Інгібітори тромбіну з п’явок ряду rhynchobdellida родини theromyzon, екстракт та поліпептид, що мають інгібіторну активність

1 Экстракт, обладающий ингибиторной активностью по отношению к тромбину, отличающийся тем, что указанный экстракт содержит растворимые в воде компоненты из тканей или секреций пиявок отряда Rhynchobdelhda семейства Theromyzon 2 Экстракт по п 1, отличающийся тем, что он выделен из пиявок вида Theromyzon tessulatum 3 Полипептид, обладающий ингибиторной активностью по отношению к тромбину, который отличается от гирудина по молекулярному весу, изоэлектрической точке и последовательности аминокислот, отличающийся тем, что он получен из тканей или секреций пиявок отряда Rhynchobdelhda семейства Theromyzon, предпочтительно Theromyzon tessulatum, путем гомогенизации передней третьей части замороженных и подвергнутых сублимационной сушке пиявок в смеси вода/ацетон и выделения полипептида путем последующей очистки водорастворимых компонентов полученного экстракта методом тромбинспецифической аффинной хроматографии с последующей по крайней мере одной стадией гельпроникающей хроматографии и по крайней мере одной стадией жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой 4 Полипептид по п 3, отличающийся тем, что имеет молекулярный вес около 3 кДа и выделенный из экстракта стадией гельпроникающей хроматографии с применением гелевой матрицы, имеющей предел исключения 5 кДа 5 Полипептид по п 3, отличающийся тем, что имеет молекулярный вес около 9 кДа и следующую N-концевую последовательность аминокислот Glu-Asp-Asp-Asn-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Ala-Cys-ProGly-Glu 6 Полипептид по п 3, отличающийся тем, что имеет молекулярный вес около 14 кДа и следующую N-концевую последовательность аминокислот Ser-Gln-Leu-Gly-Gln-Ser-Cys-Ser-Lys-Glu-Asn-ProCys-Pro-Ser-Asn-Met-Lys-Cys-Asn-Arg-Glu-Thr-PheLys 7 Полипептид по одному из пп 3-6, отличающийся тем, что его используют в качестве медицинского средства 8 Полипептид по п 7, отличающийся тем, что его используют в качестве ингибитора тромбина при лечении in vivo расстройств, вызываемых тромбозом 9 Полипептид по п 7, отличающийся тем, что его используют в качестве ингибитора тромбина для подавления агрегирования тромбоцитов в экстракорпоральной крови 10 Полипептид по одному из пп 3-6, отличающийся тем, что его используют для приготовления фармацевтической композиции для лечения in vivo расстройств, вызываемых тромбозом 11 Полипептид по одному из пп 3-6, отличающийся тем, что его используют для приготовления фармацевтической композиции для подавления агрегирования тромбоцитов и образования сгустков крови в экстракорпоральной крови 12 Применение пиявок отряда Rhynchobdelhda, предпочтительно вида Theromyzon tessulatum в качестве исходного материала для получения веществ-ингибиторов тромбина по одному из пп 3-5 О го 00 го 43831 Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам тромбона, в частности, к ингибиторам тромбина, выделяемым из тканей и секреций пиявок Тромбин катализирует образование сгустков фибрина, а потому подавляет свертывание крови Кроме того, тромбин выступает в роли биорегулятора в таких процессах, как прямая активация агрегирования тромбоцитов и активация воспалительного отклика путем стимулирования синтеза активационного фактора тромбоцитов клетками эндотелия Это означает, что тромбин играет главную роль в заболеваниях, вызываемых тромбозом, таких как, например, заболевания сердечно-сосудистой системы По этой причине сохраняется значительный интерес к новым или обладающим улучшенными свойствами ингибиторам тромбина и антикоагулянтам Примерами хорошо известных ингибиторов тромбина являются гепарин и гирудин Гепарин усиливает антикоагуляционную активность антитромбина III Он широко используется для лечения состояний, таких как венозный тромбоэмболизм, при которых активность тромбина ответственна за развитие или распространение тромба Он не эффективен для терапевтического применения в тех случаях, когда содержание антитромбива III понижено, например, в случае тромбоза, вызываемого нефрозом или синдромом коагулопатии потребления Более того, гепарин вызывает многочисленные побочные эффекты, в том числа кровотечение и тромбоцитопению Гирудин является хорошо известным и хорошо изученным полиптотидом, который, как известно, является тромбинспецифическим и может быть выделен из экстрактов слюнных желез и других тканей пиявок вида Hirudo medicinahs Гирудин и его производные можно получать также по рекомбинантной технологии Полипептид имеет сравнительно небольшой молекулярный вес порядка 7000 Да и состоит из 65 остатков аминокислот Последовательность аминокислот гирудина была впервые определена Додтом и др (FEBS Letters, 1984, Vol I65, рр 180-184) В пиявках Hirudo medicinahs обнаружены три основные формы гирудина (HV 1, HV 2, HV 3), которые отличаются всего лишь приблизительно на 10%% от общего числа позиций аминокислот Наиболее значительное различие состоит в первых двух позициях N конца молекулы Val- Val в форме I гирудина и Не—ТІг в форме 2 гирудина Указанные различия носят второстепенный характер и не оказывают влияние ни на функции, ни на специфичность взаимодействия гирудин-тромбин Гирудин является потенциальным природным ингибитором коагуляции Показана его эффективность для предотвращения тромбоза вен, закупорки анастомозов сосудов и вызываемого тромбином синдрома и коагуляриин потребления, однако он вызывает продолжительные кровотечения Фитогенетически медицинская пиявка Hirudo medicinahs являются членом подсемейства Herudmmae семейство пиявок Herudmidae (R Т Sawyer "Leech Biology an Bihavior", Oxford University Press,Vol 2, p 688, 1986) Эволюционно более развитым видом пиявок является Hirudinamnae того же семейства Herudmidae Неожиданно похожая, но вполне отличная изоформа гирудина была недавно обнаружена в Herudmaria manillensis, как это описано в международной патентной заявке РСТ Wo 90/05143 Указанная изоформа отличается почти по 40% позиций аминокислот при сравнении с нирудином от Hirudo medicinahs Для указанных ранее вида, а именно Hirudo medicinahs и Herudmaria mam llensis относятся к отряду пиявок Arhynchobdelhda ("пиявки с челюстями") Помимо отряда Arhynchobdelhda существует еще один большой отряд пиявок, т е Rhynchob dellida ("пиявки с хоботом") (R Т Sawyer "Heech Biology and Behavi our" Oxford University Press Vol, 2 p 651, 1986) Что касается белков, содержащихся в слюне, то наиболее изученным представителем отряда "Rhynchob dellida" является "амазонская пиявка" Haementeria ghilanii Неожиданно было обнаружено, что этот вид не содержит антитромбин (Budzynski et al Proc Soc Biol Med ,1981, Vol 168, pp 259-265) Вместо того Haementeria ghilanii содержит фибринолитическии фермент, получивший название гементин (Патент США 4390630), а также ингибитор фактора коагуляции крови Ха (С Condra et al Thromb Haemost 1986, Vol 61, pp 437-441) Основываясь на этом открытии и последующих публикациях, полагали, что антитромбиноподобная активность ограничивается пиявками отряда Arhynchobdelhda и отсутствует у отряда Rhynchob dellida Несмотря на обсуждавшиеся выше разработки, сохраняется потребность в других, кроме гепарина и гирудина, антиокоагулянтах и антитромбинах, соответственно, которые обладают более высокой эффективностью при подавлении образования сгустков, вызываемой тромбином активации действия у клеток эндотелия, и которые можно было бы получать в коммерческих количествах Неожиданно было обнаружено, что соединения антитромбиноподобной активностью могут быть выделены из тканей и секреции пиявок отряда Rhynchob dellida предпочтительно семействаTheromuzon и наиболее предпочтительно вид Theromuzon tessulatum, которых часто называют "птичьими пиявками", т к образ жизни этих пиявок заключается втом, что они сосут кровь из ноздрей водоплавающих птиц Таким образом, целью настоящего изобретения является использование пиявок отряда Rhynchob dellida, предпочтительно вида Theromuzon tessulatum для получения соединений-ингибиторов тромбина* Было показано, что активность ингибитора тромбина можно измерить в экстрактах, состоящих из растворимых в воде компонентов указанных пиявок Таким образом, целью настоящего изобретения является получение экстрактов с ингибиторной активностью по отношению к тромбину из тканей или секреции пиявок отряда Rhynchob dellida или семейства Theromuzon или вида Theromuzon tessulatum, содержащих растворимые в воде компоненты указанных пиявок 43831 АІСГИВНЬІЙ ингибитор тромба может быть выделен из указанных экстрактов Таким образом, целью настоящего изобретения является в достаточной степени очищенный ингибитор тромбина, который можно охарактеризовать как полипоптиды, обладающий антитробной активностью, выделенной из указанного выше и в формуле изобретения экстракта путем очистки экстракта полуденного гомогенизацией передней третьей части замороженных и подвегнутых сублимационной сушке пиявок в смеси вода/ацетон, методом тромбинспецифической аффинной хроматографии с последующей, по крайней мере, одной стадией гель-проникающей хроматографии и, по крайней мере, одной стадией жидкостной хроматографии высокого разрешения (SXEP) с обращенной фазой Ингибитор тромбина преимущественно содержит активные полипептидные фрагменты с молекулярными весами около 3 кДа, приблизительно 14 кДа, соответственно Указанные активные полипептиды можно рассматривать как продукты разложения исходного ингибитора тромба или предшественника ингибитора тромба Ингибитор тромба по настоящему изобретению является новым, поскольку он отличается от известных антитромбинов, в частности, по своему молекулярному весу, изоэлектрической точке в Nконцевой последовательности аминокислотных остатков, что указывают на низкую гомологию (ниже 40%) с другими ингибиторами тромбина Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является изобретение из указанного экстракта ингибитора тромбина, состоящего, по крайней мере из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярный вес около 3 кДа Далее целью настоящего изобретения является ингибитор тромбина, состоящий, по крайней мере, из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярный вес около 9 кДа и следующую N-концевую последовательность аминокислот Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys ProGlyGlu/ Далее, целью HacTzotuj изобретения является ингибитор тромбина, состоящий, по крайней мере из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярный вес около 14 кДа и следующую N-концевую последовательность аминокислот Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys В соответствии с настоящим изобретением термины "около 3 (9,14) кДа" включают максимальное отклонение плюс/минус 1 кДа, преимущественно 0,5 кДа Более того, в объем притязаний по настоящему изобретению входят указанные выше и ниже по тексту последовательности, в которых произведена замена аминокислот, так что сохраняются основные биологические свойства Изобретение охватывает такие формы, фрагменты, подединицы, природные мутанты и произвольно возникшие искусственные мутанты Сюда включаются также гибридные белки, такие как белки слияния, полученные из указанных поптидов Изобретение относится к способу получения указанного выше и в формуле изобретения экстракта путем гомогенизации тканей или секреций пиявок отряда Rhynchob delhda преимущественно вида Theromuzon tessulatum и приготовления фракции, включающей их растворимые в воде компоненты Далее, целью настоящего изобретения является способ получения полипептида по пп 4-7 формулы изобретения путей очистки экстракта с помощью тромбинспецифической аффинной хроматографаии и, по крайней мере, одной стадии стандартной хроматографической очистки Ингибитор тромбина по настоящему изобретению обладает антикоагуляционными и антитромботическими свойствами Поэтому он может использоваться при лечении клинических состояний, при которых нарушена система коагуляции Это использование включает лечение тромбоза, паралича, инфаркта миокарда, глубокого тромбоза вен, закупорки артерий конечностей, тромбоза легких, тромбоза артерии сетчатки глаза иди других еду чаев тромбоза Более того, ингибиторы тромбина могут применяться для пациентов с артериовенозными щунтами или пациентов, которым устанавливаются коронарные обходныеанастомозы Полипептиды по настоящему изобретению могут также использоваться в качестве антикоагулянтов для профилактики тромбоза или повторной закупорки артерий, для консервации крови иди продуктов крови и для экстракорпоральной циркуляции крови или плазмы Ингибиторы тромбина (полипептиды) по настоящему изобретению проявляют биологическую активность, которая в основном сопоставима с активностью гирудина Сродство при присоединении к тромбину (константа ингибирования) даже несколько возрастает по сравнению с гирудином, который является в настоящее время самым сильным ингибитором тромбина* Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является использование указанных выше и в формуле изобретения полипептидов в качестве медицинского средства, в частности, при лечении ІП in vivo расстройств, вызываемых тромбозом, и для подавления агрегирования тромбоцитов и образования сгустков крови в экстракорпоральной крови Наконец, в настоящем изобретении заявляется также фармацевтическая композиция, включающая ингибитор тромбина или указанный выше полипептид, соответственно, и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения заболеваний, вызываемых тромбозом, как это указано ранее Краткое описание рисунков Подробное описание рисунков приводится в Примерах 1-10 На рис 1 представлен профиль элюмрования антитробина после аффинной колонки (Пример 3) На рис 2 приведен фильтрационный анализ антитробина, полученного от Т tessulatum на 43831 8 Biogel P4 (Прпмср4) зактивированный тромбин, включая также пептиды-производные тромбина, напоминающие На Рис 3 показаны результаты проведения тромбин или другие производные тромбина, В аналитической ЖХВР с обращенной фазой позисоответствии с изобретением тромбин или укативных фракций после аффинной хроматографии занные производные тромбина иммобилизуют на (Пример 5) активную матрицу геля, преимущественно за счет На Рис 4 показаны результаты проведения взаимодействия с азлактоновой группой указанпрепаратной ЖХВР с обращенной фазой позитивной матрицы геля с использованном известных ных фракций после аффинной хроматографии способов В противной случае проводят аффинПример 5) ную хроматографию обычными способами На Рис 5 проводится сравнение гирудина и ингибитора по настоящему изобретению методаПредпочтительно использовать метод гельми ЖХВР (Пример 6) проникающей хроматографии совместно с аффинной хроматографией На Рис 6 представлена повторная хроматограмма активного пика 2 после ЖХВР с обращенМатрица геля в соответствии с настоящим ной фазой (Пример 7), изобретением имеет предел разделения приблизительно 5 кДа, что позволяет провести фракциоНа Рис 7 изображен масс-спектр активного нирование в интервале приблизительно от I кДа пика 2 после ЖХБР с обращенной фазой (Пример до 5 кДа, 7) На Рис 8 приведен ГЕГслед активного пика 2 Выделенные экстракты антитромбина, с цепосле ЖХБР с обращенной фазой (Пример 7) лью дальнейшей очистки, преимущественно подвергают далее ЖХВР с обращенной фазой УкаНа Рис 9 представлена повторная хроматозанные ранее полипептиды получают очисткой грамма активного пика 7 после ЖХВР с обращенвыделенных экстрактов с помощью ЖХВР с обной фазой (Пример 9) ращенной фазой Примерами подходящих соедиНа Рис 10 изображен масс-спектр активного нений для обращенных фаз являются силикагели, пика 4 после ЖХВР с обращенной фазой (Пример модифицированные C2-CI8 алифатическими за9) местителями Однако полипептиды по настоящеПодробное описание изобретения му изобретению могут быть очищены другими хоИнгибиторы тромбина по настоящему изобрерошо известными методами хроматографии тению могут быть выделены и очищены от тканей Методики осуществления ЖХВР приведены в и секреций пиявок отряда Rhynchob delhda, преПримерах Активность ингибиторов тромбина в имущественно семейства Theromyzon Ингибитоэкстрактах и отдельных фракциях, получаемых на ры тромбина, получаемые из пиявок семейства стадиях очистки, может быть определена in vitro Theromyzon, обладают сходной активностью и _по удлинению времени сгуст-кообразования (F лишь незначительно отличаются друг от друга Markwardt Meth Enz 1970, Vol/I9, pp 924-932) или Примерами подходящих видов семейства по ослаблению расщепления тромбинспецифичеTheromyzon являются Т bmannu-lafum, Тсоореп, ских субстратов, таких как ацетат тозил-глицилТ qargaewi, N maculocum, T molhssium, T pallens, припил-аргинин-4-нитроанилида (Chro-mozyn Т Н Т propmquum, T rude, T sexocutatum, и частности "Boehrmger" Мапгйт),как это написано в монограТ Tessulatum фии Н U Bergmeyer, Meth Enz, Anal, 3 rd, Ed, Vol В качестве источника в соответствии с на5, 365-394, 1988 roстоящим изобретением используют слюнные железы пиявок Но так как для приготовления слюнКак указано ранее, полипептиды по настояных желез необходимо приложить определенные щему изобретению пригодны в качестве фармаусилия, при этом неизбежны большие потери мацевтически эффективных соединений при создатериала, можно также использовать в качестве нии фармацевтических композиций и смесей источника головы или первую третью часть пияФармацевтические составы по настоящему вок изобретению не обязательно могут содержать активные дополнительные ингредиенты, подобОбычно первая стадия способа заключается в ные антикоагулянтам, таким как гирудин или гепаосновной в глубоком замораживании и/или сублирин или подобные тромболитическим средствам, мационной сушке тканей пиявок перед проведетаким как активатор плазминогена или гементин нием гомогенизации, которую обычно проводят в ацетоне или смесях ацетон/вода Тем не менее, Новые полипептиды и ингибиторы тромбина, для удаления нерастворимых в воде компонентов соответственно, по настоящему изобретению момогут использоваться и другие полярные раствогут образовывать фармацевтически приемлемые рители Предпочтительно также, чтобы экстракт, соли с нетоксичными, органическими или неоргаполученный на первой стадии, подвергался ценническими кислотами Неорганическими кислотатрифугированию перед проведением аффинной ми являются, например, соляная, бромистохроматографии для удаления нежелательных водородная, серная или фосфорная кислота и продуктов распада клеток Аффинную хроматокислые соли металлов, такие как моногидрофосграфию предпочтительно проводят на колонках, фат натрия и гидросульфат калия Примерами содержащих "активные участки тромбина" Термин органических кислот являются моно-, ди-, и три"активные участки тромбина" в данном случае карбоновые кислоты, такие как уксусная , гликолеуказывает на наличие в колонке участков тромбивая, молочная, пировиноградная, малоновая, янна, к которым может прикрепляться ингибитор тарная, глутаровая, фумаровая, яблочная, тромбина Примерами активных участков тромбивинная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, на являются иммобилизованный натрий или дегидроксималеиновая, бензойная, гидроксибензои 43831 ная, фенилуксусная, коричная, салициловая кислоты и сульфокислоти, такие как метансульфокислота Соли остатка С-концевой аминокислоты могут включать нетоксичные соли карбонових кислот, образованные с любыми подходящими неорганическими или органическими основаниями Указанные соли включают, например, соли щелочных металлов, таких как натрий и калий, соли щелочно-земельных металлов Группы ІІІА, включая алюминий, и соли органических первичных, вторичных и третичных аминов, таких как триалкиламины, в том числе триэтиламин, прокаин, дибензиламин, 1-этонал, N, N-дибен-зилэтиламин— диамин, дигидроабиетиламин и Nалкилпиперидин Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает в данном случае инертный, нетоксичный твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или материал для инкапсулирования, которые не вступают в нежелательное взаимодействие с активным соединением или не оказывают вредного воздействия на пациента Подходящими, преимущественно жидкими носителями, хорошо известными из области техники, являются такие как стерильная вода, солевой раствор, водный раствор декстрозы, растворы Сахаров, этанол, гликоли и масла, в том числе получаемые из нефти и масла растительного, животного происхождения и синтетические масла, например, арахисовое масло, соевое масло и минеральное масло Составы по настоящему изобретению могут назначаться в виде стандартных доз, содержащих нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, разбавители, вспомогательные соединения и наполнители, которые типичны для парентерального назначения Термин "парентеральный" включает в данном случае подкожные, внутривенные, внутрисуставные и внутритрахейные инъекции и вливания Пригодны и другие способы назначения, такие как оральное назначение и местное назначение Парентеральные композиции и сочетания наиболее предпочтительно вводятся внутривенно как в виде болюсов, так и путем постоянного вливания с использованием известных методов Таблетки и капсулы для орального назначения содержат обычные вспомогательные соединения, такие как связующие, наполнители, разбавители, таблетирущие средства, смазывающие средства, разрыхлители и смачивающие средства Таблетки могут быть покрыты с помощью методов, хорошо известных из области техника Жидкие составы для орального назначения могут быть приготовлены в виде водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров или приготовлены в виде сухих продуктов, которые растворяют перед употреблением в воде и в другом подходящем носителе Указанные жидкие препараты могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие средства, эмульгаторы, неводные носители и консерванты Составы для местного назначения могут быть в виде водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, желе или предпочтительно мазей в 10 форме эмульсии Стандартные дозы в соответствии с настоящим изобретением могут содержать суточную дозу белка по настоящему изобретению или ее дольные единицы с тем, чтобы получить требуемую дозу Оптимальная терапевтически приемлемая доза и интенсивность приема лекарства для данного пациента (млекопитающего, в том числе человека) зависит от ряда факторов, таких как активность конкретного применяемого активного соединения, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола пациента, диеты, времени и пути введения, коэффициента очищения крови, поставленной цели лечения, т е терапии или профілактики, и природы тромботического заболевания, которое лечат, антитромбоцитарной и антикогуляционной активности Потому в композициях или составах, полезных в качестве антикоагулянтов при лечении больного (в условиях in vivo) фармацевтически эффективная доза пептида по настоящему изобретению составляет приблизительно от 0,01 до 100 мг/кг веса тела, преимущественно от 0,1 до 10 мг/кг веса тела В соответствии с изобретением одна стандартная доза может содержать от 0,5 до 10 мг ингибитора тромбина Для достижения антикоагуляционного эффекта в экстракорпоральной крови фармацевтически активное количество пептида по изобретению составляет от 0,2 до 150 мг/л преимущественно от 1 мг до 20 мг/л экстракорпоральной крови Целью настоящего изобретения является также имплантируемое или размещаемое вне тела медицинское устройство, контактирующее сжиткостями организма, поверхность которого для придания ей достаточной тромбозности покрыта иммобилизованным поли пептидом, указанным ранее и в формуле изобретены Поли пептид по настоящему изобретению иммобилизует на медицинское устройство, с целью придания поверхности свойства биосовместимости и тромборозистентности Указанные устройства иногда имеют смачиваемые поверхности, которые вызывают аггродирование тромбоцитов, что является нежелательным, если указанию устройства предназначены для использования в имплантирующем и экстракорпоральном устройстве, контактирующем с кровью как другими жидкостями организма Примерами подобных устройств, которые обычно изготавливают из пластмасс и синтетических волокон, являются протезы, искусственные органы, шовне материалы, сегменты искусственных сосудов, катетеры, диализаторы, трубки в сосуды для хранения крови Настоящее изобретению далее иллюстрируется следующими примерами, которые приведены лишь для пояснения изобретения и не лимитируют объем притязаний по настоящему изобретению Пример 1 Доказательство присутствия антитромбина в Т tessulatum Года вы Theromyzon tessulatum гомогенизируют в изотоническом растворе Гомогенизат в течение короткого времени центрифугируют для удаления частичек веществ и жидкость над осадком 43831 12 11 сохраняют для проведения следующего антикубатор с температурой 37°С тромбинового анализа и для указанных гематолоДальнейшие детали осуществления этого тесгических испытаний та описаны РТ Сойером и др (Comp, Haematol Int 1991, Vol, pp 35-41) В следующей таблице Для оценки антитромбиновой активности 20 подытожены сведения об ингибировании парамкл указанного выше экстракта смешивают с 10 метров сгусткообразования в условиях in vitro с мкл тромбина (I ед ) К этой смеси приливают 100 использованием неочищенных экстрактов, полумкл раствора, содержащего 0,5 мг/мл фибриногеченных из Theromyzon tessulatum на, перемешивают и на I минуту помещают в инТаблица 1 Доказательство присутствия антитромбиновой активности в Т tessulatum Время протромбина (внешний) Активированный РТТ (внутренний) Время тромбина (антитромбин) Время рептилазы Контрольные образцы, сек 15 40 Как видно из приведенных данных, область головы Theromyzon tessulatum содержит растворимый в воде фактор или факторы, которые значительно увеличивают время сгусткообразования тромбина Пример 2 Хромогенный анализ на ингибирование тромбина и фактора Ха а) Ингибирование тромбина 20 мкл раствора тромбина (5 ед Национального института здоровья (NIH-U) тромбина/мл в 20 мм фосфатном буфере с рН 6,5 , содержащем 0,05% полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000) предварительно выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут в инкубаторе вместе с 880 мкл буферного раствора для проведения анализа на тромбин (100 ьь Tns-HCI, 200 мм NaCI, 0,05% ПЭГ с рН 8,3) в фотометрической кювете Инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата (4 Mr_Chromozym ТН от фирмы "Boehnnger", Мангейм, Германия, растворенного в 5 мл воды) и определяют поглощение через каждые ЗО сек при 25°С на длине волны 405 нм в течение 5 минут Дія сценки активности ингибирования образцы или гирудин в качестве стандарта в количестве Ю20О мкл смешивают с 20 мкл раствора тромбина и доводят общий объем до 900 мкл с помощью буферного раствора для анализа Полученную смесь предварительно-вадерживают в инкубаторе при температуре в течение 5 минут и инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата, б) Ингибирование активности фактора Ха 20 мкл раствора фактора Ха (10 ед /0,5 мл разбавляют водой до объема 2,0 мл) предварительно выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут в инкубаторе вместе с 880 мкл буферного раствора для проведения анализа на фактор Ха (100 мм Tns -HCI, 200мм NaCI, 0 05% ПЭГ с рН 8,3) в фотометрической кювете Инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстра-та (3,5 мг Chromozym X от фирмы "Boehnnger", Мангейм, растворенного в 5 мл воды) и определяют поглощение через каждые 30 сек при 25°С на длине волны 405 нм з течение 5 минут Для оценки активности интибирования образцы или гирудин в качестве стандарта в количестве 45 20 Неочищенный экстракт, сек 42 220 600 20 Ю-200 мкл смешивают с 20 мкл раствора Na и добавляют общий объем до 900 мкл с помощью буферного раствора для анализа Полученную смесь предварительно выдерживают в течение 5 минут и инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата Припер 3 Очистка ингибитора тромбина из Стадия 1 Первые третьи части от 1000 откормленных второсортных The romyzon tessulatum быстро замораживают при температуре минус 70°С и подвергают сублимационной сушке К полученному материалу добавляют 40%-ный водный раствор ацетона и гомогенизируют суспензию ультратораксом трижды по 10 секунд Вслед за двухминутной обработкой ультразвуком в гомогенизаторе следует еще одна стадия гомогенизации (30 секунд) Гомогенизат центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 6000 об/мин и полученную жидкость над осадком сохраняют (SI) К таблетке I добавляют еще 35 мл 40%$-ного ацетона и проводят вторую гомогенизацию (1x10 сек, 2 мин гомогенизации ультразвуком, I x 30 сек) гомогенизацию опять-таки центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 6000 об/мин Жидкость над осадком 2 добавляют к жидкости над осадком I и к объединенным растворам добавляют 80%-ный ацетон (об/об) Доводят рН до 4,0 с помощью уксусной кислоты и полученную суспензию центрифугируют в течение 20 мин со скоростью 6000 об/мин Таблетку 3 отделяют Жидкость над осадком 3 упаривают в 4 раза с помощью ротационного испарителя (фирмы " Speed Vac ") Свободный от ацетона экстракт испытывает на антитромбиновую активность по анализу сгусткообразования в соответствии с Примером I, a также по хромогенному анализу в соответствии с Примером 2 Стадия 2 Свободный от ацетона экстракт помещают в колонку PD-10 (от фирмы Pharmacia") для замены буфера Колонку уравнивают эфирным буфером (20 мМ Tns -HCI, 50 мМ HCI с рН 7,4) и в колонку помещают 2,5 мл экстракта со стадии I Элюат анализируют на антитромбиновую активность Тромбиновую аффинную колонку готовят еле 43831 14 13 дующим образом 400 мг сухой матрицы _Azlacton вают матрицу дважды пятикратным объемом ацеTentacle Fractogel ("E Meek", Дармштадт, Гермататного буфера (100 мМі ацетата натрия, 50 мМ ния) суспондируют в 7 мл буфера для связывания хлорида натрия с рН 4,0) Заключительное урав(50 мМ фосфата, 150 мМ HaCI с рН 7,5} при комнивание проводят, дважды промывая пятикратнатной температуре в течение 2 час Суспензию ным объемом аффинного буфера дважды промывают центрифугированием и ресусАктивные элюаты колонки PD-10 подают в пендированием в буфере для связывания 5000 аффинную колонку с помощью перистальтическоNIH- U бычьего тромбина ("Sioma") растворяют в го насоса (поток 10 мл/мин) Несвязанную фрак1 мл воды и доводят рН до 7,5 Подученный расцию собирают и промывают колонку 12 мл афтвор тромбина уравнивают буфером для связывафинного буфера (промывка 1) Элюирование ния с помощью колонки PD-10 для гельпроводят 6 мл ацетатного буфера с рН 4,0 и собипроникающей хроматографии К уравновешеннорают фракции объемом 0,5 мл Профиль элюирому раствору тромбина добавляют сульфат натрия вания этой колонки представлен на Рис 1 до конечной концентрации 1 м Тромбиновый беЗа первым элюированием следует второе с лок быстро вносят пипеткой в активированную использованием 6 мл ацетатного буфера с рН 3,0 матрицу геля и дают возможность связываться Собирают фракции по 1,5 мл Колонку вновь уравпри 4°С в течение 3 час при медленном переменовешивают с помощью 25 мл аффинного бушивании Промывают трижды пятикратным объефера мом буфера для связывания Для дезактивации Результаты стадии экстракции и аффинной матрицы добавляют 1,5 мл этаноламина и оставхроматографии суммированы в следующей Табляют при 4°С на ночь, слегка встряхивал Промылице 2 Таблица 2 Результаты очистки ингибитора тромбина из Theromyzon tessulatum с помощью аффинной хроматографии Фракция Объем (мл) Время сгусткообразования (сек) Ингибирование тромбина(меж ед) пустая ацетон 34 20,5 59,4 0 33 не связанный экстракт после аффин Хромат промывка 1 34 24,3 1,8 1,1 24 20,2 1,6 1,0 элюат 1 аффин хромат элюат 2 аффин хроглат 4 600 25 0,2 4 22,1 0 0 Пример 4 Анализ активного ингибитора тромбина из Theromyzon tessulatum с помощью шощыэ гель-проникающей хроматографии Активное вещество помещают в колонку Вюgel P4 ("Biorad") объемом 25 мл Элюирование проводят 20 мМ Tns - HCI, 50 мМ NaCI с рН 7,4 со скоростью подачи реагентов 4 мл/час На антитромбиновую активность исследуют фракция объемом 1 мл Гель-матрица Р4 имеет предел разделения 5000 Да в позволяет проводить фракционирование в интервале молекулярных весов от 1000 до 5000 Да Неожиданно было обнаружено, что антитромбиновая активность элюируется во фракционируемый объем, т е очевидно имеет молекулярный вес меньше 5000 Да (Рис 2) Такое поведение отличается от гирудина (молекулярный вес 7000 Да), который в тех же условиях остается в отдельном объеме Путем калибрования колонки Р4 для антитромбинной активности из Theromyzon tessulatum был получен молекулярный вес приблизительно 3000 Да Пример 5 ЖХЕР с обращенной фазой ингибитора тромбина из Theromyzon tessulatum Активные элюаты после стадии аффинной Ингибирование фактора Ха(меж ед) 0 не определялось хроматографии по Примеру 3 далее анализируют методы ЖХЕР с обращенной фазой 20 мкл образца инжектируют в колонку ЖХЕР (Li Chrospher 300 RP-18, 5 микрон, "Е Morck", Дармштадт, Германия) и градионтно элюируют в следующих ацетонитрильных растворах со скоростью подачи реагентов 1,0 мл/мин Буфер А 0,1% трифторуксусной кислоты в воде* Буфер Б 0,08% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле Градиент 0-2 мин 10% Б, 2-3 мин инжекция, 3-28 мин 60% Б На Рис 3 показана типичная аналитическая хроматограмма, записанная на длине волны 220 нм Активность ингибитора тромбин обнаруживается в пиках обозначенных пик 2 и пик 4 Информацию, полученную с помощью аналитической ЖХЕР, используют для проведения препаративного разделения в тех же самых условиях* Препаративную очистку проводят, используя аликвоты 500 мкд После аффинной хроматографии (Рис 4) Отбирают индивидуальные пики, алюируют и упаривают на ротационном испарите 43831 16 15 ле Speed Vac Упаренные фракции вновь раствоингибитором по настоящему изобретению Подряют в воде и анализируют на антитромбиновую робности метода описаны в публикации G W/ активность в тесте по времени сгусткообразоваTameson et al Biochem T, 1973, Vol 131,pp 107ния, а также в хромогенном тесте, приведенном в 117 Примере 2 Если коротко, то в эксперименте по титрованию используют флуорогенный субстрат Tos-ClyНаибольшая активность в обеих системах обPro-Arg-AMC с концентрацией 50 мкМ Анализ наружена у пиков 2 и 4, некоторая активность обпроводят в 100 мМ Тг -HCI, 200 мМ NaCI, 0,05% наруживается в пике 5, что вероятнее всего свиЦЭГ 6000 с рН 7,8 при 25°С Титрованный альфадетельствует о загрязнении пика 5 соединением тромбин человека с концентрацией активных учапика 4 Все другие пики на хроматограмме вовсе стков 20 пМ выдерживают в инкубаторе и вместе с не проявляют антитромбиновой активности Сумингибитором при 0,2-5 х Ео в течение 10 минут и марная активность пиков 2 и 4 соответствует приопределяют постоянные скорости после добавлеблизительно 93% общей активности ния субстрата Кинетические константы рассчитыПример 6 Сравнение ингибитора тромбина по вают, используя программу нелинейного регреснастоящему изобретению с гирудином методами сивного анализа Gra Fit, Стейнз, Великобритания, ЖХЕР 1980) Найдено, что Ki составляет 178 фемтомоЧтобы привести дальнейшие доказательства лей того, что ингибитор по настоящему изобретению является молекулой, принципиально отличной от Молекулярный вес гирудина, проводят следующий эксперимент К Молекулярный вес активного пика 2 опредеактивному пику 2 после ЖХЕР в соответствии с ляют с помощью масс спектрометрии с лазерной Примером 5 добавляют аналогичную белковую десорбцией, используя метод MAL DI-TOF концентрацию очищенного гирудина и подвергают (Kratos) 0,5 мкл образца смешивают с небольшим смесь ЖХЕР с обращенной фазой в градиенте количеством дигидроксибензойной кислоты в ацеацето-нитрила (40-70%) Обнаружены два пика, тонитрил, которая служит матрицей Смесь высукоторые содержат антитромбиновую активность шивают холодным воздухом на поверхности се(Рис 5) С помощью сравнительных эксперименребряного прободержателя и помещают в прибор тов, в которых вводят индивидуальные ингибитоПолученный масс-спектр калибруют по стандартры, проводят отнесение пиков, как это показано на ным белкам с известным молекулярным весом Рис 5 Пик соответствует молекулярной массе около 9000 Да (Рис 7) Из Рис 5 очевидно, что антитромбин по настоящему изобретению элюируется совершенно отлично от гирудина То же самое может быть показано для активного пика 4 после разделения методом ЖХЕР по Примеру 5 Пример 7 Дальнейшее изучение пика 2 антитромбиновой активностью Чистота Элкированный активный пик 2 после ЖХЕР с обращенной фазой подвергают повторной хроматографии в тех же условиях, что и приведенные на Рис 3 Как показано на Рис 6, от основного активного пика может быть отделено небольшое количество примесного соединения, в итого после повторной ЖХЕР с обращенной фазой получают гомогенный препарат (см также Рис 8, на котором представлены данные капиллярного электрофореза указанной фракции) Ингибированного тромбина Пик 2 после ЖХЕР с обращенной фазой проявляют активность и в анализе на сгусткообразование (время тромбина > 600сек/5 мл) и в хромогенном антитромбиновом анализе по Примеру 2 Активность в последнем тосте составляет 3,2 межд ед /250 мкл Ингибированная активность фактора Ха, определяемая по Примеру 2 в пике 2 не обнаруживается, что свидетельствует о том, что максимальная анти-фактор Ха активность составляет « 1% от антитромбиновой активности На этом основании можно заключить, что описанный здесь ингибитор являются весьма специфичным по отношению ктромбину Титрование активных участков Константу ингибитора по отношению к тромбину определяют спектрофотометрическим титрованием стандартизированного раствора тромбина Изоэлектрофокусировка Изоэлектрическую точку ингибитора определяют методом капиллярного электрофореза в режиме изоэлектрофокусировки ("Applied Biosystems") Как видно из Рис 8, пик ингибитора появляется при значении 4,9, если сравнивать со стандартными белками Пример 8 Данные о последовательности пика 2 с антитромбиновой активностью Используя ЖХЕР с обращенной фазой (Пример 5), для пика 2 методом химического разложения по Эдману в белковом секвенвенторе фирмы "Beckman" получают следующую N-концевую последовательность Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys ProGlyGlu Пример 9 Дальнейшее изучение пика 4 с антитромбиновой активностью Частота Элкированный активный пик 4 после ЖХЕР с обращенной фазой подвергают повторной хроматографии в тех же условиях Как показано на Рис 9 от основного активного пика может быть отделено небольшое количество примесного соединения и в итоге после повторной ЖХЕР с обращенной фазой получают гомогенный препарат Ингибирование тромбина Пик 4 после ЖХЕР с обращенной фазой проявляет активность и в анализе на сгусткообразование (время тромбина >600 сек/5 мл) и в хромогенном антибромбиновом анализе по Примеру Активность в последнем тесте составляет 1,3 межд ед /250 мкл Ингибиторная активность фактора Ха, определяемая по Примеру 2, в пике 4 не обнаруживается, что свидетельствует о том, что 43831 18 17 максимальная анти-фактор Ха активность составПример 10 Данные о последовательности пиляв « 1 % от антитромбиновой активности На ка 4 с антитромбиновой активностью этом основании можно заключить, что описанный Используя ЖХЕР с обращенной фазой (Приздесь ингибитор является весьма специфичным мер 5), для пика 4 методом химического разложепо отношению ктромбину ния по Эдману в белковом секвенторе фирмы "Beckman" получают следующую N-концевую поТитрование активных участков следовательность Константу ингибитора по отношению к тромбину определяют спектрофотометрическим титроSer Glu Leu Gly Gin Ser Cys Lys Glu Asn Pro ванием стандартизированного раствора тромбина Cys Pro Sen Asn Met Lus Cys Asn Arg Glu Thn Phe ингибитором по настоящему изобретению ПодLys робности метода описаны в Примере 7 Найдено, Пример 11 что Ki составляет 240 фемтомолей Используя те же методики, что и приведенные в Примерах1-5, можно выделить антитромббиноМолекулярный вес вую активность из следующих видов Theromyzon, Молекулярный вес активного пика 4 определяют с помощью масс спектрометрии с лазерной Т bmannu latum, десорбцией, используя метод MALD I-TOF Т соореп, (Kratos), как описано в Примере 7 Полученный Т garjaewi, масс-спектр калибруют по стандартным белкам с Т macu losum, известным молекулярным весом Пик соответстТ sexocu latum вует молекулярной массе около 14 кДа (Рис 10) * =ан-итром6ииавэя активность СО=230ни Фиг. 1 • * * жангитромбинавэя активность OD=280HM Отделяемый объем Фиг. 2 Фиг. 4 5 19 20 43831 Фиг. 8 Фиг, 6 5000 Фиг. 7 1G0 00 ФЙГ 10 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 15000 УКРАЇНА (19) иА (11,43831 (із) С2 (51)6А61К38/58,С07К14/815,А61Р7/02 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) ІНГІБІТОРИ ТРОМБІНУ З ГТЯВОК РЯДУ RHYNCHOBDELLIDA РОДИНИ THEROMYZON, ЕКСТРАКТ ТА ПОЛІПЕПТИД, ЩО МАЮТЬІНПБІТОРНУ АКТИВНІСТЬ (21)95018001 (22)03 05 1994 (24)15 01 2002 (46) 15 01 2002, Бюл № 1, 2002 р (86) РСТ/ЕР94/01404, 03 05 1994 (31)9309509 9 (32)07 05 1993 (33) GB (46) 15 01 2002, Бюл № 1, 2002 р (72) Хембергер Юрген , DE, Сойер Рой , GB, Вольф Сабіна , DE, Додт Йоханнес , DE (73) МЕРК ПАТЕНТ ГМБХ, DE (56) ЕР 0347376, 20 12 1989, WO, А, 91 15576, 17 10 1991 (57) 1 Экстракт, обладающий ингибиторной активностью по отношению к тромбину, отличающийся тем, что указанный экстракт содержит растворимые в воде компоненты из тканей или секреций пиявок отряда Rhynchobdelhda семейства Theromyzon 2 Экстракт по п 1, отличающийся тем, что он выделен из пиявок вида Theromyzon tessulatum 3 Полипептид, обладающий ингибиторной активностью по отношению к тромбину, который отличается от гирудина по молекулярному весу, изоэлектрической точке и последовательности аминокислот, отличающийся тем, что он получен из тканей или секреций пиявок отряда Rhynchobdelhda семейства Theromyzon, предпочтительно Theromyzon tessulatum, путем гомогенизации передней третьей части замороженных и подвергнутых сублимационной сушке пиявок в смеси вода/ацетон и выделения полипептида путем последующей очистки водорастворимых компонентов полученного экстракта методом тромбинспецифической аффинной хроматографии с последующей по крайней мере одной стадией гельпроникающей хроматографии и по крайней мере одной стадией жидкостной хроматографии высокого разрешения с обращенной фазой 4 Полипептид по п 3, отличающийся тем, что имеет молекулярный вес около 3 кДа и выделенный из экстракта стадией гельпроникающей хроматографии с применением гелевой матрицы, имеющей предел исключения 5 кДа 5 Полипептид по п 3, отличающийся тем, что имеет молекулярный вес около 9 кДа и следующую N-концевую последовательность аминокислот Glu-Asp-Asp-Asn-Pro-Gly-Pro-Pro-Arg-Ala-Cys-ProGly-Glu 6 Полипептид по п 3, отличающийся тем, что имеет молекулярный вес около 14 кДа и следующую N-концевую последовательность аминокислот Ser-Gln-Leu-Gly-Gln-Ser-Cys-Ser-Lys-Glu-Asn-ProCys-Pro-Ser-Asn-Met-Lys-Cys-Asn-Arg-Glu-Thr-PheLys 7 Полипептид по одному из пп 3-6, отличающийся тем, что его используют в качестве медицинского средства 8 Полипептид по п 7, отличающийся тем, что его используют в качестве ингибитора тромбина при лечении in vivo расстройств, вызываемых тромбозом 9 Полипептид по п 7, отличающийся тем, что его используют в качестве ингибитора тромбина для подавления агрегирования тромбоцитов в экстракорпоральной крови 10 Полипептид по одному из пп 3-6, отличающийся тем, что его используют для приготовления фармацевтической композиции для лечения in vivo расстройств, вызываемых тромбозом 11 Полипептид по одному из пп 3-6, отличающийся тем, что его используют для приготовления фармацевтической композиции для подавления агрегирования тромбоцитов и образования сгустков крови в экстракорпоральной крови 12 Применение пиявок отряда Rhynchobdelhda, предпочтительно вида Theromyzon tessulatum в качестве исходного материала для получения веществ-ингибиторов тромбина по одному из пп 3-5 О го 00 го 43831 Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам тромбона, в частности, к ингибиторам тромбина, выделяемым из тканей и секреций пиявок Тромбин катализирует образование сгустков фибрина, а потому подавляет свертывание крови Кроме того, тромбин выступает в роли биорегулятора в таких процессах, как прямая активация агрегирования тромбоцитов и активация воспалительного отклика путем стимулирования синтеза активационного фактора тромбоцитов клетками эндотелия Это означает, что тромбин играет главную роль в заболеваниях, вызываемых тромбозом, таких как, например, заболевания сердечно-сосудистой системы По этой причине сохраняется значительный интерес к новым или обладающим улучшенными свойствами ингибиторам тромбина и антикоагулянтам Примерами хорошо известных ингибиторов тромбина являются гепарин и гирудин Гепарин усиливает антикоагуляционную активность антитромбина III Он широко используется для лечения состояний, таких как венозный тромбоэмболизм, при которых активность тромбина ответственна за развитие или распространение тромба Он не эффективен для терапевтического применения в тех случаях, когда содержание антитромбива III понижено, например, в случае тромбоза, вызываемого нефрозом или синдромом коагулопатии потребления Более того, гепарин вызывает многочисленные побочные эффекты, в том числа кровотечение и тромбоцитопению Гирудин является хорошо известным и хорошо изученным полиптотидом, который, как известно, является тромбинспецифическим и может быть выделен из экстрактов слюнных желез и других тканей пиявок вида Hirudo medicinahs Гирудин и его производные можно получать также по рекомбинантной технологии Полипептид имеет сравнительно небольшой молекулярный вес порядка 7000 Да и состоит из 65 остатков аминокислот Последовательность аминокислот гирудина была впервые определена Додтом и др (FEBS Letters, 1984, Vol I65, рр 180-184) В пиявках Hirudo medicinahs обнаружены три основные формы гирудина (HV 1, HV 2, HV 3), которые отличаются всего лишь приблизительно на 10%% от общего числа позиций аминокислот Наиболее значительное различие состоит в первых двух позициях N конца молекулы Val- Val в форме I гирудина и Не—ТІг в форме 2 гирудина Указанные различия носят второстепенный характер и не оказывают влияние ни на функции, ни на специфичность взаимодействия гирудин-тромбин Гирудин является потенциальным природным ингибитором коагуляции Показана его эффективность для предотвращения тромбоза вен, закупорки анастомозов сосудов и вызываемого тромбином синдрома и коагуляриин потребления, однако он вызывает продолжительные кровотечения Фитогенетически медицинская пиявка Hirudo medicinahs являются членом подсемейства Herudmmae семейство пиявок Herudmidae (R Т Sawyer "Leech Biology an Bihavior", Oxford University Press,Vol 2, p 688, 1986) Эволюционно более развитым видом пиявок является Hirudinamnae того же семейства Herudmidae Неожиданно похожая, но вполне отличная изоформа гирудина была недавно обнаружена в Herudmaria manillensis, как это описано в международной патентной заявке РСТ Wo 90/05143 Указанная изоформа отличается почти по 40% позиций аминокислот при сравнении с нирудином от Hirudo medicinahs Для указанных ранее вида, а именно Hirudo medicinahs и Herudmaria mam llensis относятся к отряду пиявок Arhynchobdelhda ("пиявки с челюстями") Помимо отряда Arhynchobdelhda существует еще один большой отряд пиявок, т е Rhynchob dellida ("пиявки с хоботом") (R Т Sawyer "Heech Biology and Behavi our" Oxford University Press Vol, 2 p 651, 1986) Что касается белков, содержащихся в слюне, то наиболее изученным представителем отряда "Rhynchob dellida" является "амазонская пиявка" Haementeria ghilanii Неожиданно было обнаружено, что этот вид не содержит антитромбин (Budzynski et al Proc Soc Biol Med ,1981, Vol 168, pp 259-265) Вместо того Haementeria ghilanii содержит фибринолитическии фермент, получивший название гементин (Патент США 4390630), а также ингибитор фактора коагуляции крови Ха (С Condra et al Thromb Haemost 1986, Vol 61, pp 437-441) Основываясь на этом открытии и последующих публикациях, полагали, что антитромбиноподобная активность ограничивается пиявками отряда Arhynchobdelhda и отсутствует у отряда Rhynchob dellida Несмотря на обсуждавшиеся выше разработки, сохраняется потребность в других, кроме гепарина и гирудина, антиокоагулянтах и антитромбинах, соответственно, которые обладают более высокой эффективностью при подавлении образования сгустков, вызываемой тромбином активации действия у клеток эндотелия, и которые можно было бы получать в коммерческих количествах Неожиданно было обнаружено, что соединения антитромбиноподобной активностью могут быть выделены из тканей и секреции пиявок отряда Rhynchob dellida предпочтительно семействаTheromuzon и наиболее предпочтительно вид Theromuzon tessulatum, которых часто называют "птичьими пиявками", т к образ жизни этих пиявок заключается втом, что они сосут кровь из ноздрей водоплавающих птиц Таким образом, целью настоящего изобретения является использование пиявок отряда Rhynchob dellida, предпочтительно вида Theromuzon tessulatum для получения соединений-ингибиторов тромбина* Было показано, что активность ингибитора тромбина можно измерить в экстрактах, состоящих из растворимых в воде компонентов указанных пиявок Таким образом, целью настоящего изобретения является получение экстрактов с ингибиторной активностью по отношению к тромбину из тканей или секреции пиявок отряда Rhynchob dellida или семейства Theromuzon или вида Theromuzon tessulatum, содержащих растворимые в воде компоненты указанных пиявок 43831 АІСГИВНЬІЙ ингибитор тромба может быть выделен из указанных экстрактов Таким образом, целью настоящего изобретения является в достаточной степени очищенный ингибитор тромбина, который можно охарактеризовать как полипоптиды, обладающий антитробной активностью, выделенной из указанного выше и в формуле изобретения экстракта путем очистки экстракта полуденного гомогенизацией передней третьей части замороженных и подвегнутых сублимационной сушке пиявок в смеси вода/ацетон, методом тромбинспецифической аффинной хроматографии с последующей, по крайней мере, одной стадией гель-проникающей хроматографии и, по крайней мере, одной стадией жидкостной хроматографии высокого разрешения (SXEP) с обращенной фазой Ингибитор тромбина преимущественно содержит активные полипептидные фрагменты с молекулярными весами около 3 кДа, приблизительно 14 кДа, соответственно Указанные активные полипептиды можно рассматривать как продукты разложения исходного ингибитора тромба или предшественника ингибитора тромба Ингибитор тромба по настоящему изобретению является новым, поскольку он отличается от известных антитромбинов, в частности, по своему молекулярному весу, изоэлектрической точке в Nконцевой последовательности аминокислотных остатков, что указывают на низкую гомологию (ниже 40%) с другими ингибиторами тромбина Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является изобретение из указанного экстракта ингибитора тромбина, состоящего, по крайней мере из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярный вес около 3 кДа Далее целью настоящего изобретения является ингибитор тромбина, состоящий, по крайней мере, из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярный вес около 9 кДа и следующую N-концевую последовательность аминокислот Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys ProGlyGlu/ Далее, целью HacTzotuj изобретения является ингибитор тромбина, состоящий, по крайней мере из одного полипептида, обладающего ингибиторной активностью по отношению к тромбину и имеющего молекулярный вес около 14 кДа и следующую N-концевую последовательность аминокислот Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys В соответствии с настоящим изобретением термины "около 3 (9,14) кДа" включают максимальное отклонение плюс/минус 1 кДа, преимущественно 0,5 кДа Более того, в объем притязаний по настоящему изобретению входят указанные выше и ниже по тексту последовательности, в которых произведена замена аминокислот, так что сохраняются основные биологические свойства Изобретение охватывает такие формы, фрагменты, подединицы, природные мутанты и произвольно возникшие искусственные мутанты Сюда включаются также гибридные белки, такие как белки слияния, полученные из указанных поптидов Изобретение относится к способу получения указанного выше и в формуле изобретения экстракта путем гомогенизации тканей или секреций пиявок отряда Rhynchob delhda преимущественно вида Theromuzon tessulatum и приготовления фракции, включающей их растворимые в воде компоненты Далее, целью настоящего изобретения является способ получения полипептида по пп 4-7 формулы изобретения путей очистки экстракта с помощью тромбинспецифической аффинной хроматографаии и, по крайней мере, одной стадии стандартной хроматографической очистки Ингибитор тромбина по настоящему изобретению обладает антикоагуляционными и антитромботическими свойствами Поэтому он может использоваться при лечении клинических состояний, при которых нарушена система коагуляции Это использование включает лечение тромбоза, паралича, инфаркта миокарда, глубокого тромбоза вен, закупорки артерий конечностей, тромбоза легких, тромбоза артерии сетчатки глаза иди других еду чаев тромбоза Более того, ингибиторы тромбина могут применяться для пациентов с артериовенозными щунтами или пациентов, которым устанавливаются коронарные обходныеанастомозы Полипептиды по настоящему изобретению могут также использоваться в качестве антикоагулянтов для профилактики тромбоза или повторной закупорки артерий, для консервации крови иди продуктов крови и для экстракорпоральной циркуляции крови или плазмы Ингибиторы тромбина (полипептиды) по настоящему изобретению проявляют биологическую активность, которая в основном сопоставима с активностью гирудина Сродство при присоединении к тромбину (константа ингибирования) даже несколько возрастает по сравнению с гирудином, который является в настоящее время самым сильным ингибитором тромбина* Таким образом, еще одной целью настоящего изобретения является использование указанных выше и в формуле изобретения полипептидов в качестве медицинского средства, в частности, при лечении ІП in vivo расстройств, вызываемых тромбозом, и для подавления агрегирования тромбоцитов и образования сгустков крови в экстракорпоральной крови Наконец, в настоящем изобретении заявляется также фармацевтическая композиция, включающая ингибитор тромбина или указанный выше полипептид, соответственно, и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения заболеваний, вызываемых тромбозом, как это указано ранее Краткое описание рисунков Подробное описание рисунков приводится в Примерах 1-10 На рис 1 представлен профиль элюмрования антитробина после аффинной колонки (Пример 3) На рис 2 приведен фильтрационный анализ антитробина, полученного от Т tessulatum на 43831 8 Biogel P4 (Прпмср4) зактивированный тромбин, включая также пептиды-производные тромбина, напоминающие На Рис 3 показаны результаты проведения тромбин или другие производные тромбина, В аналитической ЖХВР с обращенной фазой позисоответствии с изобретением тромбин или укативных фракций после аффинной хроматографии занные производные тромбина иммобилизуют на (Пример 5) активную матрицу геля, преимущественно за счет На Рис 4 показаны результаты проведения взаимодействия с азлактоновой группой указанпрепаратной ЖХВР с обращенной фазой позитивной матрицы геля с использованном известных ных фракций после аффинной хроматографии способов В противной случае проводят аффинПример 5) ную хроматографию обычными способами На Рис 5 проводится сравнение гирудина и ингибитора по настоящему изобретению методаПредпочтительно использовать метод гельми ЖХВР (Пример 6) проникающей хроматографии совместно с аффинной хроматографией На Рис 6 представлена повторная хроматограмма активного пика 2 после ЖХВР с обращенМатрица геля в соответствии с настоящим ной фазой (Пример 7), изобретением имеет предел разделения приблизительно 5 кДа, что позволяет провести фракциоНа Рис 7 изображен масс-спектр активного нирование в интервале приблизительно от I кДа пика 2 после ЖХБР с обращенной фазой (Пример до 5 кДа, 7) На Рис 8 приведен ГЕГслед активного пика 2 Выделенные экстракты антитромбина, с цепосле ЖХБР с обращенной фазой (Пример 7) лью дальнейшей очистки, преимущественно подвергают далее ЖХВР с обращенной фазой УкаНа Рис 9 представлена повторная хроматозанные ранее полипептиды получают очисткой грамма активного пика 7 после ЖХВР с обращенвыделенных экстрактов с помощью ЖХВР с обной фазой (Пример 9) ращенной фазой Примерами подходящих соедиНа Рис 10 изображен масс-спектр активного нений для обращенных фаз являются силикагели, пика 4 после ЖХВР с обращенной фазой (Пример модифицированные C2-CI8 алифатическими за9) местителями Однако полипептиды по настоящеПодробное описание изобретения му изобретению могут быть очищены другими хоИнгибиторы тромбина по настоящему изобрерошо известными методами хроматографии тению могут быть выделены и очищены от тканей Методики осуществления ЖХВР приведены в и секреций пиявок отряда Rhynchob delhda, преПримерах Активность ингибиторов тромбина в имущественно семейства Theromyzon Ингибитоэкстрактах и отдельных фракциях, получаемых на ры тромбина, получаемые из пиявок семейства стадиях очистки, может быть определена in vitro Theromyzon, обладают сходной активностью и _по удлинению времени сгуст-кообразования (F лишь незначительно отличаются друг от друга Markwardt Meth Enz 1970, Vol/I9, pp 924-932) или Примерами подходящих видов семейства по ослаблению расщепления тромбинспецифичеTheromyzon являются Т bmannu-lafum, Тсоореп, ских субстратов, таких как ацетат тозил-глицилТ qargaewi, N maculocum, T molhssium, T pallens, припил-аргинин-4-нитроанилида (Chro-mozyn Т Н Т propmquum, T rude, T sexocutatum, и частности "Boehrmger" Мапгйт),как это написано в монограТ Tessulatum фии Н U Bergmeyer, Meth Enz, Anal, 3 rd, Ed, Vol В качестве источника в соответствии с на5, 365-394, 1988 roстоящим изобретением используют слюнные железы пиявок Но так как для приготовления слюнКак указано ранее, полипептиды по настояных желез необходимо приложить определенные щему изобретению пригодны в качестве фармаусилия, при этом неизбежны большие потери мацевтически эффективных соединений при создатериала, можно также использовать в качестве нии фармацевтических композиций и смесей источника головы или первую третью часть пияФармацевтические составы по настоящему вок изобретению не обязательно могут содержать активные дополнительные ингредиенты, подобОбычно первая стадия способа заключается в ные антикоагулянтам, таким как гирудин или гепаосновной в глубоком замораживании и/или сублирин или подобные тромболитическим средствам, мационной сушке тканей пиявок перед проведетаким как активатор плазминогена или гементин нием гомогенизации, которую обычно проводят в ацетоне или смесях ацетон/вода Тем не менее, Новые полипептиды и ингибиторы тромбина, для удаления нерастворимых в воде компонентов соответственно, по настоящему изобретению момогут использоваться и другие полярные раствогут образовывать фармацевтически приемлемые рители Предпочтительно также, чтобы экстракт, соли с нетоксичными, органическими или неоргаполученный на первой стадии, подвергался ценническими кислотами Неорганическими кислотатрифугированию перед проведением аффинной ми являются, например, соляная, бромистохроматографии для удаления нежелательных водородная, серная или фосфорная кислота и продуктов распада клеток Аффинную хроматокислые соли металлов, такие как моногидрофосграфию предпочтительно проводят на колонках, фат натрия и гидросульфат калия Примерами содержащих "активные участки тромбина" Термин органических кислот являются моно-, ди-, и три"активные участки тромбина" в данном случае карбоновые кислоты, такие как уксусная , гликолеуказывает на наличие в колонке участков тромбивая, молочная, пировиноградная, малоновая, янна, к которым может прикрепляться ингибитор тарная, глутаровая, фумаровая, яблочная, тромбина Примерами активных участков тромбивинная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, на являются иммобилизованный натрий или дегидроксималеиновая, бензойная, гидроксибензои 43831 ная, фенилуксусная, коричная, салициловая кислоты и сульфокислоти, такие как метансульфокислота Соли остатка С-концевой аминокислоты могут включать нетоксичные соли карбонових кислот, образованные с любыми подходящими неорганическими или органическими основаниями Указанные соли включают, например, соли щелочных металлов, таких как натрий и калий, соли щелочно-земельных металлов Группы ІІІА, включая алюминий, и соли органических первичных, вторичных и третичных аминов, таких как триалкиламины, в том числе триэтиламин, прокаин, дибензиламин, 1-этонал, N, N-дибен-зилэтиламин— диамин, дигидроабиетиламин и Nалкилпиперидин Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает в данном случае инертный, нетоксичный твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или материал для инкапсулирования, которые не вступают в нежелательное взаимодействие с активным соединением или не оказывают вредного воздействия на пациента Подходящими, преимущественно жидкими носителями, хорошо известными из области техники, являются такие как стерильная вода, солевой раствор, водный раствор декстрозы, растворы Сахаров, этанол, гликоли и масла, в том числе получаемые из нефти и масла растительного, животного происхождения и синтетические масла, например, арахисовое масло, соевое масло и минеральное масло Составы по настоящему изобретению могут назначаться в виде стандартных доз, содержащих нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, разбавители, вспомогательные соединения и наполнители, которые типичны для парентерального назначения Термин "парентеральный" включает в данном случае подкожные, внутривенные, внутрисуставные и внутритрахейные инъекции и вливания Пригодны и другие способы назначения, такие как оральное назначение и местное назначение Парентеральные композиции и сочетания наиболее предпочтительно вводятся внутривенно как в виде болюсов, так и путем постоянного вливания с использованием известных методов Таблетки и капсулы для орального назначения содержат обычные вспомогательные соединения, такие как связующие, наполнители, разбавители, таблетирущие средства, смазывающие средства, разрыхлители и смачивающие средства Таблетки могут быть покрыты с помощью методов, хорошо известных из области техника Жидкие составы для орального назначения могут быть приготовлены в виде водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов или эликсиров или приготовлены в виде сухих продуктов, которые растворяют перед употреблением в воде и в другом подходящем носителе Указанные жидкие препараты могут содержать обычные добавки, такие как суспендирующие средства, эмульгаторы, неводные носители и консерванты Составы для местного назначения могут быть в виде водных или масляных суспензий, растворов, эмульсий, желе или предпочтительно мазей в 10 форме эмульсии Стандартные дозы в соответствии с настоящим изобретением могут содержать суточную дозу белка по настоящему изобретению или ее дольные единицы с тем, чтобы получить требуемую дозу Оптимальная терапевтически приемлемая доза и интенсивность приема лекарства для данного пациента (млекопитающего, в том числе человека) зависит от ряда факторов, таких как активность конкретного применяемого активного соединения, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола пациента, диеты, времени и пути введения, коэффициента очищения крови, поставленной цели лечения, т е терапии или профілактики, и природы тромботического заболевания, которое лечат, антитромбоцитарной и антикогуляционной активности Потому в композициях или составах, полезных в качестве антикоагулянтов при лечении больного (в условиях in vivo) фармацевтически эффективная доза пептида по настоящему изобретению составляет приблизительно от 0,01 до 100 мг/кг веса тела, преимущественно от 0,1 до 10 мг/кг веса тела В соответствии с изобретением одна стандартная доза может содержать от 0,5 до 10 мг ингибитора тромбина Для достижения антикоагуляционного эффекта в экстракорпоральной крови фармацевтически активное количество пептида по изобретению составляет от 0,2 до 150 мг/л преимущественно от 1 мг до 20 мг/л экстракорпоральной крови Целью настоящего изобретения является также имплантируемое или размещаемое вне тела медицинское устройство, контактирующее сжиткостями организма, поверхность которого для придания ей достаточной тромбозности покрыта иммобилизованным поли пептидом, указанным ранее и в формуле изобретены Поли пептид по настоящему изобретению иммобилизует на медицинское устройство, с целью придания поверхности свойства биосовместимости и тромборозистентности Указанные устройства иногда имеют смачиваемые поверхности, которые вызывают аггродирование тромбоцитов, что является нежелательным, если указанию устройства предназначены для использования в имплантирующем и экстракорпоральном устройстве, контактирующем с кровью как другими жидкостями организма Примерами подобных устройств, которые обычно изготавливают из пластмасс и синтетических волокон, являются протезы, искусственные органы, шовне материалы, сегменты искусственных сосудов, катетеры, диализаторы, трубки в сосуды для хранения крови Настоящее изобретению далее иллюстрируется следующими примерами, которые приведены лишь для пояснения изобретения и не лимитируют объем притязаний по настоящему изобретению Пример 1 Доказательство присутствия антитромбина в Т tessulatum Года вы Theromyzon tessulatum гомогенизируют в изотоническом растворе Гомогенизат в течение короткого времени центрифугируют для удаления частичек веществ и жидкость над осадком 43831 12 11 сохраняют для проведения следующего антикубатор с температурой 37°С тромбинового анализа и для указанных гематолоДальнейшие детали осуществления этого тесгических испытаний та описаны РТ Сойером и др (Comp, Haematol Int 1991, Vol, pp 35-41) В следующей таблице Для оценки антитромбиновой активности 20 подытожены сведения об ингибировании парамкл указанного выше экстракта смешивают с 10 метров сгусткообразования в условиях in vitro с мкл тромбина (I ед ) К этой смеси приливают 100 использованием неочищенных экстрактов, полумкл раствора, содержащего 0,5 мг/мл фибриногеченных из Theromyzon tessulatum на, перемешивают и на I минуту помещают в инТаблица 1 Доказательство присутствия антитромбиновой активности в Т tessulatum Время протромбина (внешний) Активированный РТТ (внутренний) Время тромбина (антитромбин) Время рептилазы Контрольные образцы, сек 15 40 Как видно из приведенных данных, область головы Theromyzon tessulatum содержит растворимый в воде фактор или факторы, которые значительно увеличивают время сгусткообразования тромбина Пример 2 Хромогенный анализ на ингибирование тромбина и фактора Ха а) Ингибирование тромбина 20 мкл раствора тромбина (5 ед Национального института здоровья (NIH-U) тромбина/мл в 20 мм фосфатном буфере с рН 6,5 , содержащем 0,05% полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000) предварительно выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут в инкубаторе вместе с 880 мкл буферного раствора для проведения анализа на тромбин (100 ьь Tns-HCI, 200 мм NaCI, 0,05% ПЭГ с рН 8,3) в фотометрической кювете Инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата (4 Mr_Chromozym ТН от фирмы "Boehnnger", Мангейм, Германия, растворенного в 5 мл воды) и определяют поглощение через каждые ЗО сек при 25°С на длине волны 405 нм в течение 5 минут Дія сценки активности ингибирования образцы или гирудин в качестве стандарта в количестве Ю20О мкл смешивают с 20 мкл раствора тромбина и доводят общий объем до 900 мкл с помощью буферного раствора для анализа Полученную смесь предварительно-вадерживают в инкубаторе при температуре в течение 5 минут и инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата, б) Ингибирование активности фактора Ха 20 мкл раствора фактора Ха (10 ед /0,5 мл разбавляют водой до объема 2,0 мл) предварительно выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут в инкубаторе вместе с 880 мкл буферного раствора для проведения анализа на фактор Ха (100 мм Tns -HCI, 200мм NaCI, 0 05% ПЭГ с рН 8,3) в фотометрической кювете Инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстра-та (3,5 мг Chromozym X от фирмы "Boehnnger", Мангейм, растворенного в 5 мл воды) и определяют поглощение через каждые 30 сек при 25°С на длине волны 405 нм з течение 5 минут Для оценки активности интибирования образцы или гирудин в качестве стандарта в количестве 45 20 Неочищенный экстракт, сек 42 220 600 20 Ю-200 мкл смешивают с 20 мкл раствора Na и добавляют общий объем до 900 мкл с помощью буферного раствора для анализа Полученную смесь предварительно выдерживают в течение 5 минут и инициируют реакцию добавлением 100 мкл раствора субстрата Припер 3 Очистка ингибитора тромбина из Стадия 1 Первые третьи части от 1000 откормленных второсортных The romyzon tessulatum быстро замораживают при температуре минус 70°С и подвергают сублимационной сушке К полученному материалу добавляют 40%-ный водный раствор ацетона и гомогенизируют суспензию ультратораксом трижды по 10 секунд Вслед за двухминутной обработкой ультразвуком в гомогенизаторе следует еще одна стадия гомогенизации (30 секунд) Гомогенизат центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 6000 об/мин и полученную жидкость над осадком сохраняют (SI) К таблетке I добавляют еще 35 мл 40%$-ного ацетона и проводят вторую гомогенизацию (1x10 сек, 2 мин гомогенизации ультразвуком, I x 30 сек) гомогенизацию опять-таки центрифугируют в течение 15 минут со скоростью 6000 об/мин Жидкость над осадком 2 добавляют к жидкости над осадком I и к объединенным растворам добавляют 80%-ный ацетон (об/об) Доводят рН до 4,0 с помощью уксусной кислоты и полученную суспензию центрифугируют в течение 20 мин со скоростью 6000 об/мин Таблетку 3 отделяют Жидкость над осадком 3 упаривают в 4 раза с помощью ротационного испарителя (фирмы " Speed Vac ") Свободный от ацетона экстракт испытывает на антитромбиновую активность по анализу сгусткообразования в соответствии с Примером I, a также по хромогенному анализу в соответствии с Примером 2 Стадия 2 Свободный от ацетона экстракт помещают в колонку PD-10 (от фирмы Pharmacia") для замены буфера Колонку уравнивают эфирным буфером (20 мМ Tns -HCI, 50 мМ HCI с рН 7,4) и в колонку помещают 2,5 мл экстракта со стадии I Элюат анализируют на антитромбиновую активность Тромбиновую аффинную колонку готовят еле 43831 14 13 дующим образом 400 мг сухой матрицы _Azlacton вают матрицу дважды пятикратным объемом ацеTentacle Fractogel ("E Meek", Дармштадт, Гермататного буфера (100 мМі ацетата натрия, 50 мМ ния) суспондируют в 7 мл буфера для связывания хлорида натрия с рН 4,0) Заключительное урав(50 мМ фосфата, 150 мМ HaCI с рН 7,5} при комнивание проводят, дважды промывая пятикратнатной температуре в течение 2 час Суспензию ным объемом аффинного буфера дважды промывают центрифугированием и ресусАктивные элюаты колонки PD-10 подают в пендированием в буфере для связывания 5000 аффинную колонку с помощью перистальтическоNIH- U бычьего тромбина ("Sioma") растворяют в го насоса (поток 10 мл/мин) Несвязанную фрак1 мл воды и доводят рН до 7,5 Подученный расцию собирают и промывают колонку 12 мл афтвор тромбина уравнивают буфером для связывафинного буфера (промывка 1) Элюирование ния с помощью колонки PD-10 для гельпроводят 6 мл ацетатного буфера с рН 4,0 и собипроникающей хроматографии К уравновешеннорают фракции объемом 0,5 мл Профиль элюирому раствору тромбина добавляют сульфат натрия вания этой колонки представлен на Рис 1 до конечной концентрации 1 м Тромбиновый беЗа первым элюированием следует второе с лок быстро вносят пипеткой в активированную использованием 6 мл ацетатного буфера с рН 3,0 матрицу геля и дают возможность связываться Собирают фракции по 1,5 мл Колонку вновь уравпри 4°С в течение 3 час при медленном переменовешивают с помощью 25 мл аффинного бушивании Промывают трижды пятикратным объефера мом буфера для связывания Для дезактивации Результаты стадии экстракции и аффинной матрицы добавляют 1,5 мл этаноламина и оставхроматографии суммированы в следующей Табляют при 4°С на ночь, слегка встряхивал Промылице 2 Таблица 2 Результаты очистки ингибитора тромбина из Theromyzon tessulatum с помощью аффинной хроматографии Фракция Объем (мл) Время сгусткообразования (сек) Ингибирование тромбина(меж ед) пустая ацетон 34 20,5 59,4 0 33 не связанный экстракт после аффин Хромат промывка 1 34 24,3 1,8 1,1 24 20,2 1,6 1,0 элюат 1 аффин хромат элюат 2 аффин хроглат 4 600 25 0,2 4 22,1 0 0 Пример 4 Анализ активного ингибитора тромбина из Theromyzon tessulatum с помощью шощыэ гель-проникающей хроматографии Активное вещество помещают в колонку Вюgel P4 ("Biorad") объемом 25 мл Элюирование проводят 20 мМ Tns - HCI, 50 мМ NaCI с рН 7,4 со скоростью подачи реагентов 4 мл/час На антитромбиновую активность исследуют фракция объемом 1 мл Гель-матрица Р4 имеет предел разделения 5000 Да в позволяет проводить фракционирование в интервале молекулярных весов от 1000 до 5000 Да Неожиданно было обнаружено, что антитромбиновая активность элюируется во фракционируемый объем, т е очевидно имеет молекулярный вес меньше 5000 Да (Рис 2) Такое поведение отличается от гирудина (молекулярный вес 7000 Да), который в тех же условиях остается в отдельном объеме Путем калибрования колонки Р4 для антитромбинной активности из Theromyzon tessulatum был получен молекулярный вес приблизительно 3000 Да Пример 5 ЖХЕР с обращенной фазой ингибитора тромбина из Theromyzon tessulatum Активные элюаты после стадии аффинной Ингибирование фактора Ха(меж ед) 0 не определялось хроматографии по Примеру 3 далее анализируют методы ЖХЕР с обращенной фазой 20 мкл образца инжектируют в колонку ЖХЕР (Li Chrospher 300 RP-18, 5 микрон, "Е Morck", Дармштадт, Германия) и градионтно элюируют в следующих ацетонитрильных растворах со скоростью подачи реагентов 1,0 мл/мин Буфер А 0,1% трифторуксусной кислоты в воде* Буфер Б 0,08% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле Градиент 0-2 мин 10% Б, 2-3 мин инжекция, 3-28 мин 60% Б На Рис 3 показана типичная аналитическая хроматограмма, записанная на длине волны 220 нм Активность ингибитора тромбин обнаруживается в пиках обозначенных пик 2 и пик 4 Информацию, полученную с помощью аналитической ЖХЕР, используют для проведения препаративного разделения в тех же самых условиях* Препаративную очистку проводят, используя аликвоты 500 мкд После аффинной хроматографии (Рис 4) Отбирают индивидуальные пики, алюируют и упаривают на ротационном испарите 43831 16 15 ле Speed Vac Упаренные фракции вновь раствоингибитором по настоящему изобретению Подряют в воде и анализируют на антитромбиновую робности метода описаны в публикации G W/ активность в тесте по времени сгусткообразоваTameson et al Biochem T, 1973, Vol 131,pp 107ния, а также в хромогенном тесте, приведенном в 117 Примере 2 Если коротко, то в эксперименте по титрованию используют флуорогенный субстрат Tos-ClyНаибольшая активность в обеих системах обPro-Arg-AMC с концентрацией 50 мкМ Анализ наружена у пиков 2 и 4, некоторая активность обпроводят в 100 мМ Тг -HCI, 200 мМ NaCI, 0,05% наруживается в пике 5, что вероятнее всего свиЦЭГ 6000 с рН 7,8 при 25°С Титрованный альфадетельствует о загрязнении пика 5 соединением тромбин человека с концентрацией активных учапика 4 Все другие пики на хроматограмме вовсе стков 20 пМ выдерживают в инкубаторе и вместе с не проявляют антитромбиновой активности Сумингибитором при 0,2-5 х Ео в течение 10 минут и марная активность пиков 2 и 4 соответствует приопределяют постоянные скорости после добавлеблизительно 93% общей активности ния субстрата Кинетические константы рассчитыПример 6 Сравнение ингибитора тромбина по вают, используя программу нелинейного регреснастоящему изобретению с гирудином методами сивного анализа Gra Fit, Стейнз, Великобритания, ЖХЕР 1980) Найдено, что Ki составляет 178 фемтомоЧтобы привести дальнейшие доказательства лей того, что ингибитор по настоящему изобретению является молекулой, принципиально отличной от Молекулярный вес гирудина, проводят следующий эксперимент К Молекулярный вес активного пика 2 опредеактивному пику 2 после ЖХЕР в соответствии с ляют с помощью масс спектрометрии с лазерной Примером 5 добавляют аналогичную белковую десорбцией, используя метод MAL DI-TOF концентрацию очищенного гирудина и подвергают (Kratos) 0,5 мкл образца смешивают с небольшим смесь ЖХЕР с обращенной фазой в градиенте количеством дигидроксибензойной кислоты в ацеацето-нитрила (40-70%) Обнаружены два пика, тонитрил, которая служит матрицей Смесь высукоторые содержат антитромбиновую активность шивают холодным воздухом на поверхности се(Рис 5) С помощью сравнительных эксперименребряного прободержателя и помещают в прибор тов, в которых вводят индивидуальные ингибитоПолученный масс-спектр калибруют по стандартры, проводят отнесение пиков, как это показано на ным белкам с известным молекулярным весом Рис 5 Пик соответствует молекулярной массе около 9000 Да (Рис 7) Из Рис 5 очевидно, что антитромбин по настоящему изобретению элюируется совершенно отлично от гирудина То же самое может быть показано для активного пика 4 после разделения методом ЖХЕР по Примеру 5 Пример 7 Дальнейшее изучение пика 2 антитромбиновой активностью Чистота Элкированный активный пик 2 после ЖХЕР с обращенной фазой подвергают повторной хроматографии в тех же условиях, что и приведенные на Рис 3 Как показано на Рис 6, от основного активного пика может быть отделено небольшое количество примесного соединения, в итого после повторной ЖХЕР с обращенной фазой получают гомогенный препарат (см также Рис 8, на котором представлены данные капиллярного электрофореза указанной фракции) Ингибированного тромбина Пик 2 после ЖХЕР с обращенной фазой проявляют активность и в анализе на сгусткообразование (время тромбина > 600сек/5 мл) и в хромогенном антитромбиновом анализе по Примеру 2 Активность в последнем тосте составляет 3,2 межд ед /250 мкл Ингибированная активность фактора Ха, определяемая по Примеру 2 в пике 2 не обнаруживается, что свидетельствует о том, что максимальная анти-фактор Ха активность составляет « 1% от антитромбиновой активности На этом основании можно заключить, что описанный здесь ингибитор являются весьма специфичным по отношению ктромбину Титрование активных участков Константу ингибитора по отношению к тромбину определяют спектрофотометрическим титрованием стандартизированного раствора тромбина Изоэлектрофокусировка Изоэлектрическую точку ингибитора определяют методом капиллярного электрофореза в режиме изоэлектрофокусировки ("Applied Biosystems") Как видно из Рис 8, пик ингибитора появляется при значении 4,9, если сравнивать со стандартными белками Пример 8 Данные о последовательности пика 2 с антитромбиновой активностью Используя ЖХЕР с обращенной фазой (Пример 5), для пика 2 методом химического разложения по Эдману в белковом секвенвенторе фирмы "Beckman" получают следующую N-концевую последовательность Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys ProGlyGlu Пример 9 Дальнейшее изучение пика 4 с антитромбиновой активностью Частота Элкированный активный пик 4 после ЖХЕР с обращенной фазой подвергают повторной хроматографии в тех же условиях Как показано на Рис 9 от основного активного пика может быть отделено небольшое количество примесного соединения и в итоге после повторной ЖХЕР с обращенной фазой получают гомогенный препарат Ингибирование тромбина Пик 4 после ЖХЕР с обращенной фазой проявляет активность и в анализе на сгусткообразование (время тромбина >600 сек/5 мл) и в хромогенном антибромбиновом анализе по Примеру Активность в последнем тесте составляет 1,3 межд ед /250 мкл Ингибиторная активность фактора Ха, определяемая по Примеру 2, в пике 4 не обнаруживается, что свидетельствует о том, что 43831 18 17 максимальная анти-фактор Ха активность составПример 10 Данные о последовательности пиляв « 1 % от антитромбиновой активности На ка 4 с антитромбиновой активностью этом основании можно заключить, что описанный Используя ЖХЕР с обращенной фазой (Приздесь ингибитор является весьма специфичным мер 5), для пика 4 методом химического разложепо отношению ктромбину ния по Эдману в белковом секвенторе фирмы "Beckman" получают следующую N-концевую поТитрование активных участков следовательность Константу ингибитора по отношению к тромбину определяют спектрофотометрическим титроSer Glu Leu Gly Gin Ser Cys Lys Glu Asn Pro ванием стандартизированного раствора тромбина Cys Pro Sen Asn Met Lus Cys Asn Arg Glu Thn Phe ингибитором по настоящему изобретению ПодLys робности метода описаны в Примере 7 Найдено, Пример 11 что Ki составляет 240 фемтомолей Используя те же методики, что и приведенные в Примерах1-5, можно выделить антитромббиноМолекулярный вес вую активность из следующих видов Theromyzon, Молекулярный вес активного пика 4 определяют с помощью масс спектрометрии с лазерной Т bmannu latum, десорбцией, используя метод MALD I-TOF Т соореп, (Kratos), как описано в Примере 7 Полученный Т garjaewi, масс-спектр калибруют по стандартным белкам с Т macu losum, известным молекулярным весом Пик соответстТ sexocu latum вует молекулярной массе около 14 кДа (Рис 10) * =ан-итром6ииавэя активность СО=230ни Фиг. 1 • * * жангитромбинавэя активность OD=280HM Отделяемый объем Фиг. 2 Фиг. 4 5 19 20 43831 Фиг. 8 Фиг, 6 5000 Фиг. 7 1G0 00 ФЙГ 10 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 15000