Спосіб визначення культур lactobacillus casei, lactobacillus paracasei та lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції

Реферат: Винахід належить до способу визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції, що використовують при дослідних та виробничих роботах з ідентифікації ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei у заквашувальних препаратах та ферментованих харчових продуктах. UA 114260 C2 (12) UA 114260 C2 UA 114260 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, харчової промисловості і може бути використаним для ідентифікації видів Lactobacillus casei та Lactobacillus paracasei в заквашувальних препаратах та ферментованих продуктах харчування. Молочнокислі бактерії, які належать до роду Lactobacillus широко використовуються як лікарські пробіотичні препарати для профілактики і лікування діареї і запальних станів, а також як біологічно активні добавки і продукти функціонального харчування для людини і кормові добавки для тварин [1]. Лактобацили - Lactobacillus, зокрема види Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei характеризуються високим функціональним потенціалом та широко застосовуються у складі сучасних заквашувальних препаратів для виробництва різноманітних кисломолочних продуктів, таких як: кисломолочні напої, кефір, йогурт, ряжанка, сир тощо. Залучення до раціону харчування таких кисломолочних продуктів дозволяє без використання лікувальних препаратів поліпшити загальний стан здоров'я людини шляхом впливу біологічно активних культур Lactobacillus на мікроекологію кишкового тракту, перетравлювання та засвоєння їжі. Основні переваги від споживання функціональних молочних продуктів з Lactobacillus полягають у пригніченні кишкових патогенних мікроорганізмів, поліпшенні засвоєння лактози, зниженні рівня холестерину в сироватці крові та стимуляції імунної системи. Рід Lactobacillus об'єднує мікроорганізми - грампозитивні, кислотостійкі, аеротолерантні, факультативно анаеробні та які не утворюють спори. Лактобацили є хемоорганотрофами і ростуть на багатих середовищах, каталазонегативні і утворюють молочну кислоту як кінцевий продукт метаболізму вуглеводів. На даний час ідентифіковано понад 140 видів лактобацил [2]. Зважаючи на загал роду для зручності систематизації виділяють кілька філогенетичних груп, кожна з яких об'єднує від кількох до двох десятків видів. Найбільш численні групи Lactobacillus: L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. delbrueckii, L. plantarum, L. reuterі, L. salivarius, L. sakei [3]. Основним і найпоширенішим критерієм видової належності лактобацил є їх культуральні, морфологічні та біохімічні властивості. Однак ідентифікація цих мікроорганізмів з використанням лише таких тестів викликає певні труднощі. Зокрема, ідентифікація близькоспоріднених видів L.rhamnosus, L.plantarum, L.casei, L.paracasei на основі лише фенотипових характеристик ускладнена через подібність їх властивостей [4]. Сучасні генетичні методи є перспективною альтернативою класичної біохімічної ідентифікації. Активний розвиток методів на основі полімеразної ланцюгової реакції - ПЛР, відкриває нові можливості для швидкої ідентифікації молочнокислих бактерій [5, 6]. ПЛР дозволяє ефективно проводити ідентифікацію та детекцію видоспецифічних генів культур за допомогою підібраних специфічних олігонуклеотидних праймерів [7]. Праймери - синтетичні олігонуклеотиди - короткі фрагменти нуклеїнової кислоти, комплементарні певним послідовностям ДНК або РНК, які ініціюють синтез комплементарного ланцюга за участі ДНК-полімерази. Праймерів має бути два - прямий та зворотний, які обмежують ділянку ДНК, що піддається ампліфікації, тобто чисельному копіюванню. Праймери ініціюють синтез нового ланцюга ДНК, починаючи з 3'-кінця [8]. Використання термостабільних ДНК-полімераз зробило спосіб ПЛР зручним та загальновживаним. Тепер полімеразна ланцюгова реакція широко використовується для ідентифікації та детекції видоспецифічних генів [9]. Для гена або ділянки ДНК, яка цікавить дослідників, підбирається пара праймерів, за допомогою якої можна провести ампліфікацію ділянки характерної довжини і отримати відповідні амплікони, які ідентифікують розділенням в агарозному гелі методом електрофорезу [10]. Для початкової ідентифікації роду, філогенетичної групи і виду Lactobacillus використовують мікробіологічні та біохімічні методи, однак вони дають лише попередні відомості про систематичне положення даного мікроорганізму і часто не дозволяють віднести його до певного виду. Для більш точної ідентифікації мікроорганізмів використовують різноманітні молекулярногенетичні методи [11]. Ці методи можна поділити на кілька груп: 1. Методи, які не пов'язані з ПЛР: поділ сумарного білка клітин в SDS-PAGE електрофорезі; аналіз рестрикційних фрагментів хромосомної ДНК - RLFP; ДНК-ДНК гібридизація, в тому числі з використанням чипів -comparative genomic hybridization, CGH [12]. 2. Методи, засновані на реакції ПЛР: використовуються як випадкові праймери - RAPD, так і праймери для повторюваних послідовностей ДНК - REP-PCR, ERIC-PCR і праймери для певних генів. Як такі гени частіше за інших використовуються гени 16S і 23S рибосомальних РНК і спейсерні ділянки між ними. Використовуються також деякі білок-кодуючі гени: hsp60 - ген білка 1 UA 114260 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 теплового шоку; dnaK - ген білка теплового шоку 70 kDa; rpoA - ген α-субодиниці РНКполімерази; tuf - ген фактору елонгаціі Тu; β-субодиниці F1F0-АТФ синтази [13, 14, 15]. 3. Методи ПЛР, засновані на визначенні нуклеотидної послідовності ДНК: визначення нуклеотидної послідовностей окремих генів, або їх фрагментів рибосомальної РНК і білоккодуючих генів; визначення одиночних нуклеотидних замін в таких генах - SNP; одночасне визначення нуклеотидної послідовності фрагментів кількох білок-кодуючих генів - MLST [16, 17]. Для ідентифікації виду частіше використовується ПЛР з родоспецифічними і видоспецифічними праймерами, створеними за генами і міжгенними вставками рибосомальних і білок-кодуючих генів, з подальшим аналізом продуктів реакції методом електрофорезу і визначенням їх нуклеотидної послідовності. Для ідентифікації штамової приналежності лактобацил частіше використовуються рестрикційний аналіз ДНК, ПЛР з неспецифічними праймерами - RAPD, REP-PCR, ERIC-PCR, визначення нуклеотидних послідовностей ряду генів - MLST, гібридизація з чипами CGH. Однак жоден з перерахованих методів не є універсальним, кожен має свої переваги, недоліки, межі застосування і використовується для аналізу конкретних видів або груп видів [18]. Тому існує нагальна потреба залучення нових генів для молекулярно-генетичної ідентифікації лактобацил. Відомий спосіб детекції Lactobacillus case і та Lactobacillus paracasei, що включає синтез олігонуклеотидних праймерів до 16S рРНК, проведення порівняння даного гена з послідовностями, специфічними для Lactobacillus casei та Lactobacillus paracasei згідно з базою даних GenBank [19]. Цей спосіб дозволяє ідентифікувати бактеріальні ізоляти на рівні виду. До недоліків даного способу можна віднести необхідність проведення гідролізу і секвенування ампліконів, порівняння кожного з базою даних GenBank, що обумовлює довготривалість і високу вартість процесу тестування [20]. Найбільш близьким способом до винаходу, що заявляється є специфічні праймери на основі вибраного фрагмента ДНК, генетичного маркера - міжгенної ділянки, яка передує оперону F1F0 АТФ синтази - gene atpD, product ATP synthase subunit beta, специфічного для Lactobacillus casei та Lactobacillus paracasei, із залученням аналізу повних геномів референтних штамів Lactobacillus casei та Lactobacillus paracasei, представлених у базі даних GenBank (HTTP: //www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank Search.html). Вибрані фрагменти ДНК було перевірено за допомогою програми BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) [21]. Однак ці праймери не достатньо специфічні та мають високий ступінь самокомплементарності. Спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції є об'єктом даного винаходу. Спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквашувальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, відповідно до винаходу, для визначення ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei використовують пару олігонуклеотидних праймерів до генетичного маркера - гена upp: прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bр та зворотний праймер Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bр - для ампліфікації 150 bр фрагмента ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Створення нових заквасок та бактеріальних препаратів для виробництва ферментованих харчових продуктів вимагає швидкої ідентифікації молочнокислих бактерій. Одним з найвживаніших мікроорганізмів, які застосовуються у заквашувальних культурах є Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Ідентифікація, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei на рівні фенотипу з використанням стандартних мікробіологічних методів, за біохімічними ознаками з використанням комерційних тест-систем АРІ 50 СН, складна внаслідок гетерогенності бактерій в межах виду, що не завжди дозволяє встановити точне таксономічне положення та отримати цілісну оцінку властивостей Lactobacillus. Для точної детекції та ідентифікації ряду культур роду Lactobacillus використовуємо спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР. Спосіб визначення ДНК за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР використовують для детекції та ідентифікації бактерій Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei на видовому рівні, що 2 UA 114260 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дозволяє ефективно відбирати безпечні і технологічні культури Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei при виробництві заквашувальних препаратів, ферментованих харчових продуктів та здійснювати контролювання їх наявності. Вибір праймерів ґрунтується на таких критеріях: високий рівень подібності фрагментів ДНК з ДНК штамів культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, вміст основ GC не менше 50 %, не утворення димерів, комплементарність послідовностям ДНК на граничних ділянках фрагмента. У даному винаході спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. ш за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp методом полімеразної ланцюгової реакції здійснено підбір пари високоспецифічних олігонуклеотидних праймерів з низьким ступенем самокомплементарності за принципом молекулярної ампліфікації ген-специфічної полімеразної ланцюгової реакції [22]. Спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквашувальних препаратах, ферментованих харчових продуктах та для здійснення контролювання їх наявності, в якому для визначення ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei використовують пару олігонуклеотидних праймерів до гена upp урацил фосфорібозілтрансферази, послідовність якого представлена у базі даних GenBank: gene upp-Uracil phosphoribosyltransferase, 13184021319031=630 bp: прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bp та зворотний праймер Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bp - для ампліфікації 150 bp фрагмента ДНК культури Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Запропонований спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції застосовують у наукових дослідженнях та виробничих роботах з ідентифікації ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei у заквашувальних препаратах, ферментованих харчових продуктах, здійснюють контролювання їх наявності методом полімеразної ланцюгової реакції. Для визначення ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei використовують пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp: прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bр та зворотний праймер Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bр - для ампліфікації 150 bр фрагмента ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Підбір пари праймерів проводять згідно правил молекулярного дизайну. Для підбору праймерів використовують програми Primer, Oligo, тощо, які дозволяють здійснювати багатофакторний аналіз вибраних послідовностей ДНК. Порівняльний аналіз підібраної пари специфічних олігонуклеотидних праймерів здійснюють за допомогою програми Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) для виключення фрагментів гомологічних до ДНК споріднених та неспоріднених видів. Геномний аналіз проводять за повними послідовностями геномів культур, доступних в GenBank, на основі гомології до нуклеотидних послідовностей генів молочнокислих бактерій за допомогою програми Blast. Об'єктом дослідження є культури Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei які належать до Cellular organisms > Bacteria > Firmicutes > Bacilli > Lactobacillales > Lactobacillaceae > Lactobacillus > Lactobacillus casei group > Lactobacillus casei / Lactobacillus paracasei [23]. Для визначення ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei вибрано добре вивчений ген upp із Lactobacillus casei W56, complete genome, який відповідає за синтез білка урацил фосфорібозілтрансферази [22]. За даними GenBank per. № НЕ970764.1 - фрагмент від 1318402 р до 1319031 р довжиною 630 bр, Lactobacillus casei W56 complete genome GenBank: HE970764.1 3 UA 114260 C2 5 10 Див. Фіг. 1 "Послідовність гена upp Lactobacillus casei W56, complete genome". Спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції - виконання підбору пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp: прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bр та зворотний праймер Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bр - для ампліфікації 150 bр фрагмента ДНК культури Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, тобто: - прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bp діє з 127 p, a - зворотний праймер Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bp діє з 276 p. Розмір послідовності: 630 bp. 15 4 UA 114260 C2 Розмір фрагмента: 150 bp 5 10 15 20 25 30 Див. Фіг. 2 "Підбір праймерів до гена upp Lactobacillus casei W56, complete genome". Виконання перевірки пари специфічних олігонуклеотидних праймерів у Способі визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp методом полімеразної ланцюгової реакції: прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bр та зворотний праймер Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bр - для ампліфікації 150 bр фрагмента ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, за допомогою програми BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), див. Фіг. 3 "Перевірка пари праймерів до гена upp культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei". Спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції виконується таким чином: - вибір генетичного маркера - гена upp; - підбір пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp; - перевірка пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp за допомогою програми BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast); - перевірка дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp методом полімеразної ланцюгової реакції. Підібрану пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp: прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bр та зворотний праймер Lc.pc R 5'AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bр - для ампліфікації 150 bp фрагмента ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei використовують за проведення полімеразної ланцюгової реакції. Приклад 5 UA 114260 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Перевірка дієвості пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР по визначенню ДНК у заквашувальних препаратах, ферментованих харчових продуктах та здійснення контролювання наявності культур. У способі визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовували реакційну суміш з термостабільної Taq-полімерази, відповідного десятикратного ПЛР-буферу з MgCl2, розчину чотирьох дезоксирибонуклеотидтрифосфатів, праймерів та проб в об'ємі, мкл: Н2О 8,5 Taq-полімераза 0,5 10Х буфер з MgCl2 25 мМ 2 dNTP 0,5 мМ 2 праймер 1F (10 пкМ/мкл) 2,5 праймер 2R (10 пкМ/мкл) 2,5 проба 2, 25, де: праймер 1 F Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bр - (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, праймер 2 R-Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bр - (10 пкМ/мкл) - 2,5 мкл, проби об'ємом 2 мкл: 1 - деіонізована вода 2 - проба ДНК йогурту, який містить Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei; 3 - проба ДНК бактеріального препарату Danisco ТА Lyo 125DCU, який не містить Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei; 4 - проба ДНК бактеріального препарату Лактіалє, який містить Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei; 5 - проба ДНК бактерального препарату Лактуале, який містить Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Отримали аліквоти № 1-5 об'ємом по 25 мкл для проведення полімеразної ланцюгової реакції. Полімеразну ланцюгову реакцію 5-ти аліквот проводили у термоциклері "GeneAmp PCR System 9600" з відповідним програмним забезпеченням. Параметри: - початкова стадія денатурації ДНК за 95 °C впродовж 2 хвилин; - 40 циклів ампліфікації, які складаються з: - етапу денатурації за 95 °C впродовж 30 секунд, - етапу відпалювання олігонуклеотидних праймерів за 60 °C впродовж 30 секунд, - етапу добудови нитки ДНК за 72 °C впродовж 60 секунд; - кінцева стадія елонгації фрагментів за 72 °C впродовж 5 хвилин. У кожній з аліквот прикладу використовували пару специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена upp: прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bр та зворотний праймер Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bр - для ампліфікації 150 bр фрагмента ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, разом з різними пробами ДНК: 1 Повна відсутність ДНК у пробі - деіонізована вода, контроль реакційної суміші з праймерами 2 ДНК йогурту, який містить Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei; 3 ДНК бактеріального препарату Danisco ТА Lyo 125DCU, який не містить Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei - негативний контроль; 4 ДНК бактеріального препарату Лактіалє, який містить Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei; 5 ДНК бактерального препарату Лактуале, який містить Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Результати полімеразної ланцюгової реакції аліквот № 1-5 наведено в таблиці 1 "Перевірка роботи пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР по визначенню ДНК бактеріальних препаратів". 6 UA 114260 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Амплікони характерної довжини 150 bр специфічного фрагмента ДНК гена upp культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei розрізняють після електрофоретичного розділення в агарозному гелі. Для розділення фрагментів ДНК, отриманих під час ПЛР, проводили електрофорез у 2 % агарозному гелі в трис-ацетат-EDTA буфері, який містив барвник бромистий етидій для фарбування ампліконів і подальшої візуалізації результатів під дією ультрафіолетових променів. З кожної аліквоти № 1-5 відібрали по 10 мкл і кожну 10 мкл аліквоту окремо змішали з 3 мкл буферу для нанесення. У лунки 2 % агарозного гелю внесли: - маркер молекулярної ваги з кроком 100 bр для контролю розміру отриманого фрагмента (ДНК маркер GeneRuler ™ 100+ П.М. "Ферментас"); - аліквоти № 1-5. Провели електрофорез у камері для горизонтального електрофорезу за напруги 70 В протягом 60 хв. Результати електрофорезу оцінювали, переглядаючи та фотографуючи гель в ультрафіолетовому світлі з довжиною хвилі 254 нм на трансілюмінаторі. Як контроль розміру отриманого фрагмента використовують ДНК маркер GeneRuler ™ 100+ П.М. ("Ферментас"), див. фотографія "Дієвість пари специфічних олігонуклеотидних праймерів по визначенню ДНК бактеріальних препаратів". Як видно на фотографії - у аліквотах 2, 4 та 5 присутній амплікон 150 bр, що свідчить про наявність 150 bр специфічного фрагмента ДНК гена upp культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. У аліквоті 1 з деіонізованою водою та аліквоті 3 з ДНК бактеріального препарату Danisco ТА Lyo 125DCU, негативний контроль амплікон 150 bр відсутній. Результатом застосування способу визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР є ампліфікація фрагментів 150 bр специфічного фрагмента ДНК генетичного маркера - гена upp, що дозволяє визначити присутність ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei у заквашувальних препаратах, ферментованих харчових продуктах та за здійснення контролювання їх наявності. Запропонований спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою специфічних праймерів методом ПЛР має переваги у значній економії реактивів, витрат часу і в точності детекції та ідентифікації культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Запропонований спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР використовують для якісного визначення ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, видової ідентифікації культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei у наукових дослідженнях та технологічних роботах у промисловості. Рекомендовано використовувати спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР для визначення ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei при проведенні моніторингу зразків заквашувальних препаратів та ферментованих харчових продуктів, перевірки відповідності наявності Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei згідно з нормативними та супровідними документами на виробництві та у торговельній мережі. Джерела інформації: [1] Lebeer S., Vanderleyden J., De Keersmaecker CJ. / Genes and molecules of Lactobacilli supporting probiotic action. // Microbiol. Molec. Biol. Rev., 2008, 72, 4, p. 738-764. [2] http://www.bacterio.cict.fr/l/Lactobacillus.html. [3] Felis G., Dellaglio F. / Taxonomy of Lactobacilli and Bifidobacteria. // Curr. Issues Intestinal Microbiol, 2007, 8, p. 44-61. [4] Ботина, С.Г. Идентификация промышленных штаммов молочнокислых бактерий методами молекулярно-генетического типирования // Генетика. 2006. - Том 42. - № 12. - с. 16211635. [5] Chagnaud P. Rapid PCR-based procedure to identify lactic acid bacteria application to six common Lactobacillus species/ P. Chagnaud // Journal of Microbiological Methods. - 2001. - Vol. 44, p. 139-148. 7 UA 114260 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 [6] Ботина С.Г., Климина K.M., Коробан H.B., Амерханова A.M., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus. Генетика, 2010, 46, 11, с. 1485-1492. [7] Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA.// Science, 1988, v. 239, p. 487-491. [8] Quantitative PCR for DNA identification based on genome-specific interspersed repetitive elements/ Walker JA, Hughes DA, Hedges DJ, Anders BA, Laborde ME, Shewale J, Sinha SK, BatzerMA.// Genomics, 2004, v. 83 (3) p. 518-527. [9] PCR Protocols/ Innis et al.// Academic Press. Inc., 1990, p. 219-227. [10] Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.//Москва: Мир, 1984. - с. 157-167. [11] Singh S., Goswami P., Singh R., Heller KJ Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: a review. // LWT-Food science and technologie 2009, 42, p.448-457. [12] Markiewicz LH, Biedrzycka E., Wasilewska E., Bielecka M. Rapid molecular identification and characteristics of Lactobacillus strains. // Folia Microbiol. 2010, 55, 5 p. 481-488. [13] Saito S., Kobayashi M., Kimoto-Nira H., Aoki R., Mizumachi K., Miyata S., Yamamoto K., Kitagawa Y., Suzuki С. Intraspecies discrimination of Lactobacillus paraplantarum by PCR. // FEMS Microbiology Letters, 2011, 316, p. 70-76. [14] Huang C.-H., Lee F.-L. The dnaK gene as a molecular marker for the classification and discrimination of the Lactobacillus casei group. // Antonie van Leeuwenhoek, 2011, 99, p. 319-327. [15] Sievers M, Uermosi C, Fehlmann M, Krieger S. Cloning, sequence analysis and expression of the F1F0-ATPase beta-subunit from wine lactic acid bacteria. // Syst Appl Microbiol., 2003 26, 3, p. 350-6. [16] Huang C.-H., Chang M.-T., Huang M.-C, Lee F.-L. Rapid identification of Lactobacillus plantarum group using the SNaPshort minisequencing. // Systematic and applied microbiology, 2011, 34, p. 586-589. [17] Raftis E., Salvetti E., Torriani S., Felis GE, O'Toole PW Genomic diversity of Lactobacillus salivarius. Appl. Environ. // Microbiol., 2011, 77, 3, p. 954-965. [18] Новикова Н.А., Точилина А.Г.,Соловьева И.В. Способ индикации бактерій рода Lactobacillus / DisCollection.ru. - 10.12.2009-RU 2375459. [19] Морейра JLS, Мота Р., Орта Ф. та ін. Ідентифікація до виду з Lactobacillus, виділених в пробіотичних пошукових досліджень людського, тваринного або харчової походження за 16S23S рРНК профілювання обмеження // Мікробіологія ВМС, 2005. - Том 5-15. - с. 1-9. [20] Джобулаева А.К., Саданов А.К., Айткельдиева С.А., Байкара Б.Т., Джакибаева Г.Т., Кебекбаева К.М. / Молекулярно-генетическая идентификация двух штаммов молочнокислых бактерий на основе анализа нуклеотидных последовательностей 16S RRNA гена // Биологические науки № 8 за 2014 год. (часть 1), с. 63-67. [21] Полуэктова Е.У., Даниленко В.Н. Способ видовой идентификации лактобацилл l.casei/paracasei, l.fermentum, l.plantarum и l.rhamnosus // Патент на изобретение № 2508406 / http://www.findpatent.ru/patent/250/2508406.html. [22] Song BF, Ju LZ, Li YJ, Tang LJ. Chromosomal Insertions in the Lactobacillus casei upp Gene That Are Useful for Vaccine Expression // Appl Environ Microbiol. 2014 June; 80(11): p. 3321-3326. [23] Lactic Acid Bacteria: Biodiversity and Taxonomy / edited by Wilhelm H. Holzapfel, Brian J.B. Wood.: John Wiley & Sons. // 2014, ISBN 1118655273, 9781118655276. - p. 632. Таблиця 1 Перевірка роботи пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом ПЛР по визначенні ДНК бактеріальних препаратів № аліквоти Проба ДНК Деіонізована вода 1 Праймери Ампліфікат Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bp Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bp 8 UA 114260 C2 Продовження таблиці 1 № аліквоти 2 3 4 5 Проба ДНК Праймери проба ДНК йогурту, який Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' містить Lactobacillus casei, bp Lactobacillus paracasei та Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' Lactobacillus paracasei bp subsp. paracasei проба ДНК бактеріального Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' препарату Danisco TA Lyo bp 125DCU, який не містить Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' Lactobacillus casei, bp Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei проба ДНК бактеріального Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' препарату Лактіалє, який bp містить Lactobacillus casei, Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' Lactobacillus paracasei та bp Lactobacillus paracasei subsp. paracasei проба ДНК бактерального Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' препарату Лактіалє, який bp містить Lactobacillus casei, Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' Lactobacillus paracasei та bp Lactobacillus paracasei subsp. paracasei - - не виявлено, не ідентифіковано. Ампліфікат 20 150 bp 20 20 20 20 150 bp 20 20 150 bp 20 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 Спосіб визначення культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei за допомогою пари специфічних олігонуклеотидних праймерів методом полімеразної ланцюгової реакції у заквашувальних препаратах та ферментованих харчових продуктах, який відрізняється тим, що для визначення ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei використовують пару олігонуклеотидних праймерів до генетичного маркера - гена upp: прямий праймер Lc.pc F 5'-GAAATCACACGGGATCTGCC-3' 20 bр та зворотний праймер Lc.pc R 5'-AATCAGGCGCAAAACACCAT-3' 20 bр - для ампліфікації 150 bр фрагмента ДНК культур Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei та Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. 9 UA 114260 C2 10 UA 114260 C2 11 UA 114260 C2 12 UA 114260 C2 13 UA 114260 C2 14 UA 114260 C2 15 UA 114260 C2 16 UA 114260 C2 17 UA 114260 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 18