Застосування (rs)-s-цикропропіл-s-(4-{[4-{[(1r,2r)-2-гідрокси-1-метилпропіл]окси}-5-(трифторметил)піримідин-2-іл]аміно}феніл)сульфоксіміду для лікування пухлин

Реферат: Винахід стосується застосування (RS)-S-циклопропіл-S-(4-{[4-{[(1R,2R)-2-гiдрокси-1метилпропіл]окси}-5-(трифторметил)піримідин-2-іл]аміно}феніл)сульфоксіміду для лікування пухлин. UA 108494 C2 (12) UA 108494 C2 UA 108494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Представлений винахід стосується застосування нових загальних інгібіторів CDK для лікування пухлин. Нові загальні інгібітори CDK вибирають з похідних сульфоксiмін-заміщених анілінопіримідинів. Нові загальні інгібітори CDK та способи їх одержання описані в заявці PCT PCT/EP2009/007247, на розкриття винаходу якої посилаються в представленій заявці, та яка включена до даної заявки як посилання. Циклін-залежні кінази (CDK) є родиною ферментів, що відіграють важливу роль в регулюванні клітинного циклу, та внаслідок цього вони є особливо цікавою мішенню для створення малих молекул інгібітору. Селективні інгібітори CDK можуть застосовуватися для лікування раку або інших розладів, що викликані порушенням проліферації клітин. Піримідини та аналоги, описані як активні сполуки, наприклад, 2-анілінопіримідини, як фунгіциди (DE 4029650), або заміщені похідні піримідинів для лікування неврологічних або нейродегенеративних розладів (WO 99/19305). Надзвичайно різноманітні похідні піримідину, наприклад, 2-аміно-4-заміщені піримідини (WO 01/14375), пурини (WO 99/02162), 5ціанопіримідини (WO 02/04429), анілінопіримідини (WO 00/12486) та 2-гідрокси-3-N, Nдиметиламінопропоксипіримідини (WO 00/39101) описані як CDK інгібітори. WO 02/096888 та WO 03/076437 зокрема розкривають похідні піримідину, що демонструють інгібіторну дію по відношенню до CDK. Сполуки, що містять фенілсульфонамідну групу, є відомими як інгібітори карбоангідраз людини (зокрема, карбоангідрази-2), та застосовуються як діуретики, серед іншого для лікування глаукоми. Атом азоту та атоми кисню сульфонаміду зв'язуються через водневі зв'язки 2+ з іоном цинку та амінокислотою Thr 199 в активному центрі карбоангідрази-2 та, таким чином, блокують її ферментну функцію (A. Casini, F. Abbate, A. Scozzafava, C.T. Supuran, Bioorganic. Med. Chem. Lett. 2003, 1, 2759). Клінічне застосування інгібіторів CDK, що містять фенілсульфонамідну групу, могло б бути обмеженим внаслідок можливого інгібування карбоангідраз та результуючого цілого спектру побічних ефектів. Прикладами активних сульфоксімінових сполук є сульфонімідоїл-модифіковані триазоли, як фунгіциди (H. Kawanishi, H. Morimoto, T. Nakano, T. Watanabe, K. Oda, K. Tsujihara, Heterocycles 1998, 49, 181), або арилалкілсульфоксіміни як гербіциди та пестициди (Shell International Research, Ger. P. 2 129 678). WO 2005/037800 розкриває розімкнені похідні сульфоксімін-заміщеного анілінопіримідину як інгібітори циклін-залежних кіназ. Наданими прикладами є структури, які, в 5-положенні піримідину заміщені або незаміщені галогеном, а саме бромом. Жодна з конкретних розкритих структур не мала 5-трифторметильного замісника. Виходячи з попереднього рівня техніки, ціллю даного винаходу є сполук, які б не тільки сильно інгібувати CDK, але й також ефективно інгібувати ріст пухлини. Сильне інгібування CDK є необхідною, але недостатньою попередньою умовою для ефективного інгібування пухлини. Ефективне інгібування пухлини вимагає додаткових властивостей від структур, наприклад здатності проникати в клітину пухлини. На даний момент знайдено, що сполуки загальної формули (I) O NH S R 4 HN N R N 1 (I), OH X R F 2 R 3 F F 45 в якій X є –O– або –NH–, та 1 R є метильною, етильною, пропільною або ізопропільною групою, та 2 3 R та R незалежно один від одного є воднем, метильною або етильною групою, та 1 UA 108494 C2 4 R є C1-C6-алкільною групою або C3-C7-циклоалкільним кільцем, або їх фізіологічно прийнятні солі, діастереомери та енантіомери, не тільки сильно інгібують CDK, але й також особливо ефективно інгібують ріст пухлини. Сполуки, в яких X представляє собою –O–, підсумовані формулою (Ia). 5 O NH S R 4 HN N R N 1 (Ia), OH O R F 2 R 3 F F Сполуки, в яких X представляє собою –NH– підсумовані формулою (Ib). O NH S R 4 HN N R N 1 (Ib), OH N H F 10 15 20 25 30 35 R 2 R 3 F F Заявка ґрунтується на наступних визначеннях: C1-C6-алкіл C1-C6-алкільну групу визначають в кожному випадку як лінійний ланцюговий або розгалужений ланцюговий радикал, такий як, наприклад, метильний, етильний, пропільний, ізопропільний, бутильний, ізобутильний, втор-бутильний, трет-бутильний, пентильний, ізопентильний або гексильний радикал. C3-C7-циклоалкіл C3-C7-циклоалкільне кільце визначають як циклопропільне, циклобутильне, циклопентильне, циклогексильне або циклогептильне кільце. В загальній формулі (I), X може представляти собою –O– або –NH–. Переважно, X представляє собою –O–. 1 В загальній формулі (I), R може представляти собою метильну, етильну, пропільну або ізопропільну групу. 1 Переважно, R представляє собою метильну групу. 2 3 В загальній формулі (I), R та R незалежно один від одного можуть представляти собою водень, метильну або етильну групу. 2 3 Переважно, R та R незалежно один від одного є воднем або метильною групою. 2 3 Особливо переважно, R представляє собою метильну групу та R представляє собою водень або метильну групу. 4 В загальній формулі (I) R представляє собою C1-C6-алкільний радикал або C3-C7циклоалкільне кільце. 4 Переважно, R представляє собою метильну або етильну групу або представляє собою циклопропільне кільце. Переважною підгрупою сполук відповідно до загальної формули (I) є сполуки, в яких 2 UA 108494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 X представляє собою –O– або –NH–, та 1 R представляє собою метильну групу, та 2 R представляє собою метильну групу, та 3 R представляє собою водень або метильну групу, та 4 R представляє собою метильну або етильну групу або представляє собою циклопропільне кільце, та їх фізіологічно прийнятні солі, діастереомери та енантіомери. Найбільша перевага надається застосуванню відповідно до винаходу наступних індивідуальних сполук та їх енантіомерів, діастереомерів та фізіологічно прийнятних солей: (RS)-S-циклопропіл-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-гідрокси-1-метилпропіл]окси}-5(трифторметил)піримідин-2-іл]аміно}феніл)сульфоксіміду, (RS)-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-гідрокси-1-метилпропіл]окси}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)-S-метилсульфоксіміду, (RS)-S-(4-{[4-{[(R)-2-гідрокси-1,2-диметилпропіл]окси}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)-S-метилсульфоксіміду, (RS)-S-циклопропіл-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-гідрокси-1-метилпропіл]аміно}-5(трифторметил)піримідин-2-іл]аміно}феніл)сульфоксіміду, (RS)-S-циклопропіл-S-(4-{[4-{[(R)-2-гідрокси-1,2-диметилпропіл]аміно}-5(трифторметил)піримідин-2-іл]аміно}феніл)сульфоксіміду, - (RS)-S-етил-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-гідрокси-1-метилпропіл]аміно}-5-(трифторметил)піримідин2-іл]аміно}феніл)сульфоксіміду, - (RS)-S-етил-S-(4-{[4-{[(R)-2-гідрокси-1,2-диметилпропіл]аміно}-5-(трифторметил)піримідин2-іл]аміно}феніл)сульфоксіміду, (RS)-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-гідрокси-1-метилпропіл]аміно}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)-S-метилсульфоксіміду, (RS)-S-(4-{[4-{[(1R)-2-гідрокси-1,2-диметилпропіл]аміно}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)-S-метилсульфоксіміду. Представлений винахід також охоплює застосування фізіологічно прийнятних солей сполук. Фізіологічно прийнятні солі сполук відповідно до винаходу включають кислотні адитивні солі мінеральних кислот, карбонових кислот та сульфонових кислот, наприклад солі хлористоводневої кислоти, бромисто-водневої кислоти, сірчаної кислоти, фосфорної кислоти, метансульфонової кислоти, етансульфонової кислоти, толуолсульфонової кислоти, бензолсульфонової кислоти, нафталіндисульфонової кислоти, оцтової кислоти, трифтороцтової кислоти, пропіонової кислоти, молочної кислоти, винної кислоти, яблучної кислоти, лимонної кислоти, фумарової кислоти, малеїнової кислоти та бензойної кислоти. Фізіологічно прийнятні солі сполук відповідно до винаходу також включають солі загальноприйнятних основ, таких як, у вигляді прикладу та переважно, солі лужних металів (наприклад, солі натрію та калію), солі лужноземельних металів (наприклад, солі кальцію та магнію) та солі амонію, одержані з аміаку або органічних амінів, що містять від 1 до 16 C атомів, такі як, у вигляді прикладу та переважно, етиламін, діетиламін, триетиламін, етилдіізопропіламін, моноетаноламін, діетаноламін, триетаноламін, дициклогексиламін, диметиламіноетанол, прокаїн, дибензиламін, N-метилморфолін, аргінін, лізин, етилендіамін та N-метилпіперидин. Представлений винахід, крім того, передбачає лікарські засоби, що містять щонайменше одну сполуку відповідно до винаходу та щонайменше одну або більше додаткових активних сполук, а саме для лікування та/або профілактики пухлинних порушень. Сполуки відповідно до винаходу можуть діяти системно та/або місцево. Для цього їх можна вводити прийнятним способом, таким як, наприклад, пероральним, парентеральним, легеневим, назальним, сублінгвальним, лінгвальним, буккальним, ректальним, дермальним, трансдермальним, кон'юктивальним, у вухо, або як імплант, або як стент. Для вказаних шляхів ведення, сполуки відповідно до винаходу можна вводити в прийнятних формах для введення. Прийнятними для перорального введення є форми введення, що функціонують відповідно до відомого рівня техніки, які швидко вивільняють сполуки відповідно до винаходу, та/або в модифікованій формі, та містять сполуки відповідно до винаходу в кристалічній та/або аморфній, та/або розчиненій формі, такі як, наприклад, таблетки (непокриті або покриті таблетки, наприклад, покриті кишково, повільно розчинними або нерозчинними покриттями, які контролюють вивільнення сполуки відповідно до винаходу), таблетки, які швидко розпадаються в ротовій порожнині або плівки/пастилки, плівки/ліофілізати, капсули (наприклад, тверді 3 UA 108494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 желатинові капсули або м'які желатинові капсули), покриті цукром таблетки, гранули, пеллети, порошки, емульсії, суспензії, аерозолі або розчини. Парентеральне введення можуть проводити в обхід стадії абсорбції (наприклад, внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, внутрішньосерцеве, інтраспінальне або інтралюмбальне) або із залученням абсорбції (наприклад, внутрішньом'язове, підшкірне, внутрішньошкірне, черезшкірне або внутрішньобрюшинне). Для парентерального введення, прийнятними формами введення є, серед інших, ін'єкційні та інфузійні препарати в формі розчинів, суспензій, емульсій, ліофілізатів або стерильних порошків. Іншими прийнятними шляхами введення є, наприклад, фармацевтичні форми для інгаляції (в числі інших, порошкові інгалятори, розпилювачі), назальні краплі, назальні розчини, назальні спреї; таблетки, плівки/пастилки або капсули, що застосовують лінгвально, сублінгвально або буккально, супозиторії, очні або вушні препарати, вагінальні капсули, водні суспензії (лосьйони, примочки), ліпофільні суспензії, мазі, креми, трансдермальні терапевтичні системи (такі як, наприклад, пластирі), молочко, пасти, піни, опудрюючі засоби, імпланти або стенти. Сполуки відповідно до винаходу можуть бути перетворені в згадані форми для введення. Це може проводитись за відомим способом безпосередньо шляхом змішування з інертними нетоксичними, фармацевтично прийнятними допоміжними речовинами. Дані допоміжні речовини включають, в числі інших, носії (наприклад, мікрокристалічну целюлозу, лактозу, маніт), розчинники (наприклад, рідкі поліетиленгліколі), емульгатори та диспергуючі або зволожуючі агенти (наприклад, натрію додецилсульфат, поліоксисорбітану олеат), зв'язуючі речовини (наприклад, полівінілпіролідон), синтетичні та природні полімери (наприклад, альбумін), стабілізатори (наприклад, антиоксиданти, такі як, наприклад, аскорбінова кислота), барвники (наприклад, неорганічні пігменти, такі як, наприклад, оксиди заліза) та речовини, що корегують смак та аромат. Представлений винахід, крім того, передбачає лікарські засоби, що містять щонайменше одну сполуку відповідно до винаходу, зазвичай разом з одним або більше інертними, нетоксичними, фармацевтично прийнятними допоміжними речовинами, та їх застосування з метою, згаданою вище. Формуляцію сполуки відповідно до винаходу, з метою одержання фармацевтичних продуктів, проводять, за відомим способом, безпосередньо шляхом переведення активної(их) сполуки(сполук) зі звичайними у фармацевтичній технології наповнювачами в бажану форму введення. Допоміжними речовинами, які можуть застосовувати в даному контексті, є, наприклад, речовини-носії, наповнювачі, розпушувачі, зв'язуючі речовини, гігроскопічні речовини, змащувальні речовини, абсорбенти та адсорбенти, розріджувачі, розчинники, співрозчинники, емульгатори, солюбілізатори, маскуючі запах речовини, барвники, консерванти, стабілізатори, зволожуючі агенти, солі для зміни осмотичного тиску або буфери. В даному контексті посилання могло бути зроблене на Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylvania (1980). Фармацевтичні препарати можуть бути: в твердій формі, наприклад як таблетки, покриті таблетки, драже, супозиторії, капсули, трансдермальні системи або в м'якій формі, наприклад як мазі, креми, гелі, супозиторії, емульсії або в рідкій формі, наприклад як розчини, настойки, суспензії або емульсії. Допоміжні речовини в контексті винаходу можуть бути, наприклад, солі, сахариди (моно-, ди, три-, оліго- та/або полісахариди), протеїни, амінокислоти, пептиди, жири, воски, олії, вуглеводи та їх похідні, де допоміжні речовини можуть бути природного походження або можуть бути одержані шляхом синтезу або часткового синтезу. Прийнятними для орального та перорального введення є, зокрема, таблетки, покриті таблетки, капсули, драже, порошки, гранули, пастили, суспензії, емульсії або розчини. Прийнятними для парентерального введення є, зокрема, суспензії, емульсії та особливо розчини. Представлений винахід стосується застосування сполук формули (I) для профілактики та лікування пухлинних розладів. Сполуки формули (I) можуть застосовувати, зокрема, для інгібування або зменшення клітинної проліферації та/або ділення клітин та/або для індукування апоптозу. Сполуки відповідно до винаходу є прийнятними, зокрема, для лікування гіперпроліферативних розладів, таких як, наприклад, - псоріаз, - келоїди та інші шкірні гіперплазії, 4 UA 108494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - доброякісна гіперплазія простати (BPH), - солідні (тверді) пухлини та - гематологічні пухлини. Солідні пухлини, які можуть лікуватися відповідно до винаходу, є, наприклад, пухлинами молочної залози, дихальних шляхів, мозку, репродуктивних органів, шлунково-кишкового тракту, сечостатевого тракту, ока, печінки, шкіри, голови та шиї, щитоподібної залози, паращитоподібної залози, кісток та сполучної тканини, та метастазами даних пухлин. Гематологічні пухлини, які можуть лікуватися відповідно до винаходу, є, наприклад, множинними мієломами, лімфомами або лейкеміями. Пухлини молочної залози, які можуть лікуватися, є, наприклад: - карциномами молочної залози з позитивним статусом гормональних рецепторів - карциномами молочної залози з негативним статусом гормональних рецепторів - Her-2 позитивними карциномами молочної залози - карциномами гормональних рецепторів та Her-2 негативними карциномами молочної залози - BRCA–асоційованими карциномами молочної залози - запальними карциномами молочної залози. Пухлини дихальних шляхів, які можуть лікуватися, є, наприклад, - недрібноклітинними карциномами бронхів та - дрібноклітинними карциномами бронхів. Пухлини мозку, які можуть лікуватися, є, наприклад, - гліомами, - гліобластомами, - астроцитомами, - менінгомами та - медуллобластомами. Пухлини чоловічих репродуктивних органів, які можуть лікуватися, є, наприклад: - карциномами простати, - злоякісними тестикулярними пухлинами та - карциномами пенісу. Пухлини жіночих репродуктивних органів, які можуть лікуватися, є, наприклад: - внутрішньоматочними карциномами карциноми - карциномами шийки матки - карциномами яєчника - вагінальними карциномами - карциномами зовнішніх статевих органів. Пухлини шлунково-кишкового тракту, які можуть лікуватися, є, наприклад: - колоноректальними карциномами - анальними карциномами - карциномами шлунку - карциномами підшлункової залози - карциномами стравоходу - карциномами жовчного міхура - карциномами тонкої кишки - карциномами слинних залоз - нейроендокрійними пухлинами - шлунково-кишковими стромальними пухлинами. Пухлини сечостатевого тракту, які можуть лікуватися, є, наприклад: - карциномами сечового міхура - нирковоклітинними карциномами - карциномами ниркової миски та нижнього сечового тракту Пухлини ока, які можуть лікуватися, є, наприклад: - ретинобластомами - внутрішньоочними меланомами. Пухлини печінки, які можуть лікуватися, є, наприклад: - гепатоклітинними карциномами - холангіоцеллюлярними карциномами. Пухлини шкіри, які можуть лікуватися, є, наприклад: - злоякісними меланомами - базаліомами 5 UA 108494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - спіналіомами - саркомами Капоши - карциномами клітин Меркеля Пухлини голови та шиї, які можуть лікуватися, є, наприклад: - карциномами гортані - карциномами гортані та ротової порожнини. Саркоми, які можуть лікуватися, є, наприклад: - саркомами м'яких тканин - остеосаркомами. Лімфоми, які можуть лікуватися, є, наприклад: - неходжкінськими лімфомами - Ходжкінськими лімфомами - шкірними лімфомами - лімфомами клітин тканини - лімфомами центральної нервової системи - лімфомами, пов'язаними зі СНІДом. Лейкемії, які можуть лікуватися, є, наприклад: - гострими мієлоїдними лейкеміями - хронічними мієлоїдними лейкеміями - гострими лімфатичними лейкеміями - хронічними лімфатичними лейкеміями - волосатоклітинними лейкозами. Переважно, сполуки формули (I) можуть застосовувати для лікування карцином молочної залози, зокрема, карцином молочної залози з негативним статусом гормонального рецептору, з позитивним статусом гормонального рецептору або BRCA–асоційованих карцином молочної залози, та, крім того, карцином підшлункової залози, нирковоклітинних карцином, злоякісних меланом та інших пухлин шкіри, дрібноклітинних карцином бронхів, недрібноклітинних бронхіальних карцином, колоректальних карцином, карцином яєчника, карцином шийки матки, карцином простати, лейкемій або лімфом. Особливо переважно, сполуки формули (I) можуть застосовувати для лікування карцином, зокрема естроген рецептор-негативних карцином молочної залози, карцином яєчника, включаючи, зокрема, цисплатин-резистентні карциноми яєчника, колоректальних карцином, дрібноклітинних карцином бронхів або карцином шийки матки, включаючи зокрема мультирезистентні карциноми шийки матки. Дані розлади є добре охарактеризованими у людей, однак, крім того, існують в інших ссавців. Винахід передбачає застосування сполук загальної формули (I) відповідно до винаходу, як лікарських засобів для лікування пухлин. Крім того, винахід передбачає застосування сполук загальної формули (I) відповідно до винаходу для виготовлення лікарських засобів для лікування пухлин. Крім того, винахід передбачає застосування сполук відповідно до винаходу для лікування розладів, пов'язаних з проліферативними процесами. Сполуки відповідно до винаходу можна застосовувати самостійно або, якщо необхідно, в комбінації з одним або більше іншими фармацевтично активними речовинами, за умови, що дана комбінація не призводить до небажаних та неприйнятних побічних ефектів. Таким чином, представлений винахід, крім того, передбачає лікарські засоби, що містять, щонайменше одну зі сполук відповідно до винаходу та одну або більше додаткових активних сполук, зокрема для лікування та/або попередження вищезгаданих захворювань. Наприклад, сполуки за представленим винаходом можуть бути комбінованими з відомими антигіперпроліферативними, цитостатичними або цитотоксичними речовинами для лікування ракових захворювань. Зокрема можна зазначити, комбінації сполук відповідно до винаходу з іншими речовинами традиційними для лікування раку або також з радіотерапією. Прийнятними активними сполуками для комбінацій, які можуть бути зазначеними як приклад, є: абраксан, афінітор, альдеслейкін, алендронова кислота, альфаферон, алітретіонін, алопуринол, алопрім, алоксі, альтретамін, аміноглютетимід, аміфостин, амрубіцин, амсакрін анастрозол, анзмет, аранесп, арглабін, триоксид миш'яку, аромазин, 5-азацитидин, азатіоприн, BCG або тайс-BCG, бестатін, бетаметазону ацетат, бетаметазону фосфат натрію, бексаротен, блеоміцину сульфат, броксурідин, бортезоміб, бусульфан, кальцитонін, кампат, капецитабін, карбоплатин, касодекс, цефекон, целмолейкін, церубідин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибін, 6 UA 108494 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клодронова кислоти, циклофосфамід, цитарабін, дакарбазин, дактіноміцин, дауноксом, декадрон, декадрону фосфат, делестроген, денілейкін дифтитокс, депомедрол, деслорелін, дексразоксан, діетилстільбестрол, дифлюкан, доцетаксел, доксіфлуридин, доксорубіцин, дронабінол, DW-166HC, елігард, елітек, еленс, еіпеп, епірубіцин, епоетин-альфа, епоген, ептаплатін, ергамісол, естрас, естрадіол, естрамустину фосфат натрію, етинілестрадіол, етіол, етидронова кислота, етопофос, етопозид, фадрозол, фарстоун, філграстим, фінастерід, фліграстим, флоксуридин, флуконазол, флударабін, 5-фтордеоксіурідину монофосфат, 5фторурацил (5-FU), флуоксиместерон, флутамід, форместан, фостеабін, фотемустін, фулвестрант, гаммагард, гемцитабін, гемтузумаб, глівек, гліадел, гозерелін, гранісетрону гідрохлорид, гістрелін, гікамтин, гідрокортон, еритро-гідроксиноніладенін, гідроксисечовина, ібритумомаб тіуксетан, ідарубіцин, іфосфамід, інтерферон-альфа, інтерферон-альфа-2, інтерферон-альфа-2α, інтерферон-альфа-2β, інтерферон-альфа-n1, інтерферон-альфа-n3, інтерферон-бета, інтерферон-гамма-1α, інтерлейкін-2, інтрон, іресса, іринотекан, кітріл, лапатиніб, лентинану сульфат, летрозол, лейковорин, лейпролід, лейпроліду ацетата, левамізол, кальцієва сіль лівофолієвої кислоти, лівотроід, левоксил, ломустін, лонідамін, марінол, мехлоретамін, мекобаламін, медроксипрогестерону ацетат, мегестрол, мелфалан, менест, 6-меркаптопурин, месна, метотрексат, метвікс, мілтефозин, міноциклін, мітоміцин C, мітотан, мітоксантрон, модренал, міоцет, недаплатин, неуласта, неумега, неупоген, нілутамід, нолвадекс, NSC-631570, OCT-43, октреотид, ондансетрону гідрохлорид, орапред, оксаліплатин, паклітаксел, педіапред, пегаспаргаз, пегасіс, пентостатин, пісібаніл, пілокарпіну гідрохлорид, пірарубіцин, плікаміцин, порфімер натрію, преднімустин, преднізолон, преднізон, премарин, прокарбазин, прокрит, ралтітрексед, RDEA119, ребіф, ренію-186 етідронат, ритуксимаб, роферон-А, ромуртид, салаген, сандостатин, сарграмостим, семустин, сізофіран, собузоксан, солу-медрол, стрептозоцин, стронцію-89 хлорид, синтроід, тамоксифен, тамсулозин, тасонермін, тастолактон, таксотер, тецелейкін, темозоломід, теніпозид, тестостерону пропіонат, тестред, тіогуанін, тіотепа, тиреотропний гормон, тілудронова кислота, топотекан, тореміфен, тосітумомаб, тастузумаб, треосульфан, третиноїн, трексал, триметилмеламін, триметрексат, триптореліну ацетат триптореліну памоат, UFT, уридин, валрубіцин, веснаріон, вінбластин, вінкристин, віндезин, вінорельбін, вірулізин, зінекард, зіностатин-стімаламер, зофран; ABI-007, аколбіфен, актимун, аффінітак, амінопретин, арзоксіфен, асоприсніл, атаместан, атрасентан, BAY 43-9006 (сорафеніб), авастин, CCI-779, CDC-501, целебрекс, цетуксимаб, кріснатол, ципротерону ацетат, децитабін, DN-101, доксорубіцин-MTC, dSLIM, дутастерид, едотекарин, ефлорнітином, ексатекан, фенретинід, гістаміну дигідрохлорид, гістрелін гідрогелевих імплантатів, гольмію- 166 DOTMP, ібандронова кислота, гамма-інтерферон, інтрон-ПЕГ, іксабепілон, гемоціанін лімфи равлика, L-651582, ланреотид, ласофоксіфен, лібра, лонафарніб, міпрксифен, мінодронат, MS-209, ліпосомальний MTP-PE, MX-6, нафарелін, неморубіцин, неовастат, нолатрексед, облімерсен, онко-TCS, осідем, паклітакселу поліглутамат, памідронату динатрій, PN-401, QS-21, квазепам, R-1549, ралоксіфен, ранпірнас, 13-цис-ретиноєва кислота, сатраплатин, сеокальцитол, T-138 067, тарцева, таксопрексин, тимозин-альфа-1, тіазофурин, тіпіфарніб, тірапазамін, ТЛК-286, тореміфен, трансMID-107R, валсподар, вапреотид, ваталаніб, вертепорфін, вінфлунін, Z-100, золедронова кислота та їх комбінації. В переважному втіленні сполуки за представленим винаходом можна комбінувати з антигіперпроліферативними агентами, які можуть бути зазначені як приклад - без обмеження наведеним переліком: абраксан, аміноглютетимід, L-аспарагіназа, азатіоприн, 5-азацитидин, блеоміцин, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, коласпас, циклофосфамід, цитарабін, дакарбазин, дактіноміцин, даунорубіцин, діетилстільбестрол, 2',2'дифтордеоксицитидин, доцетаксел, доксорубіцин (адріаміцин), епірубіцин, епотілон та його похідні, еритро-гідроксиноніладенін, етинілестрадіол, етопозид, флударабіну фосфат, 5фтордеоксіурідин, 5-фтордеоксіурідин моно фосфат, 5-фторурацил, флуоксиместерон, флутамід, гексаметилмеламін, гідроксисечовина, гідроксипрогестерону капроат, ідарубіцин, іфосфамід, інтерферон, іринотекан, лейковорин, ломустін, мехлоретамін, медроксипрогестерону ацетат, мегестролу ацетат, мелфалан, 6-меркаптопурин, месна, метотрексат, мітоміцин C, мітотан, мітоксантрон, паклітаксел, пентостатин, N-фосфоноацетил L-аспартат (PALA), плікаміцин, преднізолон, преднізон, прокарбазин, ралоксифен, семустин, стрептозоцин, тамоксифен, теніпозид, тестостерону пропіонат, тіогуанін, тіотепа, триметилмеламін, уридин, вінбластин, вінкристин, віндезин та вінорельбін. Окрім того, сполуки відповідно до винаходу можуть бути дуже перспективно скомбіновані з біологічними терапевтичними засобами, такими як антитіла (наприклад, авастин, рітуксан, ербітукс, герцептин, цетуксімаб) та рекомбінантні протеїни. 7 UA 108494 C2 5 10 15 20 25 Сполуки відповідно до винаходу, крім того, можуть досягати позитивних дій в комбінації з іншими терапіями, спрямованими проти ангіогенезу, такими як, наприклад, з авастином, акситинібом, регорафенібом, ресентином, сорафенібом або сунітинібом. Комбінації з інгібіторами протеасоми, та mTOR, та антигормонами, та стероїдними інгібіторами метаболічного ферменту є особливо прийнятними, через їх прийнятний профіль побічних ефектів. Загалом, наступні цілі можуть бути здійснені шляхом комбінації сполук за представленим винаходом з іншими агентами, що мають цитостатичну або цитотоксичну дію: - покращену активність в уповільнені росту пухлини, в зменшенні її розміру або навіть в її повному зникненні в порівнянні з лікуванням індивідуальною активною сполукою; - можливість застосування хіміотерапевтичних засобів, які використовують в менших дозах, ніж при монотерапії; - можливість більш прийнятної терапії з незначними побічними ефектами в порівнянні з індивідуальним введенням; - можливість лікування більш широкого спектру пухлинних захворювань; - досягнення більш високої швидкості відповіді на терапію; - більш довгий час життя пацієнта в порівнянні з використанням сучасної стандартної терапії. Сполуки відповідно до винаходу, крім того, можуть застосовувати в комбінації з радіотерапією та/або з хірургічним втручанням. Одержання сполук відповідно до винаходу Одержання сполук відповідно до винаходу всебічно описані в PCT/EP2009/007247, опис якого наводиться в представленій заявці та який є включеним в дану заявку як посилання. Основні положення одержання: Одержання сполук формули (Ia) (4-O похідні) Сполуки відповідно до винаходу можуть бути одержані відповідно до способу, який характеризується наступними стадіями: a) окиснення сполуки формули (IVd) з одержанням сульфоксиду формули (IVc) 30 b1) пряме імінування сульфоксиду формули (IVc) з одержанням захищеного сульфоксіміну формули (IVa) F F F O S O S 4 R O O + O 4 O R N 35 N + N (IVc) O (IVa) або b2) імінування сульфоксиду формули (IVc) з одержанням незахищеного сульфоксіміну формули (IVb), та наступне введення захисної групи з одержанням сполуки формули (IVa) 8 UA 108494 C2 F F F O O S NH S 4 O + O O + O + N O (IVc) 4 R N N N S R R O O 4 (IVb) (IVa) O с) відновлення сполуки формули (IVa), з одержанням сполуки формули (IV) F F F F F O F N S O 4 O S R O O 4 R + N H2 N (IVa) O 5 N (IV) d) функціоналізація 4-положення 2,4-дихлор-5-йодпіримідину (VII) за реакцією з монозахищеним (PG = захисна група) діолом формули (VI) з утворенням проміжної сполуки формули (Va) 10 1 R HO Cl OPG 2 R 3 Cl R (VI) N N N N Cl 1 R O OPG 2 R I I (VII) 3 R (Va) e) одержання 5-CF3 проміжної сполуки (V) Cl Cl N N N 1 N 1 R R OPG O 2 R OPG O 2 R 3 R I F 3 R F F 15 (Va) (V) f) сполучення сполук формули (IV) та (V) з одержанням проміжної сполуки формули (III) 9 UA 108494 C2 F F N O N O 2 R + 3 4 HN N N F 1 R OPG O F 2 R (V) O O H2 N R 4 R R OPG N S N S 1 R O F F F F Cl F (IV) F F 3 R (III) F g) видалення захисної групи (PG) з утворенням (II) F F F F F O F N O S 4 N O S R HN N HN N N 1 R N OPG O 2 R F O 4 R 1 R OH O 3 R 2 3 R F F R F F F (III) 5 (II) h) видалення захисної групи на сульфоксіміні з утворенням (Ia) F F F O N O S 4 O NH S R HN N HN N N 1 R O R F F 15 2 OH 2 R 3 R F F (II) 1 1 R O 3 F 10 N OPG 2 R F 4 R 3 (Ia) 4 , де замісники R , R , R та R мають значення такі ж, як наведено в загальній формулі (I). Одержання сполук загальної формули (Ib) (4-N похідні) Сполуки відповідно до винаходу можуть бути одержані відповідно до способу, який характеризується наступними стадіями: a) окиснення сполуки формули (IVd) з одержанням сульфоксиду формули (IVc) 10 UA 108494 C2 b1) пряме імінування сульфоксиду формули (IVc) з одержанням захищеного сульфоксіміну формули (IVa) 5 F F F O O S N S 4 4 R O O + N O O R + N (IVc) O (IVa) або b2) імінування сульфоксиду формули (IVc) з одержанням незахищеного сульфоксіміну формули (IVb), та наступне введення захисної групи з одержанням сполуки формули (IVa) 10 F F F O O S S 4 O + O + N O (IVc) 4 R O + N S 4 N N O O R R O NH (IVb) (IVa) O c) відновлення сполуки формули (IVa) з одержанням сполуки формули (IV) F F F F F O F N S O 4 O R O + O 4 O R N 15 N S H2 N (IVa) (IV) d) функціоналізація 4-положення 2,4-дихлор-5-трифторметилпіримідину (VIIb) за реакцією аміну формули (VIa) з утворенням проміжної сполуки формули (Vb) 11 UA 108494 C2 1 R H2 N Cl 1 R OH 2 3 R R Cl N N N (VIIb) F F 3 + 1 R N R N OH N H R2 R3 Cl F 2 R (VIa) N OH HN F Cl (Vb) F F F (Vc) F F e) сполучення сполук формули (Vb) та (IV) з одержанням проміжної сполуки формули (IIb) F F F F O N S O 4 N H2 N (Vb) O NH N 1 R OH N H R2 R3 F F 4 R R + N H R2 R3 N N S 1 R OH F O F Cl N F (IV) F (IIb) F F 5 f) видалення захисної групи на сульфоксіміні з утворенням (Ib) F F F O N S O 4 O NH S R NH N NH N N 1 R N OH F 10 1 2 3 F (IIb) F 1 R OH N H R2 R3 N H R2 R3 F 4 R F F 4 (Ib) , де замісники R , R , R та R мають значення такі ж, як наведено в загальній формулі (I). Приклад 1 (RS)-S-Циклопропіл-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-гідрокси-1-метилпропіл]окси}-5(трифторметил)піримідин-2-іл]аміно}феніл)сульфоксімід 15 O NH S HN N N OH O F F F 12 UA 108494 C2 5 10 Одержання сполуки за прикладом 1 виконують відповідно до прикладу 1 PCT/EP2009/007247. Суміш діастереомерів розділяють шляхом препаративної ВЕРХ до чистих стереоізомерів: колонка: Chiralpak IA 5µ 250 × 30 мм рухомі фази: гексан/етанол 8:2 швидкість потоку: 40,0 мл/хв детектор: УФ 254 нм температура: кімнатна температура час утримання: 10,8-13,4 хв; стереоізомер 1 (= приклад 1-SI-1) 13,6-18,5 хв; стереоізомер 2 (= приклад 1-SI-2) Приклад 2 (RS)-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-Гідрокси-1-метилпропіл]окси}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)-S-метилсульфоксімід O NH S HN N N OH O F 20 25 30 F F 15 Одержання сполуки за прикладом 2 виконують відповідно до прикладу 2 PCT/EP2009/007247. Суміш діастереомерів розділяють шляхом препаративної ВЕРХ до чистих стереоізомерів: колонка: Chiralpak IC 5µ 250 × 20 мм рухомі фази: гексан/етанол 8:2 буфер: гексан/0,1 % ДЕА швидкість потоку: 25,0 мл/хв детектор: УФ 280 нм температура: кімнатна температура час утримання: 9,5-12,1 хв; стереоізомер 1 (= приклад 2-SI-1) 13,1-16,0 хв; стереоізомер 2 (= приклад 2-SI-2) Приклад 3 (RS)-S-(4-{[4-{[(R)-2-Гідрокси-1,2-диметилпропіл]окси}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)-S-метилсульфоксімід O NH S HN N N OH O F F F 35 Одержання сполуки за прикладом 3 виконують відповідно до прикладу 3 PCT/EP2009/007247. Залишок очищували шляхом ВЕРХ. Одержали 31 мг (0,07 ммоль; вихід: 14 %) продукту. Приклад 4 (RS)-S-Циклопропіл-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-гідрокси-1-метилпропіл]аміно}-5 13 UA 108494 C2 (трифторметил)піримідин-2-іл]аміно}феніл)сульфоксімід O NH S HN N N OH N H F F F 5 10 15 Одержання сполуки за прикладом 4 виконують відповідно до прикладу 4 PCT/EP2009/007247. Суміш діастереомерів розділяють шляхом препаративної ВЕРХ до чистих стереоізомерів: колонка: Chiralpak IA 5µ 250 × 20 мм рухомі фази: гексан/2-пропанол 50:50 буфер: гексан/0,1 % ДЕА швидкість потоку: 15,0 мл/хв детектор: УФ 254 нм температура: кімнатна температура час утримання: 5,9-6,6 хв; стереоізомер 1 (= приклад 4-SI-1) 7,1-8,8 хв; стереоізомер 2 (= приклад 4-SI-2) Приклад 5 (RS)-S-Циклопропіл-S-(4-{[4-{[(R)-2-гідрокси-1,2-диметилпропіл]аміно}-5(трифторметил)піримідин-2-іл]аміно}феніл)сульфоксімід O NH S HN N N OH N H F 20 25 30 35 F F Одержання сполуки за прикладом 5 виконують відповідно до прикладу 5 PCT/EP2009/007247. Суміш діастереомерів розділяють шляхом препаративної ВЕРХ до чистих стереоізомерів: колонка: Chiralpak AD-H 5µ 250 × 20 мм рухомі фази: гексан/2-пропанол 60:40 буфер: гексан/0,1 % ДЕА швидкість потоку: 20,0 мл/хв детектор: УФ 280 нм температура: кімнатна температура час утримання: 5,1-6,3 хв; стереоізомер 1 (= приклад 5-SI-1) 8,0-10,8 хв; стереоізомер 2 (= приклад 5-SI-2) Приклад 6 (RS)-S-Етил-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-гідрокси-1-метилпропіл]аміно}-5-(трифторметил)піримідин2-іл]аміно}феніл)сульфоксімід 14 UA 108494 C2 O NH S HN N N OH N H F F F 5 10 15 Одержання сполуки за прикладом 6 виконують відповідно до прикладу 6 PCT/EP2009/007247. Суміш діастереомерів розділяють шляхом препаративної ВЕРХ до чистих стереоізомерів: колонка: Chiralpak AD-H 5µ 250 × 20 мм рухомі фази: гексан/2-пропанол 60:40 буфер: гексан/0,1 % ДЕА швидкість потоку: 20,0 мл/хв детектор: УФ 280 нм температура: кімнатна температура час утримання: 6,2-6,8 хв; стереоізомер 1 (= приклад 6-SI-1) 7,2-8,9 хв; стереоізомер 2 (= приклад 6-SI-2) Приклад 7 (RS)-S-Етил-S-(4-{[4-{[(R)-2-гідрокси-1,2-диметилпропіл]аміно}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)сульфоксімід O NH S HN N N OH N H F F F 20 25 30 Одержання сполуки за прикладом 7 виконують відповідно до прикладу 7 PCT/EP2009/007247. Суміш діастереомерів розділяють шляхом препаративної ВЕРХ до чистих стереоізомерів: колонка: Chiralpak AD-H 5µ 250 × 20 мм рухомі фази: A:гексан B:2-пропанол буфер: гексан/0,1 % ДЕА градієнт: 20→40 %B(20')+40 %B(5') швидкість потоку: 10,0 мл/хв детектор: УФ 280 нм температура: кімнатна температура час утримання: 17,5-19,8 хв; стереоізомер 1 (= приклад 7-SI-1) 20,1-22,0 хв; стереоізомер 2 (= приклад 7-SI-2) Приклад 8 (RS)-S-(4-{[4-{[(1R, 2R)-2-Гідрокси-1-метилпропіл]аміно}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)-S-метилсульфоксімід 35 15 UA 108494 C2 O NH S HN N N OH N H F F F 5 10 15 Одержання сполуки за прикладом 8 виконують відповідно до прикладу 8 PCT/EP2009/007247. Суміш діастереомерів розділяють шляхом препаративної ВЕРХ до чистих стереоізомерів: колонка: Chiralpak IC 5µ 250 × 20 мм рухомі фази: гексан/етанол 50:50 буфер: гексан/0,1 % ДЕА швидкість потоку: 20,0 мл/хв детектор: УФ 254 нм температура: кімнатна температура час утримання: 5,1-5,8 хв; стереоізомер 1 (= приклад 8-SI-1) 6,1-6,7 хв; стереоізомер 2 (= приклад 8-SI-2) Приклад 9 (RS)-S-(4-{[4-{[(1R)-2-Гідрокси-1,2-диметилпропіл]аміно}-5-(трифторметил)піримідин-2іл]аміно}феніл)-S-метилсульфоксімід O NH S HN N N OH N H F F F 20 25 30 35 Одержання сполуки за прикладом 9 виконують відповідно до прикладу 9 PCT/EP2009/007247. Суміш діастереомерів розділяють шляхом препаративної ВЕРХ до чистих стереоізомерів: колонка: Chiralpak IC 5µ 250 × 20 мм рухомі фази: гексан/етанол 80:20 швидкість потоку: 30,0 мл/хв детектор: УФ 254 нм температура: кімнатна температура час утримання: 6,0-6,7 хв; стереоізомер 1 (= приклад 9-SI-1) 7,1-8,9 хв; стереоізомер 2 (= приклад 9-SI-2) Приклад 10 10.1 Випробовування 1: Аналіз CDK1/CycB кінази Рекомбінантні CDK1 та CycB-GST злиті протеїни, очищені від клітин комах, інфікованих бакуловірусом (Sf9), були придбані у компанії ProQinase GmbH, Freiburg, Germany. Гістон IIIS, який використовували як субстрат кінази, є комерційно доступним від Sigma. CDK1/CycB (200 нг/контрольна точка) інкубували протягом 10 хвилин при 22 °C в присутності речовин, що досліджуються, в різних концентраціях (0 мкМ, та в діапазоні 0,01 – 100 мкМ) в буфері випробування [50 мМ тріс/HCl pH 8,0, 10 мМ MgCl2, 0,1 мМ Na орто-ванадату, 1,0 мМ дитіотреїтолу, 0,5 мкМ аденозину трифосфату (АТФ), 10 мкг/ контрольна точка гістону IIIS, 16 UA 108494 C2 33 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0,2 мкКі/контрольна точка P-гама АТФ, 0,05 % NP40, 1,25 % диметилсульфоксиду]. Реакцію зупиняли додаванням розчину ЕДТО (250 мМ, pH 8,0, 15 мкл/контрольна точка). З кожної реакційної суміші 15 мкл наносили на P30 фільтруючі смужки (від Wallac), та 33 незв'язані Р-АТФ видаляли шляхом три разового промивання фільтруючих смужок, протягом 10 хвилин кожен раз, в 0,5 % фосфорній кислоті. Після висушування фільтруючих смужок протягом 1 години при 70 °C, фільтруючі смужки покривали сцинтиляційними смужками TM (MeltiLex А, від Wallac) та сушили в камері протягом 1 години при 90 °C. Кількість незв'язаних 33 P (фосфорилювання субстрату) визначали шляхом сцинтиляційного вимірювання у вимірювальному приладі з гамма-випромінюванням (Wallac). Виміряні дані були стандартизовані до 0 % інгібування (ферментативна реакція без інгібітору) та 100 % інгібування (всі компоненти випробування, за винятком ферменту). Значення IC50 визначали за допомогою 4-х параметрів відповідності, використовуючи власне програмне забезпечення компанії. 10.2 Випробування 2: Аналіз CDK2/CycE кіназиРекомбінантні CDK2 та CycE-GST злиті протеїни, очищені від клітин комах, інфікованих бакуловірусом (Sf9), були придбані у компанії ProQinase GmbH, Freiburg, Germany. Гістон IIIS, який використовували як субстрат кінази, є комерційно доступним від Sigma. CDK2/CycE (50 нг/контрольна точка) інкубували протягом 10 хвилин при 22 °C в присутності речовин, що досліджуються, в різних концентраціях (0 мкМ, та в діапазоні 0,01 – 100 мкМ) в буфері випробування [50 мМ тріс/HCl pH 8,0, 10 мМ MgCl 2, 0,1 мМ Na орто-ванадату, 1,0 мМ дитіотреїтолу, 0,5 мкМ аденозину трифосфату (АТФ), 10 мкг/ контрольна точка гістону IIIS, 0,2 33 мкКі/контрольна точка P-гама АТФ, 0,05 % NP40, 1,25 % диметилсульфоксиду]. Реакцію зупиняли додаванням розчину ЕДТО (250 мМ, pH 8,0, 15 мкл/контрольна точка). З кожної реакційної суміші 15 мкл наносили на P30 фільтруючі смужки (від Wallac), та 33 незв'язані Р-АТФ видаляли шляхом три разового промивання фільтруючих смужок, протягом 10 хвилин кожен раз, в 0,5 % фосфорній кислоті. Після висушування фільтруючих смужок протягом 1 години при 70 °C, фільтруючі смужки покривали сцинтиляційними смужками TM (MeltiLex А, від Wallac) та сушили в камері протягом 1 години при 90 °C. Кількість незв'язаних 33 P (фосфорилювання субстрату) визначали шляхом сцинтиляційного вимірювання у вимірювальному приладі з гамма-випромінюванням (Wallac). Виміряні дані були стандартизовані до 0 % інгібування (ферментативна реакція без інгібітору) та 100 % інгібування (всі компоненти випробування, за винятком ферменту). Значення IC50 визначали за допомогою 4-х параметрів відповідності, використовуючи власне програмне забезпечення компанії. 10.3 Випробування 3: Аналіз кіназиVEGF рецептору-2 Рекомбінантну тирозинкіназу VEGF рецептору-2 очищували, як GST злитий протеїн, від клітин комах, інфікованих бакуловірусом (Sf9). Полі-(Glu4Tyr), який використовували як субстрат кінази, є комерційно доступним від Sigma. Тирозинкіназу VEGF рецептору (90 нг/контрольна точка) інкубували протягом 10 хвилин при 22 °C в присутності речовин, що досліджуються, в різних концентраціях (0 мкМ, та в діапазоні 0,001 – 30 мкМ) в 30 мкл буферу випробування [40 мМ тріс/HCl pH 5,5, 10 мМ MgCl2, 1 мМ MnCl2, 3 мМ Na орто-ванадату, 1,0 мМ дитіотреїтолу, 8 мкМ аденозину трифосфату (АТФ), 0,96 33 мкг/контрольна точка полі-(Glu4Tyr), 0,2 мкКі/контрольна точка P-гама АТФ, 1,4 % диметилсульфоксиду]. Реакцію зупиняли додаванням розчину ЕДТО (250 мМ, pH 8,0, 15 мкл/контрольна точка). З кожної реакційної суміші 15 мкл наносили на P30 фільтруючі смужки (від Wallac), та 33 незв'язані Р-АТФ видаляли шляхом три разового промивання фільтруючих смужок, протягом 10 хвилин кожен раз, в 0,5 % фосфорній кислоті. Після висушування фільтруючих смужок протягом 1 години при 70 °C, фільтруючі смужки покривали сцинтиляційними смужками TM (MeltiLex А, від Wallac) та сушили в камері протягом 1 години при 90 °C. Кількість незв'язаних 33 P (фосфорилювання субстрату) визначали шляхом сцинтиляційного вимірювання у вимірювальному приладі з гамма-випромінюванням (Wallac). Виміряні дані були стандартизовані до 0 % інгібування (ферментативна реакція без інгібітору) та 100 % інгібування (всі компоненти випробування, за винятком ферменту). Значення IC50 визначали за допомогою 4-х параметрів відповідності, використовуючи власне програмне забезпечення компанії. 10.4 Випробування 4: Проліферативний аналіз Приклад 1: Проліферативний аналіз Культивовані клітини пухлини людини (первісно отримані з ATCC, HeLa-MaTu та HeLaMaTu-ADR, первісно отримані від Epo GmbH, Berlin, Germany) висівали з густиною від 1000 до 5000 клітин/контрольна точка, в залежності від швидкості росту клітинної лінії, в 96-лунковий мультититрувальний планшет в 200 мкл середовища росту (DMEM/HAMS F12, 2 мМ Lглутаміну, 10 % ембріональна теляча сироватка). Через 24 години клітини одного планшету 17 UA 108494 C2 5 10 15 20 (планшет нульової точки) фарбували кристалічним фіолетовим (дивись нижче), в той час як середовище інших планшетів замінювали на свіже культуральне середовище (200 мкл), до яких додавали речовини, що досліджували, в різних концентраціях (0 мкМ, та в діапазоні 0,01 – 30 мкМ; кінцева концентрація розчинника диметилсульфоксиду становила 0,5 %). Клітини інкубували протягом 4 днів в присутності речовин, що досліджували. Клітинну проліферацію визначали за допомогою фарбування клітин кристалічним фіолетовим: клітини фіксували шляхом додавання 20 мкл/контрольна точка 11 % розчину глутарового альдегіду протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Після триразового промивання фіксованих клітин водою планшети сушили при кімнатній температурі. Клітини фарбували шляхом додавання 100 мкл/контрольна точка 0,1 % розчину кристалічного фіолетового (pH регулювали до pH 3 шляхом додавання оцтової кислоти). Після триразового промивання фарбованих клітин водою планшети сушили при кімнатній температурі. Барвник розчиняли, додаючи 100 мкл/контрольна точка 10 % розчину оцтової кислоти. Екстинцію визначали фотометрично на довжині хвилі 595 нм. Зміну в рості клітин у відсотках розраховували шляхом стандартизації значень, що вимірювали, до значень екстинції планшету нульової точки (=0 %) та екстинції необроблених (0 мкМ) клітин (=100 %). Дані, що вимірювали, стандартизували до 0 % інгібування (клітинна проліферація без інгібітору) та 100 % інгібування (планшет нульової точки). Значення IC50 визначали за допомогою 4-х параметрів відповідності, використовуючи власне програмне забезпечення компанії. Речовини перевіряли на наступних клітинних лініях, які, у вигляді прикладу, представляють зазначені показники: Таблиця 1 Ознака пухлини карцинома молочної залози з естроген-негативними рецепторами карцинома молочної залози з естроген-позитивними рецепторами карцинома яєчників карцинома товстої кишки/прямої кишки Карцинома простати недрібноклітинна карцинома бронхів дрібноклітинна карцинома бронхів карцинома нирок карцинома підшлункової залози карцинома шийки матки шкіри: епідермісу шкіри: меланома лейкемія 25 Клітинна лінія SK-BR-3 MDA-MB 231 MDA-MB 453 MCF7 OVCAR-8 NCI-ADR-Res A2780 A2780-Cis HT29 Caco-2 SW480 HCT116 DU145 PC3 NCI-H460 A549 H1975 NCI-H69 Caki2 786-O MIA PaCa-2 HeLa HeLa-MaTu HeLa-MaTu-ADR A431 A375 MOLM-13 10.5 Моделі in-vivo Клітини пухлини, вирощені в клітинному середовищі, були імплантовані підшкірно в бік самка або самцям "голих" мишей лінії NMRI. Лікування розпочинали як тільки пухлини виростала до розміру приблизно 20 мм². Дослідження припиняли як тільки в одній з груп пухлини досягали розміру приблизно 150 мм². Використовували наступні групи для дослідження: 18 UA 108494 C2 5 10 15 Контрольна група, що одержувала носій: лікували солюбілізатором (40 % ПЕГ400/60 % води) Терапевтичні групи: зазначені в 10.8. Дослідження були розроблені для визначення початкової відповіді моделі пухлини людини до лікування ілюстративною сполукою 2-СІ-2. Інгібування росту пухлини у відсотках (TGI) розраховували або наприкінці дослідження виходячи з ваги пухлини (TGITW), використовуючи формулу 100 х [1 - (вага пухлини в терапевтичній групі / вагу пухлини в контрольній групі, що одержувала носій)], або в день, коли контрольну групу, що одержувала носій, повинні були умертвити, виходячи з площі пухлини (TGITA), використовуючи формулу 100 х [1 - (площа пухлини в терапевтичній групі на день вимірювання - площа пухлини в терапевтичній групі до лікування) / (площа пухлини в контрольній групі, що одержувала носій, на день вимірювання площа пухлини в контрольній групі, що одержувала носій, до лікування)]. Вважається, що лікування є ефективним, у випадку інгібування росту пухлини більш ніж на 50 %. Сполука 2-SI-2, як приклад, перевіряли in vivo в наступних моделях пухлин, які, у вигляді прикладу, представляють зазначені показники: Таблиця 2 Ознака пухлини карцинома молочної залози з естроген-негативними рецепторами карцинома яєчників карцинома товстої кишки/прямої кишки дрібноклітинна карцинома бронхів карцинома шийки матки Модель пухлини in vivo MDA-MB 231 A2780Cis HCT116 NCI-H69 NCI-H146 NCI-H526 NCI-H82 HeLa-MaTu HeLa-MaTu-ADR 10.6 Результати ферментних аналізів Таблиця 3 Фермент Приклад 1-SI-1 1-SI-2 2-SI-1 2-SI-2 3 4-SI-1 4-SI-2 5-SI-1 5-SI-2 6-SI-1 6-SI-2 7-SI-1 7-SI-2 8-SI-1 8-SI-2 9-SI-1 9-SI-2 20 CDK1/CycB CDK2/CycE VEGF-R2 (аналіз 1) (аналіз 2) (аналіз 3) Концентрація напівмаксимального інгібування активності ферменту або клітинної проліферації, IC50 [нМ] 9 7 114 7 9 163 5 6 84 4 5 281 13 10 6 6 46 25 9 10 5 24 7 11 3 4 17 8 8 5 5 4 5 6 4 5 3 10.7 Результати проліферативного аналізу 19 70 82 73 71 143 136 116 81 158 154 UA 108494 C2 Таблиця 4 Приклади Лінії клітин SK-BR-3 MDA-MB 231 MDA-MB 453 MCF7 OVCAR-8 NCI-ADR-Res A2780 A2780-Cis HT29 Caco-2 SW480 HCT116 DU145 PC3 NCI-H460 A549 H1975 NCI-H69 Caki2 786-O MIA PaCa-2 HeLa HeLa-MaTu HeLa-MaTu-ADR A431 A375 MOLM-13 5 10 15 20 25 30 1 SI-1 48 80 45 48 13 35 2 SI-2 13 18 15 15 12 33 29 16 15 18 8 25 12 20 11 37 26 20 21 12 11 8 14 14 14 SI-1 39 80 28 68 12 32 3 SI-2 21 16 16 11 14 29 3 10 28 24 19 16 9 27 16 23 14 37 24 22 19 13 8 7 17 15 9 70 IC50 [нМ] 4 5 6 7 8 9 SI-1 SI-1 SI-2 SI-1 SI-2 SI-1 SI-2 SI-1 SI-2 SI-1 SI-2 33 11 34 33 34 59 26 106 39 44 23 89 271 112 42 120 26 196 32 200 28 26 24 100 197 152 64 41 31 17 30 61 107 67 45 17 42 34 185 70 33 50 24 119 51 30 28 34 112 22 63 50 10 24 16 35 32 10 18 27 112 33 10 36 14 30 25 10 24 20 19 21 114 37 98 76 113 70 63 12 35 22 20 31