Є ще 238 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Олігомер довжиною 7-10 нуклеїнових основ, який містить безперервну послідовність нуклеїнових основ з 7-10 нуклеїнових основ, де щонайменше 70 % одиниць нуклеїнових основ олігомеру являють собою одиниці нуклеїнових основ замкненої нуклеїнової кислоти (LNA), і де олігомер містить щонайменше один фосфоротіоатний зв'язок.

2. Олігомер за п. 1, де щонайменше 75 % міжнуклеозидних зв'язків, розташованих між одиницями нуклеїнових основ безперервної послідовності нуклеїнових основ, являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки.

3. Олігомер за п. 1, де всі міжнуклеозидні зв'язки, розташовані між одиницями нуклеїнових основ безперервної послідовності нуклеїнових основ, являють собою фосфоротіоатні міжнуклеозидні зв'язки.

4. Олігомер за будь-яким з пп. 1-3, який містить 3'-кінцеву одиницю LNA і 5'-кінцеву одиницю LNA.

5. Олігомер за будь-яким з пп. 1-4, в якому всі одиниці нуклеїнових основ безперервної послідовності нуклеїнових основ являють собою одиниці нуклеїнових основ LNA.

6. Олігомер за будь-яким з пп. 1-5, де олігомер складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ.

7. Олігомер за будь-яким з пп. 1-6, де безперервна послідовність нуклеїнових основ містить послідовність, яка комплементарна вихідній послідовності ссавця, людини або послідовності вірусної мікроРНК.

8. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в міРНК, вибраній з групи, що складається з:

9. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в міРНК, вибраній з групи, що складається з:

10. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-33 або hsa-miR-33b.

11. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-9 або hsa-miR-9*.

12. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-10a або hsa-miR-10b.

13. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-20a або hsa-miR-20b.

14. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-19a або hsa-miR-19b.

15. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-106a.

16. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-155.

17. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-21.

18. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-122a.

19. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-208.

20. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-499.

21. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-15.

22. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-195.

23. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-451.

24. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-29.

25. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-92.

26. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-143.

27. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-145.

28. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-199.

29. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-206.

30. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-378.

31. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-375.

32. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-138.

33. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-34a.

34. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-27a.

35. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-182.

36. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-183.

37. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-96.

38. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-338.

39. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-30.

40. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-133.

41. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-17.

42. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ є комплементарною відповідній нуклеотидній послідовності, яка міститься в hsa-miR-24.

43. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ складається з або містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з:

44. Олігомер за будь-яким з пп. 1-7, де безперервна послідовність нуклеїнових основ складається з або містить послідовність, вибрану з групи, яка складається з:

45. Олігомер за будь-яким з пп. 1-44, де олігомер складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ з 7 нуклеїнових основ LNA, в якому всі міжнуклеозидні зв’язки є фосфоротіоатними.

46. Олігомер за будь-яким з пп. 1-44, де олігомер складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ з 8 нуклеїнових основ LNA, в якому всі міжнуклеозидні зв’язки є фосфоротіоатними.

47. Олігомер за будь-яким з пп. 1-44, де олігомер складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ з 9 нуклеїнових основ LNA, в якому всі міжнуклеозидні зв’язки є фосфоротіоатними.

48. Олігомер за будь-яким з пп. 1-44, де олігомер складається з безперервної послідовності нуклеїнових основ з 10 нуклеїнових основ LNA, в якому всі міжнуклеозидні зв’язки є фосфоротіоатними.

49. Олігомер за будь-яким з пп. 1-48 для застосування як лікарського засобу.

50. Спосіб in vitro зменшення ефективної кількості мікроРНК-мішені в клітині, який включає введення композиції, яка містить олігомери за будь-яким з пп. 1-48 з метою зменшення ефективної кількості мікроРНК в клітині.

Текст

Реферат: Винахід належить до дуже коротких глибоко модифікованих олігонуклеотидів, що спрямовані на мікроРНК та інгібують їх in vivo, і до їх застосування в лікарських засобах і фармацевтичних композиціях. UA 102529 C2 (12) UA 102529 C2 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується дуже коротких олігонуклеотидів, що інгібують мікроРНК in vivo, мішенню для яких є мікроРНК, і до їх застосування в лікарських засобах і фармацевтичних композиціях. РІВЕНЬ ВИНАХОДУ МікроРНК (міРНК) являють собою численний клас коротких ендогенних РНК, які діють як посттранскрипційні регулятори генної експресії шляхом спарювання основ з їх цільовою матричною РНК (мРНК). Вони процесуються з більш довгих (близько 70-80 нуклеотидів (нт)) шпилькоподібних попередників, званих пре-міРНК, за допомогою дайсер-ферменту РНКази III. Збірка мікроРНК відбувається в рибонуклеопротеїнових комплексах, званих miRNP, при цьому міРНК розпізнають свої ділянки-мішені за допомогою антисмислової комплементарності, що, таким чином, сприяє даун-регуляції їх генів-мішеней. Майже довершена або довершена комплементарність між міРНК і її сайтом-мішенню призводить до гідролізу мРНК-мішені, тоді як обмежена комплементарність мікроРНК і її сайта-мішені призводить до трансляційного інгібування гена-мішені. Суть ролі мікроРНК в захворюваннях людини і інгібування мікроРНК з використанням одноланцюжкових олігонуклеотидів розглянуті в патентах WO2007/112754 і WO2007/112753, які обидва повністю включені в даний винахід за допомогою посилання. Патент WO2008046911, включений в даній опис за допомогою посилання, описує послідовності мікроРНК, пов'язані з раковими захворюваннями. Існує зв'язок багатьох мікроРНК з фенотипами захворювань, і тому бажано отримати речовини, здатні модулювати доступність мікроРНК in vivo. У патентах WO2007/112754 і WO2007/112753 розкриті короткі одноланцюжкові олігонуклеотиди, для яких передбачається утворення потужних дуплексів з міРНК-мішенню. Згідно з патентами WO2007/112754 і WO2007/112753, розкритими в них послідовності SEQ ID NO: 1-45 являють собою приклади анти-мікроРНК олігонуклеотидів. СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ У даній заявці запитується пріоритет чотирьох заявок: US № 60/977497, поданої 4 жовтня 2007 року, US № 60/979217, поданої 11 жовтня 2007 року, US № 61/028062, поданої 12 лютого 2008 року, і EP08104780, поданої 17 липня 2008 року, всі з яких включені з посиланням в даний винахід за допомогою посилання. Крім того, автори посилаються на патенти WO2007/112754 і WO2007/112753, які є більш ранніми заявками цих самих заявників, і включають їх в даний винахід за допомогою посилання. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід грунтується на відкритті, що використання дуже коротких олігонуклеотидів, що націлені на мікроРНК і мають високе співвідношення нуклеотидних аналогів нуклеотидів, таких як ЗНК-нуклеотидів (замкнених нуклеїнових кислот (LNA)), є високоефективним для полегшення репресії РНК, таких як мРНК, за допомогою націлених мікроРНК in vivo. Даний винахід належить до олігомеру з безперервною послідовністю довжиною 7, 8, 9 або 10 нуклеотидних одиниць, що використовується для зменшення ефективної кількості мікроРНКмішеней в клітині або в організмі, де щонайменше 70 % нуклеотидних одиниць олігомеру, наприклад, щонайменше 80 % нуклеотидних одиниць олігомеру, вибрані з групи, що складається з одиниць ЗНК і 2'-заміщених аналогів нуклеотиду. Даний винахід належить до олігомеру з безперервною послідовністю довжиною 7, 8, 9 або 10 нуклеотидних одиниць, що використовується для зменшення ефективної кількості мікроРНКмішеней в клітині або в організмі, де щонайменше 70 % нуклеотидних одиниць олігомеру вибрані з групи, що складається з одиниць ЗНК і 2'-заміщених аналогів нуклеотиду, і де щонайменше 50 %, наприклад, щонайменше 60 %, наприклад, щонайменше 70 % нуклеотидних одиниць олігомеру є ЗНК-одиницями. Даний винахід належить до олігомерів довжиною від 7 до 10 нуклеотидів, які містять безперервну послідовність нуклеотидів в загальній складності від 7 до 10 нуклеотидів, наприклад, 7, 8, 9 нуклеотидних одиниць, де щонайменше 50 % нуклеотидних одиниць олігомеру є аналогами нуклеотидів. Даний винахід додатково належить до олігомеру довжиною від 7 до 10 нуклеотидів, який містить безперервну нуклеотидну послідовність загалом від 7 до 10 нуклеотидів, наприклад, 7, 8, 9 або 10 нуклеотидних одиниць, в якому нуклеотидна послідовність комплементарна відповідній нуклеотидній послідовності, що виявляється в мікроРНК ссавців або вірусів, і де щонайменше 50 % нуклеотидних одиниць олігомеру є нуклеотидними аналогами. Даний винахід належить до олігомерів за винаходом як лікарський засіб. Даний винахід належить до фармацевтичних композицій, що містять олігомер за винаходом і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій, сіль або ад'ювант. 1 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід належить до кон'югату, що містить олігомер за винаходом, кон'югований з щонайменше однією ненуклеотидною або полінуклеотидною одиницею, такою як стерин, наприклад, з холестерином. Даний винахід належить до застосування олігомеру або кон'югату за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування захворювання або клінічного порушення, пов'язаного з наявністю або надекспресією мікроРНК, наприклад, однієї або декількох мікроРНК, що згадуються в даному винаході. Даний винахід належить до лікування захворювання або клінічного порушення, пов'язаного з наявністю або надекспресією мікроРНК, що включає стадію введення композиції (наприклад, фармацевтичної композиції), що містить олігомер або кон'югат за винаходом, пацієнту, у якого діагностовано або приблизно є вказане захворювання або клінічне порушення. Даний винахід належить до способу зменшення ефективної кількості мікроРНК-мішені в клітині або організмі, що включає введення в клітину або організм олігомеру за винаходом або композиції (наприклад, фармацевтичної композиції), що містить олігомер або кон'югат за винаходом. Даний винахід належить до способу зменшення ефективної кількості мікроРНК-мішені в клітині або організмі, що включає введення в клітину або організм олігомеру або кон'югату або фармацевтичної композиції за винаходом. Даний винахід належить до способу дерепресії мРНК-мішені (або однієї або декількох РНК) в клітині або в організмі, що включає введення у вказану клітину або організм олігомеру або кон'югату за винаходом, або композиції, що містить вказаний олігомер або кон'югат. Даний винахід належить до застосування олігомеру або кон'югату за винаходом для інгібування мікроРНК в клітині, в якій міститься вказана мікроРНК, наприклад, в клітині людини. Застосування можна здійснювати in vivo або in vitro. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігура 1. Схематичне відображення 8-мірних ЗНК-анти-мікроРНК: miR-21, miR-155 і miR-122, з вказівкою положень мішеней з повною ЗНК-модифікованою і фосфоротіольованою ЗНК-антиmiR. Також позначені переважні положення гібридизації для 7-мірних, 8-мірних, 9-мірних і 10мірних олігонуклеотидів ЗНК на зрілій мікроРНК. Фігура 2. Оцінка антагонізму miR-21 за допомогою SEQ ID NO: 3205 і SEQ ID NO: 3204 ЗНКанти-miR в клітинах MCF-7 (Michigan Cancer Foundation 7) з використанням люциферазасенсорного аналізу. Клітини MCF-7 котрансфекували люцифераза-чутливими плазмідами, що містять повністю співпадаючий сайт-мішень для miR-21 або помилковий сайт-мішень (mm2) і ЗНК-анти-miR в різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Всі показані середні значення співвідношення люцифераз Renilla/світляк в трьох окремих експериментах (риска зверху = стандартна помилка середнього s.e.m.) були стандартизовані за 0 нМ psiCHECK2 (=контроль). Фігура 3. Оцінка антагонізму miR-21 за допомогою SEQ ID NO: 3205 і SEQ ID NO: 3204 ЗНКанти-miR в клітинах HeLa з використанням люцифераза-сенсорного аналізу. Клітини HeLa були котрансфіковані люцифераза-чутливими плазмідами, що містять повністю співпадаючий сайтмішень для miR-21 (mir-21) або помилковий сайт-мішень (mm2) і ЗНК-анти-miR в різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Всі показані середні значення співвідношення люцифераз Renilla/світляк в трьох окремих експериментах (риска зверху = s.e.m.) були стандартизовані за 0 нМ psiCHECK2 (=контроль). Фігура 4. Оцінка антагонізму miR-155 з допомогою з SEQ ID NO: 3206 і SEQ ID NO: 3207 ЗНК-анти-miR в оброблених ЛПС (ліпополісахаридом) мишачих клітинах RAW з використанням люцифераза-сенсорного аналізу. Клітини RAW були котрансфіковані miR-155 і різними ЗНКанти-miR в різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Всі показані середні значення співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ psiCHECK2. Фігура 5. Оцінка антагонізму miR-122 за допомогою з SEQ ID NO: 3208 і SEQ ID NO: 4 ЗНКанти-miR в клітинах HuH-7 з використанням люцифераза-сенсорного аналізу. Клітини HuH-7 котрансфекували люцифераза-чутливою miR-122, що містить повністю співпадаючий сайтмішень miR-122 і відмінні ЗНК-анти-miR в різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Всі показані середні значення співвідношення люцифераз Renilla/світляк в трьох окремих експериментах (риска зверху = s.e.m.) були стандартизовані за 0 нМ psiCHECK2 (=контроль). Фігура 6. Схематичне представлення репортерних конструкцій miR-21-люциферази. Фігура 7. Оцінка антагонізму miR-21 з допомогою 8-мірних ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3205) в порівнянні з 15-мірними ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3204) в клітинах PC3 з використанням 2 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 люцифераза-сенсорного аналізу. Клітини PC3 були котрансфіковані люциферазними репортерними плазмідами, що містять повністю співпадаючий сайт-мішень miR-21 або помилковий сайт-мішень і ЗНК-анти-miR при різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені (=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-21 і конструкція і положення замкнених нуклеїнових кислот ЗНК-анти-miR. Нуклеотиди ЗНК позначені овалами, і залишки ДНК позначені рисками. Фігура 8. Оцінка специфічності антагонізму miR-21 з допомогою 8-мірних ЗНК-анти-miR в клітинах HeLa з використанням аналізу з люциферазним репортером. Клітини HeLa котрансфекували люциферазними репортерними плазмідами, що містять повністю співпадаючий або помилковий сайт-мішень для miR-21 і ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3205) або 8мірний ЗНК-помилковий контрольний олігонуклеотид (SEQ ID NO: 3218) при різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені (=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-21 і конструкція і положення замкнених нуклеїнових кислот ЗНК-анти-miR. Неспівпадання позначені чорними овалами. Фігура 9. Оцінка можливої найбільш короткої довжини повністю ЗНК-модифікованої ЗНКанти-miR, яка сприяє ефективному антагонізму miR-21. Клітини HeLa були котрансфіковані люциферазними репортерними плазмідами, що містять повністю співпадаючий або помилкового сайт-мішень для miR-21 і ЗНК-анти-miR при різних концентраціях (SEQ ID NO: 3209=6-мірна і SEQ ID NO: 3210=7- мірна). Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені (=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-21 і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 10. Оцінка довжини повністю ЗНК-заміщених ЗНК-анти-miR, які є антагоністами miR21. Клітини HeLa котрансфекували люциферазними репортерними плазмідами, що містять повністю співпадаючий або помилкового сайт-мішень для miR-21 і ЗНК-анти-miR при різних концентраціях (SEQ ID NO: 3211=9- мірна, SEQ ID NO: 3212=10-мірна, SEQ ID NO: 3213=12мірна і SEQ ID NO: 3214=14-мірна). Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені (=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-21 і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 11. Визначення найбільш оптимального положення для 8-мірних ЗНК-анти-miR в розпізнаваній послідовності-мішені miR. Клітини HeLa були котрансфіковані люциферазними репортерними плазмідами, що містять повністю співпадаючий або помилкового сайт-мішень для miR-21 і ЗНК-анти-miR при різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені (=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-21 і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 12. Визнання взаємодії Pdcd4-3'-UTR і miR-21 з допомогою 8-мірних SEQ ID NO: 3205 ЗНК-анти-miR. Клітини HeLa котрансфекували люциферазною репортерною плазмідою, що містить частину 3'UTR з гена Pdcd4 і ЗНК-анти-miR при різних концентраціях (SEQ ID NO: 3205=8-мірні, повністю співпадаючі; SEQ ID NO: 3218=8-мірні, помилкові; SEQ ID NO: 3204=15мірні, суміш ЗНК/ДНК; SEQ ID NO: 3220=15-мірні, з розривом (gapmer)). Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані співвідношення люцифераз Renilla/світляк, стандартизовані за 0 нМ. Також показане схематичне представлення послідовності miR-21 і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 13. Порівняння 8-мірної ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3207) з 15-мірною ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3206) відносно антагонізму до miR-155 в мишачих клітинах RAW. Мишачі клітини RAW котрансфекували люциферазними репортерними плазмідами, що містять повністю співпадаючі miR-155 і різні ЗНК-анти-miR в різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були 3 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені miR-155 (=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-155 і конструкція і положення ЗНК-антиmiR. Фігура 14. Оцінка с/EBPer ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3207) з 15-мірної ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3206) відносно антагонізму до miR-155 в клітинах RAW миші. Клітини RAW миші були котрансфіковані люциферазними репортерними плазмідами, що містять повний збіг до miR-155, і через 20 годин клітини збирали і аналізували білкові екстракти з клітин RAW з допомогою вестерн-блоттинга. Позначені різні ізоформи з/EBPβ, і нижче показані співвідношення, обчислені за с/EBPβ LIP і бета-тубуліну. Фігура 15. Антагонізм miR-106b з допомогою повністю ЗНК-модифікованої 8-мірної (SEQ ID NO: 3221) ЗНК-анти-miR або 15-мірної (SEQ ID NO: 3228) анти-miR з короткими ділянками, що чергуються (міксмер). Клітини HeLa були котрансфіковані люциферазними репортерними плазмідами, що містять повні збіги для miR-106b і відмінні ЗНК-анти-miR при різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення чотирьох реплікацій, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені міРНК (=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-106b і конструкція і положення ЗНКанти-miR. Фігура 16. Антагонізм miR-19b з допомогою повністю ЗНК-модифікованої 8-мірної (SEQ ID NO: 3222) ЗНК-анти-miR і 15-мірної (SEQ ID NO: 3229) анти-miR з короткими ділянками, що чергуються. Клітини HeLa були котрансфіковані люциферазними репортерними плазмідами, що містять повні збіги для miR-19a і двох ЗНК-анти-miR в різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення чотирьох реплікацій, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені miR-19a (=контроль). Показане також схематичне представлення послідовності miR-19a і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 17. Схематичне зображення, що показує зрілі людські послідовності miR-221 і miR222. У квадраті показана вихідна послідовність (7-мірна), яка збережена в обох послідовностях міРНК. Фігура 18. Направлений вплив на сімейство мікроРНК з використанням короткої, повністю ЗНК-заміщеної ЗНК-анти-miR. Клітини PC3 котрансфекували люциферазними репортерними плазмідами для miR-221 і miR-222 роздільно або разом і з різним ЗНК-анти-miR при варіюючих концентраціях. При котрансфекції ЗНК-анти-miR (15-мірними) SEQ ID NO: 3223 (проти miR-221) і SEQ ID NO: 3224 (проти miR-222), загальна концентрація становила 2 нМ (1 нМ кожні), а при трансфекції клітин SEQ ID NO: 3225 (7-мірної) концентрації становили 0, 1, 5, 10 або 25 нМ. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені міРНК(=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-221/222 і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 19. Оцінка рівнів білка p27 як функціонального показника антагонізму сімейства miR221/222 з допомогою 7-мірної SEQ ID NO: 3225 ЗНК-анти-miR. Клітини PC3 трансфекували 7мірною ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3225, направленою і на miR-221 і на miR-222 при варіюючих концентраціях. Через 24 години клітини збирали і вимірювали рівні білка з допомогою вестернблоттинга. Показані співвідношення p27/тубулін. Фігура 20. Оцінка антагонізму miR-21 з допомогою 8-мірної ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3205) в порівнянні з 15-мірною ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3204) і 8-мірною послідовністю з 2 помилками (SEQ ID NO: 3218) в клітинах HepG2 з використанням аналізу з люциферазним репортером. Клітини HepG2 котрансфекували люциферазною репортерною плазмідою, що містить повністю співпадаючий сайт-мішень miR-21 і ЗНК-анти-miR в різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені (=контроль). Показане також схематичне представлення послідовності miR-21 і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 21. Визнання взаємодії Pdcd4 3'UTR і miR-21 з допомогою 8-мірної SEQ ID NO: 3205 ЗНК-анти-miR в порівнянні з 15-мірною (SEQ ID NO: 3204) і 8-мірною послідовністю з двома невідповідностями (SEQ ID NO: 3218). Клітини Huh-7 котрансфекували люциферазною репортерною плазмідою, що містить частину 3'UTR з гена Pdcd4, пре-miR-21 (10 нМ) і ЗНК-анти-miR при різних концентраціях. 4 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m.) трьох незалежних експериментів, в яких співвідношення люцифераз Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайта-мішені (=контроль). Також показане схематичне представлення послідовності miR-21 і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 22. Антагонізм miR-21 за допомогою SEQ ID NO: 3205 призводить до збільшення рівня білка Pdcd4. Клітини HeLa трансфекували 5 нМ ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3205 (повністю співпадаючої), або скрембльованої SEQ ID NO: 3219 ЗНК (8-мірної) або SEQ ID NO: 3218 (8-мірної невідповідної). Через 24 години клітини збирали і проводили вестерн-блоттинг з антитілом Pdcd4. Фігура 23. Рівні АЛТ (аланінамінотрансферази) і АСТ (аспартатамінотрансферази) у мишей, яким вводили SEQ ID NO: 3205 (повністю співпадаючу) або SEQ ID NO: 3218 (контрольну, невідповідну). Мишей умертвлювали через 14 днів і після введення 25 мг/кг через день. Фігура 24. Оцінка рівнів білка PU.1 як функціонального показника антагонізму miR-155 з допомогою короткої ЗНК-анти-miR (SEQ ID NO: 3207). Клітини THP-1 котрансфекували пре-miR-155 (5 нмоль) і додавали різні олігонуклеотиди ЗНК (5 нМ) і 100 нг/мл ЛПС. Через 24 години клітини збирали і способом вестерн-блоттинг аналізували екстракти білка з клітин THP-1. Позначені PU.1 і тубулін. Фігура 25. Оцінка рівнів білка p27 як функціонального показника антагонізму сімейства miR221/222 з допомогою 7-мірної SEQ ID NO: 3225 ЗНК-анти-miR. Клітини PC3 були трансфіковані 7-мірної ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3225, направленої і на miR-221 і на miR-222, і як контроль скрембльованої ЗНК в кількості 5 і 25 нМ. Через 24 години клітини збирали і вимірювали рівні білка з допомогою вестерн-блоттинга. Показані співвідношення p27/тубулін. Фігура 26. Нокдаун miR-221/222 за допомогою 7-мірної SEQ ID NO: 3225 (повністю співпадаючої) ЗНК-анти-miR зменшує утворення колоній клітин PC3 на м'якому агарі. Клітини PC3 трансфекували 25 нМ 7-мірною ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3225, направленою на miR-221 і на miR-222 або на 7-мірну скрембльовану контрольну послідовність (SEQ ID NO: 3231). Через 24 години клітини збирали і висівали на м'який агар. Підрахунок колоній проводили через 12 днів. Один експеримент проводили три рази. Фігура 27. Огляд сімейства людського let-7 і тестованих антагоністів (вгорі). Послідовності представляють зрілу міРНК для кожного учасника, в квадраті показані нуклеотиди 2-16, і ЗНКанти-miR зазвичай є антагоністами для вказаних положень. Колонки праворуч показують кількість нуклеотидних відмінностей в порівнянні з let-7a, в межах вихідної (S: положення 2-8), розширеної вихідної (ES; положення 2-9) і послідовності, що залишається, які зазвичай є мішенню для ЗНК-анти-miR (NE; положення 9-16), відповідно. Нуклеотиди, виділені білим на чорному фоні, є зміненими в порівнянні з let-7a (нижче). Узагальнені дані тестованих антагоністів проти сімейства let-7, що включають інформацію про конструкцію, довжину і абсолютно комплементарні мішені. Всі сполуки є повністю фосфоротіольованими. Фігура 28. Оцінка антагонізму let-7 з допомогою шести різних ЗНК-анти-miR в клітинах Huh-7, за допомогою аналізу з люциферазним репортером. Клітини Huh-7 котрансфекували люциферазними репортерними плазмідами, що містять частковий ген HMGA2 3'UTR (з чотирма let-7 сайтами зв'язування), з попередником let-7a або без (сірі і чорні стовпчики, відповідно), і з 6 різними ЗНК-анти-miR при зростаючих концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення співвідношень Renilla/світляк для двократних вимірювань і допустимі відхилення в кожному аналізі. У кожній групі ЗНК-антиmiR всі відношення були стандартизовані за середньою кількістю ямок, що не містять попередник let-7a (чорні стовпчики). Фігура 29. Результати люциферазного аналізу клітин Huh-7, трансфікованих сенсорною плазмідою HMGA2 3'UTR, нуклеїновими кислотами ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3226 (зліва) і SEQ ID NO: 3227 (праворуч), і попередником-miR (пре-miR) для let-7a (А), let-7d (В), let-7e (З) і let-7i (D). Сірі стовпчики показують цільову дерепресію після включення попередників mi, а чорні стовпчики контролю відображають еквівалентний рівень без додавання пре-miR. Кожне співвідношення показане на основі чотирикратних вимірювань і стандартизироване за середньою кількістю ямок, що не містять попередника (чорні стовпчики) в кожній групі введення. Фігура 30. Результати люциферазного аналізу клітин HeLa, трансфікованих сенсорною плазмідою HMGA2 3'UTR або контрольним вектором, і ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3227 в різних концентраціях. Кожне співвідношення показане на основі чотирикратних вимірювань і 5 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стандартизироване за порожнім контрольним вектором без введення (0 нМ) (psi-CHECK-2; сірі стовпчики). Фігура 31. Оцінка антагонізму miR-21 з допомогою 8-мірної (SEQ ID NO: 3205) в клітинах HCT116 в аналізі з люциферазною репортерною плазмідою. Клітини HCT116 котрансфекували люциферазною репортерною плазмідою, що містить повністю співпадаючий сайт-мішень miR-21 (сірі стовпчики) і ЗНК-анти-miR і контрольні олігонуклеотиди в різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показаний один типовий приклад з двох, в якому співвідношення Renilla/світляк стандартизовані за потожнім вектором 0 нМ (= чорні стовпчики). Фігура 32. Сайленсінг miR-21 за допомогою 8-мірної SEQ ID NO: 3205 ЗНК-анти-miR зменшує утворення колоній в м'якому агарі в клітинах PC3. Клітини PC3 були трансфіковані 25 нМ 8-мірною ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3205, націленою на miR-21. Через 24 години клітини збирали і висівали на м'якому агарі. Підрахунок колоній проводили через 12 днів. Показані середні значення в трьох окремих експериментах, кожний з яких проводили тричі, і вказані значення стандартизовані за контролем 0 нМ (тобто трансфекція, але без ЗНК). р=0,01898 для SEQ ID NO: 3205. Фігура 33. Нокдаун miR-21 за допомогою 8-мірної SEQ ID NO: 3205 ЗНК-анти-miR зменшує утворення колоній клітин HepG2 на м'якому агарі. Клітини HepG2 трансфекували 25 нМ 8мірною ЗНК-анти-miR SEQ ID NO: 3205, направленою на miR-21. Через 24 години клітини збирали і висівали на м'який агар. Підрахунок колоній проводили через 17 днів. Показані середні значення з трьох повторів одного експерименту (риска зверху = SEM). Фігура 34. Закриття рани в інвазивній клітинній лінії PC3 простати людини після введення SEQ ID NO: 3205. (А) Клітини PC3 трансфекували на 3 день ЗНК-анти-miR і контрольними олігонуклеотидами в кількості 25 нМ, SEQ ID NO: 3205 (8-мірною, що повністю співпадає) і SEQ ID NO: 3219 (8-мірною, помилковою), і на наступний день наносили екскоріацію. Через 24 години робили знімки для контролю міграції. (В) У кожній точці часу вимірювали зону за допомогою програмного забезпечення Image J і стандартизували за відповідною точкою часу 0 годин. Фігура 35. Оцінка довжини повністю ЗНК-заміщених ЗНК-анти-miR, які є антагоністами для miR-155. Клітини RAW котрансфекували люциферазною репортерною плазмідою, що містить повністю співпадаючий сайт-мішень miR-155, і олігонуклеотидами ЗНК-анти-miR при різних концентраціях. Клітини збирали через 24 години і вимірювали активність люциферази. Показані середні значення (риска зверху = s.e.m) для трьох незалежних експериментів, де співвідношення Renilla/світляк були стандартизовані за 0 нМ порожнього вектора без сайтамішені (= mock). Також показане схематичне представлення послідовності miR і конструкція і положення ЗНК-анти-miR. Фігура 36. Зв'язування міченої 5'-FAM (флуорофор карбоксифлуоресцеїн) ЗНК-анти-miR-21 (SEQ ID NO: 3205) з мишачим білком плазмі. (А) % незв'язаної сполуки ЗНК-анти-miR-21 в залежності від концентрації олігонуклеотиду в плазмі миші. (В) Концентрація незв'язаної сполуки ЗНК-анти-miR-21 SEQ ID NO: 3205 в залежності від концентрації № 3205 в плазмі миші. Фігура 37. Кількісний вестерн-блот аналіз рівнів білка Ras. А. Зображення гелю, що показує білки Ras і тубулін (внутрішній стандарт) в зразках легені і нирки, оброблені (анти-let-7; 8-мірною) в порівнянні з необробленими (сольовий розчин). В. Кількісні аналізи рівнів білка Ras в легені і нирці, відповідно, у мишей після введення ЗНК-антиmiR (чорні стовпчики), стандартизовані за еквівалентними контрольними зразками (введення сольового розчину - сірі стовпчики), з використанням тубуліну як контролю рівномірного внесення. В. Сайленсінг miR-21 за допомогою SEQ ID NO: 3205 призводить до зростання рівнів білка Pdcd4 in vivo. С. Мишам вводили сольовий розчин або ЗНК-анти-miR в дозі 25 мг/кг (SEQ ID NO: 3205) протягом 14 днів через день, загалом в 5 доз. Мишей умертвлювали, виділяли білок з нирки і піддавали його вестерн-блот аналізу з антитілом Pdcd4. А. Зображення гелю, що показує білки Pdcd4 і Gapdh (внутрішній стандарт) в зразках нирки (M1, миша 1; M2, миша 2), оброблених (анти-miR-21; 8-мірною) в порівнянні з необробленими (сольовий розчин). В. Кількісний аналіз рівня білка Pdcd4 в нирках мишей, оброблених ЗНК-анти-miR (темно-сірі стовпчики), стандартизованого за середнім рівнем еквівалентного введення контрольного сольового розчину (світло-сірі стовпчики), використовуючи Gapdh як контрольне внесення. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Короткі олігонуклеотиди, що включають ЗНК, відомі в галузі реагентів in vitro (див., наприклад, патенти WO2005/098029 і WO 2006/069584). Разом з тим, молекули, розроблені для 6 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діагностики або використання як реагентів, значно відрізняються за конструкцією від молекул, що застосовуються in vivo або для фармацевтичного використання. Наприклад, термінальними нуклеотидами реагенту оліго зазвичай є не ЗНК, а ДНК, і міжнуклеотидні зв'язки зазвичай не є фосфоротіоатними, що являють собою переважний зв'язок для використання в олігонуклеотидах за даним винаходом. Таким чином, даний винахід розглядає по суті новий клас олігонуклеотидів (що згадуються тут, як олігомери). Наступні варіанти здійснення належать до конкретних варіантів здійснення олігомеру за даним винаходом, який можна застосовувати в фармацевтичній композиції. Аспекти, що належать до олігомеру, можуть також належати до суміжної послідовності нуклеотиду, і навпаки. Олігомер Олігомер за даним винаходом являє собою одноланцюжковий олігонуклеотид, який містить нуклеотидні аналоги, такі як ЗНК, які утворюють частину нуклеотидної послідовності або всю безперервну нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду. Нуклеотидна послідовність олігомеру складається з безперервної нуклеотидної послідовності. Термін "олігонуклеотид" (або просто "оліго"), який використовується почергово з терміном "олігомер", в контексті даного винаходу належить до молекули, утвореної ковалентним зв'язком двох або декількох нуклеотидів. Термін "олігонуклеотид", що використовується в контексті олігонуклеотиду за винаходом (який також належить до одноланцюжкового олігонуклеотиду), в одному варіанті здійснення може мати, наприклад, від 7 до 10 нуклеотидів, наприклад, в окремих варіантах здійснення 7, 8, 9 або 10 нуклеотидів. Термін "нуклеотид" належить до нуклеотидів, таких як ДНК і РНК, і до нуклеотидних аналогів. Необхідно визнати, що в деяких аспектах також можна використовувати термін "нуклеїнова основа" для опису нуклеотиду, який може бути природного або штучного походження, тобто в цьому відношенні терміни нуклеїнова основа і нуклеотид можна використовувати в даному винаході почергово. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотидів складається з 7 нуклеотидних аналогів. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотиду складається з 8 нуклеотидних аналогів. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотидів складається з 9 нуклеотидних аналогів. В одному варіанті здійснення щонайменше близько 50 % нуклеотидів в олігомері є нуклеотидними аналогами, наприклад, щонайменше близько 55 %, наприклад, щонайменше близько 60 % або щонайменше близько 65 %, або щонайменше близько 70 %, наприклад, щонайменше близько 75 %, наприклад, щонайменше близько 80 %, наприклад, щонайменше близько 85 %, наприклад, щонайменше близько 90 %, наприклад, щонайменше близько 95 % або, наприклад, 100 %. Також буде очевидно, що олігонуклеотид може містити послідовність нуклеотидів, яка складається тільки з нуклеотидних аналогів. Відповідно, олігомер може містити щонайменше один мономер ЗНК, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 мономерів ЗНК. Як описано нижче, безперервна послідовність нуклеотиду може складатися тільки з одиниць ЗНК (включаючи зв'язуючі групи, такі як фосфоротіоатні зв'язки), або може складатися з елементів ЗНК і ДНК, або з ЗНК і інших нуклеотидних аналогів. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотидів містить або один або два ДНК-нуклеотиди, і інші нуклеотиди є нуклеотидними аналогами, такими як вказані ЗНК. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотидів складається з 6 нуклеотидних аналогів і єдиного ДНК-нуклеотиду. У деяких варіантах здійснення безперервний нуклеотид складається з 7 аналогів нуклеотиду і єдиного ДНК-нуклеотиду. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотидів складається з 8 нуклеотидних аналогів і єдиного ДНК-нуклеотиду. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотидів складається з 9 нуклеотидних аналогів і єдиного ДНК-нуклеотиду. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотидів складається з 7 нуклеотидних аналогів і двох ДНК-нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення безперервна послідовність нуклеотидів складається з 8 нуклеотидних аналогів і двох ДНК-нуклеотидів. Олігомер може складатися з безперервної послідовності нуклеотидів. В особливо переважному варіанті здійснення всі нуклеотидні аналоги являють собою ЗНК. У додатковому переважному варіанті здійснення всі нуклеотиди в олігомері є ЗНК. У додатковому переважному варіанті здійснення все нуклеотиди в олігомері є ЗНК, і всі міжнуклеозидні зв'язуючі групи є фосфоротіоатними. Згідно з даним винаходом, термін "азотиста основа" охоплює пурини і піримідини, такі як ДНК-основи А-аденін, С-цитозин, Т-тимін і G-гуанін, РНК-основи А, С, U-урацил і G, а також неMe ДНК/РНК нуклеїнові основи, такі як 5-метилцитозин ( С), ізоцитозин, псевдоізоцитозин, 5 7 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бромурацил, 5-пропінілурацил, 5-пропініл-6-фторурацил, 5-метилтіазолурацил, 6-амінопурин, 2амінопурин, інозин, 2,6-діамінопурин, 7-пропін-7-деазааденін, 7-пропін-7-деазагуанін і 2-хлор-6Me амінопурин, зокрема С. Розуміється, що фактичний вибір не-ДНК/РНК нуклеїнових основ буде залежати від відповідного (або комплементарного) нуклеотиду, розташованого в ланцюжку мікроРНК, який вважається мішенню для олігонуклеотиду. Наприклад, якщо відповідним нуклеотидом є G, зазвичай необхідно вибирати не-ДНК/РНК основу, яка може утворювати водневі зв'язки з G. В цьому конкретному випадку, де відповідним нуклеотидом є G, типовим Me прикладом переважної не-ДНК/РНК основи є С. Необхідно розуміти, що поняття "в одному варіанті здійснення" не обов'язково повинне обмежено належати до одного конкретного варіанту здійснення, але може належати до ознаки, яка може бути присутньою в "деяких варіантах здійснення", або навіть служити родовою ознакою винаходу. Аналогічно, використання поняття "деякі варіанти здійснення" може мати місце для опису ознаки одного конкретного варіанту здійснення або групи варіантів здійснення, або навіть бути родовою ознакою винаходу. Поняття "відповідний чому-небудь" і "відповідати" належать до порівняння нуклеотидної послідовності олігомеру або безперервної нуклеотидної послідовності (перша послідовність) з еквівалентною безперервною нуклеотидною послідовністю іншої послідовності, що вибирається з i) суб-послідовності зворотно комплементарної нуклеїнової кислоти мікроРНК-мішені (наприклад, мікроРНК-мішені, вибирана з послідовностей SEQ ID NO: 40-976, і/або ii), послідовності нуклеотидів, що розглядається в даному винаході, такої як група, що складається з SEQ ID NO: 977-1913, або SEQ ID NO: 1914-2850, або SEQ ID NO: 2851-3787. Нуклеотидні аналоги порівнюють безпосередньо з їх еквівалентними або відповідними нуклеотидами. Перша послідовність, яка відповідає іншій послідовності з пп. i) або ii), зазвичай ідентична вказаній послідовності за довжиною першої послідовності (наприклад, безперервної нуклеотидної послідовності). Довжина нуклеотидної молекули, як вказано у винаході, відповідає кількості мономерних одиниць, тобто нуклеотидів, безвідносно тому, чи є ці мономерні одиниці нуклеотидами або нуклеотидними аналогами. Що стосується нуклеотидів або нуклеїнових основ, терміни мономер і одиниця використовуються в даному винаході почергово. Розуміється, що поняття "близько", що використовується в даному розкритті в контексті конкретних значень або діапазонів значень, включає конкретне значення або діапазон, що згадується. Термін "гібридизація", що використовується в даному винаході, означає утворення водневого зв'язку, яке може відбуватися за Уотсоном-Кріком, за Хугстеном (Hoogsteen), шляхом зворотного водневого зв'язування Хугстена і т.д., між комплементарними нуклеозидними або нуклеотидними основами. Чотири нуклеїнові основи, що зазвичай виявляються в ДНК, означаються G, А, Т і С, які являють собою пари G-C і Т. В РНК Т заміщений на урацил (U), який стає парою для A. Хімічні групи в нуклеїнових основах, які беруть участь в стандартному утворенні дуплексів, складають площину Уотсона-Кріка. Декілька років потому Хугстен показав, що пуринові нуклеїнові основи (G і А) додатково до площини Уотсона-Кріка мають площину Хугстена, яку можна розпізнати зовні дуплексу і використовувати для зв'язку піримідинових олігонуклеотидів водневим зв'язком, утворюючи таким чином потрійну спіральну структуру. У контексті даного винаходу термін "комплементарність" належить до здатності двох нуклеотидних послідовностей точно вистроювати пари одна з одною. Наприклад, якщо нуклеотид в певному положенні в олігонуклеотиді здатний до утворення водневого зв'язку з нуклеотидом у відповідному положенні в молекулі ДНК або РНК, то вважається, що олігонуклеотид і ДНК або РНК є комплементарними один до одного в цьому положенні. Ланцюжки ДНК або РНК вважаються комплементарними один до одного, якщо достатня кількість нуклеотидів в олігонуклеотиді може утворювати водневі зв'язки з відповідними нуклеотидами в ДНК-мішені або РНК-мішені, що дозволяє створити стійкий комплекс. Для стійкості in vitro або in vivo олігонуклеотидна послідовність не повинна бути на 100 % комплементарною до її мікроРНК-мішені. Таким чином, під термінами "комплементарність" і "специфічно гібридизований" розуміють, що олігонуклеотид зв'язується досить потужно і специфічно з молекулою-мішенню, щоб досягнути бажаного впливу на нормальну функцію мішені, не впливаючи при цьому на функцію нецільових РНК. Разом з тим, в одному переважному варіанті здійснення термін комплементарність буде означати 100 % комплементарність або повну комплементарність. У переважному прикладі олігонуклеотид за винаходом на 100 % комплементарний послідовності міРНК, наприклад, людській послідовності мікроРНК, або одній з послідовностей мікроРНК, що згадуються у винаході. 8 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У переважному прикладі олігонуклеотид за винаходом містить безперервну послідовність, яка на 100 % комплементарна вихідній області людської послідовності мікроРНК. Переважно термін "мікроРНК" або "міРНК" в контексті даного винаходу означає олігонуклеотид РНК, що має довжину від 18 до 25 нуклеотидів. У функціональному плані міРНК зазвичай являють собою регуляторні ендогенні молекули РНК. Терміни "цільова мікроРНК" або "міРНК-мішень" належать до мікроРНК, що грає біологічну роль в захворюваннях людини, наприклад, як ап-регуляторна, онкогенна міРНК або міРНК пухлинної супресії при ракові, що таким чином є метою терапевтичного втручання при захворюванні, що розглядається. Терміни "ген-мішень" або "мРНК-мішень" належать до регуляторних мРНК-мішеней для мікроРНК, в яких мікроРНК на основі майже абсолютної або абсолютної комплементарності між міРНК і її сайтом-мішенню пост-транскрипційно регулює вказаний "ген-мішень" або "мРНКмішень", що призводить до розщеплення мРНК-мішені; або на основі обмеженої комплементарності, яка часто належить до комплементарності між так званою вихідною послідовністю (нуклеотиди 2-7 з міРНК) і сайтом-мішенню, що призводить до трансляційного інгібування мРНК-мішені. У контексті даного винаходу олігонуклеотид є одноланцюжковим, це стосується ситуації, коли відсутній комплементарний олігонуклеотид для вказаного олігонуклеотиду, тобто не утворюється дволанцюжковий олігонуклеотидний комплекс, такий як siРНК. В одному варіанті здійснення композиція за винаходом не містить інший олігонуклеотид, у якого існує область комплементарності з олігомером з 5 або більше, наприклад, з 6, 7, 8, 9 або 10 послідовних нуклеотидів, наприклад, з восьми або більше нуклеотидів. Довжина Автори даного винаходу несподівано виявили, що такі короткі 'анти-miR' забезпечують поліпшене специфічне інгібування мікроРНК in vivo, зберігаючи високу специфічність для мікроРНК-мішені. Була виявлена додаткова перевага, а саме здатність інгібувати декілька мікроРНК одночасно завдяки консервації гомологічних коротких послідовностей між видами мікроРНК, таких як вихідні області, описані у винаході. Згідно з даним винаходом була виявлена особлива перевага коротких олігонуклеотидів в 7, 8, 9, 10 нуклеотидів, наприклад, в 7, 8 або 9 нуклеотидів. Послідовності Безперервна нуклеотидна послідовність є комплементарною (наприклад, комплементарною на 100 %, тобто абсолютно комплементарною) відповідній області послідовності мікроРНК (міРНК) ссавців, людини або вірусу, переважно людської або вірусної послідовності міРНК. Відповідною послідовністю мікроРНК може бути зріла мікроРНК. У деяких варіантах здійснення мікроРНК може бути мікроРНК-попередником. Людську послідовність мікроРНК можна вибирати з SEQ ID NO: 1 558, згідно з розкриттям в патенті WO2008/046911, який повністю і конкретно включений за допомогою посилання в даний винахід. Як описано в патенті WO2008/046911, ці мікроРНК пов'язані з раком. У деяких варіантах здійснення вірусну послідовність мікроРНК можна вибирати з групи, що складається з вірусу простого герпесу 1, вірусу герпесу, асоційованого з саркомою Капоші, вірусу Епштейна-Барра і цитомегаловірусу людини. В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність є комплементарною (наприклад, 100 %-комплементарною) відповідній області міРНК послідовності, що вибирається з групи міРНК, перерахованих в таблиці 1. Таблиця 1 показує націлені на людські і вірусні мікроРНК 7-мірні, 8-мірні і 9-мірні олігомери, які наведені в базі даних miRBase (Випуск 12.0http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/). У деяких варіантах здійснення олігомери за винаходом можуть складатися з безперервної послідовності нуклеотидів або містити таку послідовність, яка комплементарна відповідній послідовності мікроРНК, що вибирається з групи, яка складається з miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222, miR-375. Тому, в одному варіанті здійснення, міРНК (тобто міРНК-мішень) вибирають з групи, що складається з miR-1, miR-10b, miR-17-3p, miR-18, miR-19a, miR-19b, miR-20, miR-21, miR-34a, miR-93, miR-106a, miR-106b, miR-122, miR-133, miR-134, miR-138, miR-155, miR-192, miR-194, miR-221, miR-222 і miR-375. В одному варіанті здійснення міРНК-мішень входить до складу кластера miR 17-92, наприклад, miR 17, miR 106a, miR 106b, miR 18, miR 19a, miR 19b/1, miR 19b/2, miR20/93, miR92/1, miR92/2 і miR25. 9 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких варіантах здійснення безперервна нуклеотидна послідовність є комплементарною відповідній області послідовності мікроРНК (міРНК), що вибирається з групи, яка складається з miR-21, miR-155, miR-221, mir-222 і mir-122. У деяких варіантах здійснення вказані міРНК вибирають з групи, що складається з miR-1, miR-10, miR-29, miR-125b, miR-126, miR-133, miR-141, miR-143, miR-200b, miR-206, miR-208, miR-302, miR-372, miR-373, miR-375 і miR-520c/е. У деяких варіантах здійснення безперервна нуклеотидна послідовність комплементарна відповідній області послідовності мікроРНК (міРНК), яка присутня в кластері miR 17-92, наприклад, мікроРНК, що вибирається з групи, що складається з miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR-106a/b, miR-18a/b, miR-19a/b, miR-25, miR-92a, miR-363. В одному варіанті здійснення міРНК (тобто міРНК-мішень) являє собою miR-21, наприклад, hsa-miR-21. В одному варіанті здійснення міРНК (тобто міРНК-мішень) являє собою miR-122, наприклад, hsa-miR-122. В одному варіанті здійснення міРНК (тобто міРНК-мішень) являє собою miR-19b, наприклад, hsa-miR-19b. В одному варіанті здійснення міРНК (тобто міРНК-мішень) являє собою miR-155, наприклад, hsa-miR-155. В одному варіанті здійснення міРНК (тобто міРНК-мішень) являє собою miR-375, наприклад, hsa-miR-375. В одному варіанті здійснення міРНК (тобто міРНК-мішень) являє собою miR-375, наприклад, hsa-miR-106b. Відповідно, безперервна нуклеотидна послідовність може бути комплементарна відповідній області мікроРНК, такий як hsa-miR, яку вибирають з групи, що складається з 19b, 21, 122, 155 і 375. Вихідна область і вихідні олігомери (сидмери) Автори даного винаходу виявили, що ретельно сконструйовані короткі одноланцюжкові олігонуклеотиди містять або складаються з нуклеотидних аналогів, таких як високоафінні нуклеотидні аналоги, наприклад, одиниці замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК), що виявляють значний сайленсінг мікроРНК, який призводить до зниження рівня мікроРНК. Було виявлене велике значення міцного зв'язування вказаних олігонуклеотидів з так званою вихідною послідовністю мікроРНК мішеней, зазвичай від 2 до 8 нуклеотидів або від 2 до 7, рахуючи від 5'кінця. Нуклеотид 1 з мікроРНК-мішеней являє собою непарну основу і, найбільш ймовірно, схований в зв'язуючій кишені білка Ago 2. Без зв'язку з конкретною теорією автори даного винаходу вважають, що при виборі вихідної області послідовностей, зокрема, з олігонуклеотидами, які містять ЗНК, переважно одиниці ЗНК в області, яка комплементарна вихідній області, дуплекс міРНК і олігонуклеотиду має особливу ефективність в націленні на міРНК, уникаються ефекти мішеней і, можливо, забезпечується додаткова ознака, яка запобігає дії міРНК, направленій на індукований РНК комплекс сайленсинга (RISC). Автори даного винаходу виявили, що сайленсінг мікроРНК ще більше зростає, якщо ЗНКмодифіковані одноланцюжкові олігонуклеотиди не містять на 3'-кінці нуклеотид, який відповідає вказаному непарному нуклеотиду 1. Було додатково виявлено, що щонайменше дві одиниці ЗНК на 3'-кінці олігонуклеотидів за винаходом роблять вказані олігонуклеотиди високо стійкими до нуклеаз. В одному варіанті здійснення перші або другі 3'-нуклеотиди в олігомері відповідають другим 5'-нуклеотидам в послідовності мікроРНК і можуть бути нуклеотидним аналогом, таким як ЗНК. В одному варіанті здійснення нуклеотидні одиниці 1-6 (включно) олігомеру, рахуючи від 3'кінця області олігомеру, є комплементарними послідовності вихідної області мікроРНК, і всі вони можуть являти собою нуклеотидні аналоги, такі як ЗНК. В одному варіанті здійснення нуклеотидні одиниці 1-7 (включно) олігомеру, рахуючи від 3'кінця області олігомеру, є комплементарними послідовності вихідної області мікроРНК, і всі можуть бути нуклеотидними аналогами, такими як ЗНК. В одному варіанті здійснення нуклеотидні одиниці 2-7 (включно) олігомеру, рахуючи від 3'кінця області олігомеру, є комплементарними послідовності вихідної області мікроРНК, і всі можуть бути нуклеотидними аналогами, такими як ЗНК. В одному варіанті здійснення олігомер містить щонайменше одну одиницю нуклеотидного аналога, наприклад, щонайменше одну одиницю ЗНК, в положенні, яке знаходиться в межах області, комплементарної вихідній області міРНК. В одному варіанті здійснення олігомер може містити від близько однієї до 6 або від 1 до 7 одиниць нуклеотидного аналога, наприклад, в діапазоні від 1 до 6 і від 1 до 7 одиниць ЗНК, в положенні, яке знаходиться в межах області, комплементарної вихідній області міРНК. В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність складається з послідовності або містить послідовність, комплементарну (наприклад, на 100 % комплементарну) вихідній послідовності вказаної мікроРНК. 10 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність складається з послідовності або містить послідовність, вибирану з будь-якої з сидмерних послідовностей, перерахованих в таблиці 1. В одному варіанті здійснення 3'-нуклеотиди сидмера утворюють 3' більшість нуклеотидів безперервної нуклеотидної послідовності, при цьому безперервна нуклеотидна послідовність може необов'язково містити один або два додаткові 5'-нуклеотиди до сидмерної послідовності. В одному варіанті здійснення олігомер не містить нуклеотид, який відповідає першому нуклеотиду, присутньому в послідовності мікроРНК, рахуючи від 5'-кінця. В одному варіанті здійснення олігонуклеотид згідно з винаходом не містить нуклеотид на 3'кінці, який відповідає першим нуклеотидам 5'-кінця в мікроРНК-мішені. Нуклеотидні аналоги Згідно з даним винаходом була виявлена особлива перевага коротких олігонуклеотидів з 7, 8, 9, 10 нуклеотидів, наприклад, з 7, 8 або 9 нуклеотидів, в яких щонайменше 50 %, наприклад, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або, наприклад, 100 % нуклеотидних одиниць олігомеру є нуклеотидними аналогами (переважно високоафінними), такими як нуклеотидна одиниця замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК). У деяких варіантах здійснення олігонуклеотид за винаходом має довжину 7, 8 або 9 нуклеотидів і містить безперервну нуклеотидну послідовність, яка комплементарна вихідній області людської або вірусної мікроРНК, і в якій щонайменше 75 %, наприклад, щонайменше 80 %, наприклад, щонайменше 85 %, наприклад, щонайменше 90 %, наприклад, щонайменше 95 %, наприклад, 100 % нуклеотидів являють собою нуклеотидні одиниці замкненої нуклеїнової кислоти (ЗНК). У таких олігомерах, в деяких варіантах здійснення, зв'язуючі групи являють собою не фосфодіефірні зв'язки, а є, наприклад, фосфоротіоатними зв'язками. В одному варіанті здійснення всі нуклеотидні одиниці безперервної нуклеотидної послідовності є нуклеотидними одиницями ЗНК. В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з 7, 8, 9 або 10, переважно з безперервних нуклеотидних одиниць ЗНК. У додатковому переважному варіанті здійснення олігонуклеотид за винаходом має довжину 7, 8 або 9 нуклеотидів і містить безперервну нуклеотидну послідовність, яка комплементарна вихідній області людської або вірусної мікроРНК, і в якій щонайменше 80 % нуклеотидів є ЗНК, і в якій щонайменше 80 %, наприклад, 85 %, наприклад, 90 %, наприклад, 95 %, наприклад, 100 % міжнуклеотидних зв'язків є фосфоротіоатними зв'язками. Розуміється, що безперервна нуклеотидна послідовність олігомеру (сидмера) може виходити за межі вихідної області. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотид за винаходом має довжину 7 нуклеотидів, всі з яких є ЗНК. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотид за винаходом має довжину 8 нуклеотидів, з яких до 1 нуклеотиду може не бути ЗНК. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотид за винаходом має довжину 9 нуклеотидів, з яких до 1 або 2 нуклеотиду можуть відрізнятися від ЗНК. У деяких варіантах здійснення довжина олігонуклеотиду винаходу становить 10 нуклеотидів, з яких 1, 2 або 3 нуклеотиди можуть відрізнятися від ЗНК. Нуклеотиди, які відрізняються від ЗНК, можуть являти собою, наприклад, ДНК або 2'-заміщені нуклеотидні аналоги. Високоафінні нуклеотидні аналоги є нуклеотидними аналогами, які утворюють олігонуклеотиди, що мають більш високу температурну дуплексну стабільність з комплементарним РНК-нуклеотидом, на відміну від зв'язуючої афінності еквівалентного ДНКнуклеотиду. Це можна визначити шляхом вимірювання Т m. У деяких варіантах здійснення одиниці нуклеотидних аналогів, присутні в безперервній нуклеотидній послідовності, необов'язково незалежно вибирають з групи, що складається з одиниці 2'-O_алкіл-РНК, одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'-аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, одиниці ЗНК, одиниці протеїн-нуклеїнової кислоти (ПНК), одиниці гексит-нуклеїнової кислоти (ГНК), одиниці INA (ІНК) і одиниць 2'-МОЕ-РНК. У деяких варіантах здійснення одиниці нуклеотидних аналогів, присутні в безперервній нуклеотидній послідовності, необов'язково незалежно вибирають з групи, що складається з одиниці 2'-O_алкіл-РНК, одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'-аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, одиниці ЗНК і одиниць 2'-МОЕ-РНК. Термін 2'-фтор-ДНК належить до аналога ДНК із заміщенням на фтор в 2' положенні (2'F). Переважною формою 2'-фтор-ДНК є 2'-фтор-нуклеотид. У деяких варіантах здійснення олігомер містить щонайменше 4 одиниці нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше 5 одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше 6 11 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше 7 одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше 8 одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше 9 одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, 10 одиниць нуклеотидних аналогів. В одному варіанті здійснення олігомер містить щонайменше 3 одиниці ЗНК, наприклад, щонайменше 4 одиниці ЗНК, наприклад, щонайменше 5 одиниць ЗНК, наприклад, щонайменше 6 одиниць ЗНК, наприклад, щонайменше 7 одиниць ЗНК, наприклад, щонайменше 8 одиниць ЗНК, наприклад, щонайменше 9 одиниць ЗНК, наприклад, 10 ЗНК. В одному варіанті здійснення щонайменше один з нуклеотидних аналогів, наприклад, одиниця ЗНК, є або цитозином або гуаніном, як, наприклад, між 1-10 з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, знаходиться або цитозин або гуанін, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або 9 з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, являють собою або цитозин або гуанін. В одному варіанті здійснення щонайменше два з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, являють собою або цитозин або гуанін. В одному варіанті здійснення щонайменше три з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, є або цитозином або гуаніном. В одному варіанті здійснення щонайменше чотири з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, є або цитозином або гуаніном. В одному варіанті здійснення щонайменше п'ять з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, є або цитозином або гуаніном. В одному варіанті здійснення щонайменше шість з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, є або цитозином або гуаніном. В одному варіанті здійснення щонайменше сім з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, є або цитозином або гуаніном. В одному варіанті здійснення щонайменше вісім з нуклеотидних аналогів, таких як одиниці ЗНК, є або цитозином або гуаніном. У переважному варіанті здійснення нуклеотидні аналоги володіють більш високою температурною дуплексною стабільністю для комплементарного РНК-нуклеотиду, на відміну від зв'язуючої афінності еквівалентного ДНК-нуклеотиду до вказаного комплементарного РНКнуклеотиду. В одному варіанті здійснення нуклеотидні аналоги підвищують стабільність сироватки до одноланцюжкового олігонуклеотиду. У списку послідовностей і в таблиці 1 вказані конкретні SEQ ID, що належать до олігомерів мономерів ЗНК з фосфоротіоатним (PS) скелетом, разом з тим розуміється, що даний винахід також охоплює використання інших нуклеотидних аналогів і/або зв'язків, або як альтернатива, або в комбінації з ЗНК. Також послідовність нуклеотидів (основ), вказана в списках послідовностей, може бути послідовністю ЗНК, такою як ЗНК/PS, ЗНК або може являти собою олігомери, що мають альтернативну хімію скелета, наприклад, цукрові хімічні зв'язки, зберігаючи при цьому ту ж основну послідовність (А, Т, С або G). Оскільки передбачається, що в олігомерах за винаходом можуть бути корисні інші нуклеотидні аналоги, такі як 2'-МОЕ-РНК або 2'-фтор-нуклеотид, переважною є висока пропорція олігомерів, наприклад, щонайменше 50 % нуклеотидів ЗНК. Нуклеотидний аналог може бути аналогом ДНК, таким як аналог ДНК, в якому 2'-H група заміщена замісником, відмінним від -ОН(РНК), наприклад, шляхом заміщення -О-CH3, -О-CH2CH2-O-CH3, -О-CH2-CH2-CH2-NH2, -О-CH2-CH2-CH2-OH або -F. Нуклеотидний аналог може бути аналогами РНК, такими як аналог РНК, модифікований в його групі 2'-OH, наприклад, шляхом заміщення групою, відмінною від -H(ДНК), наприклад, -О-CH3, -O-CH2-CH2-O-CH3, -О-CH2-CH2CH2-NH2, -О-CH2-CH2-CH2-OH або -F. В одному варіанті здійснення аналогом нуклеотиду є "ENA". Замкнені нуклеїнові кислоти Терміни "одиниця ЗНК", "мономері ЗНК", "залишок ЗНК", "одиниця замкненої нуклеїнової кислоти", "мономер замкненої нуклеїнової кислоти" або "залишок замкненої нуклеїнової кислоти", які використовуються в контексті даного винаходу, належать до біциклічного нуклеозидного аналога. Одиниці ЗНК описані, серед іншого, в наступних патентах: WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO 01/25248, WO 02/28875, WO 03/006475 і WO 03/095467. Визначення одиниці ЗНК можна також давати за її хімічною формулою. Таким чином, "одиниця ЗНК", що використовується в даному винаході, має хімічну структуру, показану на схемі 1 нижче: Схема 1 , 12 UA 102529 C2 5 в якій X вибирають H H з групи, що складається з О, S і NR , де R являє собою Н або C1-4-алкіл; Y є (-СН2)r, де r складає ціле число від 1 до 4; і В є азотистою основою. У переважному варіанті здійснення винаходу r дорівнює 1 або 2, зокрема 1, тобто переважна одиниця ЗНК має хімічну структуру, показану в схемі 2 нижче: Схема 2 , 10 15 в якій визначення X і В наведене вище. У цікавому варіанті здійснення одиниці ЗНК, включені в олігонуклеотиди за винаходом, незалежно вибирають з групи, що складається з одиниць тіо-ЗНК, одиниць аміно-ЗНК і одиниць окси-ЗНК. Таким чином, одиниця тіо-ЗНК може мати хімічну структуру згідно зі схемою 3 нижче: Схема 3 , 20 25 в якій визначення В наведене вище. Переважно, одиниця тіо-ЗНК знаходиться в своїй бета-D-формі, тобто має структуру, показану в схемі 3A вище, аналогічно одиниця аміно-ЗНК може мати хімічну структуру згідно зі схемою 4 нижче: Схема 4 , H 30 в якій визначення В і R наведене вище. Переважно одиниця аміно-ЗНК знаходиться в своїй бета-D-формі, тобто має структуру, показану в схемі 4A вище. Одиниця окси-ЗНК може мати хімічну структуру, показану на схемі 5 нижче: Схема 5 , 35 40 в якій визначення В наведене вище. Переважно, одиниця окси-ЗНК знаходиться в своїй бета-D-формі, тобто має структуру, показану в схемі 5A вище. Як визначено вище, В являє собою азотисту основу, яка може бути природного або синтетичного походження. Конкретні приклади азотистих основ включають Me аденін (А), цитозин (С), 5-метилцитозин ( С), ізоцитозин, псевдоізоцитозин, гуанін (G), тимін (Т), урацил (U), 5-бромурацил, 5-пропінілурацил, 5-пропініл-6,5-метилтіазолурацил, 6 13 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінопурин, 2-амінопурин, інозин, 2,6-діамінопурин, 7-пропін-7-деазааденін, 7-пропін-7деазагуанін і 2-хлор-6-амінопурин. Термін "одиниця тіо-ЗНК" належить до одиниці ЗНК, в якій X на схемі 1 є S. Одиниця тіо-ЗНК може знаходитися і в бета-D-формі і в альфа-L формі. Загалом, переважною є бета-D-форма одиниці тіо-ЗНК. Одиниці тіо-ЗНК в бета-D-формі і альфа-L-формі показані на схемі 3, як сполуки 3A і 3B, відповідно. Термін "одиниця аміно-ЗНК" належить до одиниці ЗНК, в якій X на схемі 1 являє собою NH H H або NR , де R є воднем або C1-4-алкілом. Одиниця аміно-ЗНК може бути і в бета-D формі і в альфа-L-формі. Загалом, переважною є бета-D-форма одиниці аміно-ЗНК. Одиниці аміно-ЗНК в бета-D-формі і альфа-L-формі показані на схемі 4, як сполуки 4A і 4B, відповідно. Термін "одиниця окси-ЗНК" належить до одиниці ЗНК, в якій X на схемі 1 являє собою O. Одиниця окси-ЗНК може бути і в бета-D формі і в альфа-L-формі. Загалом, переважною є бетаD-форма одиниці окси-ЗНК. Одиниці окси-ЗНК в бета-D-формі і альфа-L-формі показані на схемі 5, як сполуки 5A і 5B, відповідно. У даному описі терміном "C1-6-алкіл" позначений лінійний або розгалужений насичений вуглеводневий ланцюг, при цьому найдовші ланцюги мають від одного до шести атомів вуглецю, такі як метил, етил, n-пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, ізопентил, неопентил і гексил. Розгалуженим вуглеводневим ланцюгом вважається C 1-6алкіл, заміщений за будь-яким атомом вуглецю вуглеводневим ланцюгом. У даному описі термін "C1-4-алкіл" призначений для позначення лінійного або розгалуженого насиченого вуглеводневого ланцюга, при цьому найдовші ланцюги мають від одного до чотирьох атомів вуглецю, такі як метил, етил, н-пропіл, ізопропіл, н-бутил, ізобутил, втор-бутил і трет-бутил. Розгалуженим вуглеводневим ланцюгом вважають C 1-4-алкіл, заміщений за будьяким атомом вуглецю вуглеводневим ланцюгом. Термін "C1-6-алкокси", що використовується в даному винаході, означає C 1-6-алкіл-окси, наприклад, метокси, етокси, н-пропокси, ізопропокси, н-бутокси, ізобутокси, втор-бутокси, третбутокси, пентокси, ізопентокси, неопентокси і гексокси. У даному описі термін "C2-6-алкеніл" означає лінійну або розгалужену вуглеводневу групу, що має від двох до шести атомів вуглецю і що містить одиг або більше подвійних зв'язків. Ілюстративні приклади C2-6-алкенільних груп включають аліл, гомо-аліл, вініл, кротил, бутеніл, бутадієніл, пентеніл, пентадієніл, гексеніл і гексадієніл. Ненасиченим (подвійним зв'язком) може бути будь-яке положення у вуглецевому ланцюгу. У даному описі термін "C2-6-алкініл" означає лінійні або розгалужені вуглеводневі групи, щомістять від двох до шести атомів вуглецю і що містять один або більше потрійних зв'язків. Ілюстративні приклади C2-6-алкінільних груп включають ацетилен, пропініл, бутиніл, пентиніл і гексиніл. Ненасиченим (потрійним зв'язком) може бути будь-яке положення у вуглецевому ланцюгу. Більше ніж один зв'язок може бути ненасиченим таким чином, що "C 2-6-алкініл" може являти собою ді-ін, або енеді-ін, що відомо фахівцеві в даній галузі техніки. Відносно заміщення одиниці ДНК на відповідну їй одиницю ЗНК в контексті даного винаходу, термін "відповідна одиниця ЗНК" означає, що одиницю ДНК замінили на одиницю ЗНК, що містить ту саму азотисту основу, що і замінена одиниця ДНК, наприклад, на одиницю ЗНК, що містить азотисту основу А, яка відповідає одиниці ДНК, яка також містить азотисту основу A. Виключення полягає в тому, що якщо одиниця ДНК містить основу С, то відповідна одиниця Me Me ЗНК може містити основу С або основу С, переважно С. Термін "одиниця не-ЗНК", що використовується в даному винаході, належить до нуклеозиду, який відрізняється від одиниці ЗНК, тобто термін "одиниця не-ЗНК" містить одиницю ДНК, а також одиницю РНК. Переважна одиниця не-ЗНК являє собою одиницю ДНК. Терміни "одиниця", "залишок" і "мономер" використовуються у винаході взаємозамінно. Термін "щонайменше один" охоплює ціле число, яке більше або дорівнює 1, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 і т.д. Однина, що використовується у відношенні нуклеотиду, агента, одиниці ЗНК і т.д., призначена означати один або більше. Зокрема, вираз "компонент (наприклад, нуклеотид, агент, одиниця ЗНК або подібне), вибираний з групи, що складається з…" означає, що один або більше вказаних компонентів можна вибирати. Таким чином, такі вирази, як "компонент, вибираний з групи, що складається з А, В і С", вказують, що всі комбінації А, В і С, тобто А, В, С, А+В, А+С, В+С і А+В+С, включені в число компонентів, що розглядаються. Міжнуклеозидні зв'язки Термін "група міжнуклеозидного зв'язку" означає групу, здатну до ковалентного зв'язування двох нуклеотидів, наприклад, утворення зв'язку між одиницями ДНК, між одиницями ДНК і нуклеотидними аналогами, між двома одиницями не-ЗНК, між одиницею не-ЗНК і одиницею 14 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ЗНК, і між двома одиницями ЗНК, і т.д. Приклади включають фосфатні, фосфодіефірні групи і фосфоротіоатні групи. У деяких варіантах здійснення щонайменше один із зв'язків або, наприклад, всі міжнуклеозидні зв'язки в олігомері є фосфодіефірними. Однак в умовах використання in vivo можуть бути переважними фосфоротіоатні зв'язки. Звичайними групами міжнуклеозидних зв'язків в олігонуклеотидах є фосфатні групи, але їх можна замінювати на нефосфатні групи міжнуклеозидного зв'язку. У додатковому представляючому інтерес варіанті здійснення винаходи модифікують структуру групи міжнуклеозидного зв'язку в олігонуклеотиді за винаходом, тобто модифікований олігонуклеотид містить групу міжнуклеозидного зв'язку, яка відрізняється від фосфатної групи. Відповідно, в переважному варіанті здійснення олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить щонайменше одну групу міжнуклеозидного зв'язку, яка відрізняється від фосфатної групи. Конкретні приклади груп міжнуклеозидного зв'язку, які відрізняються від фосфатної групи (О-P(O)2-О-), включають -О-P(O,S)-O-, -О-P(S)2-О, -S-P(O)2-О-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-О-, -ОH H P(O)2-S-, -О-P(O, S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(R )-O-, О-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NR )-O-, -OH H H H PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHR )-O-, -О-P(O)2-NR -, -NR -P(O)2-O-, -NR -СОH H H Н Н Н О-, -NR -CO-NR -, -О-CО-О-, -O-CO-NR -, -NR -CO-CH2-, -О-CH2-CO-NR -, -О-CH2-CH2-NR -, Н H CO-NR -CH2-, -CH2-NR -CO-, -О-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, Н H H CH2-CO-NR -, -О-CH2-CH2-NR -CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, де R є воднем або C1-4-алкілом. При модифікації групи міжнуклеозидного зв'язку переважною групою міжнуклеозидного зв'язку є фосфоротіоатна група (-О-P(O, S)-O-). У переважному варіанті здійснення всі групи міжнуклеозидного зв'язку олігонуклеотидів згідно з даним винаходом є фосфоротіоатними. Міжнуклеотидний зв'язок можна вибирати з групи, що складається з: -О-P(O)2-О-, -О-P(O, S)O-, -О-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O, S)-O-, -S-P(S)2-О-, -O-P(O)2-S-, -О-P(O, S)-S-, -S-P(O)2-S-, H H О-PО(R )-О-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NR )-O-, -О-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -OH H H H H H PO(NHR )-O-, -О-P(O)2-NR -, -NR -P(О)2-О-, -NR -CО-О-, -NR -CО-NR -, і/або міжнуклеотидний H H зв'язок можна вибирати з групи, яка складається з: -O-CO-O-, -O-CO-NR -, -NR -CO-CH2-, -ОH H Н H CH2-CO-NR -, -O-CH2-CH2-NR -, -CО-NR -CH2-, -CH2-NR -CО-, -О-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, H H H S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CО-NR -, -O-CH2-CH2-NR -CO-, -CH2-NCH3-O-CH2-, в якій R вибирають з водню і C1-4-алкілу. Відповідно, в деяких варіантах здійснення можуть бути переважними міжнуклеозидні зв'язки, які містять сірку (S), як вказано вище. Міжнуклеотидні зв'язки можна незалежно вибирати, або всі вони можуть бути однаковими, такими як фосфоротіоатні зв'язки. В одному варіанті здійснення щонайменше 75 %, наприклад, 80 % або 85 %, або 90 %, або 95 %, або всі міжнуклеозидні зв'язки, розташовані між нуклеотидними одиницями безперервної послідовності нуклеотидів, є фосфоротіоатними міжнуклеозидними зв'язками. Олігонуклеотиди мікро-mir, мішенню для яких є більше однієї мікроРНК В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність комплементарна відповідній послідовності щонайменше з двох послідовностей міРНК, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 послідовностей міРНК. Використання єдиної універсальної основи може сприяти тому, що єдиний олігомер за винаходом буде націлений на дві незалежних мікроРНК, з яких або одна або обидві мають єдине неспівпадання в тій ділянці, яка відповідає олігомеру в місці розташування універсального нуклеотиду. В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з послідовності, яка комплементарна послідовності щонайменше з двох областей вихідної послідовності міРНК, наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 послідовностям області вихідної міРНК. В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність комплементарна відповідній області і miR-221 і miR-222. В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність комплементарна відповідній області більше ніж одного кластера miR-17-92, наприклад, двом або більше, або всім miR-17-5p, miR-20a/b, miR-93, miR-106a/b; або двом або більше, або всім miR-25, miR-92a і miR-363. В одному варіанті здійснення безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з послідовності, якої комплементарна 5'GCTACAT3'. Конструкція олігомеру В одному варіанті здійснення перший нуклеотид олігомеру згідно з винаходом, рахуючи від 3'-кінця, є нуклеотидним аналогом, таким як одиниця ЗНК. В одному варіанті здійснення, який може бути аналогічним або іншим, останній нуклеотид олігомеру згідно з винаходом, рахуючи від 3'-кінця, є нуклеотидним аналогом, таким як одиниця ЗНК. 15 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В одному варіанті здійснення другий нуклеотид олігомеру за винаходом, рахуючи від 3'кінця, є нуклеотидним аналогом, наприклад, одиницею ЗНК. В одному варіанті здійснення дев'ятий і/або десятий нуклеотид олігомеру за винаходом, рахуючи від 3'-кінця, є нуклеотидним аналогом, наприклад, одиницею ЗНК. В одному варіанті здійснення дев'ятий нуклеотид олігомеру за винаходом, рахуючи від 3'кінця, є нуклеотидним аналогом, наприклад, одиницею ЗНК. В одному варіанті здійснення десятий нуклеотид олігомеру згідно з винаходом, рахуючи від 3'-кінця, є нуклеотидним аналогом, наприклад, одиницею ЗНК. В одному варіанті здійснення і дев'ятий, і десятий нуклеотиди олігомеру за винаходом, рахуючи від 3'-кінця, є нуклеотидними аналогоми, наприклад, одиницею ЗНК. В одному варіанті здійснення олігомер за винаходом не містить область з більше 3 послідовних нуклеотидних одиниць ДНК. В одному варіанті здійснення олігомер за винаходом не містить область з більше 2 послідовних нуклеотидних одиниць ДНК. В одному варіанті здійснення олігомер містить щонайменше область, що складається щонайменше з двох послідовних одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше з двох послідовних одиниць ЗНК. В одному варіанті здійснення олігомер містить щонайменше область, що складається щонайменше з трьох послідовних одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше з трьох послідовних одиниць ЗНК. Інші зразки нуклеотидних аналогів, такі як ЗНК в олігомері Передбачається, що олігомери, які містять щонайменше 6 ЗНК, наприклад, щонайменше 7 нуклеотидних одиниць, можуть бути переважними, тому відкриття ефективності настільки коротких олігомерів в націленні на мікроРНК in vivo можна використовувати для підготовки більш коротких олігомерів згідно з винаходом, які містять інші нуклеотидні аналоги, такі як високоафінні нуклеотидні аналоги. Фактично, комбінація ЗНК з іншими високоафінними нуклеотидними аналогами розглядається як частина даного винаходу. Модифікація нуклеотидів в положеннях 1-2, рахуючи від 3'-кінця. Нуклеотид в положеннях 1 і/або 2 може бути нуклеотидним аналогом, наприклад, високоафінним нуклеотидним аналогом, таким як ЗНК, або нуклеотидним аналогом, вибираним з групи, що складається з одиниці 2'-Oалкіл-РНК, одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'-аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, одиниці 2'-МОЕРНК, одиниці ЗНК, одиниці ПНК, одиниці ГНК, одиниці ІНК. Таким чином, два 3'-нуклеотиду можуть являти собою Хх, хХ, XX або хх, в яких: в одному варіанті здійснення X являє собою ЗНК, і х є ДНК або іншим нуклеотидним аналогом, наприклад, 2'-заміщеним нуклеотидним аналогом, який вибирають з групи, що складається з одиниці 2'-O_алкіл-РНК, одиниці 2'-ОМеРНК, одиниці 2'-аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, ЗНК і одиниці 2'-МОЕ-РНК. Вказана одиниця не-ЗНК (х), таким чином, може являти собою 2'-МОЕ-РНК або 2'-фтор-ДНК. Альтернативно X є нуклеотидним аналогом, і х являє собою ДНК. Вищезазначена модифікація в 2-х 3'-кінцевих нуклеотидах може поєднуватися з модифікацією нуклеотидів в положеннях 3 8, рахуючи від 3'-кінця, як описано нижче. У цьому відношенні нуклеотиди, позначені як X і х, скрізь в олігомері можуть бути однаковими. Необхідно вказати, що можна не враховувати 8-ий нуклеотид, рахуючи від 3'-кінця, якщо довжина олігомеру становить тільки 7 нуклеотидів. У нижчезгаданих варіантах здійснення, які належать до модифікації нуклеотидів в положеннях 3-8, рахуючи від 3'-кінця, одиниці ЗНК в одному варіанті здійснення можуть замінюватися на інші нуклеотидні аналоги, такі як згадані в даному винаході. Тому "X" можна вибирати з групи, що складається з одиниці 2'-O-алкіл-РНК, одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'-аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, одиниці 2'-МОЕ-РНК, одиниці ЗНК, одиниці ПНК, одиниці ГНК, одиниці ІНК. "x" переважно є ДНК або РНК, найбільш переважно ДНК. Разом з тим, X переважно являє собою ЗНК. В одному варіанті здійснення винаходу олігонуклеотиди за винаходом модифікують в положеннях 3-8, рахуючи від 3'-кінця. Конструкцію цієї послідовності можна визначати за кількістю присутніх одиниць не-ЗНК або за кількістю присутніх одиниць ЗНК. У переважному варіанті здійснення у вказаній послідовності щонайменше один, наприклад, один нуклеотид в положенні від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, є одиницею не-ЗНК. У іншому варіанті здійснення щонайменше два, наприклад, два нуклеотиду в положенні від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, є одиницями не-ЗНК. У ще одному варіанті здійснення щонайменше три, наприклад, три нуклеотиду в положенні від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, є одиницями не-ЗНК. Ще в одному варіанті здійснення щонайменше чотири, наприклад, чотири нуклеотиду в положенні від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, є одиницями не-ЗНК. У додатковому варіанті здійснення щонайменше п'ять, наприклад, п'ять нуклеотидів від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, є одиницями не-ЗНК. Ще в одному додатковому варіанті 16 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснення всі шість нуклеотидів в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, є одиницями не-ЗНК. Альтернативно вказано, як варіант здійснення, що олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить щонайменше три одиниці ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'кінця. У варіанті здійснення вказаного олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить три одиниці ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця. Зразок заміни для нуклеотидів в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, можна вибирати з групи, що складається з XXXxxx, xXXXxx, xxXXXx, xxxXXX, XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX і XxXxXx, в якій "X" означає одиницю ЗНК і "x" означає одиницю не-ЗНК. У переважному варіанті здійснення зразок заміни для нуклеотидів в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, вибирають з групи, що складається з XXxXxx, XXxxXx, XXxxxX, xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, XxXXxx, XxxXXx, XxxxXX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX, xXxXxX і XxXxXx, в якій "X" означає одиницю ЗНК і "x" означає одиницю не-ЗНК. У більш переважному варіанті здійснення зразок заміни для нуклеотидів в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, вибирають з групи, що складається з xXXxXx, xXXxxX, xxXXxX, xXxXXx, xXxxXX, xxXxXX і xXxXxX, в якій "X" означає одиницю ЗНК і "x" означає одиницю не-ЗНК. В одному варіанті здійснення зразок заміни для нуклеотидів в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, являє собою xXxXxX або XxXxXx, в якій "X" означає одиницю ЗНК і "x" означає одиницю не-ЗНК. В одному варіанті здійснення зразок заміни для нуклеотидів в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, являє собою xXxXxX, в якій "X" означає одиницю ЗНК і "x" означає одиницю не-ЗНК. У додатковому варіанті здійснення олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить щонайменше чотири одиниці ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця. У варіанті здійснення вказаного олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить чотири одиниці ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця. Зразок заміни для нуклеотидів в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, можна вибирати з групи, що складається з xxXXXX, xXxXXX, xXXxXX, xXXXxX, xXXXXx, XxxXXX, XxXxXX, XxXXxX, XxXXXx, XXxxXX, XXxXxX, XXxXXx, XXXxxX, XXXxXx і XXXXxx, в якій "X" означає одиницю ЗНК і "x" означає одиницю не-ЗНК. Ще в одному додатковому варіанті здійснення олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить щонайменше п'ять одиниць ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'кінця. В одному варіанті здійснення олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить п'ять одиниць ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця. Зразок заміни для нуклеотидів в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, можна вибирати з групи, що складається з xXXXXX, XxXXXX, XXxXXX, XXXxXX, XXXXxX і XXXXXx, в якій "X" означає одиницю ЗНК і "x" означає одиницю не-ЗНК. Переважно олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить одну або дві одиниці ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця. Вважається, що для стабільності Аспіралі, утвореної оліго, мають перевагу: дуплекс мікроРНК, дуплекс, схожий з РНК: дуплексна структура РНК. Ще в одному додатковому варіанті здійснення олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить щонайменше шість одиниць ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'кінця. В одному варіанті здійснення винаходу олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить від трьох до шести одиниць ЗНК в положеннях від третього до восьмого, рахуючи від 3'-кінця, і додатково в тій самій області він містить від одного до трьох інших високоафінних нуклеотидних аналогів, таким чином, що загальна кількість високоафінних нуклеотидних аналогів (що включають в себе одиниці ЗНК) в області від третього до восьмого положення, рахуючи від 3'кінця, складає шість. У деяких варіантах здійснення, наприклад, коли X являє собою ЗНК, вказана одиниця неЗНК (х) є іншою одиницею нуклеотидного аналога, наприклад, 2'-заміщеного нуклеотидного аналога, яку вибирають з групи, що складається з одиниці 2'-O_алкіл-РНК, одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'-аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, ЗНК і одиниці 2'-МОЕ-РНК. Вказана одиниця не-ЗНК (х), тому, може являти собою 2'-МОЕ-РНК або 2'-фтор-ДНК. В олігомерах, що мають 9 або 10 нуклеотидів, нуклеотид в положеннях 9 і/або 10 може бути нуклеотидним аналогом, наприклад, високоафінним нуклеотидним аналогом, таким як ЗНК, або нуклеотидним аналогом, який вибирають з групи, що складається з одиниці 2'-O-алкіл-РНК, одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'-аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, одиниці 2'-МОЕ-РНК, одиниці ЗНК, одиниці ПНК, одиниці ГНК, одиниці ІНК. Два 5'-нуклеотиду, тому, можуть являти собою Хх, хХ, XX або хх, в яких: в одному варіанті здійснення X являє собою ЗНК, і х є ДНК або іншим нуклеотидним аналогом, наприклад, 2'-заміщеним нуклеотидним аналогом, який вибирають з 17 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 групи, що складається з одиниці 2'-O_алкіл-РНК, одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'-аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, ЗНК і одиниці 2'-МОЕ-РНК. Вказана одиниця не-ЗНК (х), тому, може являти собою 2'-МОЕ-РНК або 2'-фтор-ДНК. Альтернативно X є нуклеотидним аналогом, і х являє собою ДНК. Вищевказану модифікацію в 2-х 5'-кінцевих нуклеотидах і/або в 2-х 3' нуклеотидах можна комбінувати з модифікацією нуклеотидів в положеннях 3 8, рахуючи від 3'-кінця, як описано вище. У цьому відношенні нуклеотиди, позначені X і х, можуть бути однаковими у всьому олігомері. У переважному варіанті здійснення винаходу олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить одиницю ЗНК на 5'-кінці. В іншому переважному варіанті здійснення олігонуклеотид згідно з даним винаходом містить одиницю ЗНК в перших двох положеннях, рахуючи від 5'кінця. В одному варіанті здійснення винахід додатково належить до олігомеру, опис якого наведений в контексті фармацевтичної композиції винаходу, або для використання in vivo в організмі, наприклад, як лікарського засобу, при цьому вказаний олігомер (або безперервна нуклеотидна послідовність) містить або i) щонайменше один фосфоротіоатний зв'язок, і/або ii) щонайменше одну 3'-кінцеву одиницю ЗНК, і/або iii) щонайменше одну 5'-кінцеву одиницю ЗНК. Таким чином, олігомер може містити щонайменше один фосфоротіоатний зв'язок, наприклад, мати всі фосфоротіоатні зв'язки, і щонайменше одну 3'-кінцеву одиницю ЗНК, і щонайменше одну 5'-кінцеву одиницю ЗНК. У більшості терапевтичних застосувань переважним є повністю фосфоротіольований олігонуклеотид, за винятком терапевтичних олігонуклеотидів для введення в ЦНС, наприклад, в мозок або спинний мозок, де фосфоротіолювання може бути токсичним, і завдяки відсутності нуклеаз можна використовувати фосфодіефірні зв'язки, навіть між суміжними одиницями ДНК. Як згадано в даному винаході у відношенні олігонуклеотиду згідно з винаходом, іншим аспектом є те, що другий 3'-нуклеотид, і/або 9-ий і 10-ий (від 3'-кінця), у випадку їх присутності, також можуть являти собою ЗНК. В одному варіанті здійснення олігомер містить щонайменше п'ять одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, щонайменше п'ять одиниць ЗНК, в положеннях, яких комплементарні вихідній області міРНК. В одному варіанті здійснення нуклеотидну послідовність олігомеру, комплементарного послідовності вихідної області мікроРНК, вибирають з групи, що складається з (X)xXXXXX, (X)XxXXXX, (X)XXxXXX, (X)XXXxXX, (X)XXXXxX і (X)XXXXXx, де "X" означає нуклеотидний аналог, наприклад, одиницю ЗНК, (X) означає необов'язковий нуклеотидний аналог, наприклад, одиницю ЗНК, і "x" означає ДНК- або РНК-нуклеотидну одиницю. В одному варіанті здійснення олігомер містить шість або сім одиниць нуклеотидних аналогів, наприклад, шість або сім одиниць ЗНК, в положеннях, які комплементарні вихідній області міРНК. В одному варіанті здійснення нуклеотидна послідовність олігомеру, комплементарного послідовності вихідної області мікроРНК, вибирають з групи, що складається з XXXXXX, XxXXXXX, XXxXXXX, XXXxXXX, XXXXxXX, XXXXXxX і XXXXXXx, де "X" означає нуклеотидний аналог, такий як одиниця ЗНК, наприклад, одиницю ЗНК, і "x" означає ДНК- або РНКнуклеотидну одиницю. В одному варіанті здійснення два нуклеотидних мотиви в положенні 7-8, рахуючи від 3'-кінця олігомеру, вибирають з групи, що складається з хх, XX, хХ і Хх, де "X" означає нуклеотидний аналог, такий як одиниця ЗНК, наприклад, одиницю ЗНК, і "x" означає ДНК- або РНКнуклеотидну одиницю. В одному варіанті здійснення два нуклеотидні мотиви в положенні 7-8, рахуючи від 3'-кінця олігомеру, вибирають з групи, що складається з XX, хХ і Хх, де "X" означають аналог нуклеотиду, такий як одиниця ЗНК, наприклад, одиницю ЗНК, і "x" означає ДНК- або РНКнуклеотидну одиницю. В одному варіанті здійснення олігомер містить 12 нуклеотидів, при цьому два нуклеотидних мотиви в положенні 11-12, рахуючи від 3'-кінця олігомеру, вибирають з групи, що складається з хх, XX, хХ і Хх, де "X" означає нуклеотидний аналог, такий як одиниця ЗНК, наприклад, одиницю ЗНК, і "x" означає ДНК- або РНК-нуклеотидну одиницю. В одному варіанті здійснення олігомер містить 12 нуклеотидів, при цьому два нуклеотидні мотиви в положенні 11-12, рахуючи від 3'-кінця олігомеру, вибирають з групи, що складається з 18 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 XX, хХ і Хх, де "X" означає нуклеотидний аналог, такий як одиниця ЗНК, наприклад, одиницю ЗНК, і "x" означає ДНК- або РНК-нуклеотидну одиницю, наприклад, одиницю ДНК. В одному варіанті здійснення олігомер містить на 5'-кінці одиницю нуклеотидного аналога, таку як одиниця ЗНК. В одному варіанті здійснення одиниці нуклеотидних аналогів, наприклад, X, незалежно вибирають з групи, що складається з: одиниці 2'-O-алкіл-РНК, одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'аміно-ДНК, одиниці 2'-фтор-ДНК, одиниці 2'-МОЕ-РНК, одиниці ЗНК, одиниці ПНК, одиниці ГНК, одиниці ІНК. В одному варіанті здійснення всі нуклеотиди олігомеру за даним винаходом являють собою одиниці нуклеотидних аналогів. В одному варіанті здійснення одиниці нуклеотидних аналогів, наприклад, X, незалежно вибирають з групи, що складається з: одиниці 2'-ОМе-РНК, одиниці 2'-фтор-ДНК і одиниць ЗНК. В одному варіанті здійснення олігомер містить вказаний щонайменше один одиницю аналога ЗНК і щонайменше одну додаткову одиницю нуклеотидного аналога, відмінну від ЗНК. В одному варіанті здійснення одиницю або одиниці не-ЗНК нуклеотидного аналога незалежно вибирають з одиниць 2'-ОМе-РНК і одиниць 2'-фтор-ДНК. В одному варіанті здійснення олігомер складається щонайменше з однієї послідовності XYX або YXY, в яких X являє собою ЗНК, і Y є або одиницею 2'-ОМе-РНК і одиницею 2'-фтор-ДНК. В одному варіанті здійснення нуклеотидна послідовність олігомеру складається з альтернативних одиниць X і Y. В одному варіанті здійснення олігомер містить одиниці, що чергуються ЗНК і ДНК (Хх) або (хХ). В одному варіанті здійснення олігомер містить мотив з ЗНК, що чергуються, що супроводяться 2 одиницями ДНК (Xxx), xXx або xxX. В одному варіанті здійснення щонайменше одна з ДНК- або не-ЗНК-одиниць нуклеотидного аналога замінена на ЗНК-нуклеотид в положенні, яке вибирають з положень, що означаються ЗНК-нуклеотидними одиницями в будь-якому з варіантів здійснення, згаданих вище. В одному варіанті здійснення "X" є донором одиниці ЗНК. Додаткові конструкції олігомерів за винаходом У таблиці 1 нижче наведені необмежуючі обсяг даного винаходу приклади коротких послідовностей мікроРНК, які можуть мати перевагу як мішені для олігонуклеотидів за даним винаходом. Олігонуклеотиди згідно з винаходом, такі як розкриті в таблиці 1, в одному варіанті здійснення можуть мати послідовність в 7, 8, 9 або 10 ЗНК-нуклеотидів 5'-3' LLLLLLL(L)(L)(L)(L), або мати послідовність нуклеотидів, яку вибирають з групи, що складається з перших 7, 8, 9 або 10 нуклеотидів наступних мотивів: Фармацевтична композиція і застосування в медицині Даний винахід належить до фармацевтичної композиції, що містить олігомер за винаходом, і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій, сіль або ад'ювант. Винахід додатково передбачає використання олігонуклеотиду згідно з винаходом, наприклад, олігонуклеотидів, які можуть входити до складу фармацевтичної композиції, для виробництва лікарського засобу для лікування захворювання або клінічного порушення, пов'язаного з присутністю або надекспресією (ап-регуляцією) мікроРНК. Винахід додатково належить до способу лікування захворювання або клінічного порушення, пов'язаного з присутністю або надекспресією мікроРНК, що включає стадію введення потребуючій лікування людині композиції (наприклад, фармацевтичної композиції) за винаходом. Винахід додатково належить до способу зменшення ефективної кількості міРНК в клітині або в організмі, що включає введення в клітину або організм композиції (наприклад, 19 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 фармацевтичної композиції) за винаходом або олігомеру за винаходом. Зниження ефективної кількості в цьому контексті належить до зменшення вмісту в клітині або організмі функціональної міРНК. Признається, що переважні олігонуклеотиди за винаходом можливо не завжди значно зменшують фактичну кількість міРНК в клітині або організмі, оскільки зазвичай вони утворюють дуже стійкі дуплекси з їх міРНК-мішенями. В одному варіанті здійснення можна виміряти зниження ефективної кількості міРНК в клітині шляхом визначення клітинного рівня дерепресії міРНК-мішені. Винахід додатково належить до способу дерепресії мРНК-мішені з міРНК в клітині або в організмі, що включає введення в клітину або організм композиції (наприклад, фармацевтичної композиції) або олігомеру за винаходом. Винахід додатково належить до використання олігомеру, що має довжину від 7 до 10, наприклад, 7, 8, 9 або 10 нуклеотидів, для виробництва лікарського засобу для лікування захворювання або клінічного порушення, пов'язаного з присутністю або надекспресією мікроРНК. В одному варіанті здійснення клінічний стан (або хвороба) являє собою гепатит С (HCV), і міРНК являє собою miR-122. В одному варіанті здійснення фармацевтична композиція згідно з винаходом призначена для застосування в лікуванні клінічного порушення або хвороби, що вибирається з групи, яка складається з: вірусної інфекції гепатиту С і гіперхолестеринемії і пов'язаних з ними порушень, і ракових захворювань. В одному варіанті здійснення клінічне порушення або захворювання являє собою патологію ЦНС, наприклад, захворювання ЦНС, для якого відома одна або більше ідентифікованих мікроРНК. У контексті пов'язаних з гіперхолестеринемією патологій розглядаються такі хвороби, як атеросклероз або гіперліпідемія. Додаткові приклади пов'язаних з гіперхолестеринемією захворювань також включають різні типи холестеринового дисбалансу ЛПВЩ/ЛПНЩ (ліпопротеїни високої щільності/ліпопротеїни низької щільності); дисліпідемії, наприклад, сімейна сукупна гіперліпідемія (FCHL), надбана гіперліпідемія, статин-резистентна гіперхолестеринемія; захворювання коронарних артерій (ЗКА), ішемічна хвороба серця (ІХС), атеросклероз. В одному варіанті здійснення фармацевтична композиція згідно з винаходом додатково містить другий незалежний активний компонент, який є інгібітором шляху збирання VLDL (ліпопротеїнів дуже низької щільності), наприклад, інгібітор ApoB або інгібітор MTP (мікросомального білка, що переносить тригліцериди) (наприклад, розкриті в патенті США 60/977497, включеному посиланням в даний винахід). Винахід додатково належить до способу лікування захворювання або клінічного порушення, пов'язаного з присутністю або надекспресією мікроРНК, що включає стадію введення потребуючій лікування людині композиції (наприклад, фармацевтичної композиції), яка містить олігомер, що має довжину від 7 до 10, наприклад, 7, 8, 9 або 10, нуклеотидів. Винахід додатково належить до способу зменшення ефективної кількості міРНК-мішені (тобто "доступних" міРНК) в клітині або організмі, що включає введення в клітину або організм композиції (наприклад, фармацевтичної композиції), яка містить олігомер, що має довжину від 6-7 до 10, наприклад, 7, 8, 9 або 10, нуклеотидів. Необхідно вважати, що "зменшення ефективної кількості" однієї або більше мікроРНК в клітині або організмі належить до інгібування функції мікроРНК в клітині або організмі. Клітиною переважно є клітина ссавця або людська клітина, яка експресує одну мікроРНК або декілька мікроРНК. Винахід додатково належить до способу дерепресії в клітині або організмі мРНК-мішені з міРНК, які містять олігомер, що має довжину від 7 до 10, наприклад, 7, 8, 9 або 10, нуклеотидів (або композиція, що містить вказаний олігонуклеотид) в клітині або організмі. Як згадано вище, мікроРНК пов'язані з багатьма захворюваннями. Отже, четвертий аспект винаходу належить до застосування олігонуклеотиду за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування захворювання, пов'язаного з експресією мікроРНК, яке вибране з групи, що складається з спінальної м'язової атрофії, синдрому Туретта, гепатиту С, синдрому розумової відсталості з ламкою Х-хромосомою, синдрому Ді Георга і раку, як необмежувального прикладу, хронічного лімфоцитарного лейкозу, раку молочної залози, раку легені і раку ободової кишки, зокрема, раку. Способи синтезу 20 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід додатково належить до способу синтезу олігомеру, націленого на людську мікроРНК, наприклад, олігомеру, описаного в даному винаході, при цьому вказаний спосіб містить наступні етапи: a. необов'язково вибір першого нуклеотиду, рахуючи від 3'-кінця, який є нуклеотидним аналогом, таким як нуклеотид ЗНК; b. необов'язково вибір другого нуклеотиду, рахуючи від 3'-кінця, який є нуклеотидним аналогом, таким як нуклеотид ЗНК; с. вибір області олігомеру, який відповідає вихідній області міРНК, при цьому вказана область являє собою область, визначену за винаходом; d. вибір сьомого і необов'язково восьмого нуклеотидів, вказаних за винаходом; е. необов'язково вибір одного або двох додаткових 5'-кінців олігомеру згідно з винаходом; при цьому синтез здійснюють шляхом послідовного синтезу областей, вказаних в етапах ае, при цьому вказаний синтез можна провести або в напрямку 3'-5' (від а. до f.) або в напрямку 5'-3' (від е. до a.), і при цьому вказаний олігомер комплементарний послідовності міРНК-мішені. Винахід додатково належить до способу отримання олігомеру (такого як олігомер за винаходом), при цьому вказаний спосіб включає етапи a) порівняння послідовностей двох або більше послідовностей міРНК для ідентифікації двох або більше послідовностей міРНК, які містять загальну безперервну послідовність нуклеотидів з довжиною щонайменше 7 нуклеотидів, наприклад, 7, 8, 9 або 10 нуклеотидів (тобто послідовність, що виявляється в обох неідентичних міРНК), b) виготовлення послідовності олігомеру, що містить або складається з безперервної нуклеотидної послідовності, яка комплементарна вказаній загальній безперервній нуклеотидній послідовності, при цьому вказаний олігомер є олігомером за винаходом. У переважному прикладі загальна безперервна нуклеотидна послідовність містить або складається з вихідної області кожної з вказаних двох або більше послідовностей міРНК (які містять загальну безперервну нуклеотидну послідовність довжиною щонайменше 6 нуклеотидів). В одному варіанті здійснення вихідні області двох або більше міРНК є ідентичними. Відповідно, олігомер містить або складається з сидмерної послідовності довжиною 7 або 8 нуклеотидів, яка містить послідовність, комплементарну вказаним двом або більше міРНК. Цей спосіб можна використовувати в поєднанні з етапом с. вищевказаного способу. Спосіб синтезу олігомеру згідно з винаходом можна здійснювати з використанням стандартного твердофазного синтезу олігонуклеотидів. В одному варіанті здійснення спосіб синтезу олігомеру, націленого проти людської мікроРНК, здійснюють в напрямку а-е від 3'- до 5'-кінця. Додатковим аспектом даного винаходу є спосіб зменшення рівня мікроРНК-мішені шляхом контакту мікроРНК-мішені з олігонуклеотидом, як вказано у винаході, при цьому олігонуклеотид (i) комплементарний послідовності мікроРНК-мішені, (ii) на 3'-кінці не містить нуклеотид, який відповідає першим нуклеотидам мікроРНК-мішені 5'-кінця. Стабільність дуплексу і температура Т m В одному варіанті здійснення олігомер за даним винаходом здатний до утворення дуплексу з комплементарною одноланцюжковою молекулою нуклеїнової кислоти РНК (зазвичай приблизно аналогічної довжини вказаного одноланцюжкового олігонуклеотида) з фосфодіефірними міжнуклеозидними зв'язками, при цьому дуплекс має температуру T m в діапазоні від 30 °C і до 70 °C або 80 °C, наприклад, від 30 °C і до 60 °C, до 70 °C, або від 30 °C до 50 °C або до 60 °C. В одному варіанті здійснення Т m складає щонайменше 40 °C. Можна визначати Тm, визначаючи Тm олігомеру і комплементарної РНК-мішені з наступними буферними умовами: 100 мМ NaCl, 0,1 мМ етилендіамін-тетраоцтової кислоти ЕДТА, 10 мМ Naфосфату, рівень pH 7,0 (див. приклади докладного протоколу). Високоафінні аналоги можна визначити як аналог, який при використанні в олігомері за винаходом призводить до підвищення Тm олігомеру в порівнянні з ідентичним олігомером, що містить тільки ДНК-основи. Кон'югати В одному варіанті здійснення вказаний олігомер кон'югований з одним або декількома ненуклеотидними (або полінуклеотидними) сполуками. У даному описі термін "кон'югат" застосовується для позначення гетерогенної молекули, утвореної ковалентним приєднанням ("кон'югацією") олігомеру, описаною у винаході, до однієї або декількох ненуклеотидних або неполінуклеотидних функціональних груп. Приклади ненуклеотидних або неполінуклеотидних функціональних груп включають макромолекулярні агенти, такі як білки, ланцюги жирних кислот, залишки цукру, глікопротеїни, полімери або їх комбінації. Звичайні білки можуть являти собою антитіла до білка-мішені. Звичайні полімери можуть являти собою поліетиленгліколь. 21 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Таким чином, в різних варіантах здійснення олігомер за винаходом може містити як полінуклеотидну область, яка зазвичай складається з безперервної послідовності нуклеотидів і комплементарної області ненуклеотиду. У відношенні олігомеру за винаходом, що складається з безперервної нуклеотидної послідовності, сполука може містити ненуклеотидні компоненти, наприклад, компонент кон'югат. У різних варіантах здійснення винаходу олігомерна сполука приєднана до лігандів/кон'югатів, які можна використовувати, наприклад, для збільшення клітинного захоплення олігомерних сполук. У патенті WO2007/031091, включеному з посиланням в даний винахід, розглянуті відповідні ліганди і кон'югати. Винахід також належить до кон'югату, який містить описану у винаході сполуку і щонайменше одну ненуклеотидну або неполінуклеотидну функціональну групу, ковалентно приєднану до вказаної сполуки. Тому, в різних варіантах здійснення, де сполука за винаходом складається з конкретної нуклеїнової кислоти або нуклеотидної послідовності, розкритої у винаході, сполука також може містити щонайменше одну ненуклеотидну або неполінуклеотидну функціональну групу (наприклад, що не містить один або більше нуклеотидів або нуклеотидних аналогів), приєднану ковалентно до вказаної сполуки. Кон'югація (до функціональної групи кон'югату) може збільшити активність, ділення в клітині або клітинне захоплення олігомеру за винаходом. Такі функціональні групи включають без обмеження антитіла, поліпептиди, ліпідні функціональні групи, наприклад, групи холестерину, холевої кислоти, тіоефіру, наприклад, гексил-s-тритилтіол, тіохолестерин, алифатичний ланцюг, наприклад, залишки додекандіолу або ундецилу, фосфоліпіди, наприклад, ди-гексадецил-racгліцерин або триетиламонію 1,2-ді-о-гексадецил-rac-гліцеро-3-h-фосфонату, ланцюги поліамінгліколю або поліетиленгліколю, адамантан-оцтову кислоту, функціональні групи пальмітилу, окстадециламіну або гексиламіно-карбоніл-оксихолестерину. Олігомери за даним винаходом також можуть кон'югуватися з діючою лікарською субстанцією, наприклад, з аспірином, ібупрофеном, сульфа-препаратом, протидіабетичним, антибактеріальним засобом або антибіотиком. У деяких варіантах здійснення кон'югована функціональна група являє собою стерин, наприклад, холестерин. У різних варіантах здійснення кон'югована функціональна група містить або складається з позитивно зарядженого полімеру, наприклад, з позитивно заряджених пептидів, наприклад, довжиною від 1 до 50, наприклад, від 2 до 20, наприклад, від 3 до 10 амінокислотних залишків, і/або з окису поліалкілену, наприклад, з поліетиленгліколю (ПЕГ) або поліпропиленгліколю див. патент WO 2008/034123, включений в даний винахід посиланням. Відповідно позитивно заряджений полімер, наприклад, окис поліалкілену, можна приєднувати до олігомеру за винаходом за допомогою лінкеру, наприклад, вільного лінкер, описаного в WO 2008/034123. У кон'югатах за даним винаходом можна використовувати як приклад наступні кон'юговані функціональні групи: Активовані олігомери Термін "активований олігомер", що використовується в даному винаході, належить до олігомеру за винаходом, ковалентно зв'язаного (тобто функціоналізованого) з щонайменше однією функціональною групою, яка допускає ковалентне зв'язування олігомеру з однією або декількома кон'югованими функціональними групами, тобто з групами, які самі по собі не є нуклеїновими кислотами або мономерами, для утворення кон'югату, описаного у винаході. Зазвичай функціональна група містить хімічну групу, яка здатна до ковалентного сполуки з олігомером, наприклад, за допомогою 3'-гідроксильної групи або екзоциклічної NH2 групи аденінового основи, спейсер, який переважно є гідрофільним, і термінальну групу, здатну до зв'язування з кон'югованою функціональною групою (наприклад, аміно, сульфгідрильна або гідроксильна група). У деяких варіантах здійснення вказана термінальна група не є захищеною, наприклад, група NH2. В інших варіантах здійснення термінальна група захищена, наприклад, будь-якою придатною захисною групою, наприклад, як описаною у виданні "Protective Groups in Organic Synthesis" авторів Theodora W Greene і Peter G. M. Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999). Приклади відповідних гідроксильних захисних груп включають складний ефір, такий як оцтовий ефір, аралкільні групи, такий як бензил, дифенілметил або трифенілметил і 22 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тетрагідропіраніл. Приклади придатних захисних аміногруп включають бензил, альфаметилбензил, дифенілметил, трифенілметил, бензилоксикарбоніл, трет-бутоксикарбоніл, і ацильні групи, такі як трихлороцтова або трифтороцтова групи. У деяких варіантах здійснення функціональна група є саморозщеплюваною. В інших варіантах здійснення функціональна група є біорозкладаною. Див. наприклад, патент США № 7087229, який повністю включений за допомогою посилання в даний винахід. У деяких варіантах здійснення олігомери за винаходом є функціоналізованими на 5'-кінці для можливості ковалентного приєднання кон'югованої функціональної групи до 5'-кінця олігомеру. В інших варіантах здійснення олігомери за винаходом можуть бути функціоналізованими на 3'-кінці. Ще в одних варіантах здійснення олігомери за винаходом можуть бути функціоналізованими по всьому скелету або в гетероциклічній основі функціональної групи. Ще в одних варіантах здійснення олігомери за винаходом можуть бути функціоналізованими більше ніж в одному положенні, що незалежно вибирається з 5'-кінця, 3'кінця, скелета і основи. У деяких варіантах здійснення активовані олігомери за винаходом синтезують шляхом включення в них під час синтезу одного або більше мономерів, ковалентно приєднаних до функціональної групи. В інших варіантах здійснення активовані олігомери за винаходом синтезують з мономерами, які не були функціоналізовані, і функціоналізацію олігомеру здійснюють після завершення синтезу. У деяких варіантах здійснення олігомери функціоналізовані з ускладненим складним ефіром, що містить аміноалкільний лінкер, в якому алкільна частина має формулу (CH 2)w, в якій w є цілим числом в діапазоні від 1 до 10, переважно близько 6, і в якому алкільна частину алкіламіногрупи може являти собою прямий ланцюг або розгалужений ланцюг, і в якому функціональна група приєднана до олігомеру за допомогою ефірної групи (-(-O-C(O)-(CH2)WNH). В інших варіантах здійснення олігомери функціоналізовані з ускладненим складним ефіром, що містить (CH2)w-сульфгідрильний (SH) лінкер, при цьому w складає ціле число в діапазоні від 1 до 10, переважно близько 6, в якому алкільна частину алкіламіногрупи може являти собою прямий ланцюг або розгалужений ланцюг, і в якому функціональна група приєднана до олігомеру за допомогою ефірної групи (-O-C(O)-(CH2)W SH). У деяких варіантах здійснення сульфгідрил-активовані олігонуклеотиди кон'юговані з полімерними функціональним групами, такими як поліетиленгліколь або пептиди (за допомогою утворення дисульфідного зв'язку). Активовані олігомери, що містять ускладнений складний ефір, як описано вище, можна синтезувати будь-яким способом, відомим в даній галузі техніки, і зокрема способами, розкритими в опублікованій PCT WO № 2008/034122 і в прикладах вказаної заявки, яка включена за допомогою посилання повністю в даний винахід. Ще в одних варіантах здійснення олігомери за винаходом є функціоналізованими шляхом введення в олігомер сульфгідрильної, аміно або гідроксильної групи за допомогою по суті функціоналізуючого реактиву, як описано в патентах США №№ 4962029 і 4914210, тобто по суті лінійного реактиву, що має фосфорамідит на одному кінці, зв'язаний за допомогою гідрофільного спейсерного ланцюга з протилежним кінцем, який містить захищену або незахищену сульфгідрильну, аміно або гідроксильну групу. Такі реактиви передусім реагують з гідроксильними групами олігомеру. У деяких варіантах здійснення такі активовані олігомери мають функціоналізуючий реактив, з'єднаний з 5'-гідроксильною групою олігомеру. В інших варіантах здійснення активовані олігомери мають функціоналізуючий реактив, з'єднаний з 3'гідроксильною групою. Ще в одних варіантах здійснення активовані олігомери за винаходом мають функціоналізуючий реактив, з'єднаний з гідроксильною групою в скелеті олігомеру. В інших додаткових варіантах здійснення олігомер за винаходом функціоналізований більше ніж одним з функціоналізуючих реактивів, як описано в патентах США № № 4962029 і 4914210, включених в даний винахід за допомогою посилання у всій повноті. Способи синтезування таких функціоналізуючих реактивів і включення їх в мономери або олігомери розкриті в патентах США №№ 4962029 і 4914210. У деяких варіантах здійснення 5'-кінець твердофазного зв'язаного олігомеру є функціоналізованим з похідним дієніл-фосфорамідиту, з подальшою кон'югацією олігомеру зі знятим захистом, наприклад, амінокислоти або пептиду, за допомогою реакції циклоприєднання Дільса-Альдера. У різних варіантах здійснення включення в олігомер мономерів, що містять 2'-цукрові модифікації, наприклад, 2'-карбамат-заміщений цукор або цукор 2'-(O-пентил-N-фталімідо)дезоксирибозу, полегшує ковалентне приєднання кон'югованих функціональних груп до цукру олігомеру. В інших варіантах здійснення виготовляють олігомер з аміно-вмісним лінкером в 2' 23 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 положенні в одному або більше мономері, використовуючи такий реактив, як, наприклад, 5'диметокситритил-2'-О-(е-фталімідиламінопентил)-2'дезоксіаденозин-3'-N, N-діізопропілціанетокси фосфорамідит. Див., наприклад, Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171. Ще в додаткових варіантах здійснення олігомери за винаходом можуть мати амін-вмісні функціональні групи в нуклеотиді, що включає пуринові аміногрупи в положенні N6, гуанін на екзоциклічному положенні N2 або цитозин на N4 або 5 положеннях. У різних варіантах здійснення така функціоналізація може бути досягнута при використанні комерційного реактиву, який вже функціоналізований в синтезі олігомеру. Деякі функціональні групи доступні комерційно, наприклад, гетеробіфункціональні і гомобіфункціональні зв'язуючі групи можна придбати у компанії Pierce Co. (Rockford, III.). Інші комерційно доступні зв'язуючі групи являють собою реактиви 5'-аміно-модифікатор C6 і 3'-аміномодифікатор, які продає корпорація Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Компанія ABI (Applied Biosystems Inc., Foster City, Каліфорнія) продає 5'-аміно-модифікатор C6 під маркою Aminolink-2, і 3'-аміно-модифікатор доступний в компанії Clontech Laboratories Inc (Palo Alto, Каліфорнія). Терапія і фармацевтичні композиції - рецептура і введення Згідно з вихідним поясненням, олігонуклеотиди за даним винаходом входять до складу придатних препаратів з поліпшеними властивостями. Конструювання ефективного і безпечного препарату вимагає точної регуляції різних параметрів, таких як афінність/специфічність, стійкість в біологічних рідинах, клітинне захоплення, механізм дії, фармакокінетичні властивості і токсичність. Відповідно, в додатковому аспекті даний винахід належить до фармацевтичної композиції, що містить олігонуклеотид за винаходом і фармацевтично прийнятний розріджувач, носій або ад'ювант. Переважно вказаний носій являє собою сольовий розчин або буферний сольовий розчин. У додатковому аспекті даний винахід належить до олігонуклеотиду за даним винаходом для застосування як лікарського засобу. Передбачається, що дозування залежить від ступеню тяжкості патологічного стану і його сприйнятливості до лікування, і курс лікування продовжується від декількох днів до декількох місяців, або до досягнення лікувального ефекту або зменшення симптомів хвороби. Оптимальні схеми введення дози можна розрахувати за вимірюванням накопичення препарату в організмі пацієнта. Оптимальні дози можуть варіювати в залежності від відносної потужності окремих олігонуклеотидів. Загалом, основою для оцінки дози можуть бути показники EC50 (середньої дози впливу, що викликає певний ефект в 50 %), при яких виявлений ефект в моделях тварин in vitro і in vivo. Загалом, доза складає від 0,01 мкг до 1 г на кг ваги тіла і може вводитися однократно або частіше щодня, щотижня, щомісяця або щорічно, або навіть однократно кожні 210 років, або шляхом постійного вливання протягом від декількох годин до декількох місяців. Частота повторного введення дози встановлюється на основі вимірювання часу знаходження і концентрацій препарату в рідинах або тканинах організму. Після успішного лікування може бути бажаним проведення підтримуючого лікування пацієнта з метою запобігання рецидиву хвороби. Як вказано вище, винахід також належить до фармацевтичної композиції, яка містить щонайменше один олігонуклеотид за винаходом як активний компонент. Розуміється, що фармацевтична композиція згідно з винаходом необов'язково містить фармацевтичний носій, і що фармацевтична композиція необов'язково містить додаткові сполуки, такі як хіміотерапевтичні сполуки, протизапальні сполуки, противірусні сполуки і/або імуномодулюючі сполуки. Олігонуклеотиди за винаходом можна використовувати "як є" або у вигляді ряду фармацевтично прийнятних солей. Термін "фармацевтично прийнятні солі", що використовується у винаході, належить до солей, які зберігають бажану біологічну дію вказаних у винаході олігонуклеотидів і виявляють мінімальні небажані токсичні ефекти. Такі солі, як необмежувальні приклади, можуть бути утворені з органічною амінокислотою, і адитивні солі основ утворюють з катіонами металів, такими як цинк, кальцій, вісмут, барій, магній, алюміній, мідь, кобальт, нікель, кадмій, натрій, калій і т.п., або з катіоном, утвореним амонієм, N, Nдибензилетилен-діаміном, D-глюкозаміном, тетраетиламонієм або етилендіаміном. В одному варіанті здійснення винаходу олігонуклеотид може знаходитися в формі проліків. Олігонуклеотиди внаслідок негативного заряду є іонами. Завдяки ліпофільній природі клітинної мембрани захоплення олігонуклеотидів клітиною зменшене в порівнянні з нейтральними або ліпофільними еквівалентами. Можна уникнути "перешкоди", зумовленої такою полярністю, 24 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 застосовуючи пролікарський підхід (див., наприклад, Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140). Фармацевтично прийнятні зв'язуючі агенти і ад'юванти можуть складати частину рецептури препарату. Приклади способів доставки для доставки терапевтичних агентів, описаних у винаході, а також подробиці фармацевтичних рецептур, солей, можуть бути добре описані в інших джерелах, наприклад, в попередніх заявках США №№ 60/838710 і 60/788995, які включені за допомогою посилання у винахід, і в датській заявці PA 200600615, яка також включена як посилання в даний винахід. Фармацевтичні композиції за даним винаходом включають без обмеження розчини, емульсії і рецептури, що містять ліпосоми. Ці композиції можна отримувати з ряду компонентів, які включають без обмеження підготовлені рідини, самоемульгувальні тверді речовини і самоемульгувальні напівтверді речовини. Доставку препарату в пухлинну тканину можна збільшити за допомогою носіїв-медіаторів доставки, які включають без обмеження катіоноактивні ліпосоми, циклодекстрини, похідних порфірину, дендримери з розгалуженим ланцюгом, полімери поліетиленіміну, наночастинки і мікросфери (Dass C.R. J Pharm. Pharmacol. 2002; 54(1):3-27). Фармацевтичні рецептури за даним винаходом, прийнятні для монолітної лікарської форми, можна виготовляти згідно зі звичайними способами, відомими в фармацевтичній промисловості. Такі способи включають етап з'єднання в асоціацію активних компонентів з фармацевтичним носієм (носіями) або наповнювачем (наповнювачами). Загалом, рецептури виготовляють шляхом однорідного і ретельного з'єднання в асоціацію активних компонентів з рідкими носіями або дрібнодисперсними твердими носіями або і з тими, і іншими, і потім, у разі необхідності, формування продукту. Рецептуру композицій за даним винаходом можна створювати у вигляді будь-якої з багатьох можливих лікарських форм, таких як таблетки, капсули, гелеві капсули, рідкі сиропи, м'які гелі і супозиторії, але не обмежуючись вищепереліченим. Композиції за даним винаходом також можуть створюватися у вигляді суспензій у водних, неводних або змішаних середовищах. Водні суспензії можуть додатково містити речовини, які підвищують в'язкість суспензії, включаючи, наприклад, натрію карбоксиметилцелюлозу, сорбіт і/або декстран. Суспензія може також містити стабілізатори. Сполуки за винаходом також можуть бути кон'юговані з діючою лікарською субстанцією, наприклад, з аспірином, ібупрофеном, сульфапрепаратом, протидіабетичним препаратом, антибактеріальним препаратом або антибіотиком. В іншому варіанті здійснення композиції за винаходом можуть містити одну або декілька олігонуклеотидних сполук, націлених на першу мікроРНК і одну або декілька додаткових олігонуклеотидних сполук, націлених на другу мікроРНК-мішень. Дві або більше об'єднані сполуки можна використовувати спільно або послідовно. Композиції, розкриті в даному винаході, є корисними в ряді терапевтичних застосувань, як вказано вище. Загалом, способи лікування за винаходом включають введення ссавцеві, зокрема, людині, терапевтично ефективної кількості олігонуклеотиду. У конкретному варіанті здійснення даний винахід належить до фармацевтичної композиції, що містить (a) одну або декілька сполук за винаходом, і (b) один або декілька хіміотерапевтических агентів. При використанні із сполуками за винаходом такі хіміотерапевтичні агенти можуть застосовуватися окремо, послідовно або в комбінації з одним або більше іншими вказаними хіміотерапевтичними агентами або в комбінації з променевою терапією. Всі хіміотерапевтичні агенти, відомі фахівцям в даній галузі техніки, включені у винахід як комбіноване лікування разом із сполукою згідно з винаходом. Також в композиціях за винаходом можна об'єднувати інші активні речовини, такі як протизапальні препарати, що включають без обмеження нестероїдні протизапальні препарати і кортикостероїди, противірусні препарати і імуномодулюючі препарати. Дві або декілька комбіновані сполуки можуть застосовуватися спільно або послідовно. Приклади медичного свідчення, для лікування яких можна застосовувати фармацевтичні композиції за винаходом: 25 UA 102529 C2 мікроРНК miR-1 miR-21 miR-21, miR-200b i miR-141 miR-122 miR-19b miR-26a 5 10 15 20 25 30 35 Можливі медичні показання серцева аритмія гліобластома, рак молочної залози, гепатоцелюлярна карцинома, рак ободової і прямої кишки, сенсибілізація до цитотоксичних препаратів при гліомах, гіпертрофія серця чутливість до хіміотерапії та регуляції росту холангіокарциноми гіперхолестеринемія, інфекція гепатиту С, гемохроматоз лімфома та інші види пухлин остеобластне диференціювання людських стовбурових клітин лімфома, ріст пухлини підшлункової залози, рак молочної залози і рак miR-155 легені miR-203 псоріаз діабет, хвороби обміну речовин, глюкозоиндукована секреція інсуліну miR-375 ендокринними клітинами підшлункової залози miR-181 міобластне диференціювання, аутоімунні хвороби miR-10b інвазія клітин раку молочної залози і метастазування miR-125b-1 рак молочної залози, рак легені і рак шийки матки карцинома простати, папілярний рак щитовидної залози людини, miR-221 i 222 гепатоцелюлярна карцинома людини miPHK-372 i-373 пухлини з тестикулярних зародкових клітин miR-142 В-клітинний лейкоз кластер miR-17-19b В-клітинні лімфоми, рак легені, гепатоцелюлярна карцинома Було встановлено, що ген пухлинної супресії тропомізин 1 (TPM1) мРНК є мішенню для miR21. Встановлено, що міотрофін (mtpn) мРНК є мішенню для miR 375. Ще в одному додатковому аспекті даний винахід належить до застосування олігонуклеотиду за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування хвороби, вибраної з групи, що складається з наступних захворювань: атеросклероз, гіперхолестеринемія і гіперліпідемія; рак, гліобластома, рак молочної залози, лімфома, рак легені; діабет, порушення обміну речовин; міобластне диференціювання; імунні порушення. Винахід додатково належить до олігонуклеотидів за винаходом для використання в лікуванні хвороби, вибраної з групи, яка складається з наступного: атеросклероз, гіперхолестеринемія і гіперліпідемія; рак, гліобластома, рак молочної залози, лімфома, рак легені; діабет, порушення обміну речовин; міобластне диференціювання; імунні порушення. Винахід належить до способу лікування суб'єкта, що страждає на захворювання або стан, вибраний з наступної групи: атеросклероз, гіперхолестеринемія і гіперліпідемія; рак, гліобластома, рак молочної залози, лімфома, рак легені; діабет, порушення обміну речовин; міобластне диференціювання; імунні порушення, при цьому спосіб включає стадію введення олігонуклеотиду або фармацевтичної композиції за винаходом потребуючому цього суб'єкту. Винахід додатково належить до набору, що містить фармацевтичну композицію згідно з винаходом і другий незалежний активний компонент, що являє собою інгібітор шляху збірки VLDL, такий як інгібітор ApoB, або інгібітор MTP. Рак Ще в одному додатковому аспекті даний винахід належить до застосування олігонуклеотиду за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування раку. В іншому аспекті даний винахід стосується способу лікування або профілактики раку, і вказаний спосіб включає введення олігонуклеотиду за винаходом або фармацевтичної композиції за винаходом пацієнту, який потребує такого введення. Вказані ракові захворювання можуть включати лімфоретикулярну неоплазію, лімфобластний лейкоз, пухлини головного мозку, пухлини шлунку, плазмоцитоми, множинну мієлому, лейкоз, пухлини сполучної тканини, лімфоми і солідні пухлини. Відносно застосування сполуки за винаходом у виготовленні ліків для лікування раку, вона може бути призначена для такої форми вказаного раку як солідна пухлина. Аналогічно, розкритий у винаході спосіб лікування раку може бути призначений для такої форми вказаного раку як солідна пухлина. Крім того, вказаний рак також належить до карциноми. Карциному зазвичай вибирають з групи, що складається із злоякісної меланоми, базальноклітинної карциноми, карциноми яєчника, карциноми молочної залози, недрібноклітинного раку легені, карциноми ниркоподібних клітин, карциноми сечового міхура, рецидивуючого поверхневого раку сечового міхура, 26 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 карциноми шлунку, карциноми передстатевої залози, карциноми підшлункової залози, карциноми легені, цервікальної карциноми, цервікальної дисплазії, папіломатозу гортані, карциноми ободової кишки, карциноми ободової і прямої кишки і карциноїдних пухлин. Частіше вказану карциному вибирають з групи, що складається із злоякісної меланоми, недрібноклітинного раку легені, карциноми молочної залози, карциноми ободової кишки і карциноми ниркоподібних клітин. Злоякісну меланому зазвичай вибирають з групи, що складається з поверхневої поширеної меланоми, вузлової меланоми, меланоми lentigo maligna, акральної меланоми, амеланотичної меланоми і десмопластичної меланоми. Альтернативно вказаний рак може належати до саркоми. Форму саркоми вибирають з групи, що складається з остеосаркоми, саркоми Евінга, хондросаркоми, злоякісної фіброзної гістіоцитоми, фібросаркоми і саркоми Капоші. Альтернативно рак відповідно може являти собою гліому. Додатковий варіант здійснення направлений на застосування олігонуклеотиду згідно з винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування раку, при цьому вказаний лікарський засіб додатково містить хіміотерапевтичний агент, вибираний з групи, що складається з наступних агентів: адренокортикостероїди, такі як преднізон, дексаметазон або декадрон; алтретамін (гексален, гексаметилмеламін (HMM)); аміфостин (етіол); аміноглутетімід (цитадрен); амсакрин (М-AMSA); анастрозол (арімідекс); андрогени, такі як тестостерон; аспарагіназа (елспар); бацила Кальметта-Герена; бікалутамід (касодекс); блеоміцин (бленоксан); бусульфан (мілеран); карбоплатин (параплатин); кармустин (BCNU, BiCNU); хлорамбуцил (лейкеран); хлордезоксіаденозин (2-CDA, кладрибін, лейстатин); цисплатин (платинол); цитозин арабінозид (цитарабін); дакарбазин (DTIC); дактиноміцин (актиноміцин-D, космеген); даунорубіцин (церубідин); доцетаксел (таксотер); доксорубіцин (адріоміцин); епірубіцин; естрамустин (емцит); естрогени, такі як діетилстилбестрол (DES); етопозид (VP-16, вепезид, етопофос); флударабін (флудара); флутамід (еулексин); 5-FUDR (флоксуридин); 5фторурацил (5-FU); гемцитабін (гемзар); госерелін (зодалекс); герцептин (трастузумаб); гідроксисечовина (гідреа); ідарубіцин (ідаміцин); іфосфамід; інтерлейкін ІЛ-2 (пролейкін, алдеслейкін); інтерферон альфа (інтрон А, роферон А); іринотекан (камптосар); леупролід (лупрон); левамізол (ергамізол); ломустин (CCNU); мехлоратамін (мустарген, хлорметин); мелфалан (алкеран); меркаптопурин (пуринетол, 6-MP); метотрексат (мексат); мітоміцин-С (мутамуцин); мітоксантрон (новантрон); октреотид (сандостатин); пентостатин (2дезоксикоформіцин, ніпент); плікаміцин (мітраміцин, мітрацин); прокарбазин (матулан); стрептозоцин; тамоксифін (нолвадекс); таксол (паклітаксел); теніпозид (вумон, VM-26); тіотепа; топотекан (хікамтин); третиноїн (весаноїд, ол-транс ретинойна кислота); вінбластин (валбан); вінкристин (онковін) і вінорелбін (навелбін). Придатним є вибір додаткового хіміотерапевтичного агента з групи таксанів, наприклад, Таксолу, Паклітакселу або Доцетакселу. Також винахід додатково належить до застосування олігонуклеотиду за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування раку, при цьому вказане лікування додатково включає введення додаткового хіміотерапевтичного агента, що вибирається з групи, яка складається з наступних агентів: адренокортикостероїди, такі як преднізон, дексаметазон або декадрон; алтретамін (гексален, гексаметилмеламін (HMM)); аміфостин (етіол); аміноглутетімід (цитадрен); амсакрин (М-AMSA); анастрозол (арімідекс); андрогени, такі як тестостерон; аспарагіназа (елспар); бацила Кальметта-Герена; бікалутамід (касодекс); блеоміцин (бленоксан); бусульфан (мілеран); карбоплатин (параплатин); кармустин (BCNU, BiCNU); хлорамбуцил (лейкеран); хлордезоксіаденозин (2-CDA, кладрибін, лейстатин); цисплатин (платинол); цитозин арабінозид (цитарабін); дакарбазин (DTIC); дактиноміцин (актиноміцин-D, космеген); даунорубіцин (церубідин); доцетаксел (таксотер); доксорубіцин (адріоміцин); епірубіцин; естрамустин (емцит); естрогени, такі як діетилстилбестрол (DES); етопозид (VP-16, вепезид, етопофос); флударабін (флудара); флутамід (еулексин); 5-FUDR (флоксуридин); 5фторурацил (5-FU); гемцитабін (гемзар); госерелін (зодалекс); герцептин (трастузумаб); гідроксисечовина (гідреа); ідарубіцин (ідаміцин); іфосфамід; інтерлейкін ІЛ-2 (пролейкін, алдеслейкін); інтерферон альфа (інтрон А, роферон А); іринотекан (камптосар); леупролід (лупрон); левамізол (ергамізол); ломустин (CCNU); мехлоратамін (мустарген, хлорметин); мелфалан (алкеран); меркаптопурин (пуринетол, 6-MP); метотрексат (мексат); мітоміцин-С (мутамуцин); мітоксантрон (новантрон); октреотид (сандостатин); пентостатин (2дезоксикоформіцин, ніпент); плікаміцин (мітраміцин, мітрацин); прокарбазин (матулан); стрептозоцин; тамоксифін (нолвадекс); таксол (паклітаксел); теніпозид (вумон, VM-26); тіотепа; топотекан (хикамтин); третиноїн (весаноїд, ол-транс ретинойна кислота); вінбластин (валбан); вінкристин (онковін) і вінорелбін (навелбін). Придатним при вказаному лікуванні є додаткове 27 UA 102529 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 введення додаткового хіміотерапевтичного агента, що вибирається з групи таксанів, наприклад, Таксолу, Паклітакселу або Доцетакселу. З іншого боку, мета даного винаходу, крім того, належить до способу лікування раку, що включає введення олігонуклеотиду за винаходом або фармацевтичної композиції за винаходом пацієнту, який потребує такого введення, і додатково що включає введення додаткового хіміотерапевтичного агента. Вказане додаткове введення можна здійснювати, наприклад, з додатковим хіміотерапевтичним агентом, кон'югованим із сполукою за винаходом, присутньою в фармацевтичній композиції, або з її введенням в окремій рецептурі. Інфекційні захворювання Встановлено, що сполуки за винаходом можна широко застосовувати при широкому діапазоні інфекційних захворювань, таких як дифтерія, правець, коклюш, поліомієліт, гепатит В, гепатит С, гемофільний грип, кір, свинка і краснуха. При інфекції гепатиту С виявляють Hsa-miR122, і таким чином олігонуклеотиди згідно з винаходом, мішенню для яких є miR-122, можна використовувати для лікування гепатиту С. Відповідно, ще в одному аспекті даний винахід належить до застосування олігонуклеотиду згідно з винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування інфекційного захворювання, а також до способу лікування інфекційного захворювання, при цьому вказаний спосіб включає введення олігонуклеотиду за винаходом або фармацевтичної композиції за винаходом пацієнту, який потребує такого введення. У переважному варіанті здійснення винахід належить до комбінованого лікування з використанням олігомеру анти-miR-122 в комбінації з інгібітором збирання VLDL, таким як інгібітор АpoB або MTP. Запальні захворювання Важливим механізмом захисту організму проти атаки збудників інфекцій є запальна реакція, яка також залучена в патогенез багатьох гострих і хронічних захворювань, що включає в себе аутоімунні порушення. Запальна відповідь повинна боротися з патогенами, але, незважаючи на це, її ефекти можуть бути такими, що руйнують. У зв'язку з цим часто необхідно обмежити симптоматологію запалення шляхом застосування протизапальних препаратів. Запалення являє собою комплексний процес, що зазвичай запускається пошкодженням тканин, яке включає активацію великої різноманітності ферментів, підвищення проникності судин і транссудацію рідин крові, клітинну міграцію і вивільнення хімічних медіаторів, і метою всіх вказаних механізмів є і руйнування і відновлення пошкодженої тканини. Ще в одному аспекті даний винахід належить до застосування олігонуклеотиду згідно з винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування запального захворювання, а також до способу лікування запального захворювання, при цьому вказаний спосіб включає введення олігонуклеотиду згідно з винаходом або фармацевтичною композицією згідно з винаходом потребуючому цього пацієнту. В одному переважному варіанті здійснення винаходу запальне захворювання являє собою ревматичну хворобу і/або хвороби сполучної тканини, такі як ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак (СЧВ) або вовчак, склеродерма, поліміозит, запальна хвороба кишечнику, дерматоміозит, виразковий коліт, хвороба Кроні, васкуліт, псоріатичний артрит, ексфоліативний псоріатичний дерматит, вульгарний пемфігус і синдром Шегрена, зокрема, запальну хворобу кишечнику і хворобу Кроні. Альтернативно запальне захворювання може бути неревматичним запаленням, являючи собою, наприклад, бурсит, синовіт, капсуліт, тендиніт і/або інші запальні пошкодження травматичного і/або спортивного походження. Порушення обміну речовин Порушення обміну речовин являє собою патологію, яка викликається накопиченням хімічних продуктів, що виробляються організмом. Ці захворювання зазвичай є важкими, деякі з них навіть представляють небезпеку для життя. Інші можуть сповільнювати фізичний розвиток або викликати затримку розумового розвитку. У більшості новонароджених з такою патологією спочатку не виявляються очевидні ознаки захворювання. Належне скринінгове обстеження при народженні може часто виявити такі проблеми. При ранній діагностиці і лікуванні порушення обміну речовин можуть часто ефективно контролюватися. Ще в одному аспекті даний винахід належить до застосування олігонуклеотиду згідно з винаходом або його кон'югату для виробництва лікарського засобу для лікування порушення обміну речовин, а також до способу лікування порушення обміну речовин, при це вказаний спосіб включає введення олігонуклеотиду згідно з винаходом або його кон'югату, або фармацевтичної композиції згідно з винаходом пацієнту, який потребує такого введення. 28

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Microribonucleic acids

Автори англійською

Obad, Susanna, Kauppinen, Sakari, Elmen, Joacim, Lindow, Morten, Heidenblad, Mareus

Назва патенту російською

Микрорибонуклеиновые кислоты

Автори російською

Обад Сусанна, Кауппинен Сакари, Элмен Йоаким, Линдов Мортен, Хейденблад Маркус

МПК / Мітки

МПК: A61K 31/712, C12N 15/11, A61K 31/7115, A61K 31/7105

Мітки: мікрорибонуклеїнові, кислоти

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/246-102529-mikroribonuklenovi-kisloti.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Мікрорибонуклеїнові кислоти</a>

Подібні патенти