Одержання і застосування бактеріального гістаміну

Реферат: Винахід належить до способу відбору специфічних пробіотичних молочнокислих бактерій, які продукують гістамін, і застосування таких штамів для корисних ефектів для ссавців. Зокрема, заявлено спосіб відбору молочнокислого бактеріального штаму для застосування в локальному продукуванні гістаміну в ссавці, де цей спосіб передбачає скринінг бактерій на присутність активного оперону гістидину і відбір штаму, який має активний оперон гістидину і здатний продукувати гістамін. Переважно вказаний штам відбирають на його здатність продукувати гістамін на рівні, більшому ніж 250 пг/мл. Крім того, даний винахід забезпечує продукти, що містять штами, одержувані способами відбору цього винаходу, для застосування в локальному продукуванні гістаміну в ссавці, зокрема для застосування в лікуванні або профілактиці запальних станів. UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ДАНИЙ ВИНАХІД Даний винахід стосується способу відбору специфічних пробіотичних молочнокислих бактерій, які продукують гістамін, і застосування таких штамів для надання корисних ефектів для хазяїна. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Продовольча і сільськогосподарська організація Об'єднаних Націй (ФАО) визначає пробіотики як "живі мікроорганізми, які після введення в достатніх кількостях людині здійснюють користь для здоров'я (викликають зміцнення здоров'я) цієї людини". На даний час ряд різних бактерій використовують як пробіотики, наприклад бактерії, які продукують молочну кислоту, такі, як штами Lactobacillus і Bifidobacteria. Бактерії, які продукують молочну кислоту, не тільки використовуються внаслідок їх корисної дії на здоров'я людини або тварини, але вони також широко використовуються в харчовій промисловості для процесів ферментації. Ефективність пробіотиків є штамспецифічною, і кожний штам може сприяти здоров'ю хазяїна через різні механізми. Пробіотики можуть запобігати або інгібувати проліферацію патогенів, пригнічувати продукування вірулентних факторів патогенами або модулювати імунну реакцію в прозапальному або протизапальному шляху. Застосування різних штамів пробіотичних, продукуючих молочну кислоту бактерій Lactobacillus reuteri є багатообіцяючою терапією для усунення пароксизмального болю ("дитячих колік"), ослаблення екземи, зменшення нападів професійних захворювань і супресії інфекції. Helicobacter pylori. L. reuteri вважається характерним для шлунково-кишковому тракту людини організмом і присутній, наприклад, на слизовій оболонці гастрального корпусу, гастральної порожнини, дванадцятипалої кишки і клубової кишки. Див., наприклад, патенти США з номерами 5439678, 5458875, 5534253, 5837238 і 5849289. При вирощуванні клітин L. reuteri в анаеробних умовах в присутності гліцерину вони продукують антимікробну речовину, відому як реутерин (β-гідроксипропіональдегід). Взаємозв'язок між хазяїном і його мікробами є складним, і для деяких бактерій цей взаємозв'язок хазяїн/мікроб розвивався протягом багатьох років співеволюції. Це, мабуть, є особливо вірним для Lactobacillus reuteri. Наші знання мутуалістичного взаємозв'язку між мікробами кишечнику і людини-хазяїна існують в його періоді новонародженості, але ми вже високою мірою усвідомлюємо, що мікробіом кишечнику грає важливу роль в розвитку кишечнику й імунної системи, харчуванні, і нові ланки встановлюються між мікробіомом кишечнику і головним мозком. Дисбіоз, пертурбація нормального мікробіома кишечнику, розумівся в широкому діапазоні пов'язаних із захворюваннями процесів, які включають в себе процеси, що впливають на локальне середовище кишечнику, такі, як запальна хвороба кишечнику (IBD) і синдром подразненої товстої кишки (слизовий коліт) (IBS), і процеси в ділянках, віддалених від кишечнику, такі, як метаболічний синдром. Суттєвий терапевтичний потенціал лежить в мікробіомі кишечнику, і додається дослідження в напрямі подальшої задачі зміни мікрофлори для запобігання і/або лікування різних пов'язаних із захворюванням процесів. Таким чином, існує необхідність в розумінні таких специфічних взаємодій між мікробами і людиною, пов'язаних з конкретним захворюванням або іншими ситуаціями, що впливають на здоров'я хазяїна таким чином, що велика частина придатних пробіотичних штамів може бути відібрана і використана для протидії таким розвиткам. СУТЬ ВИНАХОДУ Описаний тут винахід забезпечує локальне продукування гістаміну в ссавцях, зокрема в людині, причому це локальне продукування гістаміну включає в себе, але не обмежується ними, продукування в GI-тракті (гастроентерологічному тракті), сечостатевому тракті (GU), порожнині рота, в легенях і дихальних шляхах, на шкірі і т. д. тіла людини за допомогою відбору певних штамів молочнокислих бактерій. Ці бактерії можуть доставлятися разом з деякими амінокислотами і/або цукрами, вводитися окремо або вже бути присутніми в активній ділянці. Первинною метою даного винаходу є відбір (селекція) штамів, які можуть локально продукувати гістамін в різноманітних місцях, що включають в себе GI-тракт, GU-тракт, порожнину рота, в легенях і дихальних шляхах, на шкірі і т. д. тіла людини. Наступною метою цього винаходу є забезпечення продуктів, які містять вказані штами. Наступною метою даного винаходу є комбінування введення бактерій з введенням гістидину або харчових продуктів або композицій, що містять гістидин, для гарантії локального генерування гістаміну. Таким чином, даний винахід стосується нового способу для відбору клітин молочнокислих бактерій, які застосовні як пробіотики і в терапії. Цей новий спосіб передбачає скринінг і відбір на штами молочнокислих бактерії, які мають активний оперон гістидину і здатні продукувати гістамін. Несподівано ці молочнокислі бактеріальні штами, відібрані таким способом, застосовні 1 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 як пробіотики і в терапії, зокрема в продукуванні протизапальних ефектів, за допомогою локального продукування гістаміну. Ці ефекти даних бактерій є несподіваними, як обговорюється тут в іншому місці, і раніше присутності в харчових продуктах бактерій, які продукують гістамін, активно уникали внаслідок пізнаваного ризику для здоров'я, наприклад потенційних токсичних ефектів. Так, введення ссавцю молочнокислих бактерій, здатних локально продукувати гістамін, або фактично скринінг і селекція (відбір) молочнокислих бактерій на таку здатність локального продукування гістаміну на основі присутності активного оперону гістаміну є контрінтуїтивним відносно такої доктрини. Дійсно, раніше ніколи не повідомлялося, що пробіотики продукують гістамін. Таким чином, в найширшому розумінні даний винахід забезпечує спосіб відбору бактеріального штаму, який продукує молочну кислоту, для застосування в локальному продукуванні гістаміну в ссавці, де вказаний спосіб передбачає скринінг бактерій на присутність активного оперону гістидину і відбір штаму, який має активний оперон гістидину і здатний продукувати гістамін. Оперон гістидину містить три гени (антипортера гістидину/гістаміну, гістидиндекарбоксилази пірувоїл типу А (HdcA) і гістидиндекарбоксилази пірувоїл типу В (HdcВ)). Вважається, що активність кожного з цих генів є важливою для даного винаходу. Так, в способах скринінгу цього винаходу кандидатні бактерії оцінювали на присутність всіх трьох генів і відбирали штами, позитивні відносно всіх трьох генів. Будь-який придатний спосіб може бути використаний для детектування присутності всіх трьох генів, наприклад, генетичні способи, такі, як ПЛР. Одержання хороших рівнів гістаміну може бути також індикатором присутності всіх трьох генів і присутності активного оперону гістидину. Таким чином, цей спосіб відбору даного винаходу включає в себе також стадію відбору штаму, який здатний продукувати гістамін. Переважними є штами з високими рівнями продукування гістаміну. Таким чином, в переважних варіантах здійснення штам відбирають на його здатність продукувати гістамін на рівні, більшому, ніж 200, переважно більшому, ніж 250 або більш переважно більшому, ніж 300 пг/мл, наприклад, на рівні, більшому, ніж 350, 400, 450 або 500 пг/мл. Такі величини звичайно належать до величин гістаміну, виміряних в супернатанті штамів в культурі. Придатні способи вимірювання рівнів продукування гістаміну будуть добре відомі особі з кваліфікацією в даній галузі. Тут наводиться як приклад і є переважним спосіб масспектрометрії, більш конкретно - потрійної квадрупольної мас-спектрометрії. Однак ELISA або імуноаналізи можуть бути рівним чином використані для оцінювання і кількісного визначення продукування гістаміну. Так, в деяких варіантах здійснення спосіб відбору буде включати в себе стадію детектування кількості або рівня гістаміну, продукованого кандидатним штамом. Внаслідок подальших застосувань штамів, які відбирають способами цього винаходу, після відбору або виділення штамів, які продукують гістамін, інші варіанти здійснення будуть включати в себе додаткові способи культивування або розмноження таких штамів або, можливо, зберігання таких штамів для подальших застосувань. Такі додаткові стадії (і фактично стадії відбору способів цього винаходу) будуть звичайно необхідними для проведення у придатному культуральному середовищі, яке підтримує продукування гістаміну. Переважні культуральні середовища будуть містити придатне джерело вуглецю, яке буде підтримувати продукування гістаміну вказаним штамом. У особливо переважних варіантах здійснення ці середовища будуть містити глюкозу як джерело вуглецю і переважно не будуть містити сахарози або щонайменше будуть містити тільки сахарозу при такому рівні, який не буде суттєво погіршувати продукування гістаміну цим штамом. Гістидин або аналог гістидину може бути також забезпечений, необов'язково разом з джерелами інших амінокислот. У переважних варіантах здійснення вказаним штамом є штам Lactobacillus reuteri. Відразу після відбору придатного штаму з використанням способу даного винаходу він може бути потім використаний для локального продукування гістаміну в ссавці. Таким чином, вказані штами здатні також до локального продукування гістаміну в ссавці. Таким чином, один додатковий аспект даного винаходу забезпечує продукт, який містить клітини штаму молочнокислих бактерій, одержуваного способом відбору цього винаходу, де вказаний штам молочнокислих бактерій має активний оперон гістидину і здатний продукувати гістамін, для застосування в локальному продукуванні гістаміну в ссавці. Як буде описано тут в іншому місці, переважними застосуваннями є застосування в лікуванні і/або профілактиці запальних станів або в лікуванні і/або профілактиці станів або захворювань, які будуть одержувати користь від локального продукування гістаміну. Наприклад, таке локальне продукування гістаміну може приводити до протизапального ефекту. 2 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Альтернативні варіанти здійснення цього винаходу забезпечують штам молочнокислих бактерій, який здатний продукувати гістамін, для застосування в локальному продукуванні гістаміну в ссавці, де вказаний штам молочнокислих бактерій має активний оперон гістидину. Переважні ознаки цього штаму і його застосування описані тут в іншому місці. Забезпечені також способи лікування або способи локального продукування гістаміну в ссавці, причому вказані способи передбачають введення продукту, який містить клітини штаму молочнокислих бактерій, одержувані способом відбору цього винаходу, або введення штаму молочнокислих бактерій, де вказаний штам молочнокислих бактерій має активний оперон гістидину і здатний продукувати гістамін вказаному ссавцю в кількості, ефективній для можливості локального продукування гістаміну у вказаному ссавці. Переважні ознаки цього штаму і його терапевтичні застосування описані тут в іншому місці. Даний винахід забезпечує також застосування продукту, який містить клітини молочнокислих бактерій, одержувані способом відбору цього винаходу, де вказаний штам молочнокислих бактерій має активний оперон гістидину і здатний продукувати гістамін, в приготуванні композиції або лікарського засобу для застосування в локальному продукуванні гістаміну в ссавці. Альтернативні варіанти здійснення забезпечують застосування штаму молочнокислих бактерій, де вказаний штам молочнокислих бактерій має активний оперон гістидину і здатний до локального продукування гістаміну в ссавці. Переважні ознаки цього штаму і його терапевтичні застосування описані тут в іншому місці. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігура 1 - кількісне визначення гістаміну у фракціях HILIC-HPLC. Використовували потрійну квадрупольну мас-спектрометрію для кількісного визначення гістаміну, присутнього у вибраному діапазоні фракцій HILIC-HPLC. TNF-інгібуючі фракції мали найвищі кількості гістаміну зі всіх перевірених фракцій. Фігура 2 - очищений гістамін і гістамін з L. reuteri 6475 інгібує продукування TNF через H 2рецептор гістаміну. А. Очищений гістамін значущо інгібував продукування TNF, ефект, який блокується специфічними антагоністами H2-рецепторів залежним від дози чином. Кондиціоновані середовища (або супернатант), що містять секретовані фактори зі штаму 6475 (що включають в себе гістамін), значущо інгібували продукування TNF-ефекту, який частково блокується специфічними антагоністами H2-рецепторів. N=3, р-величина 0,05 порівняно з контрольним середовищем, **р-величина 0,05 порівняно з гістаміном, ***р-величина 0,05 порівняно з кондиціонованим середовищем ATCC 6475 (CM). В. Промивання осаду клітин зі штаму 6475, що містить гістамін, пригнічувало продукування TNF-ефекту, який частково блокувався специфічними антагоністами H2-рецепторів. Фракція В3, яка містить відносно чистий гістамін, інгібувала продукування TNF-ефекту, який повністю блокувався специфічними антагоністами H2-рецепторів. N=3, р-величина 0,05 порівняно з контрольним середовищем, **р-величина 0,05 порівняно з промиванням клітин ATCC 6475 (CP), ***р-величина 0,05 порівняно з фракцією B3. Фігура 3 - оперон гістидину є важливим для TNF-інгібуючого фенотипу L. reuteri 6475. А. Цей оперон гістидину складається з трьох генів: антипортера гістидину/гістаміну, hdcA і hdcB. В. Мутація в будь-якому одному гені в цьому опероні гістидину приводить до часткової втрати ** супресії TNF L. reuteri 6475. N=9, р-величина 0,05 порівняно з контрольним середовищем, рвеличина 0,05 порівняно з ATCC PTA 6475. Фігура 4-L. reuteri 6475 значущо зменшував втрату маси, індуковану введенням TNBS; ця фігура представляє дані з двох незалежних експериментів: *р0,05, **р0,01, ***р0,001. Фігура 5-L. reuteri 6475 значущо зменшував макроскопічне пошкодження ободової кишки, індуковане введенням TNBS; ця фігура представляє дані з двох незалежних експериментів: *р0,05, ***р0,001. Фігура 6-L. reuteri 6475 значущо зменшував концентрацію SAA, індуковану введенням TNBS; ця фігура представляє дані з двох незалежних експериментів: *р0,05, ***р0,001. Фігура 7 - мутант hdcA давав зменшену здатність атенуйованого коліту; ця фігура представляє дані з двох незалежних експериментів: *р0,05, ***р0,001. Фігура 8 - мутант hdcA давав зменшену здатність атенуйованого коліту; ця фігура представляє дані з двох незалежних експериментів: *р0,01, ***р0,001. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ДАННОГО ВИНАХОДУ І ЙОГО ПЕРЕВАЖНИХ ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ Автори даного винаходу виявили тут, що відібрана група лактобацил, які включають в себе певні штами Lactobacillus reuteri, локально продукує гістамін при конкретних умовах росту, і що такий гістамін буде давати користь для хазяїна, наприклад, зменшення запалення, зменшення деяких типів раку і т. д. 3 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Гістамін Гістамін є органічною азотистою сполукою, що бере участь в декількох, асоційованих зі здоров'ям, процесах ссавця, які включають в себе локальні імунні реакції, а також регулює фізіологічну функцію в кишечнику і діє як нейротрансмітер. Як частина імунної реакції на чужорідні патогени гістамін продукується базофілами і мастоцитами (тучними клітинами). Гістамін може бути одержаний з декарбоксилювання амінокислоти гістидину - реакції, каталізованої ферментом L-гістидиндекарбоксилазою. Бактерії здатні продукувати гістамін з використанням ферментів гістидиндекарбоксилаз, неспоріднених з ферментами, що виявляються в еукаріотах. Досі таке продукування гістаміну деякими бактеріальними штамами розглядалося швидше як небезпека для здоров'я, ніж як можлива користь для людей. Наприклад, отруєння Scombroid (форма неінфекційного захворювання новонароджених) зумовлене продукуванням гістаміну бактеріями в їжі, що зіпсувалася, зокрема рибі. Ферментовані харчові продукти і напої природно містять малі кількості гістаміну внаслідок схожого перетворення, виконуваного ферментацією бактерій або дріжджів. Доставка деяких контрольованих кількостей гістаміну з відібраних бактерій може несподівано давати швидше корисні ефекти, ніж шкідливі ефекти, як можна було б очікувати з вищезазначених досліджень. Рецептори гістаміну є класом G-білокзв'язаних рецепторів з гістаміном як їх ендогенним лігандом. Є чотири відомі рецептори гістаміну: Н1-рецептор (H1R), H2-рецептор (H2R), H3рецептор (H3R) і H4-рецептор (H4R). Vannier et al. (Histamine Suppresses Gene Expression and Synthesis of Tumor Necrosis Factor а via Histamine H2-Receptors; J Exp. Med. 1991 July 1; 174(1):281-4) показали, що LPS-індукований синтез TNF-α в мононуклеарних клітинах периферичної крові пригнічувався гістаміном, і автори додатково передбачають, що вивільнення гістаміну з тучних клітин може обмежувати ступінь запальних та імунних реакцій пригніченням локального синтезу цитокінів в H2-рецепторнесучих клітинах. Протизапальна активність гістаміну була раніше описана Wang et al. (Histamine Antagonizes Tumor Necrosis Factor (TNF) Signaling by Stimulating TNF Receptor Shedding from the Cell Surface and Golgi Storage Pool; J. Biol. Chem. 278(24): 21751-21760), які показали, що гістамін викликає транзиторну втрату поверхневого TNFR1, збільшує виділення TNFR1 і мобілізацію молекул TNFR1 з апарату Гольджі в культивованих ендотеліальних клітинах людини. Ін'єкція гістаміну в шкіру людини, трансплантовану на імунонедостатніх мишах, викликала виділення TNFR1 або зменшувала TNF-опосередковану індукцію ендотеліальних молекул адгезії. Vannier et al. and Wang et al. не згадували нічого ні про використання бактеріальних штамів як пробіотиків, ні про те, як відбирати ці штами на основі їх гістамінпродукуючих здатностей для гарантії певних, корисних для здоров'я ефектів для хазяїна, таких, як протизапальні ефекти. Цеплен, форму фармацевтичної категорії дигідрохлориду гістаміну, використовують для запобігання рецидиву в пацієнтів, діагностованих як такі, що мають гострий мієлоїдний лейкоз (AML). Цеплен вводять разом з низькими дозами імуноактивуючого цитокіну інтерлейкіну-2 (IL2) в постремісійній фазі AML, тобто після завершення пацієнтами первинної хіміотерапії. Дослідження показали, що Цеплен/IL-2 може індукувати імуноопосередковане знищення лейкозних клітин. Це лікування (підшкірні ін'єкції) надається у вигляді 3-тижневих циклів для пацієнтів вдома протягом 18 місяців. Побічні ефекти Цеплену включають в себе транзиторні припливи і головний біль. Для пацієнтів було б переважним одержання локально вироблюваного гістаміну у міру необхідності, замість підшкірних ін'єкцій; ця стратегія доставки може бути досягнута введенням бактеріально вироблюваного гістаміну пацієнту з використанням штамів, відібраних відповідно до цього дослідження. Було відомо раніше, що грамнегативні бактерії утворюють гістамін, наприклад, в сирій рибі і сирому м'ясі, після неприйнятної температури, і що грампозитивні бактерії викликають псування від гістаміну ферментованих продуктів, таких, як сир, ковбаса, м'ясо, соєвий соус, пиво і вино. Ідентифікація бактерій, які продукують гістамін, у харчових продуктах була важкою. Lactobacillus reuteri був раніше також асоційований з продукуванням гістаміну, Casas et al. (Validation of the Probiotic Concept: Lactobacillus reuteri Confers Broad-spectrum Protection against Disease in Humans and Animals.; 2000, ISSN 0891-060X) повідомляє, що було показано, що два штами L. reuteri in the hands Straub et al. (Z Lebensm Unters Forsch (1995) 201:79-82) декарбоксилюють L-гістидин з утворенням гістаміну, і ці автори застерігають проти використання таких штамів для ферментації харчових продуктів і як пробіотиків. Trip et al. (HdcB, а novel enzyme catalyzing maturation of pyruvoyl-dependent histidine decarboxylase; Molecular Microbiology (2011) 79(4), 861-871) посилаються на три типи генетичної організації локусів декарбоксилювання гістидину серед гістамінпродукуючих грампозитивних 4 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бактерій. Найбільша група виявлена в молочнокислих бактеріях, що включають в себе L. hilgardii 0006, L. buchneri B301, L. reuteri F275 і Т. halophilus. Було показано, що Lactobacillus hilgardii 0006 продукує гістамін; в дослідженні, що виконується Lucas et al. (Histamine-Producing Pathway Encoded on an Unstable Plasmid in Lactobacillus hilgardii 0006; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Mar. 2005, Vol. 71, № 3, р. 1417-1424), вони додатково стверджують, що гістамін є домішкою, яка з'являється в деяких продуктах під час росту небажаних бактерій. Lucas et al. виконали скринінг колекції молочнокислих бактерій вина для ідентифікації генів, що беруть участь у гістамінпродукуючому шляху грампозитивної бактерії вина. Зі швейцарського сиру був виділений гістамінпродукуючий штам Lactobacillus buchneri, який, мабуть, брав участь у спалаху отруєння гістаміном. (Summer et al. Isolation of histamineproducing Lactobacillus buchneri from Swiss cheese implicated in а food poisoning outbreak.; Applied and Environmental Microbiology (1985), Vol. 50, Issue 4, р. 1094-1096). Calles-Enriquez et al. (Sequencing and Transcriptional Analysis of the Streptococcus thermophiles Histamine Biosynthesis Gene Cluster: Factors That Affect Differential hdcA Expression; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Sept. 2010, Vol 76, № 18, р. 6231-6238) описують гістамінпродукуючі штами Streptococcus thermophiles, термофільну закваску, використовувану для приготування йогурту і деяких різновидів сиру. Крім того, вони вказують на те, що присутність штамів зі здатністю декарбоксилювання гістидину могла б приводити до продуктів, що містять гістамін, продукований під час приготування або під час зберігання, перед вживанням, і що це лежить в основі важливості використання тільки гістаміннегативних штамів в приготуванні ферментованих молочних продуктів. Навіть якщо раніше було відомо, що деякий Lactobacillus може виробляти гістамін, точно не відомо, що здатність продукувати гістамін є ключовим фактором для гарантії певних корисних ефектів для здоров'я для його хазяїна, наприклад протизапальних властивостей деяких штамів Lactobacillus. З попереднього рівня техніки не відомо і не є очевидним, що це може бути використано для скринінгу або відбору певних пробіотичних штамів Lactobacillus. Мастоцити (тучні клітини) Тучна клітина (також відома як мастоцит і лаброцит) є резидентною тучною клітиною декількох типів тканин і містить багато гранул, які багаті гістаміном і гепарином. Хоч вони найбільш добре відомі через їх роль в алергії і анафілаксії, тучні клітини також грають важливу захисну роль, будучи, наприклад, тісно пов'язаними із загоєнням ран і захистом проти патогенів. Тучні клітини присутні в більшості тканин, звичайно оточуючи кровоносні судини і нерви, і особливо помітні поблизу пограничних шарів між зовнішнім середовищем і внутрішнім середовищем, таким як шкіра, слизова оболонка легень і травний тракт, а також в порожнині рота, кон'юнктиви і носа. У алергічних реакціях тучні клітини залишаються неактивними, поки алерген не зв'язується з IgE вже в асоціації з цією клітиною. Інші події активації мембрани або можуть праймувати тучні клітини для подальшої дегрануляції, або можуть діяти в синергії з трансдукцією сигналу FceRI. Гістамін з такої грануляції звужує посткапілярні венули, активує ендотелій і збільшує проникність кровоносних судин. Вивільнення гістаміну приводить до локального набряку (опухання), тепла, почервоніння і атрагування інших запальних клітин до сайта вивільнення. Воно також подразнює нервові закінчення (приводячи до свербежу або болю). Шкірними ознаками вивільнення гістаміну є реакція "припливу крові до обличчя і пухирів". Шишка і почервоніння відразу ж після укусу комара є хорошим прикладом цієї реакції, яка виявляється протягом секунд після обробки тучних клітин алергеном. Інші фізіологічні активності тучних клітин є набагато менш добре зрозумілими. Декілька ліній доказу передбачають, що тучні клітини можуть мати явно фундаментальну роль в спадковому імунітеті - вони здатні удосконалити широкий ряд важливих цитокінів і інших запальних медіаторів, таких, як TNF-α, вони експресують множинні "рецептори упізнавання патернів", які, як вважається, включені в розпізнавання широких класів патогенів, і миші без тучних клітин вважаються набагато більш чутливими до різних інфекцій. З урахуванням токсичності бактеріального гістаміну в харчових продуктах і того факту, що рекомендується уникнення гістамінпродукуючих штамів в ферментованих продуктах (див. додатково приклади в Calles-Enriquez et al. Sequencing and Transcriptional Analysis of the Streptococcus thermophiles Histamine Biosynthesis Gene Cluster: Factors That Affect Differential hdcA Expression; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Sept. 2010, Vol. 76, № 18, р. 6231-6238), не можна вважати очевидним застосування певних відібраних штамів Lactobacillus для локального продукування гістаміну в лікуванні і/або профілактиці різних захворювань. 5 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Взаємовідношення між хазяїном і його мікробами є комплексним, оскільки є точно власні типи клітин ссавців, такі, як тучні клітини. Це взаємовідношення хазяїн-мікроб розвивалося протягом багатьох років співеволюції, це включає в себе продукування мікробами різних метаболітів, які можуть бути корисними для хазяїна з точки зору живлення, імунологічно і т. д., діє як всі або частина антагоністів, агоністів, десенсибілізації і т. д. специфічних рецепторів або інших процесів. Таким чином, є необхідність в розумінні таких специфічних взаємодій між мікробами і людиною таким чином, щоб більша частина придатних пробіотичних штамів могла бути відібрана і використана для протидії таким розвиткам. Автори винаходу виявили тут, що відібрана група лактобацил, яка включає в себе деякі штами Lactobacillus reuteri, локально продукує гістамін в специфічних умовах росту. Такий локально продукований гістамін, на протилежність колишнім думкам, буде приносити користь хазяїну множинними шляхами, що включають в себе зменшення запалення, зменшення певних типів раку і т. д. Однією метою цього винаходу є забезпечення продуктів, які містять вказані штами разом зі специфічним джерелом вуглецю, для одержання синбіотичного продукту. Інші цілі і переваги будуть більш повно очевидними з наступного опису і прикладеної формули винаходу. Введення штамів молочнокислих бактерій, відібраних відповідно до даного способу, ссавцю буде приводити до локально продукованого гістаміну, який міг би бути корисним по декількох причинах. Первинною метою даного винаходу є забезпечення способу відбору штамів молочнокислих бактерій, що гарантують хороший протизапальний ефект. Ці штами могли б переважно використовуватися для лікування і/або профілактики запальних станів, оскільки оперон гістидину і продукування гістаміну є суттєвими для протизапальної здатності певної молочнокислої бактерії. Переважно ці штами можуть бути використані для лікування і/або профілактики запальних процесів в GI-тракті, GU-тракті, порожнині рота, в легенях і дихальних шляхах, на шкірі і т. д. тіла ссавця, зокрема, але не обмежуючись ними, коліту, IBD, IBS, дивертикульозу, гінгівіту, вагініту і т. д. Раніше було відомо, що гістамін через H 2-рецептор може зменшувати експресію гена TNF-α. Крім того, тучні клітини здатні виробляти широкий ряд важливих цитокінів і інших запальних медіаторів, таких як TNF-α. Однак раніше не було відомо, що оперон гістидину і локальне продукування гістаміну таких відібраних штамів можуть бути корисними для цього хазяїна і є, наприклад, ключовим фактором в протизапальній здатності відібраних штамів L. reuteri. Раніше не було відоме застосування відібраного L. reuteri в лікуванні, що вимагає гістаміну. Переважними продуктами і штамами для лікування і/або профілактики запальних станів є Lactobacillus reuteri, зокрема Lactobacillus reuteri 6475 (ATCC PTA 6475). У інших варіантах здійснення цього винаходу використовуваним штамом не є Lactobacillus reuteri 6475 (ATCC PTA 6475). Терапевтичні застосування цих штамів, продуктів і композицій цього винаходу, визначених тут, приводять до зменшення або полегшення релевантних захворювань або симптомів захворювання, наприклад можуть приводити до значущого зменшення рівнів запалення в ссавці. Наприклад, локально вироблюваний гістамін може бути активуючим H 2-рецептори на кишкових епітеліальних клітинах, а також імунних клітинах для супресії мукозного імунітету хазяїна, наприклад, через інгібування прозапальних цитокінів. Таким чином, даний винахід дозволяє перетворювати дієтичний компонент (гістидин) в гістамін в сайті активності і локально модулювати імунну реакцію хазяїна (наприклад, в кишечнику). Можна бачити, що таке локальне продукування гістаміну, забезпечуване даним винаходом, може забезпечувати реальні переваги відносно, наприклад, перорального проковтування або інших форм введення гістаміну, особливо в зв'язку з тим фактом, що таке пероральне проковтування не може пропагандуватися внаслідок пізнаваних токсичних ефектів і ризиків для здоров'я. Зокрема, коли мова йде про запальні захворювання кишечнику, ці терапевтичні застосування штамів, продуктів і композицій цього винаходу можуть приводити до значущого зменшення утворення виразок і пошкодження кишечнику (наприклад, пошкодження ободової кишки), вимірюваного стандартним способом, таким, як показник Wallace, значущого зменшення втрати маси або значущого зменшення запалення кишечнику, наприклад ободової кишки. Таке зменшення або полегшення захворювання або його симптомів може бути виміряне будь-яким придатним аналізом. Переважно зменшення або ослаблення захворювання або симптомів є статистично значущим, переважно з величиною імовірності 0,05. Таке зменшення або ослаблення захворювання або симптомів звичайно визначають в порівнянні з придатним 6 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контрольним індивідуумом або контрольною популяцією, наприклад здоровим ссавцем або ссавцем, що не одержує лікування або одержує плацебо. Один придатний спосіб введення і приготування цих штамів і т. д. вибирають залежно від ділянки, в якій бажаним є продукування гістаміну. Одним переважним способом введення є пероральний спосіб, однак рівним чином для деяких обробок буде придатною місцева або деяка інша форма локального введення в шкіру, пряму кишку, піхву або ясна або внутрішньовенна або внутрішньом'язова ін'єкція. Хоч наведені тут приклади демонструють застосування штамів цього винаходу і їх придатні дози для лікування коліту, буде зрозуміло, що це є тільки одним прикладом запальних станів, які можуть лікуватися відповідно до даного винаходу, і що придатні дози цих штамів, продуктів і композицій винаходу, описаного тут, можуть бути вибрані залежно від підлягаючого лікуванню захворювання, способу введення і відповідної композиції. Дієтичні суміші, які містять гістидин, можуть бути використані для гарантії присутності гістидину і збільшення за допомогою цього ефективності цих бактерій. Гістидин може вводитися окремо або разом з цими бактеріями. Однією можливістю гарантії бактеріальної доставки гістидину є вживання багатої гістидином їжі, зокрема, але не тільки, соєвого білка, сиру, яєць, курячого м'яса або свинини. Було показано, що оперон гістидину в бактеріях поліпшує здатність росту в умовах низького рН або обмеження джерела енергії (Calles-Enriquez et al.), але оперон гістидину не був асоційований з протизапальними ознаками деяких штамів L. reuteri. Іншою метою даного винаходу є застосування штамів, відібраних відповідно до даного способу, в раковій терапії. Гістамін в комбінації з IL-2 використовували для лікування AML. Застосування штамів даного винаходу буде приводити до локально продукованого гістаміну, який в комбінації з IL-2 міг би бути використаний для лікування AML. Іншою метою даного винаходу є застосування відібраних штамів для зменшення харчової алергії, інших алергічних реакцій або інших аутоімунних захворювань. Системні збільшення гістаміну є, як було відомо раніше, наслідком алергії, що викликається грануляцією тучних клітин. При введенні штамів, відібраних відповідно до цього винаходу, реципієнту цей локально продукований гістамін буде приводити до ефекту десенсибілізації, який буде зменшувати алергію або інші аутоімунні захворювання. Метою даного винаходу є також застосування штамів молочнокислих бактерій, які продукують гістамін, для зменшення ризику діареї мандрівників. Пацієнти, що лікувалися блокаторами гістаміну, мають збільшений ризик набуття діареї мандрівників, і цей збільшений ризик міг би бути нейтралізований введенням молочнокислих бактерій відповідно до даного способу. Ще однією метою даного винаходу є застосування відібраних штамів в лікуванні MS. Гістамін був запропонований як важлива молекула для розвитку нових способів лікування для MS, і штами, відібрані відповідно до даного винаходу, будуть забезпечувати пацієнта гістаміном. Ще однією метою даного винаходу є застосування бактерій, які продукують гістамін, як протизапального лікування шкіри з використанням доступних гістидину і аналогів гістидину в шкірі. Оскільки гістидин є субстратом уроканінової кислоти, яку шкіра виробляє при УФопроміненні, ця уроканінова кислота виявляє протизапальні властивості на шкірі. Іншою метою є застосування таких відібраних штамів для інгібування активації ERK1/2. Іншою метою цього винаходу є інгібування TNF-α. Іншою метою цього винаходу є зменшення запалення, локально або системно. Іншою метою цього винаходу є посилення екзоцитозу синаптичних пухирців інгібуванням ERK1/2. Іншою метою цього винаходу є стимуляція самооновлення ембріональних стовбурових клітин інгібуванням ERK1/2. Іншою метою цього винаходу є індукування експресії макрофага ABCA1 і відтік холестерину інгібуванням ERK1/2. Іншою метою цього винаходу є зменшення серцевої гіпертрофії і серцевої недостатності інгібуванням ERK1/2. Іншою метою цього винаходу є зменшення проліферації деяких типів раку, що включають в себе лейкоз (наприклад, AML) або злоякісну меланому. Таким чином, такі типи раку є переважними захворюваннями, які можуть лікуватися з використанням цих штамів, продуктів і композицій даного винаходу. Іншою метою цього винаходу є застосування відібраних штамів для продукування гістаміну в певних умовах як нейротрансмітера, наприклад, у взаємодіях GU-тракту з CNS, а також 7 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 передачі невральних сигналів у випадку локального болю. Ця роль як нейротрансмітера може поширюватися до дій на перистальтику кишечнику (для лікування констипації або діареї) і для передачі больових сигналів в кишечнику. Іншою метою цього винаходу є застосування відібраних штамів для впливу на вісь головний мозок-кишечник, коли відібрані LAB будуть продукувати гістамін і впливати на сприйняття вісцерального болю і передачу сигналу в черевну нервову систему. Таким чином, можна бачити, що даний винахід може бути використаний для лікування і/або профілактики будь-якого захворювання, яке буде мати користь від локального продукування гістаміну, або для лікування і/або профілактики будь-якого захворювання, яке може лікуватися локальним введенням гістаміну. Додатковою метою цього винаходу є забезпечення продуктів, які містять вказані штами. Додатковою метою цього винаходу є забезпечення продуктів, які містять вказані штами, разом зі специфічним джерелом вуглецю, щоб мати синбіотичний продукт, який буде, через специфічну стимуляцію цього гістамінпродукуючого штаму, посилювати ці ефекти. Додатковою метою цього винаходу є забезпечення продуктів, які містять вказані штами, разом із гістидином, зокрема аналогами гістидину або гістидинвмісними продуктами або композицією гістидину. Переважно таку суміш вводять перорально в захисній капсулі для вивільнення її вмісту в нижній частині GI-тракту для гарантії виживання як гістидину, так і бактерій в ділянці дії. Додатковою метою цього винаходу є об'єднане введення вказаних штамів з багатою гістидином дієтою. Ще один додатковий аспект цього винаходу забезпечує продукт для терапевтичних застосувань, як визначено тут в іншому місці, де вказане застосування передбачає введення щонайменше одного додаткового терапевтичного або харчового агента. У таких варіантах здійснення цим додатковим терапевтичним агентом може бути будь-який додатковий агент, який застосовний в лікуванні захворювання, що розглядається, наприклад додатковий протизапальний агент або імунотерапевтичний агент, такий як, наприклад, хемокін або цитокін (наприклад, IL-2). У переважних варіантах здійснення вказаний додатковий агент містить гістидин або аналог гістидину, придатне джерело вуглецю, яке підтримує продукування гістаміну бактеріальним штамом, або їх комбінацію. Вказані додаткові агенти можуть вводитися разом зі штамами цього винаходу або можуть вводитися окремо. Крім того, вказані додаткові агенти можуть вводитися в той же самий час, що і штами цього винаходу, або в різних часових точках. Даний винахід забезпечує також композицію, яка містить: (i) штам молочнокислої бактерії, одержуваний способом відбору цього винаходу (або штам молочнокислої бактерії, здатний продукувати гістамін, визначений в інших випадках тут), де вказаний штам молочнокислої бактерії має оперон гістидину і здатний продукувати гістамін; і (ii) щонайменше один додатковий компонент, вибраний з групи, що складається з придатного джерела вуглецю, яке підтримує продукування гістаміну вказаним штамом, джерела гістидину або аналога гістидину і їх комбінації. У продуктах, композиціях і застосуваннях винаходу, описаного тут, переважно вказаний гістидин або аналог гістидину знаходиться в формі харчового продукту або харчової добавки, що містить гістидин або аналог гістидину, або вказане джерело вуглецю містить глюкозу. Переважно вказане джерело вуглецю не буде містити сахарози або щонайменше буде містити сахарозу при такому рівні, який не буде суттєво погіршувати продукування гістаміну цим штамом. Необов'язково можуть бути також забезпечені джерела інших амінокислот. У альтернативних варіантах здійснення штами, визначені в частині (i), можуть бути об'єднані з додатковим компонентом, який використовується в лікуванні захворювання, що розглядається, тобто додатковим терапевтичним агентом, наприклад додатковим протизапальним агентом або імунотерапевтичним агентом, таким як, наприклад, хемокін або цитокін (наприклад, IL-2). Lactobacillus reuteri є гетероферментативним видом молочнокислої бактерії, що природно заселяє кишечник людей і тварин. Конкретні пробіотичні штами L. reuteri сильно пригнічують продукування TNF-α людини, тоді як інші пробіотичні штами L. reuteri посилюють продукування TNF-α людини. Описаний тут винахід став можливим за допомогою механістичних досліджень пробіотичного штаму L. reuteri 6475 і інших штамів, які продемонстрували їх дію на активованих мієлоїдних клітинах людини. Метаболіти L. reuteri виділяли з використанням HILIC-HPLC, і гістамін ідентифікували за допомогою NMR-спектроскопії і мас-спектрометрії. Кількісне 8 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначення гістаміну потрійною квадрупольною MS виявило, що штам L. reuteri 6475 продукує відносно високі концентрації гістаміну при вирощуванні в мінімальному середовищі на основі глюкози. Попередні дослідження транскриптоміки передбачали, що два гени в опероні гістидину L. reuteri можуть грати роль в інгібуванні TNF штамом 6475. Націлений мутагенез цих генів виявив, що кожний ген в опероні гістидину, антипортера гістидину-гістаміну, HdcA і HdcB, є важливим для TNF-інгібуючого фенотипу штаму 6475. Механістичні дослідження продемонстрували, що гістамін інгібує TNF через передачу сигналу через H2-, але не через H1рецептор. Передача сигналу через H2-рецептор збільшує внутрішньоклітинну cAMP (цАМФ), що активує PKA. PKA-активність є необхідною для супресії TNF гістаміном. Гістамін блокує активацію шляху передачі сигналу MEK-ERK MAPK. Гістамін є більш відомим відносно його прозапальних ефектів в алергії і анафілаксії, але декілька досліджень продемонстрували протизапальні функції гістаміну. Дослідження in vitro показали, що гістамін може інгібувати продукування прозапальних цитокінів, IL-1, IL-12 і TNF з LPS-стимульованих моноцитів і макрофагів людини, і цей ефект є оборотним антагоністами H 2рецептора. Крім того, гістамін може стимулювати продукування протизапального цитокіну, IL-10, через H2-рецептор. Передача сигналу через H2-рецептор приводить до зменшеної експресії CD14-рецептора, рецептора, що бере участь в упізнаванні LPS, на поверхні моноцитів людини. Гістамін діє також на TNF-рецептор. Передача сигналу через H1-рецептор індукує виділення як TNFR1, так і TNFR2. Дослідження in vivo також виявили протизапальну роль гістаміну. Лікування димапритом, специфічним агоністом H2-рецептора, зменшувало рівні TNF в плазмі в мишачих моделях ендотоксинового шоку (LPS-індукування) і гепатиту (індукування LPS плюс галактозаміном). Гістамін був протективним в мишачій моделі LPS-індукованого пошкодження печінки, і ці ефекти були атенуйованими в миші з нокаутом H2-рецептора. У кишечнику гістамін може сприяти захисту проти бактеріальної інфекції. Передача сигналу через H 2-рецептор у пейєрових бляшках сприяє запобіганню інфекції Yersinia enterocolitica. Ця дія гістаміну може бути визначена по експресії рецепторів гістаміну на клітині-мішені. У Тклітинах ця дія гістаміну залежить від того, який рецептор гістаміну є активованим. За допомогою передачі сигналу через H1-рецептор гістамін посилює реакції T H1-типу, але пригнічує реакції як TH1, так і TH2 через H2-рецептор. Одне дослідження виконували зі спостереженням експресії рецептора гістаміну в шлунково-кишковому тракті людини. Багато які з цих перевірених типів клітин експресували множинні рецептори гістаміну. Наприклад, імунні клітини, що включають в себе макрофаги, високо експресували H 1- і H2-рецептор і демонстрували низьку експресію H4-рецептора. Збільшені тучні клітини і гістамін брали участь у вісцеральній гіперчутливості, асоційованій з IBS. Збільшене число і збільшена активність тучних клітин поблизу іннервації слизової оболонки ободової кишки може приводити до підвищеного сприйняття болю в животі, асоційованого з IBS. Дослідження з кетотифеном, стабілізуючим агентом тучних клітин, демонстрували збільшений поріг болю в пацієнтах з IBS, зменшені симптоми IBS, але не зміну в числі або активності (що визначаються по вивільненню гістаміну і триптази) тучних клітин в тканині біопсії тучних клітин. Ці ефекти кетотифену в поліпшенні IBS можуть не бути результатом стабілізації тучних клітин, але можуть бути віднесені до їх іншої ролі як антагоніста H1-рецептора. Якщо активація H1-рецептора асоційована з прозапальною реакцією, блокування його активності кетотифеном може дозволити гістаміну, вироблюваному або тучними клітинами, або мікробіотою кишечнику, такою як L. reuteri, передавати сигнал тільки через H2-рецептор. Як вже було продемонстровано авторами винаходу, передача сигналу через H2-рецептор може пригнічувати продукування TNF і викликати протизапальний ефект. Цей механізм кетотифену може бути використаний для нових терапій, що об'єднують антагоністи H1-рецептора із загальним пробіотичним ефектом штаму L. reuteri. Додаткова зміна джерела вуглецю середовищ для вирощування з глюкози на сахарозу є достатньою для супресії TNF-інгібуючого фенотипу відібраного штаму, наприклад штаму L. reuteri 6475. Крім того, значущу понижувальну регуляцію (даунрегуляцію) всіх трьох генів в опероні гістидину спостерігали з сахарозою в умовах росту. Ця ідентифікація гістаміну як протизапальної сполуки, продукованої відібраними пробіотичними штамами Lactobacillus, буде сприяти визначенню терапевтичних застосувань для таких штамів. Механістичні дослідження пов'язували активацію H 2-рецептора на клітинах THP-1 з гістаміном і супресією ERK-активації. ERK-активація бере участь в багатьох клітинних функціях нарівні з продукуванням TNF. ERK-активація бере участь в проліферації, онкогенезі, диференціюванні і виживанні клітин. Ці результати передбачають роль відібраних штамів, таких як L. reuteri 6475, в захисті проти раку за допомогою супресії запалення, проліферації клітин і апоптозу через інгібування ERK-активації. Крім того, гістамін є відомим нейротрансмітером. 9 UA 115864 C2 5 10 Продукування гістаміну відібраними штамами може впливати на передачу сигналу в кишковій нервовій системі, впливати на сприйняття болю і перистальтику кишечнику. Для гарантії продукування гістаміну в місці дії може бути переважним забезпечення цих бактерій гістидином. Гістидин може вводитися разом з цими бактеріями або окремо, раціон, багатий гістидином, може також збільшувати продукування гістаміну. Даний винахід забезпечує деякі штами молочнокислих бактерій і спосіб відбору таких штамів і продуктів, які містять такі штами. Ці бактерії вибирають з використанням скринінгу на оперон гістидину; несподівано було показано, що присутність активного оперону гістидину є суттєвою для різних корисних ефектів, таких як імуномодулюючі властивості штамів молочнокислих бактерій. Інші цілі і переваги даного винаходу стануть очевидними для читача, і передбачається, що ці цілі і переваги знаходяться в межах обсягу даного винаходу. Цей винахід буде описуватися далі з посиланням на наступні необмежувальні приклади. ПРИКЛАДИ 15 Таблиця 1 Бактеріальні штами, використовувані в цьому дослідженні Бактеріальні штами L. reuteri ATCC PTA 6475 L. reuteri ATCC PTA 6475:JP577 L. reuteri ATCC PTA 6475:1229 L. reuteri ATCC PTA 6475:1230 L. reuteri ATCC PTA 6475:1231 Опис Ізолят з молока фінської матері Інсерційний мутант Інсерційний мутант Інсерційний мутант Інсерційний мутант Джерело BioGaia AB (Raleigh, NC) Це дослідження Це дослідження Це дослідження Це дослідження Таблиця 2 Аналіз транскриптоми оперону гістидину в мутантах штаму L. reuteri 6475 Гістидиндекар-боксилаза, пірувоїл типу А (HdcА) Кратна р-величина р-величина зміна Ген HdcB Порівняння CFAS*(23)/ 6475 THFS1*/6475 Сахароза/ глюкоза THFS2/6475 PocR/6475 Кратна зміна Гістидин/Гістамін антипортер Кратна р-величина зміна -2,3 0,05 -1,1 0,68 -1,2 0,36 -1,33 0,60 -3,28 0,05 -3,45 0,001 -11,8 0,01 -30,1 0,001 -5,5 0,001 1,2 2,4 0,7 0,10 0,8 1,3 0,2 0,66 *Інсерційні мутанти, які втрачають здатність інгібування продукування TNF в порівнянні зі штамом дикого типу 6475. CFAS: циклопропан-жирна кислота-синтаза, THFS1: тетрагідрофолатсинтаза 1, THFS2: тетрагідрофолатсинтаза 2. § Дикий тип 6475, що ріс в LDMIIIS, порівняно з диким типом 6475, що ріс в LDMIIIS, втрачає здатність інгібування продукування TNF. 20 25 ПРИКЛАД 1 Продукування гістаміну вибраним Lactobacillus Бактеріальні штами і умови культивування Всі бактеріальні штами, використані в цьому дослідженні, описані в таблиці 1. Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 є ізолятом молока фінської матері (доступного з ATCC, Manassas, VA, USA). L. reuteri штами ATCC PTA 6475, ATCC 6475 JP577, ATCC 6475 1229, ATCC 6475 1230 і ATCC 6475 1231 будуть називатися штамами 6475, JP577, 1229, 1230 і 1231, відповідно, протягом цього опису. Штами L. reuteri культивували при анаеробних умовах протягом 16-18 годин в середовищах deMan, Rogosa, Sharpe (Difco, Franklin Lakes, NJ) і інокулювали в 2 л напіввизначеного середовища, LDMIII (OD600, коректованого до 0,1), яке було описане раніше. Джерелом вуглецю були або глюкоза, LDMIIIG, або сахароза, LDMIIIS. Цю культуру вирощували протягом 24 годин при 37 °C в анаеробній робочій установці (MACS MG-500, Microbiology 10 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 International, Frederick, MD), що постачається з сумішшю 10 % СО2, 10 % H2 і 80 % N2. Проби брали в різних часових точках для дослідження росту вимірюванням OD600. У стаціонарній фазі (24 год.), ці клітини осаджували з 2-літрової культури (4000g, 10 хв.). Осади клітин і вільні від бактерій супернатанти зберігали при -20 °C перед подальшою обробкою для розділення ВЕРХ і тестування в біоаналізі на інгібування TNF. Клітинна лінія і реагенти In vitro експерименти виконували з клітинами THP-1 (моноцитоїдною клітинною лінією, ATCC, Manassas, VA), що зберігається в середовищі RPMI (ATCC) і інактивується нагріванням фетальної телячій сироватці (Invitrogen, Carlsbad, CA) при 37 °C, 5 % CО2. MEK1/2, фосфоMEK1/2, ERK1/2 і фосфо-ERK1/2-антитіло і MEK-інгібітор одержували з Cell Signaling Technology (Dan vers, MA), і β-актин-антитіло одержували з Abeam (Cambridge, MA). Всі інші реагенти одержували з Sigma (St. Louis, MO), якщо немає іншої вказівки. HILIC-HPLC-розділення зв'язаних з клітинною стінкою факторів Осади клітин (7 г) зі штаму 6475, вирощеного або в LDMIIIG, або в LDMIIIS, промивали 30 мл охолодженої на льоду сумішшю 50 % ацетонітрил/0,1 % трифтороцтова кислота (TFA). Цю суспензію клітин центрифугували протягом 10 хв., 4000×g при 4 °C. Супернатанти фільтрували через полівініліденфторидні (PVDF) мембранні фільтри (розмір пор 0,45 мкм, Millipore, Bedford, MA), ліофілізували і ресуспендували в 10 мл 0,1 % мурашиної кислоти. Цю ресуспендовану пробу фракціонували по розміру за допомогою центрифужних фільтрувальних пристроїв Amicon Ultra-15, які використовують ultracel-3-мембрану (Millipore, Bedford, MA). Цей фільтрат (9 мл) висушували до 1 мл з використанням швидкісного вакууму (speed-вакууму) і 0,75 мл використовували для HILIC-HPLC. Цю пробу розчиняли з використанням 100 % ацетонітрилу перед пропусканням через колонку PolyLC Hydroxyethyl з градієнтом 100-0 % ацетонітрилу, 0,1 % мурашиною кислотою. Ця проба проходила протягом 25 хвилин і 25 фракцій (A1-C1) збирали при 10 мл/хв./пробірку. Три мілілітри з кожної фракції ліофілізували, ресуспендували в 3 мл 0,1 % оцтової кислоти і знову ліофілізували для тестування в біоаналізі інгібування TNF. Біоаналіз інгібування TNF і TNF-ELISA Бактеріалні супернатанти (10 мл) з 24-годинної культури LDMIII стерилізували з використанням стерилізуючих мембранних фільтрів PVDF (розмір пор 0,22 мкм, Millipore) і фракціонували по розміру, як описано вище. Один мілілітр фільтрату 3 кДа сушили за допомогою speed-вакууму і ресуспендували в середовищі RPMI. Ці проби обробленого супернатанту називають кондиціонованими середовищами. Всі супернатанти нормалізували по об'єму відносно OD600=1-0. Ліофілізовані фракції з HILIC-HPLC-розділення ресуспендували в 400 мкл 10 мг/мкл бікарбонату амонію, сушили в speed-вакуумі і ресуспендували в 400 мкл середовища. Кондиціоновані середовища і промивальні фракції осаду клітин тестували на їх здатність модулювати продукування TNF в моноцитоїдних клітинах. Коротко, THP-1-клітини 4 (приблизно 510 клітин) стимулювали для одержання TNF додаванням 100 нг/мл Pam3CysSKKKK3 HCl (EMC Microcollections, Tuebingen, Germany), як описано раніше. Інгібітори -4 6 антагоністи H2-рецептора, ранітидин і циметидин (10 -10 M), антагоніст H1-рецептора, ~5 6 індометацин (10 -10 M), інгібітор MEK, U0126 (10 мкМ) і інгібітор PKA, H89 (дигідрохлорид N-[2-5 (п-бромцинаміламіно)етил]-5-ізохінолінсульфонаміду) (10 M) - додавали до цих клітин THP-1 з подальшим додаванням кондиціонованих середовищ L. reuteri або промивальних фракцій осаду 5 ~3 -7 клітин (5 % об./об.), гістаміну (10 M) або дибутирил сAMP (10 -10 M). Планшети інкубували при 37 °C і 5 % CО2 протягом 3,5 год. Клітини THP-1 осаджували (3000×g, 5 хв., 4 °C) і використовували кількісні ELISA для визначення кількостей TNF в супернатантах THP-1-клітин відповідно до інструкцій виготовлювача (R&D Systems, Minneapolis, MN). TNF-інгібуючі сполуки L. reuteri 6475 виділяли з використанням рідинної хроматографії гідрофільної взаємодії - високоефективної рідинної хроматографії (HILIC-HPLC) Осади бактеріальних клітин промивали для видалення сполук, пухко зв'язаних з клітинною поверхнею. Компоненти промивань осадів клітин розділяли на основі гідрофобності з використанням HILIC-HPLC і одержані 25 фракцій тестували на утримування цієї TNF-інгібуючої сполуки. L. reuteri 6475, вирощений в мінімальному середовищі з глюкозою як єдиним джерелом вуглецю, продукує TNF-інгібуючі фактори, які утримувалися в 3 окремих фракціях HILIC-HPLC (B3, B5 і B6, дані не показані). L. reuteri 6475, вирощений з сахарозою як єдиним джерелом вуглецю, втрачає TNF-інгібуючий фенотип, і він служив як негативний контроль. Жодна з фракцій HILIC-HPLC з промивань осаду клітин 6475 з сахарозою не демонструвала значущого інгібування TNF (дані не показані). Гістамін ідентифікували в TNF-інгібуючій фракції HILIC-HPLC з використанням NMR (ЯМР)спектроскопії і мас-спектрометрії 11 UA 115864 C2 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 TNF-інгібуючу фракцію HILIC-HPLC B3 аналізували за допомогою H-NMR і порівнювали з сусідньою, не інгібуючою TNF фракцією В4. Унікальний ряд піків з хімічним зміщенням між 7,07,5 м.ч., яке є характеристикою ароматичної сполуки, спостерігали у фракції В3, але не у фракції В4 (дані не показані). Цей кластер ароматичних сполук додатково аналізували 2вимірним (2D) ЯМР з гетеронуклеарною одноквантовою когерентністю (HSQC) для ідентифікації його компонентів. Ці ароматичні сполуки складалися з триптофану, фенілаланіну, гістаміну і однієї сполуки, яке було неідентифіковним. Триптофан і фенілаланін є компонентами середовища для вирощування бактерій, тоді як гістамін не був компонентом середовища. Ці результати були підтверджені з використанням додаткового 2D NMR-способу загальною кореляційною спектроскопією (TOCSY). Гістамін є біогенний аміном, який продукується з гістидину через гістидиндекарбоксилазу деякими ферментативними бактеріями, в тому числі молочнокислими бактеріями. Гістамін ідентифікували також у фракції В3 з використанням часопрольотної мас-спектрометрії з іонізацією в електроспреї (ESI TOF MS). Гістамін не є ковалентно модифікованим на основі його картини фрагментації в аналізі MS/MS. Аналіз відповідної фракції В3 L. reuteri 6475, вирощеного в середовищі, що містить сахарозу, з використанням ESI TOF MS не виявив ніякого гістаміну. L. reuteri 6475, вирощений в середовищі, що містить глюкозу, продукує гістамін, який присутній в TNF-інгібуючій фракції HILIC-HPLC. Гістамін визначали кількісно у відібраних фракціях HILIC-HPLC з використанням потрійної квадрупольної мас-спектрометрії Потрійна квадрупольна мас-спектрометрія є встановленим, високочутливим способом квантифікації малих молекулярних сполук. Гістамін квантифікують (визначають кількісно) у вибраному діапазоні фракцій HILIC-HPLC з L. reuteri 6475 глюкози (B2-B7) і сахарози (B2-B9), а також в супернатанті бактеріальної культури. Високі рівні гістаміну (300 нг/мл) корелювали зі здатністю фракцій HILIC-HPLC інгібувати TNF (фігура 1). Низькі рівні гістаміну вимірювали в більшості перевірених фракцій, в тому числі фракцій з 6475 сахарози (фігура 1). Ця здатність гістаміну інгібувати продукування TNF є, мабуть, залежною від концентрації. Синтетичний гістамін і гістамін, продукований L. reuteri 6475, інгібують продукування TNF через H2-рецептор Гістамін може значущо інгібувати продукування TNF з TLR-2-активованих моноцитоїдних клітин людини (THP-1) (фігура 4A). Гістамін може передавати сигнал через чотири різних рецептори гістаміну, однак моноцитоїдні клітини експресують високі рівні тільки H 1- і H2рецепторів. Колишні дослідження показали ефекти гістаміну на продукуванні TNF через H 2рецептор. H1- і H2-рецепторспецифічні антагоністи використовували для визначення, який рецептор опосередковував ефект гістаміну на клітинах THP-1. H2-рецепторспецифічні антагоністи, ранітидин і циметидин, могли блокувати TNF-інгібування гістаміном залежним від концентрації чином (фігура 2A). Аналіз проточної цитометрії з H 2-рецепторспецифічними антитілами виявив, що THP-1-клітини високо експресують H2-рецептор (дані не показані). Один H1-рецепторспецифічний антагоніст, індометацин, не надавав дії на TNF-інгібування гістаміном (фігура 2А). Гістамін блокує продукування TNF з TLR-2-активованих THP-1-клітин через передачу сигналу через H2-рецептор. Кондиціоновані L. reuteri 6475 середовища, що містять гістамін, значущо інгібують TNF в порівнянні з контрольним середовищем, і цей ефект частково блокується H2-рецептором, але не антагоністами H 1-рецептора (фігура 2А). Часткове блокування в супресії TNF показує, що гістамін, присутній в 6475-кондиціонованому середовищі, передає сигнал через H2-рецептор, але інші TNF-інгібуючі фактори, які діють через альтернативні механізми, можуть також бути присутніми в цих кондиціонованих середовищах. Промивання осаду клітин, що містить гістамін штаму 6475, також пригнічує продукування TNF (фігура 2B). Як видно з кондиціонованими 6475 середовищами, антагоністи H2-рецептора частково блокують ефект промивання осаду клітин 6475 (фігура 2B), що передбачає, що множинні імуномодуліни присутні в цьому нефракціонованому промиванні залишку клітин. Ефекти TNF-інгібуючої фракції B3, яка містить високі кількості очищеного гістаміну, повністю блокувалися додаванням антагоністів H2-рецептора (фігура 2B). ПРИКЛАД 2 Відбір штамів, які продукують гістамін Ідентифікація/відбір бактерій, які продукують гістамін Штами, що підлягають тестуванню і, можливо, відбору, культивували при анаеробних умовах протягом 16-18 год. в середовищах deMan, Rogosa, Sharpe (Difco, Franklin Lakes, NJ) і інокулювали в 2 л напіввизначеного середовища, LDMIII (ОD 600, доведеного до 0,1). Джерелом вуглецю була глюкоза, LDMIIIG. Кожну культуру вирощували протягом 24 год. при 37 °C в анаеробній робочій установці (MACS MG-500, Microbiology International, Frederick, MD), що 12 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечується сумішшю 10 % CО2, 10 % H2 і 80 % N2. Проби брали в різних часових точках для спостереження росту за допомогою вимірювання OD600. У стаціонарній фазі (24 год.) ці клітини брали для аналізу з використанням ПЛР реального часу для тестування на присутність трьох генів, антипортера гістидин/гістамін, HdcA і HdcB. Для штамів, позитивних відносно цих трьох генів, рівні продукованого гістаміну визначають потрійною квадрупольною мас-спектрометрією. Штами з найвищим продукуванням гістаміну (250 пг/мл) відбирають. Продукування гістаміну може також оцінюватися і квантифікуватися за допомогою ELISA або імуноаналізів. ПРИКЛАД 3 Демонстрація імуномодуляції Оперон гістидину сприяє TNF-інгібуючому фенотипу L. reuteri 6475 Три гени, які, мабуть, є частиною оперону, беруть участь в продукуванні гістаміну L. reuteri 6475. Цими генами є антипортер гістидину/гістаміну, гістидиндекарбоксилази пірувоїл типу А (HdcA) і HdcB (фігура 3A). Колишні дослідження транскриптоміки передбачали, що гени антипортера гістидину/гістаміну і HdcA були потенційно важливими для TNF-інгібуючого фенотипу штаму 6475. Всі три гени є сильною мірою даунрегульованими в 6475, що росте в глюкозному середовищі (таблиця 2). Крім того, щонайменше 1 ген в цьому опероні є даунрегульованим в 2 мутантах, які втрачають TNF-інгібування (таблиця 2). Ці мутанти досліджували раніше, і навіть коли продукти генів не мали TNF-інгібуючих властивостей, ці гени, мабуть, є важливими для протизапального фенотипу 6475. На відміну від цього 2 мутанти, які не втрачають TNF-інгібування, демонстрували відсутність даунрегулювання будь-якого з цих генів в опероні гістидину (таблиця 2). Виробляли мутації в кожному з цих 3 генів інсертуванням передчасного стоп-кодону в цю генну послідовність (штами 1229, 1230 і 1231). Здійснювали також мутацію в неспорідненому гені, гені стійкості до рифампіцину, для використання як негативного контролю (штам JP577). Мутації всього лише в одному з цих генів в опероні гістидину було достатньо, щоб викликати часткову втрату TNF-інгібування в порівнянні зі штамом дикого типу (фігура 3B), що дозволяє передбачити, що кожний один з цих генів є важливим для TNF-інгібуючого фенотипу L. reuteri 6475. Часткова втрата активності дозволяє передбачити, що інші активні імуномодуліни все ще продукуються L. reuteri 6475. Активація ERK1/2 є суттєвою для продукування TNF TLR2-стимульованими моноцитоїдними клітинами ERK1/2 активується фосфорилуванням від розташованих зліва MAPKK, MEK1/2, і, як було показано раніше, є важливим для продукування TNF. THP-1-клітини обробляли специфічним інгібітором MEK1/2, U0126, для варіювання періодів часу до стимуляції агоністом TLR2 для супресії активації ERK1/2. Обробка U0126 протягом 30 хв. була достатньою для запобігання продукуванню TNF (дані не показані). ERK1/2 активується після стимуляції TLR2 і є важливим для стимуляції продукування TNF в модельній системі авторів цього винаходу. Стимуляція H2-рецептора приводить до збільшення кількості cAMP в цих клітинах H2-рецептор є G-білокзв'язаним рецептором, який може активувати аденілатциклазу і збільшувати внутрішньоклітинну cAMP (цАМФ). TNF може бути інгібований на рівні транскрипції cAMP і аналогами cAMP. THP-1-клітини стимулювали агоністом TLR2 в присутності контрольного середовища, вимірювали супернатант 6475 або гістамін з антагоністом або без антагоніста H2-рецептора і внутрішньоклітинні рівні cAMP. Супернатант L. reuteri 6475 викликав мале, але значуще збільшення в cAMP (дані не показані). Обробка H 2-рецептором блокувала цей ефект. Збільшення в cAMP також спостерігали з обробкою гістаміном, і цей ефект блокувався H2-антагоністом (дані не показані). Синтетичний аналог cAMP, дибутирил-cAMP (dcAMP), додавали до TLR2-стимульованих THP-1-клітин і дію на продукування TNF піддавали -5 -3 моніторингу. Додавання dcAMP (10 -10 M) було достатнім для інгібування продукування TNF (дані не показані). Стимуляція H2-рецептора гістаміну приводить до збільшеної cAMP, яка може блокувати подальше продукування TNF в активованих моноцитоїдних клітинах. Активність протеїнкінази А (PKA) є важливою для інгібування TNF L. reuteri 6475, гістаміном і dcAMP Збільшена концентрація cAMP може активувати PKA і потім інгібувати подальший шлях передачі сигналу ERK MAPK. Для визначення, чи є активність PKA важливою для супресії TNF гістаміном, продукованим штамом 6475, активовані клітини THP-1 обробляли специфічним інгібітором PKA, H89, в присутності супернатанту 6475, фракції B3, гістаміну або варійованих концентрацій dcAMP. Додавання H89 частково блокувало інгібування TNF всіма цими нормально TNF-інгібуючими сполуками (дані не показані). Активність PKA є важливою для супресії TNF гістаміном і dcAMP. Передача сигналу через H2-рецептор блокує активацію MEK1/2 і ERK1/2 13 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Попередні дослідження продемонстрували, що PKA може інгібувати активацію Ras/Raf MEK і, отже, передачу сигналу ERK MAPK. Обробка активованих THP-1-клітин супернатантом 6475, гістаміном або U0126 блокує фосфорилування як MEK1/2, так і потім ERK1/2 в порівнянні з середовищем-контролем (дані не показані). Обробка антагоністом H 2-рецептора відновлює активацію як MEK1/2, так і ERK1/2 (дані не показані). Не було відмінності в рівнях білка MEK1/2 і ERK1/2 з будь-яким зі способів цієї обробки. Гістамін зі штаму 6475 інгібує активацію MEK і потім ERK з одержанням зменшеного продукування TNF з TLR2-стимульованих мієлоїдних клітин. Таким чином, ці експерименти показують, що стимуляція H2-рецептора приводить до збільшеної cAMP, активації протеїнкінази А (PKA) і інгібування шляху передачі сигналу MEKERK MAPK. Як описано вище, виконували механістичні дослідження для визначення дії гістаміну на шляху передачі сигналу активованої мітогеном протеїнкінази (MAPK). Інгібування шляху передачі сигналу MEK-ERK MEK-специфічним інгібітором є достатнім для блокування продукування TNF. Обробка активованих THP-1-клітин супернатантом штаму 6475 або гістаміном збільшувала внутрішньоклітинну cAMP. Це збільшення в кількості cAMP блокували ранітидином, специфічним антагоністом H2-рецептора. Обробка TLR2-стимульованих THP-1клітин синтетичним аналогом cAMP, dcAMP, є достатньою для інгібування продукування TNF. Інгібування активності PKA частково блокує супресію TNF середовищем, раніше 6475кондиціонованим TNF-інгібуючими сполуками, фракцією B3, гістаміном і dcAMP. Обробка активованих THP-1-клітин 6475-кондиціонованим середовищем, гістаміном або U0126 пригнічувала активацію MEK1/2, тобто здійснювала ефект, який блокувався в присутності ранітидину. ПРИКЛАД 4 Детектування MEK1/2 і ERK1/2 з використанням вестерн-блотингу THP-1-клітини лізували в охолодженому на льоду лізуючому буфері, що складається з 50 мМ Тріс, pH 7,4, 250 мМ NaCl, 5 мМ ЕДТО, 50 мМ NaF, 1 мМ Na 3VО4, 1 % об./об. Nonidet P40, 0,2 % об./об. NaN3 і інгібіторів протеази і фосфатази. Лізати інкубували на льоду протягом 30 хвилин, струшували на вортексі кожні 10 хвилин і прояснювали центрифугуванням при 13000×g протягом 10 хвилин при 4 °C. Концентрації білка вимірювали з використанням набору Quant-iT™ Protein Assay (Invitrogen) і флуорометра Qubit відповідно до інструкцій виготовлювача. Рівні кількості білків завантажували на гелі електрофорезу. Аналіз активації ERK1/2 виконували з використанням специфічних фосфо-ERK1/2-антитіл. Клітинні екстракти завантажували на 10 % ДСН-поліакриламідний гель і переносили на полівінілідендифторидні мембрани (Bio-Rad, Hercules, CA). Мембрани блокували протягом ночі при 4 °C в блокувальному буфері (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). Після декількох промивань мембрани зондували ERK1/2, фосфо-ERK1/2 або β-актинспецифічними антитілами, розведеними в блокувальному буфері (Li-Cor), протягом 1 години при кімнатній температурі. Після промивань мембрани інкубували з відповідним кон'югованим з пероксидазою хрону вторинним антитілом протягом 1 години при кімнатній температурі, і потім блоти виявляли з використанням хемілюмінесцентного детектування. Аналіз активації MEK1/2 виконували, як описано вище, за винятком того, що інкубування первинних антитіл проводили протягом ночі при 4 °C. ПРИКЛАД 5 НdcA-мутант дає зменшену здатність ослаблення коліту Бактеріальні штами і культивування Мутанти генерували з використанням RecT-опосередкованої олігонуклеотидної рекомбінації. L. reuteri, експресуючий RecT (штам RPRB0000), використовували для конструювання мутацій в rpoB (тег локусу HMPREF0536_0828 (ZP_03961568)) і генах-мішенях, розташованих в кластері гістидиндекарбоксилази HMPREF0536_1229 (ZP_03961969), HMPREF0536_1230 (ZP_03961970) і HMPREF0536_1231 (ZP_03961971), з одержанням штамів RPRB3002, RPRB3004, RPRB3005 і RPRB3006, відповідно. Мутації перевіряли за допомогою ПЛР і цілісність підтверджували аналізом послідовностей. L. reuteri ATCC PTA 6475 і мутант гена гістидиндекарбоксилази (hdcA) культивували в середовищах deMan, Rogosa, Sharpe (Difco, Franklin Lakes, NJ) при 37 °C в анаеробній робочій установці (MACS MG-500, Microbiology International, Frederick, MD), що забезпечується сумішшю 10 % CО2, 10 % H2 і 80 % N2. Приготування клітин L. reuteri і введення мишам Окрему колонію кожного зі штамів L. reuteri інокулювали в 10 мл середовища MRS і вирощували при 37 °C в анаеробних умовах протягом 18-20 годин. Бактерії, доведені до OD600=0,03, інокулювали в 40 мл MRS для початку ферментації і вирощували при 37 °C при 14 UA 115864 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 анаеробних умовах протягом 5,5 годин (OD600~2,5, бактерії знаходилися в експонентній фазі в цій часовій точці). Ці клітини обережно осаджували (2500×g, RT, 4 хвилини) і суспендували в 9 MRS при концентрації 2510 КУО/мл. Як середовище-контроль використовували стерильне середовище MRS. Кожна 8-тижнева самиця миші Balb/с одержувала одну дозу свіжоприготованого L. reuteri 6475 дикого типу або hdcA-мутанта, або MRS (0,2 мл в кожному випадку) кожного дня протягом семи днів примусовим годуванням з використанням зонда через порожнину рота і шлунок після 10 днів акліматизації. Всі експерименти на мишах виконували відповідно до схваленого протоколу (AN-4199; animal facility of Baylor College of Medicine). Мишей (45-денних) одержували з Harlan Laboratories (Houston, TX) і утримували при специфічних умовах, що не містять патогенів, в клітках з фільтруючою кришкою (п'ять мишей на клітку), і вони мали вільний відступ до дистильованої води і корму 2918 для гризунів Harlan. Мишей розподіляли в різні групи випадковим чином. Індукування гострого коліту з використанням ректальної клізми трибензолсульфонової кислоти (TNBS) Коліт індукували за шість годин перед шостим примусовим годуванням через зонд. Мишей анестезували постійною інгаляцією ізофурану. 5 % розчин TNBS у воді (Sigma-Aldrich, USA) розводили рівним об'ємом абсолютного спирту і вводили в дозі 100 мг/кг маси тіла внутрішньоректально. Мишей тримали вниз головою у вертикальному положенні протягом 2 хвилин після клізми для гарантії повного утримування клізми в ободовій кишці. Контрольні миші одержували процедури 50 % етанол в ЗФР. Мишей зважували перед введенням TNBS і через два дні після введення TNBS. Потім мишей умертвляли. Запалення і пошкодження ободової кишки визначали по втраті маси, макроскопічному балу і концентрації SAA в сироватці. Макроскопічне оцінювання коліту Ободові кишки збирали, розкривали подовжньо і зображення реєстрували цифровою камерою. Запалення і пошкодження ободової кишки визначали згідно з критеріями Wallace (Morris et al., 1989). Кожну ободову кишку оцінювали наосліп. Статистику виконували з використанням GraphPad Prism version 5.01 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Тест KruskalWallis використовували для детектування значущої відмінності серед всіх груп, включених в цей аналіз. Результати підсумовували у вигляді медіани і інтерквартильного діапазону. Вимірювання амілоїдного білка А сироватки (SAA) як системного маркера запалення Проби крові збирали серцевою пункцією, антикоагулювали і центрифугували протягом 10 хвилин при 13000 об./хв. для виділення плазми. Концентрації сироваткового амілоїду А (SAA) в пробах плазми вимірювали з використанням наборів ELISA з ALPCO (Salem, NH) відповідно до інструкцій виготовлювача. SAA є білком гострої фази, що вказує на системне запалення в мишах, яке корелює з тяжкістю коліту. Результати L. reuteri 6475 захищає мишей від TNBS-індукованого гострого коліту Протизапальні ефекти L. reuteri 6475 випробовували в TNBS-індукованій моделі гострого коліту миші. Мишей, які одержували L. reuteri 6475 примусовим годуванням з використанням зонда через рот і шлунок, порівнювали з мишами, які одержували середовище-контроль. Мишей, яким вводили ЗФР замість TNBS, також досліджували як негативні контролі коліту. Фігури 4-6 представляють дані з двох незалежних експериментів. Негативні контролі коліту, які одержували ЗФР замість TNBS інтраректально, мали дуже низьку втрату маси (або навіть додавали в масі), рідке пошкодження ободової кишки і низькі концентрації SAA в сироватці. Коліт-позитивні миші, які одержували середовище MRS і TNBS/ETOH, розвивали важкий коліт, що характеризується великим показником втрати маси, утворенням виразок із запаленням в ободовій кишці і основних ділянках пошкоджень, що поширюються більше ніж на 1 см, і значущо збільшеними концентраціями SAA в сироватці. Примусове зондове годування L. reuteri 6475 через рот і шлунок суттєво зменшувало втрату маси, макроскопічне запалення в ободовій кишці і концентрації SAA в сироватці, показуючи, що L. reuteri 6475 значущо атенуює коліт. Мутант hdcA дає зменшену здатність атенуювання коліту З використанням тієї ж самої мишачої моделі автори винаходу випробовували, чи був ген hdcA, який кодує гістидиндекарбоксилазу, необхідний для протизапальних ефектів L. reuteri 6475. 8-тижневих самиць мишей BALB/с випадковим чином розподіляли в три групи, які одержували L. reuteri 6475 дикого типу або hdcA-мутант, або середовище MRS, відповідно. Фігури 7 і 8 представляють дані з двох незалежних експериментів. Знову зондове введення L. reuteri 6475 через рот і шлунок суттєво зменшувало втрату маси і пошкодження ободової кишки в порівнянні з групою середовища-контролю. У мишей, які одержували hdcA-мутант, суттєво збільшувалися втрата маси і макроскопічне запалення в ободовій кишці в порівнянні з мишами, 15 UA 115864 C2 які одержували бактерії дикого типу, показуючи, що hdcA-мутант дає зменшену здатність атенуювання коліту. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 1. Спосіб відбору пробіотичного молочнокислого бактеріального штаму для застосування в локальному продукуванні гістаміну в ссавці, де вказаний спосіб передбачає скринінг бактерій на присутність активного оперону гістидину і відбір штаму, який має активний оперон гістидину і здатний продукувати гістамін. 2. Спосіб за п. 1, де вказаний штам відбирають на його здатність продукувати гістамін на рівні, більшому ніж 250 пг/мл. 3. Спосіб за п. 1 або 2, де вказаний штам є Lactobacillus reuteri. 4. Продукт для локального продукування гістаміну у ссавця, яке забезпечує лікування і/або профілактику запальних станів, який містить клітини пробіотичного молочнокислого бактеріального штаму, одержуваного способом відбору за будь-яким із пп. 1-3, де вказаний бактеріальний штам має активний оперон гістидину і здатний продукувати гістамін. 5. Продукт за п. 4, де вказаним ссавцем є людина. 6. Продукт за п. 4 або 5, де локальне продукування гістаміну відбувається в шлунковокишковому тракті (GI-тракті), сечостатевих шляхах (GU-тракті), порожнині рота, легенях, дихальних шляхах або на шкірі вказаного ссавця. 7. Продукт за будь-яким з пп. 4-6, де запальний стан вибраний з групи, що складається з коліту, запальної хвороби кишечнику, синдрому подразненої товстої кишки (слизового коліту), дивертикульозу, гінгівіту і вагініту. 8. Продукт за будь-яким з пп. 4-7, де вказаним штамом є Lactobacillus reuteri. 9. Продукт за п. 8, де вказаним штамом є Lactobacillus reuteri 6475. 10. Продукт за будь-яким із пп. 4-9, де вказане продукування додатково передбачає введення щонайменше одного додаткового терапевтичного або харчового агента. 11. Продукт за п. 10, де вказаний додатковий агент містить гістидин або аналог гістидину, придатне джерело вуглецю, яке підтримує продукування гістаміну вказаним штамом, або їх комбінацію. 12. Композиція для локального продукування гістаміну у ссавця, яке забезпечує лікування і/або профілактику запальних станів, що містить: (і) пробіотичний молочнокислий бактеріальний штам, одержуваний способом відбору за будьяким із пп. 1-3, де вказаний молочнокислий бактеріальний штам має активний оперон гістидину і здатний продукувати гістамін, і (іі) щонайменше один додатковий компонент, вибраний з групи, що складається з придатного джерела вуглецю, яке підтримує продукування гістаміну вказаним штамом, джерела гістидину або аналога гістидину і їх комбінації. 13. Продукт за п. 11, де вказаний гістидин або аналог гістидину знаходиться в формі харчового продукту або харчової добавки, що містить гістидин або аналог гістидину, або де вказане джерело вуглецю містить глюкозу. 14. Композиція за п. 12, де вказаний гістидин або аналог гістидину знаходиться в формі харчового продукту або харчової добавки, що містить гістидин або аналог гістидину, або де вказане джерело вуглецю містить глюкозу. 16 UA 115864 C2 17 UA 115864 C2 18 UA 115864 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 19