тонкослойной хроматографии, высокая стоимость конечного продукта. Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения ганглиозида GМ3 , включающий гемолиз эритроцитов водой, экстракцию смесью хлороформа и метанола, упаривание экстракта суммарных липидов с последующей хроматографией на силикагеле и очисткой на флоризиле [2]. К недостатками способа можно отнести: низкий выход целевого продукта - ганглиозида GМ3 (40-50 мг из 1 л эритроцитарной массы), что связано с потерей целевого продукта при проведении хроматографии на силикагеле, а также с неполной экстракцией ганглиозидов из исходного сырья. В основу изобретения поставлена задача создать способ получения ганглиозида GМ3, в котором технологические стадии и параметры процесса обеспечивали бы более полное извлечение продукта из исходного сырья и снижение потерь, и за счет этого повысить выход целевого продукта. Поставленная задача решается тем, что в способе получения ганглиозида GМ3, путем гемолиза эритроцитов, экстракции из раствора хлороформ-метанольной смесью, хроматографией экстракта, очистки и сушки, согласно изобретению, гемолиз эритроцитов проводят смесью ледяной уксусной кислоты и воды при соотношении (0,9-1,1):(90-110) с последующим осаждением ацетоном при соотношении раствор:ацетон 1:(2,83,2), после экстракции осадка смесью хлороформ-метанол дополнительную экстракцию проводят смесью 70 % пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80:20, экстракт упаривают, разбавляют водой, объединяют с хлороформ-метанольным экстрактом и отделяют метанольный слой, хроматографию осуществляют на QAEсефадексе с десорбцией целевого продукта 0,05 М раствором бикарбоната аммония в метаноле, а очистку проводят на катионите КУ-2 с концентрацией целевого продукта осаждением ацетоном. В табл. 1-4 приведены данные, обосновывающие достаточность выбранных соотношений для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата. Зависимость экстракции ганглиозида GМ3 от соотношения воды и уксусной кислоты приведена в табл,1. Как видно из табл. 1, оптимальным является соотношение ледяной уксусной кислоты и воды (0,9-1,1):(90110), так как использование соотношений, выходящи х за указанные пределы, приводит к снижению выхода ганглиозида GМ3 . Зависимость выхода ганглиозидов от соотношения лизированных эритроцитов и ацетона приведена в табл.2. Как видно из табл. 2, оптимальным является соотношение объема лизированных эритроцитов и ацетона 1:(2,8-3,2), так как использование соотношений, выходящих за указанные пределы, приводит к снижению выхода ганглиозида GМ3 . Зависимость выхода ганглиозида СМз от состава смеси для экстракции приведена в табл. 3. Как видно из приведенных в табл. 3 данных, только при соотношении 70 % пропанола-2 и петролейногоо эфира 80:20 удается экстрагировать максимальное количество GМ3. Изменение соотношений приводит к уменьшению выхода целевого продукта. Зависимость выхода ганглиозида GМ3 от концентрации раствора бикарбоната аммония приведена в табл.4. Как видно из табл.4, только при использовании 0,05 М раствора бикарбоната аммо-ния достигается полная десорбция ганглиозида СМз. Уменьшение концентрации приводит к неполной десорбции, а увеличение выше 0.05 М - к сорбции балластных примесей, а следовательно, к уменьшению выхода целевого продукта в 1 мг полученной субстанции. Преимущества данного способа по сравнению с прототипом приведены в табл.5. Приведенные данные демонстрируют высокий выход ганглиозида GМ3, полученного по предлагаемому способу (увеличение выхода в 1,5-1,7 раза по сравнению с прототипом). Кроме того, предлагаемый способ позволяет сократить длительность процесса получения препарата (в 1,8 раза по сравнению с прототипом). Возможность осуществления изобретения иллюстрируется следующими примерами: Пример1. 5 л эритроцитарной массы, полученной из крови лошади, обрабатывают 2 л смеси ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 0,9:110. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин до полного лизиса эритроцитов. Затем к полученному раствору добавляют о хлажденный при температуре от -15 до -20°С ацетон в соотношении 1:3,2. Смесь выдерживают в течение 3 ч при температуре 0-5°С, и осадок отделяют фильтрацией. К полученному осадку прибавляют 7 л охлажденного при температуре от -15 до -20°С ацетона, и смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрацией и обрабатывают 9 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течение 3 ч. Раствор липидов отделяют фильтрацией, а к осадку прибавляют смесь хлороформа и метанола 2:1. Экстракцию повторяют. Осадок отделяют фильтрацией, прозрачные желтого цвета экстракты объединяют. К осадку прибавляют смесь 70 % пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80:20. Экстракцию проводят в течение 3 ч при qo-стоянном перемешивании. Осадок отделяют. Полученный экстракт липидов концентрируют в вакууме при температуре не более 40-42°С до конечного объема 1,2-1,5 л. К полученному экстракту прибавляют 3 л дистиллированной воды и объединенные хлороформ-метанольные экстракты липидов. Смесь перемешивают, и отделяют верхний водно-метанольный слой, содержащий суммарные ганглиозиды. К нижнему слою прибавляют 1 л метанола и 1 л дистиллированной воды. Смесь перемешивают, и верхний водно-метанольный слой объединяют с первым водно-метанольным слоем. Полученный объединенный водно-метанольный слой, содержащий ганглиозиды, нанося! на колонку, заполненную ОАЕ-се фадексом. Затем колонку промывают 5 л смеси хлороформ:метанол:вода в соотношении 30:60:8 для удаления балластных липидов. Далее проводят десорбцию ганглиозидов 4 л 0,05 М раствора бикарбоната аммония в метаноле. Полученный раствор подвергают обработке на колонке, заполненной сорбентом КУ-2. Полученный метанольный элюат ганглиозидов концентрируют в вакууме при температуре 4042°С до конечного объема 0,1 л. Полученный раствор ганглиозидов в метаноле осаждают охлажденным до температуры от -15 до -20°С ацетоном (0,5 л). Осадок отделяют фильтрацией и сушат в вакууме до постоянного веса. Полученный осадок наносят на колонку 3,0 х 25,0 см с сорбентом Лихросорб Сu 60 (40-63 мкм), уравновешенную хлороформом. Пигменты элюируют 200 мл хлороформа, а ганглиозиды элюируют 1,5 л смеси хлороформ:метанол:вода (70:30:4), собирая фракции по 12-15 мл. Фракции, содержащие хроматографически чистый ганглиозид GМ3, объединяют, концентрируют в вакууме до объема 10-20 мл и осаждают охлажденным при температуре от -10 до -20°С ацетоном. Полученный осадок отделяют фильтрацией, растворяют в дистиллированной воде и подвергают лиофильному высушиванию. Выход ганглиозида GМ3 составляет 500 мг. Содержание ганглиозида GМ3 – 99 %. Препарат представляет собой белый порошок, легко растворимый в воде. Пример 2. 5 л эритроцитарной массы, полученной из крови лошади, обрабатывают 2 л смеси ледяной уксусной кислоты и воды а соотношении 1:100. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин до полного лизиса эритроцитов. Затем к полученному раствору добавляют охлажденный при температуре от -15 до -20°С ацетон в соотношении 1:3.0. Смесь выдерживают в течение 3 ч при температуре 05°С, и осадок отделяют фильтрацией. К полученному осадку прибавляют 7 л охлажденного при температуре от 15 до -20°С ацетона, и смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрацией и обрабатывают 9 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течение 3 ч. Раствор липидов отделяют фильтрацией, а к осадку прибавляют смесь хлороформа и метанола 2:1. Экстракцию повторяют. Осадок отделяют фильтрацией, прозрачные желтого цвета экстракты объединяют. К осадку прибавляют смесь 70 % пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80:20. Экстракцию проводят в течение 3 ч при постоянном перемешивании. Осадок отделяют и удаляют. Полученный экстракт липидов концентрируют в вакууме при температуре не более 40-42°С до конечного объема 1,2-1,5 л. К полученному экстракту прибавляют 3 л дистиллированной воды и объединенные хлороформ-метанольные экстракты липидов. Смесь перемешивают, и отделяют верхний водно-метанольный слой, содержащий суммарные ганглиозиды. Смесь перемешивают, и верхний водно-метанольный слой объединяют с первым водно-метанольным слоем. Полученный объединенный водно-метанольный слой, содержащий ганглиозиды, наносят на колонку, заполненную QAE-са фадексом. Затем колонку промывают 5 л смеси хлороформ:метанол:вода в соотношении 30:60:8 для удаления балластных липидов. Далее проводят десорбцию ганглиозидов 4 л 0,05 М раствора бикарбоната аммония в метаноле. Полученный раствор подвергают обработке на колонке, заполненной сорбентом КУ-2. Полученный метанольный элюат ганглиозидов концентрируют в вакууме при температуре 40-42°С до конечного объема 0,1 л. Полученный раствор ганглиозидов в метаноле осаждают охлажденным до температуры от -15 до -20°С ацетоном (0,5 л). Осадок отделяют фильтрацией и сушат в вакууме до постоянного веса. Полученный осадок наносят на колонку 3,0 х 25,0 см с сорбентом Лихросорб Си 60(40-63 мкм). уравновешенную хлороформом. Пигменты элюируют 200 мл хлороформа, а ганглиозиды элюируют 1,5 л смеси хлороформ:метанол:вода (70:30:4), собирая фракции по 12-15 мл. Фракции, содержащие хроматографически чистый ганглиозид GМ3, объединяют, концентрируют в вакууме до объема 10-20 мл и осаждают охлажденным при температуре от -10 до -20°С ацетоном. Полученный осадок отделяют фильтрацией, растворяют в дистиллированной воде и подвергают лиофильному высушиванию. Выход ганглиозидов GМ3 составляет 405 мг. Содержание ганглиозида GМ3 составляет 97 %. Препарат представляет собой белый порошок, легко растворимый в воде. Пример 3. 5 л эритроцитарной массы, полученной из крови лошади, обрабатывают 2 л смеси ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 1,1:90. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин до полного лизиса эритроцитов. Затем к полученному раствору добавляют охлажденный при температуре от -15 до -20°С ацетон в соотношении 1:2,8. Смесь выдерживают в течение 3 ч при температуре 05°С, и осадок отделяют фильтрацией. К полученному осадку прибавляют 7 л охлажденного при температуре от 15 до -20°С ацетона, и смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фильтрацией и обрабатывают 9 л смеси хлороформа и метанола в соотношении 2:1. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании в течение 3 ч. Раствор липидов отделяют фильтрацией, а к осадку добавляют смесь хлороформа и метанола 2:1. Экстракцию повторяют. Осадок отделяют фильтрацией, прозрачные желтого цвета экстракты объединяют. К осадку прибавляют смесь 70 % пропанола-2 и петролейного эфира в соотношении 80:20. Экстракцию проводят в течение 3 ч при постоянном перемешивании. Осадок отделяют и удаляют. Полученный экстракт липидов концентрируют в вакууме при температуре не более 40-42°С до конечного объема 1,2-1,5 л. К полученному экстракту прибавляют 3 л дистиллированной воды и объединенные хлороформметанольные экстракты липидов. Смесь перемешивают, и отделяют верхний водно-метанольный слой, содержащий суммарные ганглиозиды. К нижнему слою прибавляют 1 л метанола и 1 л дистиллированной воды. Смесь перемешивают, и верхний водно-метанольный слой объединяют с первым водно-метанольным слоем. Полученный объединенный водно-метанольный слой, содержащий ганглиозиды, наносят на колонку, заполненную QAE-се фадексом. Затем колонку промывают 5 л смеси хлороформ:метанол:вода в соотношении 30:60:8 для удаления балластных липидов. Далее проводят десорбцию ганглиозидов 4 л 0,05 М раствора бикарбоната аммония в метаноле. Полученный раствор подвергают обработке на колонке, заполненной сорбянтом КУ-2. Полученный метанольный элюат ганглиозидов концентрируют в вакууме при температуре 4042°С до конечного объема 0,1 л. Полученный раствор ганглиозидов в метаноле осаждают охлажденным до температуры от -15 до -20°С ацетоном (0,5 л). Осадок отделяют фильтрацией и сушат в вакууме до постоянного веса. Полученный осадок наносят на колонку 3,0 х 25,0 см с сорбентом Лихросорб Сu 60 (40-63 мкм), уравновешенную хлороформом. Пигменты элюируют 200 мл хлороформа, а ганглиозиды элюируют 1,5 л смеси хлороформ:метанол:вода (70:30:4), собирая фракции по 12-15 мл. Фракции, содержащие хроматографически чистый ганглиозид GМ3, объединяют, концентрируют в вакууме до объема 10-20 мл и осаждают охлажденным при температуре от -10 до -20°С ацетоном. Полученный осадок отделяют фильтрацией, растворяют в дистиллированной воде и подвергают лиофильному высушивают. Выход ганглиозида GМ3 составляет 430 мг. Содержание ганглиозида GМ3 - 98 %. Препарат представляет собой белый порошок, легко растворимый в воде.