Алелі 1-дезокси-d-ксилулозо-5-фосфатсинтази, відповідальні за посилений біосинтез терпенів

Реферат: Винахід належить до мутованого виділеного поліпептиду, що має підвищену активність DXS та стосується способу посилення активності поліпептиду 1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатсинтази (DXS) бактерій з метою збільшення продукування терпенів у клітинах, способу підвищення виробництва терпенів у клітині-хазяїні, що містить посилений фермент DXS, клітини-хазяїна, що експресують цей поліпептид. UA 112763 C2 (12) UA 112763 C2 UA 112763 C2 Передумови винаходу Область винаходу Даний винахід стосується нового поліпептиду, що має підвищену активність 1-дезокси-Dксилулозо-5-фосфатсинтази (DXS) у порівнянні збілками DXS типових рослин або бактерій. Цей поліпептид відповідає за значне накопичення терпенів у клітинах. Винахід стосується також трансгенних рослин, бактерій або дріжджів, які експресують цей поліпептид та допускають значне підвищення накопичення терпенів у порівнянні з рослинами, бактеріями або дріжджами, що експресують типовий ген DXS. Винахід також стосується способу виробництва терпенів за допомогою культивування трансгенних рослин, бактерій або дріжджів, що експресують цей поліпептид. Нарешті, винахід стосується трансгенних рослин, які експресують цей поліпептид і є стійкими до кломазону. Рівень техніки Ізопреноїди (також відомі як терпеноїди або терпени) вважаються найбільшим сімейством натуральних продуктів, що зустрічаються в природі, яке включає більш ніж 29000 індивідуальних сполук, ідентифікованих на сьогодні. Хімічно вони дуже різноманітні за своєю структурою й складністю. Ізопреноїди беруть участь у багатьох фундаментальних біологічних функціях і, отже, вони є необхідними для нормального росту й процесів розвитку усіх живих організмів. Так, наприклад, ізопреноїди включають стабілізатори еукаріотичних мембран (стероли), тваринні та рослинні гормони (стероїди, ретиноїди, гібереліни та абсцизову кислоту), пігменти для фотосинтезу (каротиноїди та фітол бічного ланцюга хлорофілу), і носії для транспорту електронів (менахінон, пластохінон і убіхінон). Отже, ізопреноїди є великою, різноманітною групою складних природних продуктів, зі значним комерційним інтересом.Зараз ізопреноїди в основному екстрагуються з рослин або хімічно синтезуються для використання як фармацевтичні препарати (наприклад, таксол, бісаболол і артемізинін), домішкиу корми тварин і харчові барвники (різні каротиноїди, такі як лікопен і бета-каротин) або приправи і ароматизатори (наприклад, ментол, пачулол і нуткатон). Ізопреноїди діляться на групи відповідно до числа атомів вуглецю, яківони містять; основними групами інтересу є монотерпени (C10), сесквітерпени (C15), дитерпени (C20) і тритерпени (C30). Усі ізопреноїди синтезуються через загальний метаболічний попередник, ізопентеніл дифосфат (IPP; C5). Раніше передбачалося, що IPP був синтезований винятково з мевалонату за допомогою так званого "мевалонатного шляху". Однак пізніші дослідження показали, що уеубактерій, зелених водоростей і рослин IPP також синтезується за рахунок іншого шляху, називаного 2-С-метил-D-еритритол-4-фосфатним шляхом (MEP). Таким чином, рослини мають як мевалонатний, такі MEP шляхи, відповідальні за біосинтез IPP у цитозолі та пластидах, відповідно. Першим інтермедіатом MEP шляху є 1-дезоксиксилулозо-5-фосфат (DXP), біосинтез якого від гліцеральдегід-3-фосфату (G3P) і пірувату каталізується тіамін-залежним ферментом 1дезоксиксилулозо-5-фосфатсинтазою (DXS). Було показано, що DXS каталізує швидкістьлімітуючий етап формуванняізопреноїдів у бактерій і рослин. Дійсно, в Arabidopsis thalianaі помідорах (Lycopersicon esculentum),надекспресія ДКФС приводить до підвищення рівня ізопреноїдів, таких як каротиноїди, які утворюються впластидах. Це також має місце в ароматичних рослинах, таких як колосся лаванди (Lavandula latifolia), де надлишкова експресія ДКФС приводить до істотного збільшення продукції масел. Терпеноїди є частиною ароматів і запахів багатьох рослинних продуктів, і, серед них, монотерпеноли, що вносять істотний внесок у профілі ароматів столового винограду та вин. Квіткові аромати, описані як аромати троянди або конвалії, пов'язані із присутністю таких молекул, як ліналоол, гераніол, нерол, альфа-терпінеол або цитронелол. Найвищі концентрації цих молекул виявляються в сортах групи "Мускату" або вГевюрцтрамінері (Gewurztraminer), що приводить до дуже характерного аромату у цих сортів. Квіткові аромати з'явилися спонтанно в генотипах, не пов'язаних із групою Мускату. Недоліки попереднього рівня техніки Деякі дитерпеноїди комерційно експлуатуються, особливо у фармацевтичному секторі. Це справедливо, зокрема, для дитерпеноїдів з класу таксанe, паклітакселу та доцетакселу, використовуваних у лікуванні рака молочної залози та рака яєчників. Паклітаксел є природньою молекулою, яку видобувають з тису (Taxus sp.), у той час як доцетаксел є напівсинтетичною молекулою, отримуваною з попередника паклітакселу, деацетил-бакатину 1 UA 112763 C2 III (або 10-DAB III), який також видобувають з тису. Були описані більшість біосинтетичних генів паклітакселуу тиса. Ці молекули є дорогими через відносно низьку поширеність 10-DAB III і, особливо, паклітакселу в екстрактах тису, а також, через відсутність синтетичного методу, який може бути масштабований до промислового масштабу, внаслідок складної структури молекул. Таким чином, існує високий попит на способи одержання терпенів, що представляють інтерес, з меншими витратами, а також на виробництво похідних терпенів, які ще важко синтезувати. Хімічна промисловість, що виробляє органічні молекули шляхом традиційних хімічних процесів, усе частіше звертається до виробничих процесів, у якихвикористовуються фабрики з мікробних клітин. Основні фактори такого розвитку зеленої хімії полягають в тому, що такітак звані "біотехнологічні процеси" є більш екологічно чистими, що багато сполук, продукованих мікроорганізмами, є занадто складними, щоб бути отриманими шляхом органічного синтезу, і що фабрики з мікробних клітинзабезпечують необмежене постачання конкретної сполуки. Заразізопреноїдивиробляються у великому масштабі шляхом екстракції з рослин або шляхом хімічного синтезу. Основними недоліками цих двох методів є низький вихід і висока вартість. Третім варіантом одержання потрібних ізопреноїдів є ферментативне перетворення in vitro, але цей підхід обмежений доступністю попередників і, отже, у більшості випадків є економічно невигідним. Метаболічна інженерія мікроорганізмів для виробництва ізопреноїдів може привести до виробництва більших кількостей ізопреноїдів у ферментативних процесах від дешевих джерел вуглецю, і тим самим розв'язати багато поточних роблем у промисловому виробництві ізопреноїдів, допускаючи при цьому біотехнологічне використання великої різноманітності групи ізопреноїдів, знайдених в природних сполуках. До числа ізопреноїдних продуктів, які вироблялися за допомогою генної інженерії мікроорганізмів, належать лимонен, каротиноїди, епі-кедрол, таксадієнта інші. З метою підвищення виробництва ізопреноїдів в E. coli, гени dxs (що кодують DXP синтазу), dxr (що кодують DXP редуктоізомеразу) та idi (IPP ізомеразу) були надекспресовані з гарними результатами для декількох з вищезгаданих ізопреноїдних продуктів (огляд в MAURY et al., 2005). Подальше збільшення виробництва аморфадієну в E. coli було отримано за рахунок експресії шляхумевалонату від Saccharomyces cerevisiae в аморфадієн-продукуючих штамах E. coli. Деякі ізопреноїдні сполуки були також отримані в дріжджах, у тому числі епі-кедрол в S. cerevisiae, лікопен і бета-каротин в S.cerevisiae і Candida utilis. У ряді випадків було показано, що виробництво ізопреноїдів у дріжджах може бути підвищене за рахунок надекспресії HMG1 (що кодує HMG-CoA-редуктазу) (огляд MAURY et al., 2005). Незважаючи на рівень техніки, описаний вище, як і раніше існує необхідність у подальших процесах виробництва терпенів та терпеноїдів і, зокрема, у способах накопичення терпенів в мікроорганізмах з більш високим виходом, менш дорогих і більш інтенсивних за часом, ніж раніше відомі способи. Тому предметом даного винаходу є створення способу одержання терпенів і терпеноїдів, який відповідає цим потребам. Основним предметом даного винаходу є одержання мікроорганізму, який накопичує та/або секретує велику кількість терпенів у навколишнє середовище. Краще, виробництво терпенів таким мікроорганізмом є стабільним у часі. Крім того, предметом даного винаходу є інженерія рослин з підвищеним виробництвом ізопреноїдів з метою очищення компонентів ізопреноїдів, як засіб підвищення живильної цінності харчових культур, або для підвищення пристосованості самих рослин шляхом збільшення резистентності до травоїдних тварин, шкідників або патогенів. Даний винахід спрямований на подолання цих та інших недоліків, властивих попередньому рівню техніки, що забезпечується трансгенними рослинами, бактеріями або дріжджами, які експресують один з цих двох генів, і здатні істотно підвищити накопичення терпенів, у порівнянні з рослинами, бактеріями або дріжджами, що експресують типовий ген dxs. Короткий опис фігур Фігури є частиноюданого опису та включені для додаткової демонстрації деяких аспектів даного винаходу. Винахід можна краще зрозуміти, використовуючи посилання на одну або декілька з цих фігур, у комбінації з докладним описом конкретних варіантів виконання, представлених у даному документі. Фіг. 1. Нуклеотидна послідовність кДНК, що відповідають різним алелям DXS в V. vinifera cv Muscat Ottonel (мускат отонель) (MO) (MODXS1, SEQ ID No 8, and MODXS2, SEQ ID No 9) і Gewurztraminer (гевюртцамінер) (Gw) (GWDXS2, SEQ ID No 10). Положення, що відповідають SNP (одиничним нуклеотидним замінам) позначені жирним шрифтом. 2 UA 112763 C2 Фіг. 2. Порівняннябілків, що відповідають різним DXS алелям у МО та Gw, з асоційованою консенсусною послідовністю, що відповідає SEQ ID No 2. Фіг. 3. Консенсусна послідовність (за якоюбула отримана послідовність SEQ ID No 1), яка є результуючою після порівняння білків DXS з різних видів рослин: Перший рядок: консенсус 2-й рядок: Mo_DXS1 3-й рядок: Mo_DXS2 4-й рядок: GW_DXS2 5-й рядок: Arabidopsis thaliana (резуховидка Таля) 6-й рядок: Capsicum annuum (перець овочевий) 7-й рядок: Catharanthus roseus (катарантус рожевий) 8-й рядок: Glycine max (соя культурна) 9-й рядок: Narcissus pseudonarcissus (нарцис несправжній) 10-й рядок: Nicotiana tabacum (тютюн звичайний) 11-й рядок: Oryza sativa (рис посівний) Фіг. 4. вмісттерпенолів (пул з 5 основних терпенолів: гераніолу, ліналолу, цитронелолу, неролу, альфа-терпінеолу) у шкірочці виноградних ягід і DXS генотип у потомстві Мускат Отонель (2003 і 2004 року) (1: Modxs1; 2: Modxs2). Фіг. 5. вмісттерпенолів (пул з 5 основних терпенолів: гераніолу, ліналолу, цитронелолу, неролу, альфа-терпінеолу) у виноградній ягідній шкірочці та DXS генотип у потомстві Гевюрцтрамінер (2004 і 2005 роки) (1: GwDXS1=Modxs1; і 2: GwDXS2). Фіг. 6. ГХ-МС (газово-хроматографічний мас-спектрометричний) аналіз терпенів, отриманих у листах тютюну, коекспресуючих DXS алелі з виноградної лози та гераніолсинтазу (GES) з базиліка. А: Аналіз тютюнових листів, коекспресуючих Modxs1 і GES. Б: Аналіз тютюнових листів, коекспресуючих Modxs2 і GES. Фіг. 7. Біосинтез гераніолу в рослинах після тимчасової коекспресії GES і DXS алелів у листі тютюну. Нетрансформоване листя тютюну (контроль), листя, що експресує саму лише GES, і листя, що коекспресує GES і DXS алелі, булопроаналізоване за допомогою ГХ-МС, через 4 дня після Agrobacterium-опосередкованої трансформації. Для кожного стану зазначені середні значення кількості гераніолу ( стандартні помилки) від 9 незалежних експериментів. Фіг. 8. Послідовність амінокислот MODXS1 (SEQ ID No 3), MODXS2 (SEQ ID No 4), усічена MODXS2 з активністю DXS (SEQ ID No 5) і GWDXS2 (SEQ ID No 6), усічена GWDXS2 з активністю DXS (SEQ ID No 7). Фіг. 9. Нуклеотидна послідовність дикого типу гена DXS з E.coli (Ecoli DXS), послідовність гена, що кодує усічену форму білка DXS (усічений Ecoli DXS), і послідовність генів, що кодують білок DXS, приховані мутації K213→N і R306→C (Ecoli DXS-K213N і Ecoli DXS-K234C, відповідно). Фіг. 10. Порівняння білків, що відповідають різним алелям DXS в V. vinifera cv Muscat Ottonel(Мускат Отонель) (MO) (MODXS1, SEQ ID No 8, і MODXS2, SEQ ID No 9) і Gewurztraminer (Гевюрцтрамінер) (Gw) (GWDXS2, SEQ ID No 10) з DXS білком E. coli (Lois et al., 1998). Амінокислоти, що відповідають SNP в MODXS2 і GWDXS2,та відповідні амінокислоти в DXS E.coli виділені жирним шрифтом. Фіг. 11 Аналіз методом електрофорезу наполіакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (SDS-PAGE) рекомбинантного DXS, експресованого у штамі Е.coli BL21-Gold(DE3)pLysS. Доріжка 1: маркер молекулярної маси. Доріжка 2: BL21-Gold(DE3)pLysS, трансформований плазмідою pHGWA-EcoliDXS. Доріжка 3: BL21-Gold(DE3)pLysS, трансформований плазмідоюpHGWA-TruncatedEcoliDXS. Доріжка 4: BL21-Gold(DE3)pLysS, трансформований плазмідами pHGWA-EcoliDXS-k213N. Доріжка 5: BL21-Gold(DE3)pLysS, трансформований плазмідами pHGWA-EcoliDXS-k234C. DXS експресія була індукована за допомогою 1 мМ IPTG протягом 24 год. при 28 °C. Стрілка вказує положення білка DXS, і зазначена молекулярна маса маркерів. Фіг. 12. Коробчаста діаграма, що показуєвміст монотерпенів у культуральному середовищіE.coli, трансформованої різними конструкціями DXS: EcoliDXS дикоготипу, усічений EcoliDXS, EcoliDXS-K213N, EcoliDXS-K234C. Вміст монотерпенівє сумою двох основних монотерпенів, накопичених у культурах E.coli: гераніолу та геранілацетату. Дані відповідають результатам 4 незалежних експериментів. Для кожної конструкції, жирні смуги є медіанами, межами коробів є 1-а та 4-а квартілі, і смуги ззовні від коробів вказують на крайні значення. Фіг. 13. Амінокислотна послідовність DXS з E.coli, E.coli DXS-K213N, E.coli DXS-K234C і усіченого E.coli DXS. 3 UA 112763 C2 Фіг. 14. Консенсус бактеріальної послідовності DXS (зазначені консервативні амінокислоти, точкипоказують неконсервативні амінокислоти). Амінокислоти, що відповідають K213 і K234 у білку DXS E.coli, заштриховані. Фіг. 15. Консенсус бактеріальних послідовностей DXS, включаючи Deinococcus radiodurans (зазначені консервативні амінокислоти, точки показують неконсервативні амінокислоти). Фіг. 16. Амінокислотна послідовність білків DXS зE.coli, Shigella dysenteriae, Citrobacter sp., Salmonella enterica, Enterobacter sp., Cronobacter sakazakii, Klebsiella pneumonia, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Erwinia sp., Pantoea ananatis, Dickeya dadantii, Pectobacterium atrosepticum, Xenorhabdus nematophila, Rahnella sp., Serratia odorifera і Deinococcus radiodurans. Фіг. 17. Консенсус послідовності DXS рослин (зазначені консервативні амінокислоти, точки показують неконсервативні амінокислоти). Амінокислоти, що відповідають K284 і R306 у білку DXS з V. vinifera, заштриховані. Фіг. 18. Амінокислотна послідовність білків DXS з Vitis vinifera, Arabidopsis thaliana, Pinus densiflora, Chlamydomonas reinhardtii і Dunaliella salina. Докладний опис винаходу. Перший предмет даного винаходу стосується способу посилення активності 1-дезокси-Dксилулозо-5-фосфатсинтази (DXS) рослин або бактерій з метою збільшення виробництва терпенів, який включає стадії: а) Визначення щонайменше одного сайту мутації, краще двох, на поліпептиді, що має активність DXS, з рослин або бактерій, шляхом проведення порівняння послідовностей між референсною послідовністю, вибраної з групи, що складається зSEQ ID No 2, SEQ ID No 4, SEQ ID No 6, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22 і SEQ ID No 23, і послідовністю зазначеної рослини або бактерії; б) Здійснення мутації щонайменше одного сайту мутації, краще, двох сайтів мутації; с) Одержання поліпептиду, що виявляє підвищену активність DXS у порівнянні з типовою DXS. Крок (а) визначення сайту мутації(мутацій) може бути зроблений шляхом проведення порівняння послідовностей. Послідовність рослини або бактерії для відключення може бути оптимально вирівняна з референсною послідовністю, вибраною з групи, що складається зSEQ ID No 2, SEQ ID No 4, SEQ ID No 6, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22 і SEQ ID No 23. Краще, референсна послідовність вибрана із групи, що складається зSEQ ID No 4, SEQ ID No 6, SEQ ID No 19 і SEQ ID No 20. Ще краще, SEQ ID No 4 або SEQ ID No 6 використовуються як референсні послідовності для визначення сайту мутації на рослинному поліпептиді, іSEQ ID No 19 або SEQ ID No 20 використовуються як референсні послідовності для визначення сайту мутації на бактеріальних поліпептидах. Так, наприклад, амінокислоти, що відповідають K284 і R306 в DXS з Vitis vinifera (європейського винограду), можуть бути ідентифіковані в білку DXS з іншого організму, використовуючи комп'ютерну програму для множинного порівняння послідовностей, таку як ClustalW (Thompson et al., 1994) або MUSCLE (Edgar, 2004). У даному документі, терміни "посилення активності DXS" і "посилена DXS" стосуються модифікованої DXS відповідно до даного винаходу, яка дозволяє збільшити виробництво та/абонакопичення терпенів у клітині-хазяїні, наприклад, у рослині, бактерії або дріжджах, трансформованих цією модифікованою DXS у порівнянні із клітиною-хазяїном, яка експресує типовий ген DXS. Вираз "типовий ген DXS", використовуваний в даному документі, позначає ген, що з'являється з високою частотою, наприклад, дикий тип DXS MoDXS1, також відомий як SEQ ID No 8. Як використовується в даному документі, термін "мутація" позначає будь-яку зміну послідовності вихідної послідовності нуклеїнової кислоти. Ці мутації включають дрібні мутації, або мутації великого масштабу. Дрібними мутаціями є ті, які стосуються одного або декількох нуклеотидів у гені, що включаютьточкові мутації, інсерції або делеції одного чи декількох додаткових нуклеотидів у ДНК. Точкові мутації можуть бути мовчазними, місенс-мутаціями та нонсенс-мутаціями. Мутації великого масштабу в геномній структурі, такі, як дуплікації генів, делеції або мутації, які суміщають раніше розділені фрагменти ДНК, потенційно поєднують окремі гени з утворенням функціонально одмінних злитих генів. Ці останні мутації включають хромосомні транслокації, інтерстиціальні делеції, хромосомні інверсії та втрату гетерозиготності. 4 UA 112763 C2 Краще ці мутації є точковими мутаціями. Точкові мутації є окремими замінами, делеціями або додаваннями, які змінюють, додають або видаляють одну амінокислоту або невеликий відсоток амінокислот (звичайно менше 5 %, більш типово, менше 4 %, 2 % або 1 % чи менше). Як використовується в даному документі, термін "сайт мутації" позначає локус полінуклеотиду, представлений одним або декількома нуклеотидами, який є об'єктом для мутації, як описано раніше. Способи здійснення зазначених мутацій добре відомі фахівцю в даній області техніки. Наприклад, сайт-спрямований мутагенез може бути виконаний з використанням набору QuikChange kit (Stratagene, La Jolla, CA). Способи сайт-спрямованого мутагенезу також були описані Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500. Як використовується в даному документі, вираз "збільшення виробництва терпенів»позначає, що кількість терпенів, отриманих та/або накопичених у клітині-хазяїні, наприклад, рослині, бактерії або дріжджах, трансформованих цієюмодифікованою DXS, є вищою, ніж кількість терпенів, отриманих та/або накопичених у клітині-хазяїні, що експресує типовий ген DXS. Краще, виробництво терпенів відповідно до даного винаходу збільшене вдесятеро. Наприклад, мутація K234→C, введена в полінуклеотид, що кодує фермент DXS E.coli, дозволяє збільшити виробництво терпенів щонайменше вдесятеро. Другий предмет даного винаходу стосується поліпептидурослини або бактерії, що має підвищену активність DXS у порівнянні з типовою DXSзазначеної рослини або бактерії, які можуть бути отримані способом заданим винаходом. Третій предмет даного винаходу стосується виділеного поліпептиду, що має активність DXS, який містить послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з послідовністю SEQ ID No 21 або з її фрагментами, у якій амінокислота в положенні 213 уSEQ ID No 21 є аспарагіном та/або амінокислота в положенні 234 в SEQ ID No 21 є цистеїном. SEQ ID No 21 є консенсусом бактеріальної послідовності DXS, включаючи Deinococcus radiodurans, який часто характеризується в літературі. У кращому варіанті виконання виділений поліпептид за даним винаходом має послідовність SEQ ID No 22 або її фрагментів, у якій амінокислота в положенні 213 в SEQ ID No 22 є аспарагіном та/або амінокислота в положенні 234 в SEQ ID No 22 є цистеїном. SEQ ID No 22 є консенсусом бактеріальної послідовності DXS, який відрізняється тим, що він схожий ізSEQ ID No 21, за винятком того, що він не включає послідовність DXS D. radiodurans. У ще кращому варіанті виконання поліпептид за даним винаходом містить послідовність SEQ ID No 19. У ще кращому варіанті виконання поліпептид за даним винаходом містить послідовність SEQ ID No 20. Четвертим предметом даного винаходу є виділений поліпептид, що має активність дезоксиd-ксилулозасинтази (DXS), який містить послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з послідовністю SEQ ID No 1 або з її фрагментами, де амінокислота в положенні 310 SEQ ID No 1 є цистеїномта/або амінокислота в положенні 288 в SEQ ID No 1 є аспарагіном. Як використовується в даному документі, терміни "амінокислота" та "амінокислоти" стосуютьсяусіх природних L-α-амінокислот або їх залишків. Амінокислоти позначені або однієюлітерою або трьохлітерним позначенням (Asp, D - аспарагінова кислота; Ile, I - ізолейцин; Thr, T - треонін; Leu, L - лейцин, Ser, S - серин; Tyr, Y - тирозин; Glu, E - глутамінова кислота, Phe, F - фенілаланін; Pro, P - пролін; His, H - гістидин; Gly, G - гліцин; Lys, K - лізин; Ala, A аланін, Arg, R - аргінін; Cys, C- цистеїн; Trp, W - триптофан, Val, V - валін; Gln, Q - глутамін; Met, M - метіонін; Asn, N - аспарагін). Слід також розуміти, що природні амінокислоти можуть бути також замінені хімічно модифікованими амінокислотами. Як правило, такі хімічно модифіковані амінокислоти дозволяють збільшувати період напіврозпаду поліпептиду. Термін "1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатсинтаза" (скорочено "DXS"), використовуваний у даному документі, означає фермент, здатний каталізувати транскетолазний тип конденсації, до якого залучені піруват і гліцеральдегід-3-фосфат (GAP) з утворенням1-дезокси-D-ксилулозо-5фосфату. Зазначена ферментативна активність може бути легко визначена з використанням радіоактивно-міченого субстрату, як описано Lois et al. (1998). Ферментативна реакційна суміш складається з 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 2,5 мМ MgCl2, 1 мМ тіаміну дифосфату, 5 мМ 2меркаптоетанолу, 0,2 мМ[2-14С]пірувату(15,9 мКі/ммоль, NEN), 50 мМ пірувату, 50 мМ 5 UA 112763 C2 гліцеральдегід-3-фосфату в кінцевому об'ємі 50 мкл. Після інкубації протягом 2 год. при 37 °C реакцію зупиняють нагріванням до 80 °C протягом 3 хв. Після центрифугування при 13000×g протягом 5 хв, 10 мкл супернатанта (2-5 мл) наносять на TLC-пластинку (силікагель 60, Merck). Мічений D-1-дезоксиксилулозо-5-фосфат відокремлюють від [2-14С]пірувату з використанням як розчинника н-пропілового спирту/етилацетату/H2O (6:1:3) і підраховують за допомогою авторадіографії або сцинтиляційного лічильника. Альтернативно може бути використаний флуориметричний аналіз 1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатсинтази, як описано Querol et al. (2001). Краще, виділений поліпептид згідно з даним винаходом містить послідовність, що має щонайменше 90 % ідентичності з амінокислотною послідовністю SEQ ID No 2 або її фрагментами, у якій амінокислота в положенні 306 в SEQ ID No 2 є цистеїномта/або амінокислота в положенні 284 в SEQ ID No 2 є аспарагіном. Також краще, поліпептид згідно з даним винаходом має ферментативну активність, яка щонайменше на 50 % вище у порівнянні з поліпептидом SEQ ID No 3, краще, щонайменше на 70 %, і найкраще, щонайменше на 100 % вище у порівнянні з SEQ ID No 3. У ще кращому варіанті виконання поліпептид за даним винаходом містить послідовність SEQ ID No 4. У ще кращому варіанті виконання поліпептид за даним винаходом містить послідовність SEQ ID No 6. Використовуваний у даному документі термін "відсоток ідентичності" двох амінокислотних послідовностей означає відсоток ідентичних амінокислот між двома порівнюваними послідовностями, отриманий при кращому вирівнюванні зазначених послідовностей, причому цей відсоток є чисто статистичним і відмінності між цими двома послідовностями випадково розподілені по амінокислотним послідовностям. Використовуваний у даному документі термін "краще вирівнювання" або "оптимальне вирівнювання" означає вирівнювання, для якого визначений відсоток ідентичності (див. нижче) є найвищим.Порівняння послідовностей міждвома амінокислотними послідовностями звичайно реалізується шляхом порівняння цих послідовностей, які раніше були вирівняні відповідно до кращого вирівнювання; це порівняння здійснюється на сегментах порівняння для визначення та порівняння локальних областей подібності. Краще вирівнювання послідовностей для виконання порівняння може бути зробленевручну, використовуючи алгоритм глобальної гомології, розроблений SMITH і WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), використовуючи алгоритм локальної гомології, розроблений NEDDLEMAN і WUNSCH (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), за допомогою методу подібності, розробленого PEARSON і LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), використовуючи комп'ютерне програмне забезпечення з використанням таких алгоритмів (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA у програмному забезпеченні Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), використовуючи множинні алгоритми вирівнювання MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Щоб одержати нійкраще локальне вирівнювання, краще можна використовувати програмне забезпечення BLAST, з матрицею BLOSUM 62 або з матрицею PAM 30. Відсоток ідентичності між двома послідовностями амінокислот визначається шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей, причому амінокислотні послідовності можуть включати додавання або делеціїпорівняно з референсною послідовністю, з метою одержання оптимального вирівнювання цих двох послідовностей. Відсоток ідентичності розраховують шляхом визначення кількості ідентичних положення між цими двома послідовностями, ділення цього числа на загальну кількість зрівняних позицій і множення отриманого результату на 100, щоб одержати відсоток ідентичності між двома послідовностями. Відповідно до кращого варіанта виконання поліпептид згідно з даним винаходом має ідентичність щонайменше 95 %, краще, щонайменше 99 %, і найкраще 100 %, з амінокислотними послідовностями SEQ ID No 1 або SEQ ID No 2. Як використовується в даному документі, фрагменти SEQ ID No 1 або SEQ ID No 2 позначають поліпептиди, що мають довжину щонайменше 300 амінокислот, краще, мають довжину щонайменше 400 амінокислот, ще краще, мають довжину щонайменше 500 амінокислот. Як приклад фрагментаSEQ ID No 1 або SEQ ID No 2 з активністю DXS можнаназвати SEQ ID No 5, що відповідає усіченому поліпептиду MODXS2, або SEQ ID No 7, що відповідає усіченому поліпептиду GWDXS2. Як приклад, консенсусом послідовності рослинної DXS є SEQ ID No 23. Вона включає послідовність DXS V. vinifera (Mo_DXS1) та послідовність DXS A. thaliana, P. densiflora, C. reinhardtii і D. salina. 6 UA 112763 C2 П'ятий предмет даного винаходу стосується ізольованого полінуклеотиду, що кодує поліпептид відповідно до даного винаходу. Полінуклеотид за даним винаходом може мати форму РНК або форму ДНК, краще, форму ДНК. ДНК може бути дволанцюговою або одноланцюговою. Відповідно до кращого варіанта виконання полінуклеотид включає послідовність, вибрану з групи, що складається зSEQ ID No 9 (MODXS2), SEQ ID No 10 (GWDXS2), SEQ ID No 15 (E.coli DXS-K213N) і SEQ ID №16 (E.coli DXS-K234C). Шостий предмет даного винаходу стосується вектора, який містить полінуклеотид згідно з даним винаходом. Зазначений вектор може бути вектором для клонування або експресійним вектором, краще, експресійним вектором, і може мати, наприклад, формуплазміди, космуди, фагміди, вірусної частинки, фага і т.д. Такі вектори можуть включати бактеріальні плазміди, ДНК фага, бакуловірус, плазміди дріжджів, вектори, отримані з комбінації плазміди та фагової ДНК, вірусну ДНК, таку як коров'ячої віспи, аденовірусу, вірусу віспи птахів і псевдосказу. Велика кількість придатних векторів відома фахівцям у даній області техніки і є комерційно доступними. Наступні вектори наведені як приклад. Бактеріальні: pQE70, pQE60, pQE-9 (QIAGEN), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (STRATAGENE), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (PHARMACIA). Еукаріотичні: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (STRATAGENE), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (PHARMACIA). Проте, будь-який інший вектор може бути використаний за умови, що він реплікується та є життєздатним у хазяїні. Полінуклеотидна послідовність, краще, послідовність ДНК в експресійному векторі, функціонально зв'язана з відповідною контрольною послідовністю (промотором) для прямого синтезу мРНК. Як репрезентативні приклади таких промоторів можна згадати прокаріотичні або еукаріотичні промотори, такі як ранній промотор CMV, тимідинкіназа HSV, ранній і пізній SV40, LTR від ретровірусів і мишачий металотіонеїн-I. Експресійний вектор містить також сайт зв'язування рибосом для ініціації трансляції та транскрипційний вектор. Вектор також може включати відповідні послідовності для посилення експресії. Крім того, експресійні вектори краще містять один чи декілька маркерних генів для селекції, щоб забезпечити фенотипову ознаку для відбору трансформованих клітин-хазяїв, таких як дигідрофолатредуктаза або стійкість до неоміцину для еукаріотичної клітинної культури, або таких як стійкість до тетрацикліну чи ампіциліну в E.coli. Вектор за даним винаходом, що містить відповідну полінуклеотидну послідовність, як описано в даному документі вище, а також відповідний промотор або контрольну послідовність, може бути використаний для трансформації придатного хазяїна, щоб дати можливістьклітиніхазяїнуекспресувати поліпептид. Як приклад, транскрипція ДНК, що кодує поліпептид, описаний раніше, вищими еукаріотами може бути збільшена шляхом вставки послідовності енхансера у вектор. Енхансериє цисдіючими елементами ДНК, звичайно приблизно від 10 до 300 п.о. (pb), які діють на промотор, щоб збільшити його транскрипцію. Приклади енхансера включають енхансер SV40, енхансер раннього промоторуCMV та енхансери аденовірусу. Сьомий предмет даного винаходу стосується трансформованої клітини-хазяїна, що містить полінуклеотид або вектор, описаний вище. Терміни "трансформована клітина-хазяїн", "трансформований" і "трансформація" стосуються введення ДНК у клітку. Клітину називають "клітина-хазяїн", і це може бути прокаріотична або еукаріотична клітина. Типовими прокаріотичними клітинами-хазяями є різні штами E.coli. Типовими еукаріотичними клітинами-хазяями є клітини рослин, таких як кукурудза, дріжджові клітини, клітини комах або клітини тварин. Вибір придатного хазяїна робиться фахівцем у даній області техніки на основі опису, наведеного в даному документі. Трансформована клітина-хазяїн відповідно до даного винаходу є прокаріотичною або еукаріотичноюклітиною. Введення полінуклеотиду або вектора, описаних раніше, у клітинухазяїна може бути здійснене способом, добре відомим фахівцю в даній області, таким як кальцій-фосфатна трансфекція, DEAE-декстран опосередкована трансфекція або електропорація. Відповідно до кращого варіанта виконання клітина-хазяїн, що трансформується, відповідно до даного винаходу, є прокаріотичноюклітиною, вибраною з групи, що включаєеубактеріальні, архебактеріальні та ціано-бактеріальні клітини. Ще краще, трансформована клітина-хазяїн відповідно до даного винаходу є прокаріотичною клітиною, інавіть ще кращеєклітиноюEscherichia coli. 7 UA 112763 C2 Прокаріоти можуть бути також використані якклітини-хазяї для початкової стадії клонування за даним винаходом. Вони особливо корисні для швидкого виробництва великих кількостей ДНК, для одержання одноланцюговоїДНК-матриці, використовуваної для сайт-спрямованого мутагенезу, для одночасного скринінгувеликої кількості мутантів, і для секвенування ДНК отриманих мутантів. Придатними прокаріотичними клітинами-хазяями є E. coli K12 штам 94 (ATCC No. 31446), E. coli штам W3110 (ATCC No. 27325) E. coli X1776 (ATCC No. 31537) і E. coli B; однак, велике число інших штамів E. coli, таких як HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, і багато інших видів і родів прокаріот, у тому числі бацили, такі як Bacillus subtilis, інші ентеробактерії, такі як Salmonella typhimurium або Serratia marcesans, а також різні види Pseudomonas, можуть бути використані як хазяї. Відповідно до іншого кращого варіанта виконання трансформована клітина-хазяїн відповідно до даного винаходу є еукаріотичною клітиною, вибраною з групи, що включає тваринні, грибкові, дріжджові та рослинні клітини. Краще, еукаріотична клітина є грибковим мікроорганізмом, зокрема, дріжджами. Неповний перелік придатних мікроорганізмів буде включати таке: види, що належать до роду Saccharomyces – наприклад, S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, S. paradoxus, S. exiguous, S. servazzi, S. uvarum, S. kluyveri і S. castellii, види, що належать до роду Kluyveromyces - наприклад, K. lactis, K marxianus var. marxianus, K. thermotolorens, K. waltii, K. delphensis, K. nonfermentas і K. Wickerhamii, види, що належать до роду Candida - наприклад, C. utilis, C. tropicalis, C. castellii, і C. humilis, види, що належать до роду Zygosaccharomyces наприклад, Z. rouxii, Z. bailii, Z. fermentati, Z. bisporus і Z. florentinus, види, що належать до роду Pichia - наприклад, P. stipidis, P. pastoris, P. sorbithophila і P. anomala, або інші види - наприклад, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Debaromyces hansenii, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbueckii, Ashbya gossipie, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Penecillium chrysogenum, Rhizopus oryzae і Mucor circenelloides. Ще краще, еукаріотична клітина є дріжджовою, інавіть ще краще, щоб мікроорганізм був Saccharomyces cerevisiae. Наприклад, це штам S.cerevisiae, депонований в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh.) Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany, номер у каталозі: DSMZ 17900,27 січня 2006. Гетерологічним шляхом, для досягнення мети даного винаходу, є шлях, який в результаті своєї активності приводить до утворення сполук за допомогою певних проміжних стадій, з певних вихідних матеріалів, і є відсутнім у дикому типі даного мікроорганізму. Ще краще, коли гетерологічним шляхом є шлях, отриманий із ДНК різних видів. Альтернативно, еукаріотичною клітиною є клітина рослини, ще краще, рослинна клітина, вибрана з групи, що включаєклітиниVitis vinifera, Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana, іще краще, зазначена рослинна клітинаєклітиноюVitis vinifera, ще краще, клітиноюVitis viniferaCv Muscat Ottonel або Vitis viniferaCv Gewurztraminer, і найкраще, клітиноюVitis viniferaCv Gewurztraminer. Восьмий предмет даного винаходу стосується трансгенної бактерії, що містить полінуклеотид або вектор, описаний вище. Дев'ятий предмет даного винаходу стосується трансгенної рослини, що містить полінуклеотид, вектор або клітину-хазяїна, описані раніше. Трансформація культивованих рослинних клітин-хазяїв, як правило, здійснюється через Agrobacterium tumifaciens. Таким чином, трансгенні рослини можуть бути отримані, наприклад, шляхом трансформації вектора за даним винаходом (наприклад, кодуючого 1-деоксиксилулозо5-фосфатсинтазу) і ген селективного маркера (наприклад, ген kan, що кодує стійкість до канаміцину) в Agrobacterium tumifaciens, що містить хелперну Ti плазміду, як описано в HOECKEMA et al. (Nature, 303:179-181, 1983), і культивування клітинAgrobacterium зі зрізами листів або іншими тканинами чиклітинами рослини, що мають бути трансформовані, як описано в AN et al. (Plant Physiology, 81:301-305, 1986). Проте, можуть бути використані інші способи введення ДНК у клітини, такі як полібрен (Kawai and Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:1172 [1984]), злиття протопластів (Schaffner, Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 77:2163 [1980]), електропорація (Neumannet al., EMBOJ., 1:841 [1982]) і пряма мікроін'єкція в ядро (Capecchi, Cell, 22:479 [1980]). Трансформовані рослинні калюси можуть бути вибрані за допомогою селективного маркера шляхом вирощування клітин на середовищі, що містить, наприклад, канаміцинта відповідну кількість фітогормонів, таких як нафталіноцтова кислота та бензиладенін для індукції калюсу та паростків. Потім рослинні клітини можуть бути регенеровані і отримані рослини перенесені в ґрунт із використанням методик, добре відомих фахівцям у даній області. Відповідно до кращого варіанта виконання трансгеннарослиназа даним винаходом включає в геном полінуклеотид або вектор, як описано вище. 8 UA 112763 C2 Краще, зазначену рослину вибирають із групи, що включає дерева, овочі, сукуленти та декоративні рослини. Проте краще, коли трансгеннарослина є стійкою до кломазону, також називаному диметазон (FMC 57020; 2-(2-хлорфеніл)метил-4,4-диметил-3-ізоксалідинон). Використовуваний тут термін трансгенна рослина, щоє стійкою до кломазону, означає рослину, яка росте в присутності 10 мкM кломазону (Carretero-Paulet L, Cairó A, Botella-Pavía P, Besumbes O, Campos N, Boronat A, Rodríguez-Concepción M. (2006). Enhanced flux through the methylerythritol 4-phosphate pathway in Arabidopsis plants overexpressing deoxyxylulose 5-phosphate reductoisomerase. Plant Mol Biol 62: 683-95). Також краще зазначена трансгенна рослина має посилений аромат. Як приклад, зазначена трансгенна рослина вибрана з групи, що включає Lamiaceae (ясноткові)(наприклад, Ocimum (базилік), Lavandula (лаванда), Origanum (орегано), Mentha (м'ята), Salvia (шавлія), Rosmecinus (розмарин), Thymus (чебрець), Satureja (чабер) і Monarda (монарда); Umbelliferae (зонтичні)(наприклад, Carum (кмин), Anethum (кріп), Feniculum (фенхель) і Daucus (морква)); Asteraceae (астрових) (складноцвіті) (наприклад, Artemisia (естрагон, полин) і Tanacetum (пижмо)); Rutaceae (рутові) (наприклад, цитрусові рослини), Rosaceae (розоцвіті) (наприклад, троянди); Myrtaceae (миртові) (наприклад, евкаліпт, Melaleuca (чайне дерево)), Gramineae (злаки) (наприклад, Cymbopogon (цимбопогон) (цитронелла)); Geranaceae(геранієві) (Geranium (герань)) і деяких хвойних дерев, у тому числі Abies (ялиця) (наприклад, Canadian balsam (канадський бальзам)), Cedrus (кедр), Thuja (туя) і Juniperus (ялівець). Десятий об'єкт даного винаходу стосується потомства будь-якої генерації трансгенних рослин за даним винаходом, де зазначене потомство містить поліпептид, полінуклеотид, вектор або клітини-хазяї, описані раніше. Зазначене потомство може мати форму рослини або насіння. Одинадцятий об'єкт даного винаходу стосується способу одержання трансгенної рослини, як описано вище, що включає стадії: а. трансформацію рослинної клітини вектором, як описано вище; б. вибір трансформованої рослинної клітини, яка експресірует поліпептид, як описано вище, і в. вирощування трансгенної рослини із зазначеної трансформованої рослинної клітини. Стадія (а) трансформації може бути здійснена за допомогою добре відомих методів, як описано вище, таких як електропорація, трансфекція, поглинання голої ДНК, вирощування протопласта, прямий перенос ДНК у пилок, ембріональні чи плюрипотентні клітини рослини, Agrobacterium-опосередкована трансформація, бомбардування частинками або бомбардування мікрочастинками. Стадія (б) вибору може бути здійснена за допомогою добре відомих методів. Стадія (в) вирощування кломазон-стійкої трансгенної рослини із зазначеної трансформованої рослинної клітини може бути здійснена за допомогою добре відомих методів, таких як вирощування плюрипотентних клітин рослин від зазначеної трансформованої рослинної клітини. Відповідно до кращого варіанта виконання зазначений спосіб використовується для одержання насіння рослин, де зазначений спосіб додатково включає стадію: г. одержання насіннявід зазначеної трансгенної рослини. Відповідно до конкретного варіанта виконання спосіб за даним винаходом є способом одержання трансгенної рослини, стійкої до кломазону. Краще, зазначену трансгенну рослину одержують добре відомими способами, такими як описані в Klee H, Horsch R, Rogers S (1987) Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its Further Applications to Plant Biology. Annual Review of Plant Physiology 38, 467-486,та Potrykus I (1991) Gene Transfer to Plants: Assessment of Published Approaches and Results. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42, 205-225. Відповідно до іншого варіанта виконання спосіб за винаходом є способом одержання трансгенної рослини, яка має збільшені можливості біосинтезу терпенів. Рослина з підвищеними можливостями біосинтезу терпенів буде синтезувати щонайменше на 50 % більше терпенів у порівнянні з диким типом зазначеної трансгенної рослини, краще, щонайменше на 70 %, ще краще, щонайменше на 100 %. Краще, до терпенів належать гераніол, ліналол, цитронелол, нерол і альфа-терпінеол. Краще, поліпептид за даним винаходом має ферментативну активність, яка щонайменше на 50 % вище у порівнянні з поліпептидом SEQ ID No 3, краще, щонайменшена 70 %, і найкраще, щонайменше на 100 % вище у порівнянні з SEQ ID No 3. Зазначені рослини, що мають можливості біосинтезутерпенів, можуть бути ароматичними рослинами, як, наприклад, Mentha piperita, Lavandula latifolia або Rosmarinus officinalis, і 9 UA 112763 C2 лікарськими рослинами, як, наприклад, Artemisia annua, Taxus baccata, Catharanthus roseus або Lithospermum erythrorhizon, а також будь-якими видами рослин, що продукуютьцінні сполуки терпенів, як, наприклад, рослини, які продукують каротиноїди, такі як Lycopersicon esculentum, Manihot esculenta або Oryza sativa. Краще, зазначену трансгенну рослину вибирають добре відомими способами, такими, як описані в Klee et al. (1987) і Potrykus (1991). Дванадцятий предмет даного винаходу стосується способу одержання посиленого ферменту DXS, що збільшує виробництво терпенів у рослинах, бактеріях або дріжджах, який включає такі стадії: а. Культивування трансформованої клітини-хазяїна, як описано вище; б. Одержання посилення ферменту DXS, який дозволяє збільшити виробництво терпенів у рослинах або бактеріях. Краще, поліпептид, що виявляє підвищену активність DXS, може бути отриманий у спосіб, описаний раніше. Тринадцятий предмет даного винаходу стосується способу виробництва терпенів у клітиніхазяїні, який включає стадії: а. Культивування трансформованої клітини-хазяїна, як визначено вище, в умовах, ефективних для одержання терпенів (наприклад, рослин, бактерій або дріжджових клітин), як описано раніше, в умовах, ефективних для одержання більшої кількості субстрату терпенів (монотерпенів, дитерпенів, тритерпенівта/або політерпенів) за допомогою ферменту DXS2, причому зазначене одержання великої кількості субстрату терпенів приводить до виробництва великої кількості терпенів шляхом ферментативної модифікації субстратів терпенів. б. Одержання зазначених терпенів із зазначеної клітини-хазяїна. Терпен є насиченим або ненасиченим, необов'язково із заміщеноювуглеводневою основою, або складається по суті з ізопренових ланок (C5). Терпени можуть бути циклічними або ациклічними. Терпени, використовувані в даному документі, включають терпени, терпенові похідні та сполуки, що належать до терпеноїдів, які можуть входити до одного з вищеописаних класів сполук чи ні. Терпенові похідні включають сполуки, які пройшли одну або більш стадій функціоналізації, таких, наприклад, як гідроксилування, ізомеризація, окиснення-відновлення або ацилування. Краще, для цілей даного винаходу, терпен єсполукою, що відповідає цій умові, та/абоу якій вуглецевий кістяк походить, принаймні частково, але краще повністю, з MEP та/або MEV шляху. Відповідно, терпени включає терпенові спирти, наприклад, сполуки C15H26O і C10H18O, такі як пачулол, епі-кедрол, кубебол, ліналоол, неролідол, наприклад, і диспирти (дитерпенові спирти), наприклад, склареол. Терпени також включають дифосфатні сполуки, такі як борніл-дифосфат (монотерпен) і копаліл-дифосфат (дитерпен), і це лише кілька зразків величезної категорії терпенів. Використовуваний у даному документі термін "похідне" стосується будь-якої сполуки, яку одержують з відомих або передбачуваних сполук, і якавключає основні елементи вихідної речовини. Наприклад, терпени є сполуками, що мають вуглецевий кістяк з C10, C15, C20, C30, C40, C45 і так далі. Відповідно, термін "терпен" включає моно-, сескві-, ди-, три-, тетра-та/або політерпени. Краще, зазначені терпени включають гераніол, ліналол, цитронелол, нерол і альфатерпінеол. Відповідно до кращого варіанта виконання мікроорганізм за даним винаходом забезпечує вихід щонайменше 30 мкг, ще краще, щонайменше 100 мкг терпенів на 1 г свіжої маси мікроорганізму. Вихід терпенів з мікроорганізму, краще встановлений протоколом у прикладі 2. Терпени можуть накопичуватися в клітинах. Наприклад, вони можуть накопичуватися в цитоплазмі, у мітохондріях, клітинних мембранах або інших органелах клітини. Багато терпенів є ліпофільними сполуками, які накопичуються в плазматичній мембрані клітини. Для цілей даного винаходу термін "накопиченняв середовищі" також охоплює накопичення в розчиннику протягом двофазного процесу ферментації. Спосіб включає етап культивування трансформованої клітини-хазяїна в умовах, придатних для одержання зазначеного терпену. Ці умови відомі фахівцяму даній області техніки. Як правило, вони можуть бути скориговані шляхом добору адекватного середовища, посудини для ферментації, температури та рН. Спосіб одержання терпенів може включати етап виділення терпенів із середовища, клітинта/або органічного розчинника, у випадку, якщо виконується двофазна ферментація. Терпени можуть бути виділені будь-яким способом, використовуваним у даній області, включаючи, без обмежень, наприклад, хроматографію, екстракцію та дистиляцію. 10 UA 112763 C2 Фахівцю в даній області техніки добре відомо, що, наприклад, монотерпени звичайно утворюються у пластидах, і сесквітерпени в цитозолі. На відміну від рослин, мікробні системи, у яких велика кількість різних модифікацій можуть бути порівняні та об'єднані, є більш придатними для великомасштабних технологічних проектів. Однак мікроби мають деякі технічні недоліки порівняно з рослинами, особливо у випадку експресії гетерологічних генів. Чотирнадцятий предмет даного винаходу стосується способу вибору ароматичних рослин, який включає стадії: а. Визначення щонайменше однієї мутації в DXS, яка приводить до алельних змін DXS з підвищеним синтезом терпенів, та/або аналіз накопичення терпенів у біологічному зразку від зазначеної рослини. б. Вибір рослин, що містять зазначені мутації. П'ятнадцятий предмет даного винаходу стосується способу одержання ферменту DXS, що є більш стійким до кломазону, який включає стадії: а. Культивування трансформованої клітини-хазяїна, як описано вище; б. Одержання ферменту DXS, що є більш стійким до кломазону, із клітинного екстракту, суспензії клітин, білкової фракції, кристалічної фракції, культури клітин, клітинного гомогенату, клітинного лізату, супернатантуклітин, клітинного фільтрату або клітинного осаду із зазначеної трансформованої клітини-хазяїна. Наступні приклади включені для демонстрації кращих варіантів виконання винаходу. Фахівцям у даній області техніки має бути зрозуміло, що методики, описані в наступних прикладах, є добре придатними до застосування у практиці даного винаходу, як було знайдено автором даного винаходу і, отже, можуть розглядатися як кращий спосіб його здійснення. Приклади 1) Клонування кДНК з DXS Vitis vinifera (європейського винограду) сорту Мускат Отонель і Gewurztraminer (Гевюрцтрамінер). кДНК DXS із Vitis viniferaсорту Мускат Отонель (MO) і Gewurztraminer (Gw) були ампліфіковані за допомогою ЗТ-ПЦР і клоновані. Секвенуванняцих клонів показало, щоМОіGw є гетерозиготами по локусу DXS. MO і Gw містять одну й ту саме алель, позначенуMoDXS1 (Фіг. 1). Крім того, МО та Gw мають MoDXS2 і GwDXS2 алелі, відповідно. MoDXS2 і GwDXS2 алелі відрізняються від MoDXS1 на 2 і 1 SNP, відповідно, які модифікують амінокислотні послідовності відповідних білків (Фіг. 2). K284→N і R306→C мутації (стосовно SEQ ID No 2), характерні для MoDXS2 і GwDXS2, відповідно, впливають на амінокислоти, які зберігаються у всіх послідовностей рослинних DXS, доступних у базах даних (Фіг. 3). Крім того, амінокислоти K284 і R306 належать до активного центру ферменту (Xiang et al., 2007), що вказує, що вони можуть модифікувати активність MoDXS2 і GwDXS2 алелів у порівнянні з MoDXS1. 2) Вплив MoDXS2 і GwDXS2 алелів на вміст терпенів у виноградних ягодах Матеріали та методи: виділення вільних та зв'язаних монотерпенолів шляхом твердофазної екстракції (ТФЕ) Для кожної точки відбору проб, були виконані три повтори аналізу терпенів. Для кожного повтору було використано щонайменше 25 ягід. Насіння було видалене ішкірочки відділені від мезокарпа. Після зважування, шкірочки були здрібнені в рідкому азоті, а потім суспендовані в 40 мл води, після додавання 40 мг сульфіту натрію. Супернатант, отриманий після 15 хв центрифугування (11400×g при 4 °C), пропускали через скловолоконний фільтр попереднього очищення та через скляний фільтр. Додають 20 мікролітрів розчину 4-нонанолу 1 г/л як зовнішній стандарт для кількісного визначення основних терпенів. Екстракція терпенів була адаптована з Mateo et al. (1997), замість метанолу був використаний етанол. Фільтрат пропускали через колонку для SPE (твердофазної екстракції) з 1 г неполярної C18 діоксид кремнію-зв'язаної фази (BOND ELUT JR.), попередньо промитої 5 мл метанолу та 15 мл особливо чистої води, зі швидкістю приблизно одна крапля/с. Потім зразок був розділений на дві рівні підвибірки - одна для аналізу вільних і глікозидно-зв'язаних монотерпенолів і одна для аналізу вільних терпенолів. Усі фракції вільних і зв'язаних монотерпенолівелюювали з 4 мл абсолютного етанолу. Цю загальну кількість екстракту терпенолів розбавляли в 40 мл цитрат/фосфатного буфера (рН 4,5) і отриманий розчин інкубували з 50 мг AR2000 гліколітичних ферментів (Gist-Brocades, Seclin, France) протягом ночі при 37,5 °C, щоб звільнити глікозидно-зв'язані терпеноли (Tamborra et al. 2004). Вивільненітерпеноли розділяли за допомогою SPE на колонці C18 таелюювали з 4 мл дихлорметану після промивання водою3×5 мл. Етап гідролізу не проводився для аналізу вільних терпенолів, і терпеноли безпосередньо елюювали дихлорметаном після промивання водою. Екстракти сушили в піпетках Пастера, заповнених 0,5 г безводного сульфіту натрію, і концентрували до 500 мкл у слабкому тоці азоту. 11 UA 112763 C2 До кожного зразка як внутрішній контроль додавалидвадцять мікролітрів розчину м-крезолу 1 г/л. Зразки зберігали при -20 °C до газово-хроматографічного (ГХ) аналізу. Результати: Приклад 2 показує, що DXS алелі мають великий вплив на вміст терпенолу у виноградних ягодах, що показали дослідження вмісту терпенолу залежно від DXS алелів у потомстві МО (Фіг. 4) та Gw (Фіг. 5). MoDXS1 (= GwDXS1) гомозиготні генотипи мають украй низький рівень терпенолів, тоді як гетерозиготні або гомозиготні генотипи DXS2 накопичують велику кількість терпенолів. 3) Функціональна характеристика DXS алелів у рослинах Для того щоб охарактеризувати активність алелів DXS, винахідники використовували Agrobacterium-опосередковану транзієнтну трансформацію тютюну (Nicotiana benthamiana), яка дозволяє швидко та ефективно експресувати гени в листах тютюну (Batoko et al., 2000). Цей підхід вже був успішно використаний для характеристики генів, які брали участь у вторинному метаболізмі виноградної лози (Schmidlin et al., 2008; Hugueney et al., 2009). MoDXS1, MoDXS2 і GwDXS2 алелі були експресовані в листах тютюну, разом із кДНК, що кодує фермент гераніолсинтазу (GES) базиліку камфорного (Ocimum basilicum) (Iijima et al., 2004). У цій системі, GES була використана як репортерний ген, відповідальний за біосинтез монотерпенолу гераніолу, який звичайно не накопичується у тютюні. Як було показано, активність DXS обмежує біосинтез терпенів у рослинах (Estevez et al., 2001; Enfissi et al., 2005), кількість гераніолу, утвореного в результаті діяльності GES, безпосередньо залежить від доступності субстрату DXS і, отже, від активності DXS у листах тютюну. Таким чином, ГХ-МС аналіз тютюнових листів, які коекспресують GES і DXS алелі, дозволяє точно порівняти активність алелів DXS у рослинах. Матеріали та методи: кДНК DXS виноградної лози ампліфікували за допомогою ПЦР із використанням прямого праймера 5'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGGCTCTCTGTACGCTC TCATTTCC-3 '(SEQ ID No 11) і зворотного праймера 5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACTATAACATGATCTCCAGGGCCTCC-3' (SEQ ID No 12), та клонували в pDONR207 Gateway сумісний вектор (Invitrogen, Carlsbad, CA) з використанням Gateway BP клонази (Invitrogen) відповідно до інструкцій виробника. кДНК DXS секвенували, щоб переконатися, що не було введено мутації. Для Agrobacteriumопосередкованої транзієнтної експресії, кДНК DXS потім переносили в бінарний вектор GATEWAY pMDC32 (Curtis and Grossniklaus, 2003). кДНК гераніолсинтазибазиліку камфарного (Ocimum basilicum) (Iijima et al., 2004) була клонована в бінарний вектор GATEWAY pMDC83 (Curtis and Grossniklaus., 2003) і експресувалася у вигляді білка, злитого з GFP. Усі конструкції вводили в штам C58 Agrobacterium tumefaciens (pmp90) шляхом електропорації. Листи Nicotiana benthamiana інфільтрували культурою A. tumefaciens (OD600 0,5) відповідно до Voinnet et al. (2003). Сектори листів вирізали та аналізували на вміст терпенів через 96 год. після інфільтрації Agrobacterium. Потім здійснювали екстракцію терпенів з листів тютюну: Для кожної точки відбору проб було виконано три повтори аналізу терпенів. Після зважування, сектори тютюнових листів (близько 1 г) подрібнювали в рідкому азоті, а потім суспендували в 2 мл особливо чистої води. Після 5-хвилинного центрифугування (6000×g при 4 °C), супернатант збирали та як зовнішній стандарт додавали 20 мкл розчину 4-нонанолу 1 г/л. Супернатант пропускали через колонку для SPE з 1 г неполярної C18 діоксид кремнію-зв'язаної фази (BOND ELUT JR.), попередньо промитої 5 мл метанолу та 15 мл особливо чистої води. Усі терпенолиелюювали 2 мл абсолютного етанолу. Цю загальну кількість екстракту терпенолів розбавляли в 20 мл цитрат/фосфатного буфера (рН 4,5) і отриманий розчин інкубували з 25 мг гліколітичного ферменту AR2000 (Gist-Brocades, Seclin, France) протягом ночі при 37,5 °C. Вивільнені терпеноли розділялиметодом SPE на колонці C18 та елюювали 4 мл дихлорметану, після промивання водою 3 × 5 мл. Екстракти сушили в піпетках Пастера, заповнених 0,5 г безводного сульфіту натрію, і концентрували до 500 мкл у слабкому потоці азоту. До кожного зразка як внутрішній контроль додавали 20 мікролітрів розчину м-крезолу 1 г/л. Зразки зберігали при -20 °C до газово-хроматографічного (ГХ) аналізу. Нарешті, терпени аналізували за допомогою газової хроматографії та мас-спектрометрії (ГХ-МС) з використанням газовогохроматографа Agilent 6890N, обладнаного пробовідбірником Gerstel MPS2 XL і з'єднаногоіз спектрометром інертних мас Agilent 5975B (Agilent Technologies). Газовий хроматограф був обладнаний DB-Wax капілярною колонкою (60 м × 0,32 мм внутр.діам. × 0,5 мкм товщина плівки, J & W Scientific), і гелій був використаний як газ-носій (з постійним 12 UA 112763 C2 потоком 1 мл/хв). Температура печі ГХ була запрограмована без первісного часу втримання від 45 °C до 82 °C зі швидкістю 20 °C/хв (утримання 1 хв), далі від 82 °C до 235 °C (утримання 15 хв) зі швидкістю 2,7 °C/хв. Інжектор був встановлений на 250 °C и використовувався в імпульсному режимі без розподілу потоку (25 psi (172 кПа) протягом 0,50 хв). Температури інтерфейсу, джерела іонів MS і квадруполястановили 270 °C, 230 °C и 150 °C, відповідно. Масспектрометр працював у режимі електронно-ударної іонізації (EI, 70 еВ) і маси сканували в діапазоні m/z 29-300 а.о.м. Програмне забезпечення Agilent MSD Chemstation (G1701DA, Rev D.03.00) було використано для керування приладом і обробки даних. Мас-спектри були зіставлені з бібліотекою банку еталонних спектрів Wiley. Результати: Agrobacterium-опосередкована транзієнтна експресія самого лише GES приводила до накопичення значних кількостей гераніолу, біосинтез якого залежить від ендогенної активності DXS у тютюні (Фіг. 6, Фіг. 7). Коекспресія GES і MoDXS1 приводила до істотного збільшення біосинтезу гераніолу за рахунок збільшеної доступності субстрату DXP. Проте, коекспресія GES і MoDXS2 або GwDXS2 приводила, у середньому, до збільшення накопичення гераніолу в листах тютюну в три рази (Фіг. 7), вказуючи, що ці алелі мають підвищену активність DXS у порівнянні з MoDXS1. Таким чином, винахідники дійшли висновку, що масове накопиченнятерпенолів у МО та Gw обумовлене наявністю MoDXS2 або GwDXS2.Мутації K284→N і R306→C, які впливають на амінокислоти в активному центрі ферменту, забезпечують підвищену активність DXS у порівнянні з MoDXS1, який у свою чергу відповідає за підвищене накопичення терпенів у рослинах. Метою наступних експериментів є вивчення ролі цих мутацій і можливість їх розширення на DXS ферменти з інших джерел. Як модель, автори вибрали DXS E. coli, ферментативні властивості якої добре охарактеризовані (Querol et al., 2001; Xiang et al., 2007). Порівняння послідовностей білків DXS E. coli і V. vinifera показали, що амінокислоти K284 і R306 в DXS виноградної лози відповідають K213 і K234 в DXS з E.coli, відповідно (Фіг. 10). Для того, щоб оцінити вплив MO- та GW-мутацій на активність нерослинного DXS, в білок DXS E.coli були введені мутаціїK213→N і K234→C. Потім був досліджений вплив цих мутацій на можливості біосинтезу терпенів E. coli. 4) Клонування та сайт-спрямований мутагенез гена DXS Escherichia coli Матеріали та методи: Ген DXS Escherichia coli (Lois et al., 1998) ампліфікували за допомогою ПЦР із використанням прямого праймера GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGAGTTTTGATATTGCCA AATACCC (SEQ ID No 24) і зворотного праймера GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG (SEQ ID No 25) і клонували в pDONR207 Gateway-сумісний вектор (технологія, яка дозволяє швидко клонувати один чи декілька генів; вектор, що вводиться, вносить резистентність до гентаміцину) (Invitrogen, Carlsbad, CA) за допомогою BP клонази, суміші білків, що каталізує in vitro рекомбінацію продуктів або сегментів ДНК із клонів (Invitrogen), відповідно до інструкцій виробника. Ген DXS згодом був перенесений в Gateway-сумісний експресійний вектор pHGWA (Busso et al., 2003) з використанням LR клонази, суміші ферментів, щокаталізує in vitro рекомбінацію між вхідним клоном та цільовим вектором для одержання експресійного клону (Invitrogen), з одержанням плазмідиpHGWA-EcoliDXS. Цю плазміду використовували для сайтспрямованого мутагенезу, щоб ввести мутації K213→N і K234→C у білок DXS E.coli. Сайтспрямований мутагенез проводили з використанням набору QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) відповідно до інструкцій виробника. Набір QuikChange оснований на мутагенних праймерах і ДНК-полімеразі. Він розроблений, щоб допомогти привнести одну чи декілька точкових мутацій у вибраний ген та одержувати мутанти ферментів з амінокислотними змінами, вставкамиабо делеціями. Для введення мутації K213→N були використані прямий праймер GCGCGAAGGCGGGAACAAAGTTTTCTCTGGCGTGCC (SEQ ID No 26) і зворотний праймер GGCACGCCAGAGAAAACTTTGTTCCCGCCTTCGCGC (SEQ ID No 27), з одержанням плазмідиpHGWA-EcoliDXS-k213N. Для введення мутації K234→C були використані прямий праймер CGCACCGAAGAACATATTTGCGGCATGGTAGTGCCTGG (SEQ ID No 28) і зворотний праймер CCAGGCACTACCATGCCGCAAATATGTTCTTCGGTGCG (SEQ ID No 29), з одержанням плазмідиpHGWA-EcoliDXS-k234C. Результати: 13 UA 112763 C2 В результаті сайт-спрямованого мутагенезу був виділений мутантний ген DXS із зсувом рамки. Цей зсув рамки до синтезу усіченого білка DXS, який використовували як контроль. Плазміда, що кодує цей усічений DXS, була названа pHGWA-усічений EcoliDXS. 5) Експресія дикого типу та мутантного білків DXS E.coli в E.coli Матеріали та методи: Плазміди pHGWA-EcoliDXS, pHGWA-усічений EcoliDXS, pHGWA-EcoliDXS-k213N і pHGWAEcoliDXS-k234C були трансформовані в штам E.coliBL21-Gold(DE3)pLysS (Stratagene, La Jolla, CA). Штам E.coli BL21-Gold(DE3)pLysS є компетентними клітинами, які забезпечують підвищену ефективність трансформації. Вони є стійкими до тетрацикліну та хлорамфеніколу. Трансформанти культивували при 28 °C у 50 мл середовища LB з додаванням глюкози (10 г/л), в присутності ампіциліну (100 мкг/мл), хлорамфеніколу (25 мкг/мл) і тетрацикліну (2 мкг/мл). Коли культури досягали OD (оптична густина) 0,1, експресію DXS індукували за допомогою 1 мМізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозиду (IPTG) і культуру вирощували протягом 24 годин. 6) Вплив DXS мутантів на біосинтез терпенів в E.coli Вплив MO- і GW-подібних мутацій (K213→N і K234→C, відповідно) на активність ферменту DXS з E.coli оцінювали шляхом кількісного визначення терпенів у культуральному середовищі після індукування експресії DXS. Матеріали та методи: аналіз терпенів у живильномусередовищіE.coli Терпени в культуральному середовищі були проаналізовані з використанням сорбційної екстракції на магнітній мішалці (SBSE), використовуючи спосіб, адаптований з Coelho et al. (2009). Мішалку з PDMS покриттям (0,5 мм × 10 мм; Twister; Gerstel, Mullheim, Germany) поміщали в кожний зразок культурального середовища (10 мл). Екстракцію проводили при 20 °C протягом 150 хв, при швидкості обертання 800 обертів за хвилину. Потім терпени аналізували за допомогою газової хроматографії та мас-спектрометрії (ГХ-МС) з використанням газового хроматографа Agilent 6890N, обладнаного пробовідбірником Gerstel MPS2 XL і з'єднаного з масспектрометром Agilent 5975B (Agilent Technologies), як описано вище. Результати: Приклад показує, що мутації, введені в DXS E.coli, впливають на вміст монотерпенів у культуральному середовищі (Фіг. 5). Зокрема, мутація K234→С у DXS E.coli приводить до значного зростання накопичення терпенів у культуральному середовищі. Таким чином, винахідники дійшли висновку, що нерослинні ферменти DXS можуть бути модифіковані у положеннях, що відповідають K284 і R306 у білках DXS виноградної лози, для того щоб поліпшити активність DXS. Такі поліпшені мутанти DXS можуть бути використані для метаболічної інженерії мікроорганізмів з метою підвищення виробництва цільових ізопреноїдів. ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ genoplante x, X Philippe, HUGUENEY АЛЕЛІ 1-ДЕЗОКСИ-D-КСИЛУЛОЗО-5-ФОСФАТСИНТАЗИ, ВІДПОВІДАЛЬНІ ЗА ПОСИЛЕНИЙ БІОСИНТЕЗ ТЕРПЕНІВ GPL-B-0001 PCT EP 10013809.8 2010-10-20 29 PatentIn version 3.5 1 720 PRT Штучна послідовність Консенсусна послідовність рослинної DXS 5 10 15 20 25 14 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 MISC_FEATURE (3)..(3) X=L або S MISC_FEATURE (4)..(4) X=C або S MISC_FEATURE (5)..(5) X= T, N або A MISC_FEATURE (6)..(6) X= L, F або Y MISC_FEATURE (7)..(7) X= S або A MISC_FEATURE (8)..(8) X= F або V MISC_FEATURE (10)..(10) X= A, S або G MISC_FEATURE (11)..(11) X= H, Y або I MISC_FEATURE (12)..(12)X=F, I або L MISC_FEATURE (13)..(13) X=S, I або N MISC_FEATURE (14)..(14) X= Q, T або R 15 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 MISC_FEATURE (15)..(15) X= A, K або T MISC_FEATURE (16)..(16) X= G, V або відсутність амінокислот MISC_FEATURE (17)..(17) X= G, A або відсутність амінокислоти MISC_FEATURE (18)..(18) X= A, L або V MISC_FEATURE (19)..(19) X= A або S MISC_FEATURE (20)..(20) X= S або T MISC_FEATURE (21)..(21) X= N або D MISC_FEATURE (22)..(22) X= P, S, A або Y MISC_FEATURE (23)..(23) X= Q, C або S MISC_FEATURE (24)..(24) X= R або K MISC_FEATURE (25)..(25) X=L, S, P або Q MISC_FEATURE (26)..(26) X= T, L або S 16 UA 112763 C2 5 MISC_FEATURE (27)..(27) X= P або S 10 MISC_FEATURE (28)..(28) X= Q або L 15 MISC_FEATURE (29)..(29) X= C, F, S або P 20 MISC_FEATURE (31)..(31) X= H, S або E 25 MISC_FEATURE (32)..(32) X= L, R, S або W 30 MISC_FEATURE (33)..(33) X= F, S, I або Q 35 MISC_FEATURE (34)..(34) X= L, H або W 40 MISC_FEATURE (35)..(35) X= G або V 45 MISC_FEATURE (36)..(36) X= немає амінокислоти, V або T 50 MISC_FEATURE (37)..(37) X= D або відсутність амінокислоти 55 MISC_FEATURE (39)..(39) X= Q, P або H MISC_FEATURE 17 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (40)..(40) X= C, S, F або Y MISC_FEATURE (41)..(41) X= Q, P або L MISC_FEATURE (42)..(42) X= C, F, A або відсутність амінокислоти MISC_FEATURE (43)..(43) X= S, L, H або Q MISC_FEATURE (44)..(44) X= Q, K, A або H MISC_FEATURE (45)..(45) X= Q, P, K або H MISC_FEATURE (46)..(46) X= R, N або L MISC_FEATURE (47)..(47) X= S, N, T або L MISC_FEATURE (48)..(48) X= K, N, Q, H або R MISC_FEATURE (49)..(49) X= A, S, V або Q MISC_FEATURE (50)..(50) X= H, M або відсутність амінокислоти MISC_FEATURE (51)..(51) X= R, S або K 18 UA 112763 C2 MISC_FEATURE (52)..(52) X= K або N MISC_FEATURE (54)..(54) X=P, R або S MISC_FEATURE (55)..(55) X= N, A, R або C MISC_FEATURE (56)..(56) X= G, K або T MISC_FEATURE (58)..(58) X= C, Q, Y або A MISC_FEATURE (61)..(61) X= L або G MISC_FEATURE (62)..(62) X= S або A MISC_FEATURE (63)..(63) X= D, E або W MISC_FEATURE (64)..(64) X=R, K або S MISC_FEATURE (65)..(65) X=E, G або I MISC_FEATURE (66)..(66) X=E або D MISC_FEATURE (67)..(67) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 19 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 X= F або Y MISC_FEATURE (68)..(68) X=H, Y або S MISC_FEATURE (69)..(69) X=S, T, G або A MISC_FEATURE (70)..(70) X= Q, N, E або H MISC_FEATURE (71)..(71) X=R або K MISC_FEATURE (73)..(73) X=P або A MISC_FEATURE (74)..(74) X=T або V MISC_FEATURE (76)..(76) X=L або I MISC_FEATURE (77)..(77) X=L або V MISC_FEATURE (80)..(80) X=I або V MISC_FEATURE (82)..(82) X=Y або D MISC_FEATURE (84)..(84) X=I, V або A 20 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 MISC_FEATURE (91)..(91) X=V, L, A або T MISC_FEATURE (92)..(92) X=K, H, Q або P MISC_FEATURE (93)..(93) X=E або D MISC_FEATURE (95)..(95) X=K або E MISC_FEATURE (98)..(98) X=A або S MISC_FEATURE (99)..(99) X=D, A, S або E MISC_FEATURE (103)..(103) X=S, A або L MISC_FEATURE (104)..(104) X=D або E MISC_FEATURE (105)..(105) X=V, T або I MISC_FEATURE (106)..(106) X= V або I MISC_FEATURE (107)..(107) X= F, Y або H MISC_FEATURE (108)..(108) X= N, S або T 21 UA 112763 C2 5 MISC_FEATURE (110)..(110) X=S або A 10 MISC_FEATURE (111)..(111) X=K або R 15 MISC_FEATURE (117)..(117) X=G або S 20 MISC_FEATURE (118)..(118) X=S або A 25 MISC_FEATURE (124)..(124) X=D або E 30 MISC_FEATURE (126)..(126) X=T або A 35 MISC_FEATURE (128)..(128) X=V або A 40 MISC_FEATURE (131)..(131) X=Y або H 45 MISC_FEATURE (132)..(132) X=V або I 50 MISC_FEATURE (134)..(134) X=N або D 55 MISC_FEATURE (135)..(135) X=A або T MISC_FEATURE 22 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (137)..(137) X=Q, E або D MISC_FEATURE (139)..(139) X= R або K MISC_FEATURE (141)..(141) X= L або I MISC_FEATURE (148)..(148) X= S або A MISC_FEATURE (150)..(150) X= P або A MISC_FEATURE (159)..(159) X= D, G, E або S MISC_FEATURE (160)..(160) X= K, Q або R MISC_FEATURE (162)..(162) X= H, P або S MISC_FEATURE (164)..(164) X= M, L або I MISC_FEATURE (168)..(168) X= D, N або S MISC_FEATURE (171)..(171) X= A або S MISC_FEATURE (174)..(174) X= T або P 23 UA 112763 C2 MISC_FEATURE (177)..(177) X= G, S або D MISC_FEATURE (180)..(180) X= E, I, V або A MISC_FEATURE (181)..(181) X= Y, H, або F MISC_FEATURE (183)..(183) X= C або A MISC_FEATURE (186)..(186) X= T або A MISC_FEATURE (192)..(192) X= T або S MISC_FEATURE (196)..(196) X= G або A MISC_FEATURE (202)..(202) X= G або A MISC_FEATURE (205)..(205) X= L або I MISC_FEATURE (206)..(206) X= L або K MISC_FEATURE (208)..(208) X= R або K MISC_FEATURE (209)..(209) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 24 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 X= N, S або K MISC_FEATURE (211)..(211) X= N або H MISC_FEATURE (213)..(213) X= I або V MISC_FEATURE (214)..(214) X= A або S MISC_FEATURE (220)..(220) X= A або V MISC_FEATURE (233)..(233) X= A, S або V MISC_FEATURE (235)..(235) X= Y або F MISC_FEATURE (238)..(238) X=S або A MISC_FEATURE (239)..(239) X= N або D MISC_FEATURE (240)..(240) X=M або L MISC_FEATURE (243)..(243) X=I або V MISC_FEATURE (248)..(248) X= K або R 25 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 MISC_FEATURE (258)..(258) X= D або N MISC_FEATURE (261)..(261) X= I, S, V або A MISC_FEATURE (262)..(262) X= P або T MISC_FEATURE (269)..(269) X= S, G, R або K MISC_FEATURE (272)..(272) X= S, A або T MISC_FEATURE (273)..(273) X= R або K MISC_FEATURE (276)..(276) X= S або A MISC_FEATURE (277)..(277) X= S або N MISC_FEATURE (278)..(278) X= R, P, A або T MISC_FEATURE (279)..(279) X= K, P або A MISC_FEATURE (280)..(280) X= L або F MISC_FEATURE (282)..(282) X= E або Q 26 UA 112763 C2 5 MISC_FEATURE (286)..(286) X= V або A 10 MISC_FEATURE (288)..(288) X= K або N 15 MISC_FEATURE (289)..(289) X= G, S або T 20 MISC_FEATURE (290)..(290) X= V, M або I 25 MISC_FEATURE (293)..(293) X= Q або R 30 MISC_FEATURE (296)..(296) X= G або P 35 MISC_FEATURE (297)..(297) X= Q або P 40 MISC_FEATURE (298)..(298) X= M або A 45 MISC_FEATURE (300)..(300) X= E або Q 50 MISC_FEATURE (301)..(301) X= L або V 55 MISC_FEATURE (307)..(307) X= E або V MISC_FEATURE 27 UA 112763 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (310)..(310) X= R або C MISC_FEATURE (313)..(313) X= I, L або V MISC_FEATURE (315)..(315) X= G або A MISC_FEATURE (316)..(316) X= S або T MISC_FEATURE (318)..(318) X= S або A MISC_FEATURE (319)..(319) X= S або T MISC_FEATURE (336)..(336) X= S або N MISC_FEATURE (337)..(337) X= I або V MISC_FEATURE (338)..(338) X= D або E MISC_FEATURE (341)..(341) X= I або V MISC_FEATURE (342)..(342) X= A, S, або T MISC_FEATURE (344)..(344) X= L або F 28