Інгібітори мітозу для інтенсифікації процесу апоптозу при терапії

Реферат: Винахід стосується способу лікування пацієнта, що має патогенні клітини, якими є клітини злоякісного новоутворення, що включає два введення (S)-2-(3-амінопропіл)-5-(2,5дифторфеніл)-N-метокси-N-метил-2-феніл-1,3,4-тіадіазол-3(2Н)-карбоксаміду, при якому має місце перше введення інгібітора з подальшим його другим введеням протягом 12-60 годин після першого введення протягом циклу дозування, причому цикл дозування складає 11-24 днів. UA 106214 C2 (12) UA 106214 C2 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід відноситься до інгібіторів мітозу для призначення пацієнтові, що має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого мітотичним інгібітором, для інтенсифікації процесу апоптозу клітин. Рівень техніки Інгібіторами мітозу (також іменованими мітотичними інгібіторами або антимітотиками) є важливі терапевтичні засоби для лікування захворювань, і вони застосовуються при лікуванні злоякісних новоутворень, а також як протиподагричні і протигрибкові засоби і для лікування рестенозу. Ці терапевтичні засоби-інгібітори мітозу порушують мітоз, що призводить до втрати клітиною здібності до ділення. При злоякісному новоутворенні інгібітори мітозу зупиняють злоякісне зростання і призводять до апоптозу або виводять з мітозу з подальшою загибеллю клітини. Відомо багато інгібіторів мітозу. Деякими інгібіторами мітозу є антитубулінові засоби. Антитубулінові засоби діють на тубулін, білок, який необхідний для мітозу. Антитубулінові засоби включають алкалоїди барвінку, таксани та епотілони. Інгібітори мітозу, направлені на нетубулінові мішені, також досліджували як протиракові терапевтичні засоби. Різні інгібітори мітозу впливають на різні ділянки клітинного циклу та іноді на інші функції, що не мають відношення до мітозу. Наприклад, антитубулінові засоби можуть впливати на немітотичні функції цитоскелету в проліферуючих клітинах та в термінальних диференційованих клітинах. Периферична нейротоксичність асоційована з тубуліновими засобами. Таким чином, різні інгібітори мітозу можуть володіти різними токсичностями. Алкалоїди барвінку інгібують полімеризацію мікротрубочок, що, таким чином, інгібує мітоз. Алкалоїди барвінку включають вінбластин, вінкристин, віндезин і вінорелбин. Вінбластин застосовують для лікування певних типів злоякісних новоутворень, включаючи лімфому Ходжкіна, недрібноклітинний рак легені, рак грудей та рак яєчка. Вінкристин застосовують для лікування певних типів злоякісних новоутворень, включаючи лімфому, рак легені та гострий лімфобластний лейкоз. Вінбластин і винкристин також застосовують як паліативні засоби для деяких основних солідних пухлин (Див. Wood, Kenneth W… et al. "Past and future of the mitotic spindle as an oncology treatment." Current Opinion in Pharmacology. Vol. I, Issue 4 (August 1, 2001): pp. 370-377). Віндезін застосовують для лікування певних типів злоякісних новоутворень, включаючи лейкоз, лімфому, меланому, рак грудей і рак легені. Вінорелбін застосовують для лікування певних типів раку, включаючи рак грудей і недрібноклітинний рак легені. Таксани стабілізують мікротрубочки і тим самим інактивують функцію мікротрубочок клітини та інгібують клітинне ділення. Таксани включають паклітаксел (включаючи Абраксан*) і доцетаксел. Паклітаксел застосовують для лікування певних типів злоякісних новоутворень, включаючи рак легені, рак яєчників, рак грудей і останні стадії саркоми Капоші. Доцетаксел застосовують для лікування певних типів злоякісних новоутворень, включаючи рак грудей, рак яєчників і недрібноклітинний рак легені. Також у стадії розробки знаходяться нові таксани, наприклад, BMS275183 (Див. 2006 EJC Poster: Broker, L.E., et al. "The novel oral taxanes BMS275183 has а favorable activity and toxicity profile in а twice weekly schedule; Preliminary findings from an extended phase 1 trial." EJC Suppl. 2006 Abstract 644, р. 194). Крім того, інгібітором мітозу є колхіцин, який діє як антитубуліновий засіб. Колхіцин інгібує мітоз шляхом інгібування полімеризації мікротрубочок. Колхіцин застосовують для лікування подагри. Епотілони є класом засобів хіміотерапії, що стабілізують мікротрубочки, з активністю в стійких до паклітакселу лініях злоякісних клітин (див. Denduluri, Neelima, et al. "Phase U trial of ixabepilone, an epothilones B analog, given daily for three days every three weeks, in metastatic breast cancer." Invest. New Drugs. 25 (August 25, 2006): pp. 63-67). Епотілони включають епотілон A, епотілон B, епотілон D та аналог епотілону іксабепілон. Іксабепілон був покращений для лікування агресивного метастазуючого або локального прогресуючого раку грудей, непіддатливого більш засобам хіміотерапії, доступним в даний час. Доластатин та аналоги доластатину є інгібіторами мітозу. Ці сполуки включають доластатин 10, доластатин 15, синтадотин (або SYN-D або ILX651; див. 2004 ASCO Abstract No. 3068, Hammond, L.A., et al. "Phase (Ph) 1 evaluation of the dolastatin analogue synthadotin (SYN-D; ILX651): Pooled data analysis of three alternate schedules in patients (pts) with advanced solid tumors." J. Clin. Oncology. 2004 Suppl. Abstract 3068 14s (2004)), LU 103793 і кемадотин. Аврора-кінази (Aurora kinases), що включають Аврора A, Аврора B і Аврора C є серин/треонин-кінази, які функціонують в мітозі. Аврора-кінази були намічені як мішені інгібіторів мітозу. Аврора A діє в профазі мітозу і потрібне для коректного функціонування центросом. Аврора B діє при прикріпленні мітотичного веретена до центромери. Інгібітори Аврора-кіназ 1 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають AZD-1152, CYC-116, AS-703569 (або R-763), MLN-8054, PHA-739358, AT-9283, SNS314, AZD-1152-HQPA, MLN-8237, KW-2449, PF-3814735, ENMD-2076 (або ENMD-981693), PHA739385, MK-0457 (або VX-680) і MK-5108 (або VX-689). Для більшої інформації див.: Gautschi, Oliver, et al. "Aurora Kinases as Anticancer Drug Targets." Clin. Cancer Res. 14(6) (March 15, 2008): pp. 1639-48. Полоподібні кінази (Polo-like-kinases –«Plks"), що включають полоподібну кіназу 1 ("Plk1"), полоподібну кіназу 2 ("Plk2"), полоподібну кіназу 3 ("Plk3") і полоподібну кіназу 4 ("Plk4"), залучені в утворення та зміни в мітотичному веретені і в активацію комплексів CDK/циклін під час мітозу. Полоподібні кінази були намічені як мішені інгібіторів мітозу. Інгібітори полоподібних кіназ включають ON-OI910Na (або ON-1910Na або Onc-01910), BI-2536 (див.: Stecgmaier, Martin, et al. "Bl 2536, а Potent and Selective Inhibitor of Polo-like Kinase 1, Inhibits Tumor Growth In Vivo." Current Biology. 17 (February 20, 2007): pp. 316-322) і GSK-461364 (або GSK-461364A). Кінезини є типом моторних білків. Мітотичні кінезини є ферментами, необхідними для збірки і функціонування мітотичного веретена. Мітотичні кінезини грають істотну роль у всіх фазах мітозу. Під час мітозу кінезини організовують мікротрубочки в біполярну структуру, яка є мітотичним веретеном. Інгібування мітотичного кінезину викликає неправильне утворення або дисфункцію мітотичного веретена, що часто призводить до затримки клітинного циклу і до апоптозу (клітинної загибелі). Серед ідентифікованих мітотичних кінезинів є кінезиновий білок веретена (kinesin spindle protein - "KSP"). Під час мітозу KSP зв'язується з мікротрубочками мітотичного веретена, а інгібуванню KSP запобігає розділення полюсів веретена під час прометафази з отриманням монополярних веретен, що викликає затримку в мітозі та індукцію програмованої клітинної смерті. Людський KSP також має назву HsEg5. У патентній заявці США 2006/0100161 описані сполуки, що містять 2-(3-амінопропіл)-5-(3фторфеніл)-N-(2-метоксиетил)-N-метил-2-феніл-1,3,4-тіадіазол-3(2H)-кабоксамид (далі "Сполука 1"), 2-(3-амінопропіл)-5-(3-фторфеніл)-N-метокси-N-метил-2-феніл-1,3,4-тіадіазол3(2H)- карбоксамид (далі "Сполука 2"), 2-(3-амінопропіл)-5-(2,5-дифторфеніл)-N-метокси-Nметил-2-феніл-1,3,4-тіадіазол-3(2H)- карбоксамид (далі "Сполука 3") (S)-2-(3-амінопропіл)-5-(2,5дифторфеніл)-N-метокси-N-метил-2-феніл-1,3,4-тіадіазол-3(2H)-карбоксамид (далі "Сполука 4") (R)-2-(3-амінопропіл)-5-(2,5-дифторфеніл)-N-метокси-N-метил-2-феніл-l, 3,4-тіадіазол-3(2H)карбоксамид (далі "Сполука 5"), і 2-(3- амінопропіл)-5-(2,5-дифторфеніл)-N-гідрокси-N-метил-2феніл-l, 3,4-тіадіазол-3(2H)-карбоксамид (далі "Сполука 6"). Сполука 1, 2, 3, 4, 5 і 6 (разом "16l KSP-інгібітори") є інгібіторами KSP. Інгібітори KSP включають іспінесиб (або SB-715992 або CK-0238273; див. 2008 ASCO Poster: "A Phase I-11 Open-Label Trial of Ispinesib on an Alternating Dosing Schedule in ChemotherapyNa[iota]ve Patients with Locally Advanced or Metastatic Breast Cancer (MBC)." www.cytokinetics.com/pdf/ASCO2008A.pdf), '161 інгібітори KSP, AZD-4877, CRx-026, SB-743921 (SB-921), MK-0731, EMD-534085 і ARQ 621. Іспінесиб тестували в широкому спектрі типів пухлин і він був протестований в клінічних випробуваннях на людині. Серед інших моторних білків, які діють під час мітозу, також були описані низькомолекулярні інгібітори для асоційованого з центромерою білка E ("CENP-E"). CENP-E є моторним білком (див. Chan, G.K.T., et al. "Characterization of the Kinetochore Binding Domain of CENP-E Reveals Interactions with the Kinetochore Proteins CENP-F and hBUBRI." J. Cell Biology. Vol. 143, No. 1 (October 5, 1998): pp. 49-63) і може бути віднесений до типу мітотичних кінезинів. Інгібітори CENP-E включають GSK-295 (або GSK-923295). Для лікування захворювань як терапевтичні засоби було протестовано безліч інгібіторів мітозу. Деякі інгібітори мітозу вводили в одноденному режимі або щотижня, кожні два тижні, кожного місяця і включаючи 24-годинні інфузії. Призначення тільки однієї дози інгібітора мітозу може бути недостатньо для достатньо тривалої підтримки клітини в стані затримки в мітозі з тим, щоб клітини пішли в апоптоз або вийшли з мітозу і перейшли до клітинної смерті. Також деякі інгібітори мітозу вводили двічі на тиждень, три рази на тиждень або три рази на місяць. Призначення декількох доз протягом тривалішого періоду часу часто знижувало переносимість пацієнтами доз, а індивідуальні дози можуть не досягати біологічно ефективного рівня. Розкриття винаходу Несподівано було виявлено, що після першої дози інгібітора мітозу, яка вводиться ссавцеві, що має патогенні клітини, і після того, як клітини входили в стан затримки в мітозі, призначення другої дози інгібітора мітозу через один або два дні після першої дози інтенсифікувало апоптоз або вихід з мітозу з подальшою клітинною смертю. У одному аспекті, даний винахід відноситься до інгібітора мітозу для призначення пацієнтові, що має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого інгібітором мітозу, для 2 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтенсифікації апоптозу клітин. У іншому аспекті даного винаходу пропонуються '161 KSP-інгібітори для призначення пацієнтові, що має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого '161 KSP-інгібітором, для інтенсифікації апоптозу клітин. Короткий опис креслень На Фіг. 1 представлений експеримент з нейтралізації апоптозу. На Фіг. 2 представлена активність каспаз 3/7 залежно від часу в клітинах HT-29 in vitro. На Фіг. 3 представлена активність каспаз 3/7 залежно від часу в клітинах RPMI 8226 in vitro. На Фіг. 4 представлена кількість монополярних веретен в підшкірних ксенотрансплантатах клітин HT-29 в голих мишах в різні моменти часу для двох різних режимів дозування. На Фіг. 5 представлена кількість монополярних веретен в підшкірних ксенотрансплантатах клітин HT-29 в голих мишах в різні моменти часу для двох різних режимів дозування. На Фіг. 6 представлений процентний вміст апоптозних клітин в підшкірних ксенотрансплантатах клітин HT-29 в голих мишах в різні моменти часу для двох різних режимів дозування. На Фіг. 7 представлений процентний вміст апоптозних клітин в підшкірних ксенотрансплантатах клітин HT-29 в голих мишах в різні моменти часу для двох різних режимів дозування. На Фіг. 8 представлений процентний вміст клітин з монополярним веретеном та біполярним веретеном в підшкірних ксенотрансплантатах в голих мишах через 24 години і через 48 годин для різних кількостей доз. На Фіг. 9 представлений процентний вміст апоптозних клітин в підшкірних ксенотрансплантатах HT-29 в голих мишах через 24 години і через 48 годин для різних кількостей доз. На Фіг. 10 представлений експеримент інгібування пухлинного росту (tumor growth inhibition – "TGI") в голих мишах з підшкірними ксенотрансплантатами HT-29. На Фіг. 11 представлений TGI-експеримент на голих мишах з підшкірними ксенотрансплантатами HT-29. На Фіг. 12 представлений TGI-експеримент на голих мишах з підшкірними ксенотрансплантатами HT-29. На Фіг. 13 представлений TGI-експеримент на голих мишах з підшкірними ксенотрансплантатами HT-29. На Фіг. 14 представлений TGI-експеримент на голих мишах з підшкірними ксенотрансплантатами HT-29. На Фіг. 15 представлений TGI-експеримент на голих мишах з підшкірними ксенотрансплантатами HT-29. На Фіг. 16 представлений TGI-експеримент на голих мишах з підшкірними ксенотрансплантатами HT-29. На Фіг. 17 представлений процентний вміст монополярних веретен в підшкірних трансплантатах клітин RPM18226 в мишах SCID-beige в різні моменти часу для різних режимів дозування. На Фіг. 18 представлений процентний вміст апоптозних клітин в підшкірних ксенотрансплантатах клітин RPMl8226 в мишах SCID-beige в різні моменти часу для різних режимів дозування. На Фіг. 19 представлений процентний зміст біполярних веретен. Здійснення винаходу Далі буде викладено докладний опис конкретних втілень винаходу. Хоча винахід буде описаний разом з пронумерованими втіленнями, зрозуміло, що втілення не призначені для обмеження обсягу винаходу. Навпаки, винахід призначений для того, щоб охопити всі альтернативи, модифікації та еквіваленти, які можуть бути включені в обсяг даного винаходу, визначеного пунктами формули винаходу. Фахівцеві в даній області очевидні багато методів та матеріалів, подібних або еквівалентних тим, що описані в цьому документі, які можуть бути застосовані при практичному здійсненні даного винаходу. Цей винахід жодним чином не обмежений описаними способами і матеріалами. У випадку, якщо одна або декілька з включених публікацій і подібних матеріалів відрізняється від цієї заявки або суперечить їй, що включає, зокрема, певні терміни, застосування термінів, описані методи і тому подібне, то перевага буде віддана заявці. Визначення Терміни "злоякісне новоутворення" та "злоякісний" відноситься до фізіологічного стану ссавців або описує такий стан, який, як правило, характеризується нерегульованим клітинним 3 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ростом. "Пухлина" містить одну або декілька злоякісних клітин. Приклади злоякісного новоутворення включають, зокрема, карциному, лімфому, бластему, саркому та лейкоз або лімфонеоплазії. Конкретніші приклади таких злоякісних новоутворень включають плоскоклітинний рак (наприклад, епітеліальний плоскоклітинний рак), рак легені, що включає дрібноклітинний рак легені, недрібноклітинний рак легені ("NSCLC"), аденокарциному легені та плоскоклітинну карциному легені, рак черевної порожнини, печінково-клітинний рак, рак шлунково-кишкового тракту або шлунковий рак, включаючи шлунково-кишковий рак, панкреатичний рак, гліобластому, цервікальний рак, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак грудей, рак товстої кишки, ректальний рак, колоректальний рак, внутрішньоматкову або маткову карциному, карциному слинної залози, рак нирки або нирковоклітинний рак, рак простати, рак вульви, рак щитовидної залози, карциному печінки, карциному анального каналу, карциному статевого члена, рак шкіри, що включає меланому, множинну меланому, і гострий мієлоїдний лейкоз. Терміни "лікувати" або "лікування" означають терапевтичні, профілактичні, паліативні або превентивні заходи. Для цілей даного винаходу, корисні і цільові клінічні результати, що детектуються або не детектуються, включають зокрема полегшення симптомів, ослаблення ступеня захворювання, стабілізований стан захворювання (тобто без погіршення), ослаблення або уповільнення прогресії захворювання, поліпшення або тимчасове полегшення стану захворювання і ремісія (або часткова, або повна). "Лікування" також може позначати тривале виживання в порівнянні з очікуваним виживанням за відсутності отримання лікування. Ті, хто потребує лікування, включають тих, хто вже має патологічний стан або розлад, а також тих, хто схильний до патологічного стану або розладу, або тих, у кого слід запобігти патологічному стану або розладу. Інгібітори мітозу для інтенсифікації апоптозу при терапії У даному винаході пропонується інгібітор мітозу для призначення пацієнтові, що має патологічні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого інгібітором мітозу, для інтенсифікації апоптозу клітин. Призначення інгібітора мітозу в клітини вводить клітини в стан затримки в мітозі. Проте затримка в мітозі необов'язково приводить клітини до апоптозу або спричиняє за собою протипухлинну ефективність (див., наприклад: Shi, Jue, et al. "Cell Type Variation in Responses to Antimitotic Drugs that Target Microtubules and Kinesin-5." Cancer Research. 68(9) (May 1, 2008): pp. 3269-76; і 2002 AACR Poster: "A Pharmacodynamic marker of mitosis demonstrates the anti-mitotic activity of SB-715992, an inhibitor of the mitotic kinesin KSP." www.cytokinetics.com/pdf/AACR_2002_Poster_1336.pdf). Було виявлено, що перед піковими значеннями апоптозу клітини повинні залишатися в стані затримки протягом тривалого періоду часу (див. Фіг. 1). Тривалість періоду часу, необхідного для апоптозу, є різною серед типів клітин і типів пухлин (див. Фіг. 2 і 3). Також призначення двох доз замість однієї збільшує тривалість біологічного ефекту (див. Фіг. 4 і 5), що у разі інгібіторів мітозу, збільшується тривалість і сила апоптозу (див. Фіг. 6 і 7). Таким чином, підтримка клітин в стані затримки протягом відповідного ефективного періоду часу необхідна для інтенсифікації апоптозу з використанням інгібітора мітозу. Введення інгібітора мітозу до клітин перешкоджає мітозу. Наприклад, введення інгібітору KSP збільшує кількість монополярних веретен. Проте для досягнення біологічної відповіді повинна додаватися мінімальна кількість інгібітору (див. Фіг. 8). Таким чином, призначення інгібітора мітозу повинне досягати біологічно ефективної дози інгібітору. Біологічно ефективна доза інгібітору KSP є дозою інгібітору, яка в результаті призводить до появи блокованих монополярних веретен. Їх можна спостерігати за допомогою імуногістохімічних методів (див. Фіг. 4, 5 і 8). Біологічно ефективна доза інших інгібіторів мітозу в результаті призводитиме до мітотичної аберації, що узгоджується з їх цільовим профілем. Якщо призначення інгібітора мітозу не здатне досягти біологічно ефективної дози, то відповідної біологічної відповіді не буде. Також, якщо призначення інгібітору не здатне підтримувати клітини в стані затримки достатньо довго, то клітини можуть не піти в апоптоз. Таким чином, для ефективної інтенсифікації апоптозу з використанням інгібітора мітозу потрібне призначення інгібітора мітозу, принаймні, в біологічно ефективній дозі для отримання цільового біологічного ефекту (тобто затримка в мітозі), а також інгібітор мітозу повинен знаходитися в дозованому стані протягом достатнього тривалого періоду часу, щоб підтримувати клітини в стані затримки і для індукції апоптозу (див. Фіг. 4-9 і 17-19). Було виявлено, що призначення інгібітора мітозу у вигляді дробової дози, розбитої на два дні, може бути ефективнішим, ніж ця ж ціла доза, отримана в один день (див. Фіг. 16). Для пухлин, в яких клітини швидко входять в апоптоз після мітотичного блоку (див. Фіг. 3), 4 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 затримки в мітозі (див. Фіг. 17) або апоптозу (див. Фіг. 18) можуть прямо не корелювати з підвищенням ефективності інгібування пухлинного зростання при режимі дробової дози (див. Фіг. 16). У таких випадках, менша кількість клітин, спостережуваних в стані затримки в мітозі і апоптозу, може відображати швидку клітинну смерть, так що вони більш не детектуються в пухлині. Проте кількість клітин з біполярним веретеном, вказуючим на нормальний клітинний цикл в мітозі, може корелювати в зворотній залежності з підвищеною ефективністю (див. Фіг. 19). У таких випадках, менша кількість клітин з біполярними веретенами указує на повніший мітотичний блок з меншою кількістю клітин, що виходять з блоку та вступають в клітинний цикл. У одному втіленні даного винаходу пропонується інгібітор мітозу для призначення пацієнтові, який має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, що індукується інгібітором мітозу, для інтенсифікації апоптозу клітин. У іншому втіленні цього винаходу пропонується '161 KSP-інгібітор для призначення пацієнтові, який має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, що індукується '161 KSPінгібітором мітозу, для інтенсифікації апоптозу клітин. Цей винахід відноситься до призначення для інтенсифікації апоптозу інгібітора мітозу, того ж самого, що й введений для індукції затримки в мітозі. Цей винахід застосовується для обробки патогенних клітин, отриманих клітинним діленням або які були оброблені шляхом інгібування мітозу. Інгібітори мітозу можуть застосовуватися для лікування різних захворювань, що включають гіперпроліферативні захворювання та подагру. Гіперпрофілератівні захворювання включають злоякісне новоутворення, аутоіммунне захворювання, артрит, відторгнення трансплантата, запальне захворювання кишечника або проліферацію, що індукується після медичного втручання. У певних втіленнях у винаході пропонується інтенсифікований апоптоз для патогенних злоякісних клітин. Конкретніше, патогенні злоякісні клітини включають, але не обмежуються перерахованим: злоякісні новоутворення м'яких тканин: саркому (ангіосаркому, фібросаркому, рабдоміосаркому, ліпосаркому), міксому, рабдоміому, фіброму, ліпому і тератому; Легені: бронхогенну карциному (плоскоклітинну, недиференційовану дрібноклітинну, недиференційовану крупноклітинну, аденокарциному), альвеолярну (бронхіальну) карциному, бронхіальну аденому, саркому, лімфому, хондроматозну гамартому, злоякісну мезотеліому; шлунково-кишковий тракт: для стравоходу (плоскоклітинну карциному, аденокарциному, лейоміосаркому, лімфому), для шлунку (карциному, лімфому, лейоміосаркому), для підшлункової залози (дуктальну аденокарциному, інсуліному, глюкагоному, гастриному, карциноїдні пухлини, віпоми), для тонкої кишки (аденокарциному, лімфому, карциноїдні пухлини, саркому Капоші, лейоміому, гемангіому, ліпому, нейрофіброму, фіброму), для товстої кишки (аденокарциному, тубулярну аденому, ворсинчасту аденому, гамартому, лейоміому); сечостатевий тракт: для нирок (аденокарциному, пухлину Вільмса [нефробластома], лімфому, лейкоз), для сечового міхура і уретри (плоскоклітинну карциному, перехідно-клітинну карциному, аденокарциному), для передміхурової залози (аденокарциному, саркому), для яєчка (семіному, тератому, ембріональну карциному, тератокарциному, хоріокарциному, саркому, кациному інтерстиціальних клітин, фіброму, фіброаденому, аденоматоїдні пухлини, ліпому); печінка: гепатому (печінковоклітинну карциному), холангіокарциному, гепатобластому, ангіосаркому, печінковоклітинну аденому, гемангіому; кістки: остеогенну саркому (остеосаркому), фібросаркому, злоякісну фіброзну гистиоцитому, хондросаркому, саркому Евінга, злоякісну лімфому (ретикулосаркому), множинну мієлому, злоякісну пухлину гігантських клітин – хордому, остеохондрому (кістнохрящеві екзостози), доброякісну хондрому, хондробластому, хондроміксофіброму, остеоїд-остеому та пухлини гігантських клітин; нервова система: для черепа (остеому, гемангіому, гранулому, ксантому, деформуючий остит), для м'яких мозкових оболонок (менінгіому, менінгіосаркому, гліоматоз), для мозку (астроцитому, медулобластому, гліому, епендимому, герміному [пінеалома], поліморфну гліобластому, олігодендрогліому, невріному, ретинобластому, природжені пухлини), нейрофіброму спинного мозку, менінгіому, гліому, саркому); гінекологія: для матки (карциному ендометрія), для шийки матки (цервікальну карциному, передпухлинну цервікальну дисплазію), для яєчників (карциному яєчників [серозна цистаденокарцинома, слизотвірна цистаденокарцинома некласифікована карцинома], гранульозотекаклітинні пухлини, пухлини клітин Сертолі-лейдіга, дисгерміному, злоякісну тератому), для вульви (плоскоклітинну карциному, внутрішньоепітеліальну карциному, аденокарциному, фібросаркому, меланому), для піхви (світлоклітинну карциному, плоскоклітинну карциному, ботриоїдну саркому (ембріональну рабдоміосаркому], для фаллопієвих труб (карциному); гематологія: для крові та кісткового мозку (міелоїдний лейкоз [гострий і хронічний], гострий лімфобластний лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз, мієлопроліферативні захворювання, множинну мієлому, мієлодиспластичний синдром), хворобу 5 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ходжкіна, неходжкінську лімфому [злоякісну лімфому]; шкіра: злоякісну меланому, базальноклітинну карциному, плоскоклітинну карциному, саркому Капоші, родимки – диспластичні невоїдні пухлини, ліпому, ангіому, дерамтофіброму, келоїди, псоріаз; надниркові: нейробластому. При використанні в цьому документі термін "злоякісна клітина" включає клітину, уражену будь-яким з вищеописаних ідентифікованих патологічних станів. У певних втіленнях, даний винахід застосовується для інтенсифікації апоптозу патогенних злоякісних клітин, де патогенними злоякісними клітинами є клітини солідної пухлини. Клітини солідної пухлини включають, пухлинні клітини шкіри, молочної залози, мозку, цервікальної карциноми, клітини тестикулярної карциноми, тощо. У певних втіленнях, солідні пухлини вибрані з раку молочної залози, колоректального раку, недрібноклітинного раку легенів, раку підшлункової залози, раку сечового міхура, раку слинної залози (аденоїдний кистоз), раку стравоходу, злоякісної мезотеліоми та змішаного дрібноклітинного раку легені/недрібноклітинного раку легені. У певних втіленнях, даний винахід застосовується для інтенсифікації апоптозу патогенних злоякісних клітин, де патогенними злоякісними клітинами є пухлинні клітини крові. Пухлинні клітини крові включають клітини лімфоми, лейкозу, множинної мієломи, тощо. У певних втіленнях, даний винахід використовується для інтенсифікації апоптозу патогенних злоякісних клітин, де патогенні злоякісні клітини вибрані з клітин лімфоми, лейкозу і клітин множинної мієломи. У наступному втіленні, даний винахід застосовується для інтенсифікації апоптозу патогенних злоякісних клітин, де патогенними злоякісними клітинами є клітини прогресуючого мієлоїдного лейкозу або рецидивуючої або непіддатливої лікуванню множинної мієломи. У наступному втіленні, даний винахід застосовується для інтенсифікації апоптозу патогенних злоякісних клітин, де патогенними злоякісними клітинами є клітини рецидивуючої або непіддатливої лікуванню множинної мієломи. Існує маса варіабельних параметрів для пошуку інтенсифікованого апоптозу при введенні інгібіторів мітозу. Конкретно для інгібіторів мітозу, для того, щоб досягти біологічного ефекту необхідно продовжувати призначення протягом достатнього тривалого періоду часу і при достатньому рівні експонування. З метою індукції затримки в мітозі в патогенних клітинах, здійснюють перше призначення інгібітора мітозу. Вважається, що це перше призначення відбувається в перший день. Потім при здійсненні другого призначення інгібітора мітозу на другий або третій день може відбуватися інтенсифікація апоптозу. У іншому випадку, другу дозу вводять в інтервалі від 24 до 48 годин після призначення першої дози. Цей аспект даного винаходу дає можливість інтенсифікації апоптозу патогенних клітин, оскільки доза інгібітору достатньо велика для досягнення біологічно ефективної дози для отримання цільового біологічного ефекту, тобто, клітини підтримуються в стані затримки в мітозі, а також затримка в мітозі підтримується достатньо довго для стимуляції апоптозу або виходу з мітозу, що призводить до клітинної смерті. Немає необхідності, щоб час введення цієї другої дози точно відповідав 24-48 годинам після першої дози. Це зручний спосіб позначення того, що друга доза повинна вводитися через один або два дні після першої дози. Таким чином, другу дозу вводять приблизно через 24-48 годин після першої дози. Ця друга доза може вводитися через 12-60 годин після першої дози. При призначенні другої дози інгібітора мітозу, введення безпосередньо одне за одним зручніше для пацієнтів. Переважно мати зручний режим дозування для пацієнтів, щоб підвищити дотримання пацієнтами методу лікування. Це особливо важливо для терапевтичних засобів, які вводять пацієнтам за допомогою внутрішньовенної ін'єкції, оскільки додаткові дози можуть вимагати додаткових візитів в лікарню або до лікаря для отримання ін'єкції. Відомо багато типів інгібіторів мітозу, що включають алкалоїди барвінку, таксани, епотілони, доластатин та аналоги доластатину, інгібітори аврора-кіназ, полоподібних кіназ та мітотичного кінезину. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з алкалоїдів барвінку, таксанів, епотілонів, доластатину та аналогів доластатину, інгібітори аврора-кіназ, полоподібних кіназ та мітотичного кінезину. Інгібітором мітозу може бути інгібітор мітотичного кінезину. Інгібітор мітотичного кінезину може бути інгібітором CENP-E або інгібітором KSP. Інгібітором мітозу може бути інгібітор KSP. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з GSK-295, іспінесибу, '161 KSP-інгібіторів, AZD-4877, CRx-026, SB-743921 (SB-921), MK-0731, EMD-534085 і ARQ 621. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з іспінесибу, '161 KSPінгібіторів, AZD-4877, CRx-026, SB-743921 (SB-921), MK-0731, EMD-534085 і ARQ 621. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з іспінесибу, '161 KSP 6 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інгібіторів та AZD-4877. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з '161 KSP-інгібіторів. Інгібітором мітозу може бути Сполука 1. Інгібітором мітозу може бути Сполука 2. Інгібітором мітозу може бути Сполука 3. Інгібітором мітозу може бути Сполука 4. Інгібітором мітозу може бути Сполука 5. Інгібітором мітозу може бути Сполука 6. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з SU-6668, AZD-1 152, CYC-1 16, AS-703569. MLN-8054, R763, PHA-739358, AT-9283, SNS-314, AZD-1 152-HQPA, MLN-8237, KW-2449, PF-3814735, ENMD-2076, PHA-739385, MK-0457, MK-5108, ON-0191ONa, B1-2536, GSK-461364, іспінесибу, '161 KSP-інгібіторів, AZD-4877, CRx-026, SB-743921 (SB-921), MK-0731, EMD-534085, ARQ 621 і GSK-295. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з вінбластину, вінкрістину, віндезину, вінорелбину, паклітакселу, доцетакселу, Абраксана®, колхіцину, епотілону A, епотілону B, епотілону D, іксабепілону, доластатину 10, доластатину 15, синтадотину, LU I 03793, цемадотину, SU-6668, AZD-1 152, CYC-1 16, AS-703569, MLN-8054, R763, PHA-739358, AT-9283, SNS-314, AZD-1 152-HQPA, MLN-8237, KW-2449, PF-3814735, ENMD-2076, PHA739385, MK-0457, MK-5108. ON-OI9IONa, Bl-2536, GSK-461364, GSK-295, іспінесибу, '161 KSPінгібіторів, AZD-4877, CRx-026, SB-743921 (SB-921), MK-0731, EMD-534085, ARQ 621 і GSK-295. Інгібітором мітозу може бути алкалоїд барвінку. Алкалоїд барвінку може бути вибраний з групи, що складається з вінбластину, вінкрістину, віндезину та вінорелбину. Інгібітором мітозу може бути таксан. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з паклітакселу, Абраксана® і доцетаксела. Інгібітором мітозу може бути колхіцин. Інгібітором мітозу може бути епотілон. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з епотілону A, епотілону B, епотілону D та іксабепілону. Інгібітором мітозу може бути доластатин або аналог доластатину. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з доластатину 10, доластатину 15, синтадотину, LU 103793 та цемадотину. Інгібітором мітозу може бути інгібітором аврора-кіназ. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з SU-6668, AZD-1 152, CYC-1 16, AS-703569, MLN-8054, R763, PHA739358, AT-9283, SNS-314, AZD-1 152-HQPA, MLN-8237, KW-2449, PF-3814735, ENMD-2076, PHA-739385, MK-0457 або MK-5108. Інгібіторами мітозу можуть бути інгібітори полоподібних кіназ. Інгібітор мітозу може бути вибраний з групи, що складається з ON-0I910Na, BI-2536 і GSK-461364. Інгібітором мітозу може бути інгібітор CENP-E. Інгібітором мітозу може бути GSK-295. Як обговорювалося вище, відповідна кількість інгібітора мітозу повинна вводитися з метою досягнення цільового біологічного ефекту. Таким чином, для інтенсифікації апоптозу шляхом введення, інгібітор мітозу вводитиметься, принаймні, у мінімальній кількості, при якій досягається цільовий біологічний ефект, або в біологічно ефективній дозі. Проте кількість не повинна бути настільки високою, щоб переважувати неприйнятними побічними ефектами користь від біологічного ефекту. Таким чином, для інтенсифікації апоптозу шляхом призначення інгібітора мітозу вводитиметься не більше ніж максимальна переносима доза ("МПД"). Кожне призначення інгібітора мітозу регулюється між біологічно ефективною дозою і максимально припустимою дозою. Максимально припустиму дозу визначають як найбільшу дозу, яка проводить прийнятну частоту виникнення дозолімітуючої токсичності ("ДЛТ"). Дози, які викликають неприйнятну частоту ДЛТ, вважаються неприпустимими. Як правило, МПД для конкретного режиму встановлюється у фазі 1 клінічних випробувань. Вони, як правило, проводяться на пацієнтах, починаючи з безпечної стартової дози, що становить 1/10 від сильної токсичної дози ("STD10") у 2 гризунів (на основі мг/м ), і розділяючи пацієнтів на групи по три, підвищують дозу згідно модифікованої послідовності Фібоначчі, при якій вищі стадії ескалації мають відносні інкременти, що зменшуються (наприклад, доза збільшується на 100 %, 65 %, 50 %, 40 %, а після цього на 30 %-35 %). Підвищення дози продовжується в групах по три пацієнта до тих пір, поки не буде досягнута нестерпна доза. Передбачається, що наступний нижчий рівень дози, яка дає прийнятну частоту ДЛТ, є МПД. Також, МПД інгібітора мітозу варіюєтсья залежно від інгібітору, зразка, складу та режиму дозування. Наприклад, призначення інгібітора мітозу тільки в один день в порівнянні з призначенням протягом одного і двох днів, в порівнянні з введенням протягом від одного до трьох і аж до семи, чотирнадцяти, двадцяти одного або двадцяти п'яти, може мати різні МПД. Проте, як обговорювалося вище, інтенсифікація апоптозу з використанням інгібітора мітозу для того, щоб вона була біологічно ефективною, вимагає призначення інгібітору в достатньо великій 7 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кількості, а також вимагає достатньо тривалого часу, щоб підтримувати клітини в стані мітотичного блоку. Призначенням в один день можна досягти тільки біологічно ефективної дози, але воно може бути недостатньо тривалим для інтенсифікації апоптозу клітин. У іншому випадку, призначення інгібітора мітозу протягом від одного до трьох днів може бути достатньо тривалим, але його може бути недостатньо для досягнення біологічно ефективної дози, і таким чином, апоптоз не буде інтенсифікований. Це може бути пов'язано з тим, що МПД триденного дозування нижча, ніж біологічно ефективна доза. Як правило, при обробці патогенних клітин, таких як злоякісні новоутворення, конкретну сполуку в МПД вводять пацієнтові так, щоб досягалася максимальна користь від лікування. Відповідно, в одному втіленні даного винаходу пропонується інгібітор мітозу для призначення пацієнтові, що має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого інгібітором мітозу, для інтенсифікації апоптозу клітин, де інгібітор мітозу вводять в максимальній переносимій дозі. У іншому втіленні даного винаходу пропонуються '161 KSP-інгібітори для призначення пацієнтові, що має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого '161 KSPінгібіторами, для інтенсифікації апоптозу клітин, де '161-Інгібітор вводять в максимальній переносимій дозі. При обробці патогенних клітин, таких як злоякісні новоутворення, цикл дозування встановлюється так, щоб після завершення першого циклу, могли вводитися додаткові цикли до тих пір, поки така обробка не буде необхідніша або ефективніша. Один з чинників, що визначають довжину циклу, полягає в можливості відновлення після побічних ефектів або в зменшенні побічних ефектів. Після призначення фармацевтичної композиції або терапевтичного засобу, конкретно, інгібітора мітозу, пацієнти можуть відчувати побічні ефекти. Залежно від типу побічних ефектів, може бути необхідне відновлення після побічних ефектів або зменшення побічних ефектів. Це відновлення після побічних ефектів або зменшення побічних ефектів може займати час, який, у свою чергу може контролювати довжину циклу перед початком другого циклу. Одним з побічних ефектів інгібіторів мітозу, а, конкретно, інгібіторів KSP, є гостра нейтропенія. Нейтропенія є гематологічним розладом, що характеризується аномально низькою кількістю нейтрофільних гранулоцитів, типу лейкоцитів. Як правило, пацієнти, що зазнавали такий тип побічних ефектів в результаті дії інгібітора мітозу (або інгібітору KSP), з ходом часу відновлюються від побічних ефектів нейтропенії у відсутності додаткових доз інгібітору. Після одноразового призначення інгібітору KSP багато пацієнтів відновлюються після побічних ефектів або побічні ефекти зменшуються на 14-21 день циклу. У даному винаході пропонується інгібітор мітозу для призначення пацієнтові, що має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого інгібітором мітозу, для інтенсифікації апоптозу клітин, де в циклі задана можливість для відновлення після побічних ефектів або для зменшення побічних ефектів. Перша доза індукує затримку в мітозі. У даному винаході пропонується інтенсифікація апоптозу за допомогою другої дози, що вводиться через один або два дні після першої дози. У даному винаході передбачається, що цикл, який включає призначення першої і другої дози, складає 14-21 день. Це зручний спосіб позначення 2-3 тижнів, і немає необхідності в тому, щоб було точно 14-21 день. Таким чином, цикл приблизно складає 14-21 день. Цикл може складати від 11 до 24 днів. Цикл може складати 14 днів або 11-17 днів. Цикл також може складати 21 день або 18-24 дні. У іншому втіленні цього винаходу пропонується '161 KSP-інгібітор для призначення пацієнтові, що має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого '161 KSP-інгібітором, для інтенсифікації апоптозу клітин. У певних втіленнях '161 KSP-інгібітор є Сполука 1. У певних втіленнях '161 KSP-інгібітор є Сполука 2. У певних втіленнях '161 KSP-інгібітор є Сполука 3. У певних втіленнях '161 KSP-інгібітор є Сполука 4. У певних втіленнях '161 KSP-інгібітор є Сполука 5. У певних втіленнях '161 KSP-інгібітор є Сполука 6. У певних втіленнях патогенними клітинами є клітини злоякісного новоутворення. У певних втіленнях патогенними клітинами є пухлинні клітини крові. У певних втіленнях патогенні клітини вибрані з клітин лімфоми, лейкозу та клітин множинної мієломи. У певних втіленнях патогенними клітинами є клітини солідної пухлини. У певних втіленнях патогенні клітини вибрані з пухлинних клітин шкіри, молочної залози, мозку, цервікальної карциноми та клітин тестикулярної карциноми. У певних втіленнях клітини солідної пухлини вибрані з клітин раку молочної залози, колоректального раку, недрібноклітинного раку легені, раку підшлункової залози, раку сечового міхура, раку слинної залози (аденоїдного кістозного), раку стравоходу, злоякісної мезотеліоми і змішаного дрібноклітинного раку легені/недрібноклітинного раку легені. У певних втіленнях інгібітор дозують в максимальній переносимій дозі. 8 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому втіленні даного винаходу пропонується '161 KSP-інгібітор для призначення пацієнтові, що має патогенні клітини в стані затримки в мітозі, індукованого '161 KSP-інгібітором, для інтенсифікації апоптозу клітин, де інгібітор вводять в максимальній переносимій дозі. У певних втіленнях '16I KSP-інгібітор є Сполука 1. У певних втіленнях '16I KSP-інгібітор є Сполука 2. У певних втіленнях '16I KSP-інгібітор є Сполука 3. У певних втіленнях '16I KSP-інгібітор є Сполука 4. У певних втіленнях '16I KSP-інгібітор є Сполука 5. У певних втіленнях '16I KSPінгібітор є Сполука 6. У певних втіленнях патогенними клітинами є клітини злоякісного новоутворення. У певних втіленнях патогенними клітинами є пухлинні клітини крові. У певних втіленнях патогенні клітини вибрані з клітин лімфоми, лейкозу і клітин множинної мієломи. У певних втіленнях патогенними клітинами є клітини солідної пухлини. У певних втіленнях патогенні клітини вибрані з пухлинних клітин шкіри, молочної залози, мозку, цервікальної карциноми та клітин тестикулярної карциноми. У певних втіленнях клітини солідної пухлини вибрані з клітин раку молочної залози, колоректального раку, недрібноклітинного раку легені, раку підшлункової залози, раку сечового міхура, раку слинної залози (аденоїдного кістозного), раку стравоходу, злоякісної мезотеліоми і змішаного дрібноклітинного раку легені/недрібноклітинного раку легені. У певних втіленнях Інгібітор дозують в максимальній переносимій дозі. Приклади З метою ілюстрації винаходу включені наступні приклади. Проте зрозуміло, що ці приклади не обмежують винахід і призначені виключно для підтримки і пропозиції способу практичного здійснення винаходу. Приклад 1 Нейтралізація апоптозу Клітини HT-29, оброблені або контролем з носієм (ДМСО), або 10 нМ Сполуки 4, розсівали в ідентичні 96-лункові культуральні планшети. Через 8 або 24 години Сполуку 4 видаляли від клітин HT-29, і середовище замінювали на свіже ростове середовище з метою визначення нейтралізації індукції апоптозу. Вимірювали активність Каспази 3/7 у вигляді люмінесценції продукту реакції у вказані моменти часу з використанням реагенту "CaspaseGlo 3/7" (Promega) та люмінометру. Значення представлені у вигляді активності каспази 3/7 в клітинах, оброблених Сполукою 4, розділеною на активність каспази 3/7 в клітинах, оброблених ДМСО. Результати представлені на Фіг. 1. Приклад 2 Апоптоз в HT-29 після тривалої обробки за допомогою Сполуки 4 Клітини HT-29, тривало оброблені або контролем з носієм (ДМСО), або Сполукою 4 в концентраціях 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ або 0,1 нМ, висівали в ідентичні 96-лункові культуральні планшети. Вимірювали активність Каспази 3/7 у вигляді люмінесценції продукту реакції у вказані моменти часу з використанням реагенту "CaspaseGlo 3/7" (Promega) і люмінометру. Значення представлені у вигляді активності каспази 3/7 в клітинах, оброблених Сполукою 4, розділеною на активність каспази 3/7 в клітинах, оброблених ДМСО. Дані включають середнє значення і величини стандартного відхилення чотирьох незалежних експериментів. Результати представлені на Фіг. 2. Приклад 3 Апотоз в клітинах RPMI 8226 Клітини RPMI 8226, оброблені або контролем з носієм (ДМСО), або 10 нМ Сполуки 4, або 10 нМ вінкрістином висівали в ідентичні 96-лункові культуральні планшети. Вимірювали активність Каспази 3/7 у вигляді люмінесценції продукту реакції у вказані моменти часу з використанням реагенту "CaspaseGlo 3/7" (Promega) і люмінометру. Значення представлені у вигляді активності каспази 3/7 в клітинах, оброблених лікарським засобом, розділеною на активність каспази 3/7 в клітинах, оброблених ДМСО. Дані включають середнє значення і величини стандартного відхилення чотирьох незалежних експериментів. Результати представлені на Фіг. 3. Приклад 4 Тривалість існування монополярних веретен і величина апоптозу (ксенотрансплантати HT29) Самкам голих мишей підшкірно імплантували 5 × 106 клітин HT-29 в 100 мкл PBS. Через десять днів вимірювали пухлини, і мишей розділяли на три групи випадковим чином з середнім 3. розміром пухлини в кожній групі, що становить приблизно 240 мм Сполуку 4 розчиняли в нормальному сольовому розчині безпосередньо перед введенням дози. Було визначено, що МПД для Сполуки 4 складає 20 міліграм/кг. Об'єм дози склав 10 мл/кг. Вводили контроль з носієм в перший день; Сполуку 4 в концентрації 20 міліграм/кг в перший день; і 20 міліграм/кг Сполуки 4 в дні 1 і 3. У різні моменти часу після введення дози (24, 48, 72, 96, 120 і 144 години), 9 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мишей піддавали евтаназії за допомогою CO2-інгаляції, а пухлини ізолювали і негайно поміщали у формалін. Зразки групи, що отримувала порожній контроль, збирали через 24 і 72 години після введення дози. Зразки групи, що отримували сполуку в день 1, збирали через 24, 48, 72 і 96 годин після призначення дози. Зразки групи, що отримувала сполука в дні 1 і 3, збирали через 72, 96, 120 і 144 годин після призначення першої дози. Парафінові блоки пухлинної тканини готували за допомогою стандартних процедур. Візуалізацію монополярних веретен проводили шляхом фарбування зрізів за допомогою первинного людського антитіла до альфа-тубуліну (клон B-7, Santa Cruz Biotechnology) з подальшою обробкою вторинним козиним антитілом, що зв'язує мишачі антитіла, кон'югованим з Alexafluor 488 (Invitrogen). Для підрахунку клітин забарвлювали ядра за допомогою Hoechst 33342. Структури веретена підраховували уручну в трьох областях 40X збільшення для кожного зразка з використанням флуоресцентного мікроскопа. Апоптоз оцінювали кількісно за допомогою ручного підрахунку TUNEL-позитивних клітин, також в трьох областях 40X збільшення для кожного зразка (TUNEL-забарвлення проводили з використанням набору "In Situ Cell Death Detection Kit, AP" від Roche). Результати представлені на Фіг. 4 та 6. Приклад 5 Тривалість існування монополярних веретен і величина апоптозу (ксенотрансплантати з HT29) Способи прикладу 5 є тими ж, що і в прикладі 4, за винятком того, що вводили контроль з носієм в день 1; Сполуку 4 в концентрації 8 міліграм/кг в день 1; і 8 міліграм/кг Сполуки 4 в дні 1 і 3. Зразки групи, що отримувала контроль з носієм, збирали через 24 і 72 години після введення дози. Зразки групи, що отримували сполуку в день 1, збирали через 24, 48, 72 і 96 годин після введення дози. Зразки групи, що отримувала сполуку в день 1 і день 3, збирали через 72, 96, 120 і 144 годин після введення першої дози. Результати представлені на Фіг. 5 та 7. Приклад 6 Мітотичний блок і апоптоз (HT-29) Самкам голих мишей підшкірно імплантували 3 × 106 клітин HT-29 в 100 мкл PBS. Через чотирнадцять днів вимірювали пухлини, і мишей розділяли на три групи випадковим чином з 3. середнім розміром пухлини в кожній групі, що становить приблизно 300 мм Вводили контроль з носієм і Сполуку 4 в концентрації 5, 10, 20 і 30 міліграм/кг. Всі зразки збирали через 24 і 48 годин після введення дози. Решта всіх способів була описана в прикладі 4. Результати представлені на Фіг. 8 та 9. Приклад 7 Інгібування пухлинного зростання при різних режимах дозування (HT-29) Самкам голих мишей підшкірно імплантували 4 × 106 клітин HT-29 в 100 мкл PBS. Через тринадцять днів вимірювали пухлини, і мишей розділяли на вісім груп випадковим чином з 3. середнім розміром пухлини в кожній групі, що становить приблизно 210 мм Сполуку 4 розчиняли в нормальному сольовому розчині безпосередньо перед введенням і вводили інтраперитонально в кількості 10 мл/кг протягом 12 днів в дозах 4 міліграми/кг щодня, 8 міліграм/кг через день, і 16 міліграм/кг кожен четвертий день. Масу тварин і розмір пухлин вимірювали (за допомогою електронного штангенциркуля) двічі в тиждень. Об'єм пухлини 2 розраховували за допомогою формули: об'єм = (ширина x довжина)/2. Результати представлені на Фіг. 10. Приклад 8 Інгібування пухлинного зростання при різних режимах дозування (HT-29) Самкам голих мишей підшкірно імплантували 5 × 106 клітин HT-29 в 100 мкл PBS. Через одинадцять-чотирнадцять днів вимірювали пухлини, і мишей розділяли на сім груп випадковим . чином з середнім розміром пухлини в кожній групі, що становить приблизно 230 мм3 Сполуку 4 розчиняли в нормальному сольовому розчині безпосередньо перед дозуванням і вводили інтраперитонеально в кількості 10 мл/кг. Схема дозувань була наступною: порожній носій в день 1 і день 2; і Сполука 4 в концентрації 20 міліграм/кг в день 1; 20 міліграм/кг в дні 1 і 2; 20 міліграм/кг в дні 1 і 3; 5 міліграм/кг в дні 1, 2 і 3; 10 міліграм/кг в дні 1, 2 і 3; 10 міліграм/кг в дні 1, 2, 3, 4 і 5; 10 міліграм/кг в дні 1 і 2; і 10 міліграм/кг в дні 1 і 3. Масу тварин і розмір пухлин вимірювали (за допомогою електронного штангенциркуля) двічі в тиждень. Об'єм пухлини 2 розраховували за допомогою формули: об'єм = (ширина x довжина)/2. Доза 10 міліграм/кг в дні 1, 2, 3, 4 і 5 була нестерпною (більш ніж 20 % втрат ваги і/або смерть деяких з мишей). Результати представлені на Фіг. 11-15. Приклад 9 Інгібування пухлинного зростання при різних режимах дозування (RPMI 8226) Самкам мишей SCID-beige підшкірно імплантували 1 × 107 клітин RPMI 8226 в 100 мкл PBS 10 UA 106214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 разом з 50 % "Matrigel". Через двадцять п'ять днів вимірювали пухлини, і мишей розділяли на сім груп випадковим чином з середнім розміром пухлини в кожній групі, що становить приблизно 3 225 мм . Сполуку 4 розчиняли у фізіологічному розчині безпосередньо перед введенням і вводили інтраперитонеально в кількості 10 мл/кг. Схема дозувань була наступною: порожній носій в день 1; і Сполука 4 в концентрації 20 міліграм/кг в день 1; 10 міліграм/кг в дні 1 і 2; 10 міліграм/кг в дні 1 і 3; і 20 міліграм/кг в дні 1, 5 і 9. Масу тварин і розмір пухлин вимірювали (за допомогою електронного штангенциркуля) двічі в тиждень. Об'єм пухлини розраховували за 2 допомогою формули: об'єм = (ширина x довжина)/2. Результати представлені на Фіг. 16. Приклад 10 Тривалість існування монополярних веретен, біполярних веретен і величина апоптозу (RPMI 8226) Самкам мишей SCID-beige підшкірно імплантували 1 × 107 клітин RPMI 8226 в 100 мкл PBS разом з 50 % "Matrigel". Через тридцять один день вимірювали пухлини, і мишей розділяли на три групи випадковим чином з середнім розміром пухлини в кожній групі, що становить 3 приблизно 210 мм . Сполуку 4 розчиняли у фізіологічному розчині безпосередньо перед введенням. Було визначено, що МПД для Сполуки 4 складає 20 міліграм/кг. Об'єм дози склав 10 мл/кг. Схема дозувань була наступною: з порожнім контролем в день 1; із Сполукою 4 в концентрації 10 міліграм/кг в день 1; 20 міліграм/кг в день 1; 10 міліграм/кг в дні 1 і 2; і 10 міліграм/кг в дні 1 і 3. У різні моменти часу після введення доз (24, 48, 72 і 96 годин), мишей піддавали евтаназії за допомогою CO2-інгаляції, а пухлини ізолювали і негайно поміщали у формалін. Зразки групи, що отримувала контроль з носієм, збирали через 48 годин після введення доз. Зразки групи, що отримувала 10 міліграм/кг в день 1, збирали через 24 і 48 годин після введення доз. Зразки групи, що отримувала 20 міліграм/кг в день 1, збирали через 24, 48 і 72 години введення доз. Зразки групи, що отримувала 10 міліграм/кг в дні 1 і 2, збирали через 48 і 72 години після введення першої дози. Зразки групи, що отримувала 10 міліграм/кг в дні 1 і 3, збирали через 72 і 96 годин після введення першої дози. Парафінові блоки пухлинної тканини готували за допомогою стандартних процедур. Візуалізацію монополярних веретен проводили шляхом фарбування зрізів за допомогою первинного людського антитіла до альфа-тубуліну (клон B-7, Santa Cruz Biotechnology) з подальшою обробкою вторинним козиним антитілом, що зв'язує мишачі антитіла, кон'югованим з Alexafluor 488 (Invitrogen). Для підрахунку клітин ядра забарвлювали за допомогою Hoechst 33342. Структури веретена підраховували вручну в трьох областях 40X збільшення для кожного зразка з використанням флуоресцентного мікроскопа. Апоптоз оцінювали кількісно за допомогою ручного підрахунку TUNEL-позитивних клітин, також в трьох областях 40X збільшення для кожного зразка (TUNEL-забарвлення проводили з використанням набору "In Situ Cell Death Detection Kit, AP" від Roche). Результати представлені на Фіг. 17, 18 та 19. Приклад 11 Визначення МПД в Дослідженні Фази 1 У клінічне випробування фази 1 на людині було залучено всього 13 пацієнтів з різними солідними пухлинами і з середнім віком 66 років (у інтервалі 40-79 років) (див. "Phase 1 Safety and Pharmacokinetic Study of ARRY-520 in Solid Tumors." http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00462358). Оброблювані солідні пухлини були раком молочної залози (2), колоректальним раком (2), недрібноклітинним раком легені (2), раком підшлункової залози (2), раком сечового міхура, раком слинної залози (аденоїдний кістозний), раком стравоходу, злоякісною мезотеліомою і змішаним дрібноклітинним раком легені/недрібноклітинний рак легені. Для введення Сполуку 4 було надано у вигляді ліофілізованого порошку, що знаходиться в чистій скляній пробірці Типу 1, для в/в 2 застосування. Кількість дози, що вводиться, склала 1,25 і 1,6 мг/м /день Сполуки 4 в дні 1 і 2 2 кожні два тижні. Визначили, що МПД складає 1,25 мг/м /день (кумулятивна доза за цикл складає 2 2,5 мг/м ), з ДЛТ гіпонатріємії стадії 3, з анорексією, збільшенням AST і гарячковою нейтропенією. Див. також, "A Phase 1/2 Study of ARRY-520 in Patients With Relapsed or Refractory Multiple Myeloma." http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00821249. Тоді як винахід буде описаний спільно з пронумерованими втіленнями, зрозуміло, що вони не призначені для обмеження винаходу. Навпаки, винахід призначений для того, щоб охопити всі альтернативи, модифікації і еквіваленти, які можуть бути включені в рамки даного винаходу, визначеного пунктами формули винаходу. Таким чином, вищевикладений опис пропонується виключно як ілюстрація принципів винаходу. Слова "містить", "що містить", "включає" і "що включає" при використанні в даному описі і в подальшій формулі винаходу призначені для визначення присутності встановлених ознак, 11 UA 106214 C2 чисел, компонентів або стадій, але це не виключає присутності або доповнення одного або більш з інших ознак, чисел, компонентів, стадій або їх груп. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 40 1. Спосіб лікування пацієнта, що має патогенні клітини, що включає два введення (S)-2-(3амінопропіл)-5-(2,5-дифторфеніл)-N-метокси-N-метил-2-феніл-1,3,4-тіадіазол-3(2Н)карбоксаміду, при якому має місце перше введення інгібітора з подальшим його другим введеням протягом 12-60 годин після першого введення протягом циклу дозування, причому цикл дозування складає 11-24 днів. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що друге введення здійснюють через 24-48 годин після першого введення, інгібітор для першого введення є таким же, як інгібітор для другого введення. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що друге введення інгібітора здійснюють через 24 години після першого введення. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-2, який відрізняється тим, що друге введення інгібітора здійснюють через 48 годин після першого введення. 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що цикл дозування складає 14-21 днів. 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що цикл дозування складає 14 днів. 7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що цикл дозування складає 21 день. 8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що патогенними клітинами є клітини злоякісного новоутворення. 9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що патогенними клітинами є пухлинні клітини крові. 10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що патогенні клітини вибрані з клітин лімфоми, лейкозу і клітин множинної мієломи. 11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що патогенними клітинами є клітини солідної пухлини. 12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8 або 11, який відрізняється тим, що патогенні клітини вибрані з пухлинних клітин шкіри, молочної залози, мозку, цервікальної карциноми і клітин тестикулярної карциноми. 13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8 або 11, який відрізняється тим, що патогенні клітини вибрані з клітин раку молочної залози, колоректального раку, недрібноклітинного раку легені, раку підшлункової залози, раку сечового міхура, раку cлинoвої залози (аденоїдного кістозного), раку стравоходу, злоякісної мезотеліоми і змішаного дрібноклітинного раку легені/недрібноклітинного раку легені. 14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, який відрізняється тим, що (S)-2-(3-амінопропіл)-5-(2,5дифторфеніл)-N-метокси-N-метил-2-феніл-1,3,4-тіадіазол-3(2Н)-карбоксамід вводять в максимальній переносимій дозі. 15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що максимальна переносима доза складає 1,25 2 міліграм/м /доба. 12 UA 106214 C2 13 UA 106214 C2 14 UA 106214 C2 15 UA 106214 C2 16 UA 106214 C2 17 UA 106214 C2 18 UA 106214 C2 19 UA 106214 C2 20 UA 106214 C2 21 UA 106214 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 22