Штам культивованих клітин арнебії барвлячої arnebia euchroma ( royle ) jonst. – продуцент шиконіна

Штам культивованих клітин арнебм барвлячої Arnebia euchroma (Royle) Jonst - продуцент шиконіна, який зареєстровано в Колекції клітинних культур Інституту молекулярної біологи і генетики НАН України під номером 9 Винахід відноситься до галузі біотехнологп і може бути використаний у медичній, харчовій, текстильній та косметичній промисловостях Шиконін і його ПОХІДНІ є червоними пігментами нафтохшонової природи Шиконін відомий з давніх часів як барвник, а також як медпрепарат Він має протизапальні, ранозагоювальні, антибактеріальні, детоксикативні і протипухлинні властивості Сировиною для отримання шиконіна є деякі рослини з родини Бурачникових Альтернативним джерелом отримання шиконіна є культивовані клітини цих рослин Відомий штам Макротомія АЕ-2 суспензійної культури клітин арнебм барвлячої, що є продуцентом шиконіна - прототип [1] Штам вирощується одностадійним способом За вказаних умов Макротомія АЕ-2 накопичує за 14 днів 150-350 мг шиконіна на 1 л живильного середовища, що є недостатнім рівнем продуктивності Шиконін визначають спектрофотометричним або фотоколориметричним методом згідно з регламентом, розробленим в НВО "ВІЛР" (Москва, РФ) в 1988-1989 рр [2] Завданням винаходу є підвищення продуктивності культивованих клітин арнебм барвлячої з накопичення шиконіна Завдання вирішується створенням нового штаму культивованих клітин арнебм Родовид культури Штам Арнебія АЕ-3 походить від штаму Макротомія АЕ-2 [1] Останній походить від клітинної лінії "80" культури клітин арнебм барвлячої (Агnebia (Macrotomia) euchroma (Royle) Jonst), що була отримана в 1987 р в НВО "ВІЛР" (Москва, РФ) [2] Арнебію АЕ-3 отримано шляхом клонування дрібних клітинних агрегатів штаму Макротомія АЕ-2, тривалої селекції субкультур за найбільш інтенсивним червоно-бурим забарвленням та періодичного відбору дрібних найбільш забарвлених клітинних агрегатів Штам Арнебія АЕ-3 зберігається в колекції клітинних культур Інституту молекулярної біологи і генетики НАН України під номером 9 Число пасажів на момент паспортизації -184 Стандартні умови вирощування Культивування штаму проводиться у вигляді суспензії (в рідкому живильному середовищі) або калюсу (на агаризованому середовищі) при температурі 24-26°С, вологості повітря 70-80% при відсутності освітлення Суспензійну культуру вирощують при постійному перемішуванні на качалці при 80-100 об/хв, для вирощування калюсної культури качалка не використовується Культивування Арнебм АЕ-3 здійснюється одностадійним способом в модифікованому середовищі НВП "ВІЛР" [2] Склад рідкого живильного середовища, мг/л KNO3 MgSO4 7H2O СаСІ2 6Н2О КН 2 РО 4 НзВОз MnSO4 4H2O ZnSO4 7H2O Na2MoO4 2H2O КІ CuSO4 7H2O СоСІ2 6Н2О FeSO4 7H2O Na2EDTA Тіамш-бромід Нікотинова кислота Пірідоксин-хлорид Мезошозит Індолілоцтова кислота Кінетин (6-фурфуриламінопурин) Сахароза 3700-3900 360-380 430-450 160-180 6,1-6,3 22,0-22,5 8,0-9,0 0,25-0,30 0,80-0,90 0,25-0,35 0,02-0,03 27,0-0,28 37,0-38,0 0,35-0,45 0,4-0,6 0,4-0,6 70-90 0,25-0,35 0,4-0,6 25000030000 ю 42151 Вода до 1 л рН 5,6-6,0 Посуд з середовищем стерилізують гарячою парою при 115-120°С протягом 20 хв Для калюсної культури використовують живильне середовище, склад якого аналогічний вище наведеному з додатковим внесенням бактоагару в КІЛЬКОСТІ 8 г на 1 л середовища Умови стерилізації твердого середовища такі ж, як і рідкого Для вирощування культури використовують скляні колби ємністю 250 і 100 мл для суспензійної і калюсної культури, ВІДПОВІДНО Культуральні властивості Біомаса культивованих клітин штаму Арнебія АЕ-3 складається з клітин і клітинних агрегатів середньої ЩІЛЬНОСТІ Розмір клітинних агрегатів суспензійної культури складає біля 0,3 см в діаметрі При вирощуванні на твердому (агаризованому) живильному середовищі калюсна культура складається з клітинних арегатів розміром 0,3 см, зібраних у грона розміром до 0,7-0,8 см в діаметрі, і має більш інтенсивне червоно-буре забарвлення Культура, яка зростає (і суспензія, і калюс), має фруктовий аромат (полунично-малиновий) Тривалість пасажу та режим пересіву культури - 14 днів Маса шокуляту становить 2-3 г (в перерахунку на суху біомасу) на 1 л живильного середовища Життєздатність культури та стабільність продукування шиконшу перевірялись протягом 5 років (1995-1999) Ростові ознаки Тип росту - неорганізований Ростовий індекс 3-4 Життєздатність клітин становить 85% в стандартних умовах культивування Карюлопчні ознаки Культура є МІКСОПЛОІДНОЮ популяцією Розподіл клітин за числом хромосом близький до нормального з розмахом від 10 до 130 хромосом Модальний клас формують клітини, що містять від ЗО до 37 хромосом, вони складають більше 60% популяції Модальним числом є 32 хромосоми, частота клітин з цим числом сягає 30% Частота аберацій хромосом в анафазі мітозу складає менше 6%, при цьому анафази зі "свіжими" розривами хромосом (анафази з фрагментами) складають менше 1% Цитоморфолопчні ознаки Як суспензійну, так і калюсну культури складають клітини паренхіматичного типу сферичної, видовженої і неправильної форми Останні спостерігаються переважно серед клітин малого розміру Розміри сферичних клітин - від 28 до 269 мкм (середній розмір - біля 60 мкм) Мітотично активні клітини мають розміри від 49 до 79 мкм для суспензійної культури і 34-104 мкм - для калюсної Ядра клітин сферичної форми Розміри ядер - від 6 до ЗО мкм (середній розмір - біля 18 мкм) Маркерні ознаки Забарвлення клітинної маси і культуральної рідини від тем но-рожевого до червоно-бурого В біомасі переважають поодинокі клітини та дрібні КЛІТИННІ агрегати, що відрізняє цей штам від прототипу Приріст біомаси на 14-й день росту складає 16-18 г (в деяких випадках - до 20 г) сухої маси на 1 л живильного середовища Ростовий індекс - 4 Протягом пасажу (14 днів) крива мітотичної активності характеризується 1-2 підйомами в суспензійній культурі і 2-3 підйомами - в калюсній з піками в перші 3-7 днів росту Значення мітотичного індексу-1,5-2,5% Модальним числом є 32 хромосоми, частота клітин з цим числом сягає 30% Пік продукування шиконшу для суспензійної культури спостерігається на 11-й день росту Калюсна культура при продовженні терміну культивування до 21 дня досягає піку продукування шиконшу на 17-й день росту В рідке живильне середовище переходить до 70% пігментів, що також є характерною ознакою штаму АЕ-3 БІОХІМІЧНІ та бютехнолопчні ознаки Нафтохінонові пігменти накопичуються в біомасі культивованих клітин, а також в живильному середовищі в розчиненому та кристалічному (в рідкому середовищі) вигляді Сумарний вихід нафтохінонів становить 560-1120 мг на 1 л живильного середовища для суспензії та 990-1470 мг/л при вирощуванні у вигляді калюсу на твердому живильному середовищі Висушена при 50-60°С біомаса містить 40-80 мг нафтохінонів на 1 г сухої біомаси суспензійної тканини і 70-150 мг - на 1 г калюсної Крім нафтохінонів, в культурі в незначній КІЛЬКОСТІ накопичуються жовті пігменти бензохшонової природи Винахід ілюструється такими прикладами Приклад 1 Для суспензійної культури в КОНІЧНІ колби Ерленмейера об'ємом 250 мл розливають по 50 мл живильного середовища, склад якого наведено вище На 14-у добу біомасу разом з середовищем аналізують спектрофотометричним або колориметричним методом [2] на загальний вміст нафтохінонів Результати вимірювань наведені в таблиці 1 Приклад 2 Живильне середовище для калюсної культури об'ємом 25 мл розливають в колби МІСТКІСТЮ 100 мл На 14-у добу біомасу аналізують спектрофотометричним або фотоколориметричним методом [2] на загальний вміст нафтохінонів Результати вимірювань наведені втабл 2 Результати, наведені в таблицях 1 і 2, свідчать про те, що штам Арнебія АЕ-3 культивованих клітин арнебм барвлячої перевищує відомий штам Макротомія АЕ-2 за накопиченням шиконша в 2,53,5 рази при вирощуванні в суспензійній культурі і в 3-6 разів - при вирощуванні на твердому (агаризованому) середовищі у вигляді калюсної культури Джерела інформації 1 Патент України № 22418А МПК C12N5/04 Штам культивованих клітин макротоми барвлячої Arnebia (Macrotomia) euchroma (Royle) Pauls - продуцент шиконшу / Захленюк О В , Кунах В А 03 03 98 2 Давыденков В Н , Патудин А В , Попов Ю Г , Рабинович С А , Мирошников А И Культура клеток Arnebia euchroma (Royle) Jonst - новый источник получения шиконина // Хим -фарм журнал - 1991 - № 1 - С 53-55 42151 Таблиця 1 Приріст біомаси і накопичення шиконіна в суспензійній культурі арнебм барвлячої на 14-й день росту Маса сухої тканини, Вміст шиконіна, г/л середовища, x±Sx мг/л середовища x±Sx Партія сировини Штам Арнебія Відомий штам Штам Арнебія Відомий штам Макротомія Макротомія АЕ-3 АЕ-3 АЕ-2 [1] АЕ-2 [1] 1 18,7±0,8 15,0±1,9 946,4±15,6 255,5±35,0 2 20,3±1,5 13,6±0,9 1123,0±20,3 346,0±30,2 3 16,5±1,2 13,3±1,2 784,6±25,2 328,8±26,0 Середнє 18,5 13,9 951,3 310,1 Продуктивність відносно відомого штаму АЕ-2, % Суха тканина Шиконін 124,6 149,3 124,0 133,1 370,4 324,5 238,6 306,8 Таблиця 2 Приріст біомаси і накопичення шиконіна в калюсніи культурі арнебм барвлячої на 14-й день росту Маса сухої тканини, Вміст шиконіна, Продуктивність відносно г/л середовища, x±Sx мг/л середовища x±Sx відомого штаму АЕ-2, % Партія Відомий штам Відомий штам сировини Штам Арнебія Штам Арнебія Макротомія Макротомія Суха тканина Шиконін АЕ-3 АЕ-3 АЕ-2 [1] АЕ-2 [1] 1 17,6±1,0 15,0±1,9 1462,3±28,6 255,5±35,0 117,3 572,3 2 18,3±1,4 13,6±0,9 1325,2±14,0 346,0±30,2 134,6 383,0 3 20,0±0,9 13,3±1,2 995,5±22,0 328,8±26,0 150,4 302,8 Середнє 18,6 13,9 1261,0 310,1 133,8 406,6 ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Киів-133, бульв Лесі Українки, 26 (044)295-81-42, 295-61-97 Підписано до друку Обсяг с)бл -вид арк 2002 р Формат 60x84 1/8 Тираж 50 прим Зам УкрІНТЕІ, 03680, Киів-39 МСП, вулі Горького, 180 (044) 268-25-22