Фармацевтична композиція, стимулююча біосинтез s-аденозилметіоніну, і пероральний лікарський засіб

1. Фармацевтична композиція, стимулююча біосинтез S-аденозилметіоніну, що характеризується тим, що вона містить суміш метіоніну, янтарної кислоти, інозину і таурину в ефективних кількостях. 2. Пероральний лікарський засіб у вигляді пігулки, що містить активний і допоміжні компоненти, який відрізняється тим, що як активний компонент вона містить фармацевтичну композицію за п. 1. 3. Пероральний лікарський засіб за п. 2, що має гепатопротекторну дію. UA (21) a201106733 (22) 30.05.2011 (24) 26.09.2011 (31) 201100309 (32) 03.03.2011 (33) EA (46) 26.09.2011, Бюл.№ 18, 2011 р. (72) КОВАЛЄНКО АЛЄКСЄЙ ЛЄОНІДОВІЧ, RU, ПЄТРОВ АНДРЄЙ ЮРЬЄВІЧ, RU (73) ЕКОФАРМ ПАТЄНТ МЕНЕДЖМЕНТ АГ, CH (56) US 5428063 A, 27.06.1995 Powell CL et al.: Mechanism for prevention of alcoholinduced liver injury by dietary methyl donors // Toxicol Sci. 2010 May;115(1):131-9. Epub 2010 Jan 29 EP 0136464 B1, 26.10.1988 C2 2 (19) 1 3 З іншого боку, основною проблемою зниження фармакологічної активності екзогенного Sаденозилметіоніну в лікарських препаратах є рацемізація - перехід з активної (S,S) -(+) Sаденозил-L-метіонін форми в неактивну (S,S) -(+) S-аденозил-L-метіонін, каталізований температурою і вологістю. Крім того, S-аденозилметіонін хімічно нестабільний і легко піддається гідролізу з утворенням аденіну, аденозину, метилтіоаденозину і ряду інших сірковмісних органічних сполук. З метою стабілізації S-аденозилметіоніну в різних лікарських формах використовуються його суспензії в безводних спиртах [JP 2008013509; JP 2008011803] або різні добавки, наприклад аскорбінова кислота або її солі [US 2010168048], або полісахарид трехалоза [Biochim Biophys Acta 2002 Vol. 1573(2). P. 105-108.], а також декстрини [JP 2010018596]. Достатньо часто використовуються різні стабільніші похідні S-аденозил-L-метіоніну - органічні і неорганічні солі SAM [Int Jour Pharm. 2000. Vol.l94(l). P. 61-68; RU 3490997; SU 676169; US 2003/0032796], зокрема подвійні солі [US 4057686; US 3954726; US 4465672]. Як лікарський засіб або харчові добавки SAM може бути використаний в парентеральній і пероральній лікарських формах. При парентеральному введенні екзогенного SAM він виявляється головним чином в клітинах печінки, але через гематоенцефалічний бар'єр практично не проникає [Jour. Neurol Neurosurg Psychiatry. 1990 Vol. 53 (12): 1096-1098]. Необхідно відзначити, що лікування хронічних захворювань печінки з синдромом цитолізу (вірусні гепатити, цирози, жирова хвороба печінки) вимагає тривалих багатомісячних курсів застосування SAM, що не дозволяє ефективно використовувати його парентеральну лікарську форму для внутрішньовенного введення, а при пероральному введенні біодоступність SAM суттєво нижче в порівнянні з парентеральним, що обумовлено поганим транспортом SAM через слизисту оболонку шлунково-кишкового тракту і мембрани клітин печінки і мітохондрій [Сlіn Ther. 2009. Vol. 31(2):311-320.]. Таким чином, підвищення синтезу SAM при пероральному застосуванні може бути реалізоване або збільшенням кратності його прийому і дозування активної речовини - S-аденозилметіоніну (що економічно недоцільно і представляє загрозу ризику виникнення побічних ефектів), або шляхом створення альтернативних препаратів, що забезпечують стимуляцію синтезу ендогенного SAM. Серед препаратів для перорального застосування, що впливають на синтез Sаденозилметіоніну, відомий сам метіонін як прекурсор SAM [Metabolism, 1970. Vol. 19(5). P. 381391]. 96112 4 Відомі математичні моделі, що описують синтез SAM і його метаболітів метіоніном в печінці [Biochim. Biophys. Acta. 2010 Vol. 1804(1) P.89-96]. При пероральному введенні метіоніну щурам в дозуваннях від 0,6 г/кг до 4 г/кг концентрація метіоніну в печінці росте не значно і коливається на рівні 400 nМоль/г, при цьому концентрація SAM в печінці зростає від 150 до 180 М/г. Подальше збільшення дози метіоніну понад 4 г/кг приводить до "метаболічного стрибка" - різкого збільшення концентрації SAM в 4-10 разів і досягає рівня 1000 М/г [J. Theor. Biol. 2000; 204:521-532]. Проте введення тваринам метіоніну в дозі навіть 4 г/кг при перерахунку відповідає разовій дозі у людини до 40 г метіоніну на добу [Farmakol. Toksikol. 1981 Vol. 44(4). P. 389-395], що перевищує фізіологічну і лікувальну дозу метіоніну, що рекомендується, у декілька разів, і представляє небезпеку токсичного ефекту [Jour. Nutr. 2006. Vol. 136: P. 1722-1725]. Таким чином, очевидно, що досягнення прийнятних концентрацій S-аденозилметіоніну в печінці з використанням чистого метіоніну неможливе із-за токсичних ефектів останнього. Є дані, що ряд вітамінів: В6 (піридоксин), бетаїн і В12 підвищують рівень ендогенного Sаденозилметіоніну [Jour. Nutr. Sci. Vitaminol (Tokyo). 2001 Vol. 47(3). P. 188-194]. Також відомо, що біосинтез Sаденозилметіоніну може бути збільшений шляхом послідовного введення метіоніну і через 4-6 годин - похідних аденіну - 2-діокспропіладеніну (SU 1552073). Проте, необхідність роздільного введення вказаних активних речовин не дозволяє створити зручну в застосуванні пероральну лікарську форму. Як активний компонент SAM пропонується в різних пероральних лікарських формах. Наприклад, відомі пігулки з грануляту, отримані методом розпилювального сушіння [US 2003/0050274], пігулки з пролонгованим вивільненням [US 2009/088404], желатинові капсули, покриті кишковорозчинною оболонкою [US 6759395], гранули [US 2008/0274997], шипучі пігулки і гранули [ЕР 2189154], пігулки для розсмоктування [ЕР 2193787]. Також описана пероральна лікарська форма S-аденозилметіоніну, стійка до гідролізу і температури [US 2009/0110729]. Дана композиція має суттєві недоліки - маса однієї пігулки із вмістом SAM 400 мг досягає 1300 мг, що незручно для прийому пацієнтами унаслідок великих геометричних розмірів пігулок, крім того, технологія пігулок складна для промислового виробництва. Як найближчий аналог винаходу, що заявляється, може бути вибрана лікувальна композиція для орального застосування, яка описана в патенті ЕР 0136464. Композиція може бути виконана у вигляді пігулки, покритою кишковорозчинною оболонкою, наступного складу: 5 96112 6 мг % 384 72,0 маса ядра: 60 77 30 10 507 11,4 14,6 5,7 1,9 96,0 маса покриття: маса пігулки: 15 1 2,5 2,5 21 528 2,85 0,19 0,5 0,5 4,0 100,0 Активний компонент SAM сульфат пара-толуол сульфонат (еквівалентно 200 мг S-аденозилметіоніну) Цільові добавки Двоокис кремнію Крохмаль МКЦ безводна Магнію стеарат Кишковорозчинне покриття: Поліакрилат Поліетіленгліколь Тальк Магнію стеарат Вказаний лікарський засіб широко використовується в медичній практиці і може застосовуватися для лікування захворювань печінки. Проте дана пігулка має невисоку біодоступність SAM (близько 5 %) унаслідок низького рівня транспорту SAM через слизисту оболонку шлунково-кишкового тракту [Сlin Ther. 2009. Vol. 31(2). P. 311-320]. Крім того, після всмоктування з кишечника в кровоносне русло відбувається швидке руйнування SAM і в гепатоцити проникає незначна кількість SAM, що всмоктався, що вимагає повторних дозувань препарату кожні 6-8 годин для підтримки мінімального терапевтичного рівня SAM в плазмі крові [Drags. 1990 Vol. 40 Suppl 3.P.124128]. При зберіганні такого препарату спостерігається зменшення змісту активної форми SAM за рахунок процесу його рацемізації, при якому утворюється фармакологічно неактивний ізомер (R,S), -(+) S-аденозил-L-метіоніну. Перераховані недоліки знижують терапевтичну ефективність лікарських засобів, що містять екзогенний SAM, і підтверджують необхідність розробки альтернативного лікарського засобу. Короткий опис винаходу. Задачею даного винаходу є створення на основі нової нетоксичної фармацевтичної композиції стабільного перорального лікарського засобу, що має гепатопротекторну дію за рахунок стимуляції біосинтезу S-аденозилметіоніну в клітинах печінки. Поставлена задача вирішується створенням фармацевтичної композиції, стимулюючої біосинтез S-аденозилметіоніну, що, згідно з винаходом, характеризується тим, що містить суміш метіоніну, янтарної кислоти, інозину і таурину в ефективних кількостях. Поставлена задача також вирішується створенням перорального лікарського засобу у вигляді пігулки, що містить активний і допоміжні компоненти, що, згідно з винаходом, як активний компонент містить вищеописану фармацевтичну композицію. Крім того, поставлена задача вирішується тим, що вищеописаний пероральний лікарський засіб, згідно з винаходом, має гепатопротекторну дію. Авторами справжнього винаходу вперше встановлено, що композиція, що включає активні компоненти: метіонін, янтарну кислоту, інозин і таурин, направлено стимулює біосинтез Sаденозилметіоніну в клітинах печінки. Відомі склади метіоніну з метаболітами, наприклад з янтарною кислотою, пектином, амінокислотами і глюкозою [RU 2105502] або метіоніну з янтарною кислотою, амінокислотами і вітамінами [RU 2222996], справляють загальну нормалізуючу дію на обмінні процеси в організмі і використовуються як харчові добавки. Крім того, відома комбінація метіоніну з інозином, янтарною кислотою, меглюміном і солями натрію, калію і магнію, проявляє детоксикуючу активність і використовується у вигляді інфузійного розчину [RU 2240116]. Крім того, несподіваним з'явився той факт, що найбільший вплив на стимуляцію біосинтезу Sаденозилметіоніну справляє не окреме застосування метіоніну, а його комбінації з речовинами, які безпосередньо не беруть участь в біосинтезі Sаденозилметіоніну. Автори також показали, що підвищений синтез S-аденозилметіоніну в тканинах печінки досягається при використанні активних компонентів в ефективних кількостях за рахунок позитивного синергізму їх взаємодії. При цьому, згідно з винаходом ефективними є загальноприйняті мінімальні терапевтичні кількості активних компонентів. У зв'язку з тим, що підвищення біосинтезу Sаденозилметіоніну спостерігається при значному зниженні дозування метіоніну в композиції в порівнянні з його окремим застосуванням, стало можливим виключити його токсичну дію на організм і зменшити ризик виникнення побічних явищ при тривалому застосуванні даної фармацевтичної композиції. На основі композиції, що заявляється, може бути створене пероральний лікарський засіб у вигляді пігулки, яка містить цільові добавки і кишковорозчинне покриття. Як цільові добавки можуть бути використані лактоза, сахароза, сорбіт, метилцелюлоза, гідроксіпропілметилцелюлоза, мікрокристалічна целюлоза, пектин, крохмаль, альгінати, кросповідони, кальцію або магнію стеарати, стеаринову кислоту, поліетиленгліколі різної молекулярної маси, колоїдний оксид кремнію, полівініловий спирт, полівіні 7 лпіролідон, полісорбат 80, і інші загальноприйняті у фармацевтичній технології інгредієнти. Як кишковорозчинне покриття можуть бути використані співполімери метилакрилової кислоти, ацетилфталілцелюлоза, шелак і інші полімери, стійкі до шлункового соку у поєднанні з тальком, двоокисом титану, оксидами заліза і різними пластифікаторами такими як пропіленгліколь, триетилцитрат і інші загальноприйняті у фармацевтичній технології інгредієнти. Цільові добавки і кишковорозчинне покриття забезпечують фармацевтичну стабільність лікарської форми, її повний розпад і розчинення в кишечнику, захист від шлункового соку, завдяки чому активні компоненти вивільняються в дванадцятипалій кишці, де відбувається їх найбільш швидке і повне всмоктування. Гепатопротекторна дія вказаного перорального лікарського засобу обумовлена направленим впливом його активного компоненту, що є сумішшю метіоніну, янтарної кислоти, інозину і таурину в ефективних кількостях, на стимуляцію синтезу Sаденозилметіоніну в печінці, що приводить до поліпшення показників регенерації і проліферації гепатоцитів і дозволяє використовувати його при лікуванні різних захворювань, що супроводжуються ураженням печінки. Таким чином, винахід, що заявляється, як лікувальний засіб є ефективною альтернативою екзогенному введенню S-аденозилметіоніну і виключає такі властиві йому недоліки як низьку біодоступність активного компоненту, гідролітичну, термічну нестабільність і схильність до рацемізації SAM. Докладний опис винаходу. Кількісний і якісний склад композиції, що заявляється, був підібраний емпіричним шляхом в ході вивчення впливу на синтез S-аденозилметіоніну різних доз метіоніну і ряду речовин, узятих в мінімальних разових загальноприйнятих терапевтичних кількостях. В результаті дослідження з використанням культури кліток гепатоми людини HepG2 з колекції клітинних культур АТТС (США), був відібраний ряд активних речовин, які викликали достовірне підвищення синтезу S-аденозилметіоніну в наступних діапазонах концентрацій: метіонін - 5-50 мг/кг, інозин - 20-75 мг/кг, янтарна кислота - 75-125 мг/кг, таурин - 10-50 мг/кг. Отримані дані були використані в наступних дослідах. Дослід 1. Для вибору складу композиції і переважного способу її введення визначали вміст Sаденозилметіоніну в гомогенатах печінки експериментальних тварин після введення різних комбінацій раніше відібраних активних компонентів. Експерименти виконані на 400 білих щурах породи Вістар, згідно з вимогами етичного комітету і Правилами лабораторної практики в Російській 96112 8 Федерації, при використанні середніх значень дозувань метіоніну, інозину, янтарної кислоти і таурину з раніше отриманих діапазонів їх концентрацій, які склали 20, 40, 100 і 20 мг/кг відповідно. Вміст S-аденозилметіоніну в печінці визначали при внутрішньошлунковому і інтрадуоденальному введенні композицій у вигляді суспензій, приготованих в 10% крохмальному клейстері з використанням атравматичного зонда. Експериментальних тварин розділили на 20 груп по 20 тварин в кожній. Групам №№ 1-10 вводили досліджувані композиції внутрішньошлунково, а групам №№ 11-20 інтрадуоденально. Дослідження були проведені з урахуванням коефіцієнта перенесення доз з людини на гризунів. Через 2, 4, 6 і 8 годин після введення препаратів в кожній групі забивали по 5 тварин і витягували печінку для проведення аналізу на вміст SAM. Групи 1 і 11 – контрольні, отримували 10 % крохмальну суспензію без препаратів. Групи 2 і 12 отримували метіонін в дозі 20 мг/кг. Групи 2 і 13 отримували суміш метіонін 20 мг/кг + інозин 40 мг/кг. Групи 4і 14 отримували суміш метіонін 20 мг/кг + янтарна кислота 100 мг/кг. Групи 5 і 15 отримували суміш метіонін 20 мг/кг + таурин 20 мг/кг. Групи 6 і 16 отримували суміш метіонін 20 мг/кг + інозин 40 мг/кг + таурин 20 мг/кг. Групи 7 і 17 отримували суміш метіонін 20 мг/кг + інозин 40 мг/кг + янтарна кислота 100 мг/кг. Групи 8 і 18 отримували суміш метіонін 20 мг/кг + таурин 20 мг/кг + янтарна кислота 100 мг/кг. Групи 9 і 19 отримували суміш метіонін 20 мг/кг + інозин 40 мг/кг + янтарна кислота 100 мг/кг + таурин 20 мг/кг. Групи 10 і 20 отримували субстанцію SAM в дозі 160 мг/кг. Кількісний вміст SAM в печінці визначали з використанням рідинного хроматографа Shimadzu LC-20 Prominence. Для кожної проби отримували по 3 відтворні хроматограми. Статистичну обробку проводили за допомогою пакетів програм Excel, Graph Pad Prism, Mebistat на ПЕВМ PC Pentium II. Відмінності між вибірками оцінювали за допомогою критерію Ст'юдента (t). Композицію вважали ефективною при достовірному збільшенні синтезу S-аденозилметіоніну у гомогенаті печінки щурів порівняно з групами тварин, що отримували тільки метіонін або SAM. Представлені в таблицях 1 і 2 дані свідчать про суттєве збільшення синтезу ендогенного Sаденозилметіоніну при введенні різних комбінацій з метіоніном в порівнянні з його окремим застосуванням в нетоксичних терапевтичних дозах. 9 96112 10 Таблиця 1 Вміст SAM в гомогенатах печінки щурів при внутрішньо шлунковому введенні компонентів № групи 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Експериментальні групи тварин (n=20) Контрольна група Метіонін Метіонін+інозин Метіонін+ЯК Метіонін+таурин Метіонін+інозин+таурин Метіонін+інозин+ЯК Метіонін+таурин+ЯК Метіонін+інозин+ЯК+таурин SAM доза 32 мг/кг 2 години 8,2±0,2 10,4±0,2 12,5±0,3 13,1±0,2 12,2±0,2 15,4±0,3 16,2±0,3 14,9±0,2 15,7±0,2 8,6±0,2 Вміст SAM в печінці г/г (М±m) 4 години 6 годин 8,4±0,2 8,3±0,2 12,4±0,3 11,1±0,2 19,9±0,2 20,1±0,2 18,1±0,3 20,2±0,3 17,8±0,4 16,5±0,3 21,6±0,5 17,8±0,2 24,4±0,4 22,0±0,3 19,2±0,3 17,0±0,2 28,1±0,4 27,0±0,4 11,4±0,3 12,1±0,2 8 годин 8,4±0,2 9,3±0,3 14,3±0,2 14,5±0,3 11,2±0,2 11,9±0,2 16,4±0,3 12,2±0,2 18,0±0,3 11,2±0,3 Таблиця 2 Вміст SAM в гомогенатах печінці щурів при інтрадуоденальному введенні компонентів № групи 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Експериментальні групи тварин (n=20) Контрольна група Метіонін Метіонін+інозин Метіонін+ЯК Метіонін+таурин Метіонін+інозин+таурин Метіонін+інозин+ЯК Метіонін+таурин+ЯК Метіонін+інозин+ЯК+таурин SAM доза 32 мг/кг Таким чином, встановлено, що композиція, що є сумішшю метіоніну, інозину, янтарної кислоти і таурину при інтрадуоденальному введенні забезпечує максимально високий рівень вмісту SAM в печінці в найбільший інтервал часу і обумовлює використання кишковорозчинного покриття для пероральної форми. При цьому стимуляція біосинтезу SAM в печінці при введенні композиції, що заявляється, забезпечується за рахунок прояву понад сумарний ефект взаємодії активних компонентів. Переважні ефективні кількості активних компонентів в композиції складають, мас. %: метіонін 4,5-16,7 інозин 18,2-25,0 янтарна кислота 41,7-68,2 таурин 9,1-16,7. Композиція, що заявляється, містить суміш метіоніну, інозину, янтарної кислоти і таурину в ефективних кількостях, може бути реалізована шляхом приготування перорального лікарського засобу, наприклад, у вигляді пігулки. Дослід 2. Для виготовлення пігулки отримують ядро, яке покривають кишковорозчинним покриттям. Для отримання ядер пігулок, змішують: 50 г метіоніну, 100 г інозину, 250 г янтарної кислоти, 50 г таурину - активні компоненти, і цільові добавки - крохмаль, лактозу, мікрокристалічну целюло 2 години 8,4±0,2 12,5±0,2 15,2±0,2 12,8±0,3 16,3±0,2 17,5±0,4 17,9±0,3 16,5±0,2 20,1±0,4 12,3±0,2 Вміст SAM в печінці г/г (М±m) 4 години 6 годин 8,5±0,2 8,1±0,3 16,1±0,2 13,5±0,2 21,4±,03 22,9±0,4 21,9±0,4 16,3±0,3 17,8±03 16,4±0,3 24,6±0,2 26,2±0,3 27,9±0,3 24,0±0,3 25,4±0,4 17,3±0,4 35,1±0,5 32,6±0,5 15,7±0,4 14,4±0,2 8 годин 8,3±0,2 8,9±0,3 14,6±0,3 9,2±0,3 11,7±0,2 13,1±0,2 15,2±0,3 12,0±0,2 16,4±0,3 11,2±0,2 зу, колоїдний оксид кремнію і/або інші фармакологічно неактивні допоміжні речовини, використовувані в приготуванні таблетованих лікарських форм. Отриману суміш гранулюють в сушарцігрануляторі, розчином принаймні одного гранулюючого агента з ряду: метилцелюлоза, повидон, гідроксипропілметилцелюлоза, крохмаль і ін. Гранулят просівають, опудрюють стеаратом кальцію або магнію, стеариновою кислотою або іншим лубрикантом. З отриманого грануляту отримують близько 600 г пігулок з середньою масою 634 мг. На отримані пігулки-ядра в установці киплячого шару або барабанного типу наносять плівкове кишковорозчинне покриття до середньої маси однієї пігулки близько 694 мг, що забезпечує захист від низького рН шлункового соку і що складається з співполімера метакрилової кислоти і етилакрилату або ацетилфталілцелюлози, або шелаку, або іншого резистентного до шлункового соку полімеру, а так само тальку, діоксиду титану, оксидів заліза, пропіленгліколю, триетилцитрату або інших загальноприйнятих у фармацевтичній технології наповнювачів і пластифікаторів, необхідних для утворення якісного плівкового покриття. При цьому одна пігулка, покрита оболонкою, містить: мг мас. % янтарної кислоти 250 35,97 інозину 100 14,39 11 96112 таурину 50 7,19 метіоніну 50 7,19 цільових добавок 184 26,48 кишковорозчинне покриття 61 8,78 разом 695 100,00. Дослід 3. Дослідження токсичності композиції, що заявляється, проводили на комбінації, що містить активні компоненти в максимальних ефективних кількостях. Дослідження гострої токсичності проводили по стандартній методиці на 100 щурах породи "Вістар" при пероральному введенні розтертих пігулок, що мають склад відповідно до досліду 2, показало, що внутрішньошлункове введення препаратів в дозах до 10000 мг/кг по готовій лікарській формі щурам не викликає змін поведінки і загального стану тварин, масових коефіцієнтів органів щодо контрольних тварин, макроскопічних змін головного мозку, внутрішніх і ендокринних органів досвідчених тварин і не супроводжується роздратуванням або некрозом в місці основного введення препарату - слизистій оболонці шлунку і кишечника. При вивченні хронічної токсичності показано, що щоденне протягом 120 днів пероральне введення препарату в дозах 152 і 1520 мг/кг щурам і в дозах 25,7 і 257 мг/кг кроликам обох статей (по композиції активних початків) не приводить до розвитку патологічних зрушень з боку загального стану і поведінки тварин, не надає токсичної дії на серцево-судинну діяльність, морфологічний склад 12 периферичної крові і кісткового мозку, на функціональний стан печінки і нирок, білковий, вуглеводний, жировий і електролітний види обміну речовин, не викликає дистрофічних, деструктивних, осередкових склеротичних змін в паренхіматозних клітинах і стромі внутрішніх органів, а також не супроводжується місцево-подразнюючою дією. Таким чином, композиція, що заявляється, має низький рівень загальнотоксичної дії і відповідно з загальноприйнятим коефіцієнтом перерахунку [Гуськова Т.А. Оценка безопасности лекарственных средств на стадии доклинического изучения // Химико-фармацевтический журнал. - 1990. - №7. С. 10-11.] може бути використана для людини в дозі до 1800 мг суміші активних компонентів на добу. Дослід 4. Вивчення фармацевтичної стабільності перорального лікарського засобу, що заявляється, у вигляді пігулок порівняно з прототипом. Вивчення стабільності перорального лікарського засобу, що заявляється, у вигляді пігулок, отриманих відповідно до досліду 2 і пігулок прототипу, описаних в прикладі "Е" з плівковим покриттям "D", проводили в стресових умовах [ІСН Q1A, QIC; Handbook of Stability Testing in Pharmaceutical Development, 2008]. Пігулки були упаковані в Alu/Alu блістери. Стресовій дії препарат піддавали в кліматичній камері Binder KBF-240 при Т=40 °С і відносній вологості 75 % протягом 6 місяців. Результати дослідження представлені в таблиці 3. Таблиця 3 Характеристика пігулок композиції, що заявляється, і прототипу при стресовій дії Препарат, показники якості Прототип Вміст вологи, % Кількісний вміст іона SAM, мг (S,S)-(+) S-аденозил-L-метіонін, % Домішки: Аденозин, % Метилтіоаденозин, % Композиція, що заявляється Вміст вологи, % Метіонін Янтарна кислота Інозин Таурин Домішки: Гіпоксантин, % Гуанозин, % Неідентифіковані домішки Характеристика пігулок при зберіганні в стресових умовах 0 міс. 1 міс. 3 міс. 6 міс. 0,35±0,05 407,2±4,2 82,6±3,9 0,37±0,06 401,4±5,1 79,8±3,4 0,40±0,06 401,5±4,2 74,2±3,5 0,42±0,05 396,0±4,7 72,1±2,1 0,25±0,01 0,33±0,06 0,36±0,02 0,45±0,03 0,46±0,02 0,62±0,06 0,55±0,03 0,77±0,02 0,77±0,03 51,5±0,3 249,0±4,6 102,7±0,5 50,3±0,8 0,82±0,05 52,0±0,3 252,4±4,8 101,9±0,4 49,8±0,7 0,82±0,06 52,20±0,3 248,4±4,2 102,1±0,4 49,8±0,7 0,80±0,05 51,3±0,3 252,9±5,3 102,3±0,5 50,0±0,8 0,15±0,01 0,10±0,02 0,45±0,05 0,14±0,02 0,13±0,03 0,43±0,02 0,16±0,01 0,12±0,02 0,55±0,04 0,15±0,01 0,13±0,04 0,50±0,02 Представлені дані показують, що при зберіганні кількісний вміст SAM в прототипі знижується, а кількість домішок росте. Крім того спостерігається рацемізація SAM з утворенням неактивного оптичного ізомеру - (R,S) -(+) S-аденозил-Lметіоніну і падінням активного (S,S) -(+) Sаденозил-L-метіоніна. Пероральний лікарський засіб на основі композиції, що заявляється, проявляє вищу стабільність - кількість активних компонентів не зменшується, і суттєвого приросту домішок не спостерігається. Це свідчить про перевагу пропонованого препарату з погляду збереження дозування активних компонентів і зниження риски побічних ефектів в результаті утворення домішок. 13 96112 Дослід 5. Вивчення біодоступності активних компонентів і ефективності пероральної лікарської форми на основі композиції, що заявляється, порівняно з прототипом шляхом дослідження SAMстимулюючої активності було проведене на 36 кроликах породи Шиншила. Всі тварини отримували стандартний гранульований корм і містилися у віварії відповідно до прийнятих міжнародних норм поводження з лабораторними тваринами. Тварини були розділені на 3 групи по 12 особин. Тваринам першої експериментальної групи вводили по одній пігулці, отриманій в досліді 2. Тваринам другої експериментальної групи вводили по 2 пігулки з сумарним змістом SAM 400 мг, згідно прототипу (приклад "Е" з плівковим покриттям "D"). 14 Тваринам третьої експериментальної (контрольної) групи вводили плацебо - пігулки, приготовані з фармакологічно неактивних інгредієнтів: 400 мг лактози, 400 мг мікрокристалічної целюлози, оксипропілметилцелюлозу, полісорбат 80, кальцію стеарат і покриті співполімером метакрилової кислоти і етилакрилату). У кожній групі тварин через 2, 4, 6 і 8 годин після перорального введення препаратів забивали по 3 особини і витягували печінку для кількісного визначення SAM. Концентрацію SAM в гомогенатах печінки визначали методом ВЕЖХ. Отримані дані, представлені в таблиці 4, показали, що композиція, що заявляється, у вигляді пігулок, покритих кишковорозчинною оболонкою, має високу біодоступність активних компонентів, оскільки забезпечує в 1,7-2,5 разу вищий рівень концентрації SAM в печінці кроликів в порівнянні з прототипом. Таблиця 4 Концентрація SAM в гомогенатах печінці кроликів при пероральному введенні Препарат Композиція, що заявляється Прототип Контроль (плацебо) Концентрація SAM в гомогенатах печінці г/г (М±m) 2 годин 4 години 6 годин 8 годин 19,1±0,3 41,0±0,5 54,4±0,5 31,6±0,5 10,3±0,3 18,7±0,4 21,3±0,4 18,4±0,2 7,0±0,2 7,4±0,2 6,5±0,2 7,2±0,2 Дослід 6. Дослідження гепатопротекторної дії перорального лікарського засобу, що заявляється, на моделі поліорганного алкогольного ураження. Дослід був поставлений на основі стандартної моделі алкогольного поліорганного ураження. У експерименті використано 80 особин щурів-самців породи "Вістар" стандартної маси (160-170 г). Для моделювання токсичного гепатозу у 60 щурів використовували етанол, який вводили 3 рази в день внутрішньошлунково через металевий атравматичний зонд в дозі 4 г/кг (половина від LD50) впродовж 5 днів (етанол розводили у дистильованій воді до 40 % концентрації). Через 6 днів у частини експериментальних тварин, по морфологічній картині печінки, підтверджувалася наявність токсичного жирового гепатозу. Інтоксикація етанолом порушувала функціональну активність печінки: білково-синтетичну, детоксикуючу, ліпосинтезуючу. Це супроводжувалося біохімічними ознаками цитолізу. У крові підвищувалася активність трансаміназ, фосфатаз, знижувався вміст в сироватці крові загального білка, ліпідів, резерву сульфгідрильних груп, підвищувалися рівні білірубіну і церулоплазміну. У печінці зменшувалися запаси глікогену, відновленого глутатіону, рівні детоксикуючих цитохромів. Ураження печінки супроводжувалося зниженням її функціональної активності: значно зростала тривалість гексеналового сну, сповільнювалася екскреція бромсульфалеїну. Всього було сформовано 4 експериментальних групи по 20 тварин, яким після формування токсичного алкогольного гепатозу впродовж 10 днів з лікувальною метою вводили за допомогою атравматичного зонда 1 раз на добу препарати: 1. група інтактних тварин без алкогольної інтоксикації (контроль моделі алкогольної інтоксикації) 2. група тварин з алкогольною інтоксикацією без лікування - вводили 10 % крохмальну суспензію; 3. група тварин з алкогольною інтоксикацією і лікуванням композицією, що заявляється, яку вводили у вигляді розтертих пігулок, отриманих відповідно до досліду 2, в дозі 180 мг/кг по сумі активних компонентів у складі 10 % крохмальної суспензії; 4. група тварин з алкогольною інтоксикацією і лікуванням прототипом (приклад Е з плівковим покриттям D), у вигляді розтертих пігулок у складі 10 % крохмальної суспензії, в дозі, еквівалентної SAM -160 мг/кг. Гепатопротекторну активність засобу, що заявляється, порівняно з прототипом оцінювали по декількох групах показників: біохімічним, морфометричним, функціональним. Про гепатопротекторну ефективність судили по клінічній картині, динаміці маси тіла, відносній масі печінки, змісту білірубіну, трансаміназ, фосфатаз, церулоплазміну, загального білка, ліпідів сироватки крові, змісту глікогену, глутатіону, SH-груп, глютамілтрансферази, цитохромів в печінці, навантажувальним пробам (гексеналовий тест, бромсульфоалеїнова проба) і гістологічній картині печінки. Статистичну обробку результатів експериментів проводили по Стьюденту-Фішеру. Клінічна картина в другій групі щурів, що отримували етанол без лікування, характеризувалася гіподинамією, загальмованістю, закошланістю ше 15 96112 рсті і неохайністю тварин. Вони гірше набирали вагу, ніж решта щурів. У цій групі до 17-го дня дослідження загинуло 60 % тварин. У третій групі тварин, що отримували заявлений лікарський засіб, відсоток загибелі склав 20 %, різко зменшився прояв інтоксикації у щурів, викликаний введенням етанолу, - тварини були рухомі, охайні, мали хороший апетит. У четвертій групі, що отримувала прототип, спостерігалася 40 % загибель тварин, спостерігалося поліпшення поведінкових реакцій, проте вони були менш виражені в порівнянні з тваринами третьої групи. Інтоксикація етанолом супроводжується зниженням маси тіла і збільшенням відносної маси 16 печінки. Лікування заявленим засобом сприяє нормалізації цих показників більшою мірою в порівнянні з прототипом (табл. 5): маса печінки щурів третьої групи, була на 25,7 % менше печінки щурів, що отримували лікування прототипом, і практично не відрізнялася від відносної маси інтактних тварин. Смертність тварин в групі прототипу на моделі алкогольного ураження печінки була в 1,5 разу вище, при цьому біохімічні показники тварин, що вижили, в групах розрізнялися трохи; достовірна різниця в порівнюваних групах була отримана за даними динаміки АлАТ, лужної фосфатази і тимолової проби. Отримані дані корелювали з результатами біохімічних аналізів (табл. 5, 6). Таблиця 5 Маса тіла щурів і відносна маса печінки Показники, що вивчаються (М±m) Маса тіла, г Відносна маса печінки, мг/100 г Інтактні тварини 181,5 ± 4,8 46,2 ± 2,3 Експериментальні групи Лікування компоЛікування протоБез лікування зицією, що заявтипом ляється 161,5 ± 8,9 180,2 ± 8,4 172,0 ± 6,1 71,1 ± 4,4 50,2 ± 3,4 63,1 ± 3,8 Таблиця 6 Біохімічні і функціональні показники стану печінки Показники, що вивчаються (М±m) Загальний білок, г/л Загальні ліпіди, г/л АлАТ сир-ка, мкмоль/с.л АсАТ сир-ка, мкмоль/(с.л) КФ, мккат/л Лужна фосфатаза, ккат/л ЛДГ, ммоль/ч/л Тимолова проба, од. помутніння SH-групи, сироватка, мг % Відновлений глутатіон, печінка, мг % -4 Р450, печінка, ммоль/мг білка × 10 -4 В5, печінка, ммоль/мг білка × 10 Глікоген, печінка, мг % Гексеналовий сон, сік Концентрація бромсульфалеїну на 10-ій хвилині після введення, сироватка, екстинкція Церулоплазмін, сироватка, мг/л Холестерин, сироватка, ммоль/л Білірубін загальний, сироватка, ммоль/л Інтактні 64 ± 1 3,4 ± 0,3 0,30 ± 0,01 0,19 ± 0,02 0,73 ± 0,10 0,68 ± 0,08 4,82 ± 0,30 1,40 ± 0,01 1532 ± 64 167 ± 5 1,15 ± 0,03 0,85 ± 0,04 2466±100 24,8 ± 5,9 Експериментальні групи Композиція, що Без лікування заявляється 31 ± 2* 63 ± 4 2,4 ± 0,2* 3,6 ± 0,1 2,49 ± 0,09* 0,32 ± 0,08 0,38 ± 0,02* 0,22 ± 0,04 2,28 ± 0,18* 0,71 ± 0,11 2,53 ± 0,22* 0,69 ± 0,10 8,39 ± 0,35* 4,68 ± 0,30 5,88 ± 0,35* 1,39 ± 0,10 258 ± 39* 1568 ± 39 59 ± 10* 172 ± 12 0,55 ± 0,08* 1,19 ± 0,03 0,57 ± 0,05* 0,81 ± 0,01 722 ± 77* 2413 ± 105 99,2 ± 9,4 24,1 ± 5,6 Прототип 58 ± 5 3,3 ± 0,1 0,57 ± 0,09* 0,34 ± 0,11 1,03 ± 0,11* 0,96 ± 0,14 5,45 ± 0,36 2,91 ± 0,48* 1619 ± 73* 165 ± 8 0,95 ± 0,03 0,71 ± 0,03 2180 ± 144 29,9 ± 4,7 13,5 ± 0,8 40,3 ± 4,2* 13,7±0,5 13,3±0,7 408 ± 20 1,83 ± 0,22 3,1 ± 0,3 980 ± 79* 1,29 ± 0,20 7,2 ± 0,2* 441 ±21 1,78 ±0,34 3,2±0,1 484 ± 25 1,64±0,20 3,7±0,4 Примітки: * - Р