Антитіла до рецептора інсулінподібного фактора росту i та їх застосування

1. Антитіло, що має здатність до зв'язування з IGF-IR, яке є людським антитілом IgG1- або IgG3типу і є глікозильованим цукровим ланцюгом на залишку Asn297, яке відрізняється тим, що кількість залишків фукози в цукровому ланцюзі складає щонайменше 99 % ("повністю фукозиловане"), і, крім того, кількість залишків NGNA складає 1 % або менше і/або кількість залишків N-кінцевої альфа-1,3-галактози складає 1 % або менше. 2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що кількість NGNA складає 0,5 % або менше. 3. Антитіло за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що кількість N-кінцевої альфа-1,3-галактози складає 0,5 % або менше. 2 (19) 1 3 Дійсний винахід відноситься до антитіл до рецептора інсуліноподібного фактора росту І (IGFIR), способів їх одержання, фармацевтичних композицій, що містять вказані антитіла та їх застосування. Рецептор інсуліноподібного фактора росту І (IGF-IR. КФ 2.7.112, антиген CD221) відноситься до сімейства трансмембранних протеїн-тирозинкіназ (LeRoith D. і ін., Endocrin.Rev.16,1995, cc. 143-163; і Adams Т.Е. і ін., Cell. Моl. Life Sci.57,2000, cc. 1050-1093). IGF-IR зв'язується з IGF-Й з високою афінністю і ініціює фізіологічну відповідь на цей ліганд in vivo.IGF-IR зв'язується також з IGF-II, проте з дещо нижчою афінністю. Надекспресія IGF-IR стимулює неопластичну трансформацію клітин і є дані про те, що IGF-IR бере участь в трансформації клітин в злоякісні клітини і тому є придатною мішенню при розробці терапевтичних засобів лікування раку (Adams Т.Е. і ін., Cell. Моl. Life Sci.57,2000, cc. 1050-1093). Антитіла до IGF-IR добре відомі в даній галузі, і вивчена їх протипухлинна дія in vitro і in vivo (Benini S. і ін., Clin.Cancer Res.7,2001,cc.17901797; Scotlandi K. і ін., Cancer Gene Ther.9,2002,cc.296-307;Scotlandi K. і ін., Int.J.Cancer 101, 2002,cc.11-16; Brunetti А. і ін., Biochem. Biophys. Res.Commun. 165, 1989, cc.212218; Prigent S.A. і ін., J.Biol. Chem.265,1990, cc.9970-9977;Li S.L. і ін., Cancer Immunol. Immunother. 49, 2000, cc.243-252; Pessino А. і ін., Biochem. Biophys. Res. Commun.162,1989,cc.12361243; Surinya K.H. і ін., J.Biol. Chem. 277,2002,cc. 16718-16725; Soos M.A. і ін., J.Biol.Chem., 267,1992,cc.12955-12963; Soos M.A. і ін., Рrос. Natl. Acad. Sci. USA86,1989, cc. 5217-5221; O'Brien R.M. і ін., EMBO J.6,1987,cc.4003-4010;Taylor R. і ін., Biochem.J.242,1987,cc.123-129;Soos M.A. і ін., Biochem.J.235,1986,cc.199-208;Li S.L. і ін., Biochem. Biophys. Res. Commun.196,1993,cc.92-98; Delafontaine P. і ін., J. Моl. Cell.Cardiol.26,1994,cc. 1659-1673; Kull F.C.Jr. і ін. J.Biol.Chem.258,1983,cc. 6561-6566; Morgan D.O. і Roth R.A., Biochemistry25,1986,cc.1364-1371; Forsayeth J.R. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA84,1987,cc.3448-3451; Schaefer E.M. і ін., J.Biol. Chem.265,1990,cc.1324813253; Gustafson T.A. і Rutter W.J., J.Biol.Chem.265,1990,cc.18663-18667; Hoyne P.A. і ін., FEBS Lett.469,2000,cc.57-60;Tulloch P.A. і ін., J.Struct.Biol.125,1999,cc.11-18;Rohlik Q.T. і ін., Biochem. Biophys. Res.Comm.149,1987,cc.276-281; і Kalebic T. і ін., Cancer Res.54,1994,cc.55315534;Adams Ф. Е. і ін., Cell. Моl. Life Sci. 57,2000,cc.1050-1093;Dricu А. і ін., Glycobiology 9,1999,cc.571-579; Kanter-Lewensohn L. і ін., Melanoma Res.8,1998,cc.389-397; Li S.L. і ін., Cancer Immunol.Immunother.49,2000,cc.243-252). Антитіла до IGF-IR описані також в багаточисельних інших публікаціях, наприклад, у Arteaga C.L. і ін., Breast Cancer Res.Treatment 22,1992,cc.101106; і Hailey J. і ін., Мої. Cancer Ther.1,2002,cc.1349-1353. Зокрема, моноклональне антитіло до IGF-IR, що має назву IR3, знайшло широке застосування при дослідженні опосередкованих процесів і опо 95284 4 середкованих захворювань IGF-I IGF-IR, таких як рак. Альфа-IR-3 описане у Kull F.C, J. Biol.Chem.258,1983,cc.6561-6566. З тих пір опубліковано близько ста робіт, присвячених дослідженню і терапевтичному застосуванню  IR3, в яких розглядається його протипухлинна дія індивідуально і у поєднанні з цитостатичними агентами, такими як доксорубіцин і вінкристин. IR3 є мишачим моноклональним антитілом, відносно якого відомо, що воно інгібує зв'язування IGF-I з рецептором IGF, але не інгібує зв'язування IGF-II з IGFIR. У високих концентраціях IR3 стимулює проліферацію пухлинних клітин і фосфорилування IGFIR (Bergmann U. і ін., Cancer Res.55,1995, cc. 20072011;Kato H. і ін., J.Biol.Chem.268,1993, сс. 26552661). Існують інші антитіла (наприклад, 1Н7, див. Li S.L. і ін., Cancer Immunol.Immunother.49,2000, сс. 243-252), які інгібують зв'язування IGF-II з IGF-IR більшою мірою, ніж зв'язування IGF-I. Огляд рівня техніки, що стосується антитіл і їх властивостей і характеристик, приведений у Adams Т.Е. і ін., Cell. Моl. Life Sci.57,2000, сс. 1050-1093. Більшість антитіл, відомих з існуючого рівня техніки, мають походження з організму миші. Як добре відомо з існуючого рівня техніки, такі антитіла не можна застосовувати в терапії людини без додаткових змін, таких як химеризація або гуманізація. Внаслідок вказаних недоліків як терапевтичні агенти для лікування людей найпереважніше застосовують людські антитіла. Людські антитіла добре відомі з існуючого рівня техніки (van Dijk М.А. і van de Winkel J.G., Curr.Opin.Chem.Biol.5,2001,cc.368-374). З використанням цієї технології можна отримувати людські антитіла до широкої різноманітності мішеней. Приклади людських антитіл до IGF-IR представлені в WO02/053596,WO2004071529,WO2005016967,WO 2006008639,US20050249730,US20050084906,WO2 005058967,WO2006013472,US20030165502,WO20 05082415,WO2005016970,WO03106621,WO040832 48,WO2003100008,WO2004087756,WO2005005635 і WO2005094376. Проте все ще зберігається потреба в антитілах до IGF-IR, що володіють вираженими сприятливими діями для пацієнтів, що потребують протипухлинної терапії. Простіше кажучи, сприятлива дія для пацієнта й означає зменшення росту пухлини і істотне збільшення часу до прогресу захворювання, обумовлене лікуванням із застосуванням протионкогенного засобу. У Routier F.H. і ін., Glycoconjugate J.14,1997, cc. 201-207, описана схема глікозилювання гуманізованого антитіла у вигляді IgGl, що експресується в клітинах лінії CHO-DUKX. Для цього антитіла молярне співвідношення залишків фукози і манози (Fuc:Man) складає 0,8:3,0, що відповідає ступеню глікозилювання, що становить 80 %. У Niwa R. і ін., J.Immunol.Methods306,2005, cc. 151-160, описані антитіла до CD20 у вигляді IgGl і IgG3, які рекомбінантно продукуються в клітинах лінії СНО DG44, що мають ступінь фукозилування 90 % і 91 % відповідно. У Mimura Y. і ін., J.Immunol.Methods 247,2001, cc. 205-216, описано, що бутират підвищує виробництво людського химерного IgG в клі 5 95284 6 тинах лінії СНО-К1, зберігаючи при цьому функцію залишків N-кінцевої альфа-1,3-галактози складає і профіль глікозилювання. Олігосахаридні профілі 1 % або менше. свідчать про значний вміст нефукозилованих гліУ контексті винаходу поняття "кількість" ознаканових структур. У Raju T.S., BioProcess чає кількість цукрових залишків в цукровому ланInternational 1,2003, cc. 44-53, описаний вплив вацюзі, приєднаному до Asn297, узяту по відношенріації гликозілування, обумовленої експресійними ню до суми G0, G1, G2 (без манози (4 і 5)), що системами, на біологічну активність і номенклатуприймається за 100 %, і його розраховують як ру терапевтичних імуноглобулінів. У Ma S. і ін., описано в прикладі 3. Anal.Chem. 71,1999, ее. 5185-5192 описаний анаЗгідно винаходу можна створювати антитіла, ліз вуглеводного складу ритуксимабу. Ритуксимаб що зв'язуються з IGF-IR, які мають ступінь фукозимає ступінь фукозилування 9-10 % (Niwa R. і ін., лування, що становить навіть 99,4 % або більше, J.Immunol.Methods306,2005, cc. 151-160). У Fujii S., 99,5 % або більше або 99,9 % або більше. J.Biol.Chem 265,1990,cc.6009-6018 вказано, що Переважна кількість NGNA складає 0,5 % або бичачий IgG містить приблизно 11 % нефукозиломенше, переважніше 0,1 % або менше, і навіть є ваного IgG. У Mizuochi Т., J.Immunol.129,1982, cc. кількістю, що не виявляється за допомогою РХ-МС 2016-2020, приведені дані про те, що людський (рідинна хроматографія/мас-спектрометрія). IgG є приблизно на 14 % нефукозилованим. У Переважна кількість N-кінцевої альфа- 1,3Bergwerff A.A., Glycoconjugate J.12,1995,cc.318-330 галактози складає 0,5 % або менше, переважніше вказано, що антитіла, що продукуються в організмі 0,1 % менше, і навіть є кількістю, що не виявлямишей лінії SP2/0, містять у великих кількостях ється за допомогою РХ-МС. олігосахариди N-гліколілнейрамінової кислоти Цукровий ланцюг переважно володіє характе(NGNA). У Nahrgang S. і ін., In:Animal Cell ристиками N-зв'язаних гліканів, приєднаних до Technology:Products from Cells, Cells as Products, Asn297 антитіла, яке зв'язується з IGF-IR, що репід ред. Bernard А. і ін., вид-во Kluwer Academic комбінантно експресується в клітині СНО (клітина Publishers, Dordrecht, NL, 1999,cc.259-261, вказаяєчника китайського хом'яка). но, що при експресії IgGl в клітинах СНО після коПереважно клітина СНО є клітиною СНО, що роткочасної трансфекції виявлене в цілому незнамає делецію (наприклад, DG44), або функціональчне глікозилювання. У Lund J. і ін., Моl. ну інактивацію обох алелей DHFR або делецію Immunol.30,1993,cc.741-748 описано рекомбінантодного алеля DHFR і функціональну інактивацію не одержання мишачого-людського антитіла в клідругого алеля DHFR (наприклад, DXB11). тинах мишачої трансфектоми. Антитіло у вигляді Переважно антитіло є моноклональним антиIgGl є нефукозилованим приблизно на 13 %. У тілом. Переважно антитіло є химерним, гуманізоPatel Т.Р. і ін., Biochem.J.285,1992,cc.839-845, опиваним або людським антитілом. сане глікозилювання антитіл, одержаних з клітин Винахід переважно відноситься до повністю гібридоми і мишачих асцитів. У Niwa R. і ін., фукозилованого антитіла, що володіє здатністю J.Immunol.Methods306,2005,cc.151-160, вказано, зв'язуватися з IGF-IR і інгібувати зв'язування IGF-I і що антитіло у вигляді IgGl до CD20, одержане меIGF-II з IGF-IR, де антитіло відрізняється тим, що тодом рекомбінації в клітинах СНО DG44, має фувоно володіє одним або декількома властивостякозилування, що становить 91 %, а у Mori K. і ін., ми, вибраними з групи, що включає: Biotech.Bioeng.88,2004,cc.901-908, вказано, що а) співвідношення значень ІС50, що характерифукозилування складає 94 %. У Davies J. і ін., зують інгібування зв'язування IGF-I з IGF-IR і інгіBiotechnol.Bioeng.74,2001,cc.288-294, вказано, що бування зв'язування IGF-II з IGF-IR, складає від 1:3 експресія антитіл із зміненими глікоформами придо 3:1; водить до підвищення антитіло-обумовленої кліб) у концентрації 5нМ інгібує щонайменше на тиннозалежної цитотоксичності (ADCC). У Sheeley 80 %, переважно щонайменше на 90 % фосфориD.M. і ін., Anal.Biochem.247,1997,cc.102-110, прилування IGF-IR за даними клітинного аналізу фоведено порівняння глікозилювання антитіл, одерсфорилування з використанням клітин лінії НТ29 в жаних в різних експресійних системах. У Shields середовищі, що містить 0,5 % фетальної телячої R.L. і ін., J.Biol.Chem.277,2002,cc.26733-26740, сироватки інактивованої тепловою обробкою вказано, що відсутність фукози на Fc-фрагменті (FCS), в порівнянні з фосфорилуванням за даними аналізу без антитіла; людського IgGl підвищує зв'язування FcRIII і підв) не володіє IGF-IR-стимулюючою активністю вищує ADCC. Антитіло Неr2, яке має ступінь гліко(відсутність передачі сигналу, відсутність IGF-1зилювання, що становить приблизно 90 %, володіє подібної активності), вимірюваною за РКВтакож значною ADCC. У Zhu L. і ін., Nature фосфорилуванням при використанні концентрації Biotechnol.23,2005,cc.1159-1169, описано одер10мкМ в клітинному аналізі фосфорилування з жання людських антитіл в курячих яйцях. використанням клітин лінії ЗТЗ, що мають 400000Винахід відноситься до антитіла, що володіє 600000 молекул IGF-IR на клітину, в середовищі, здатністю до зв'язування з IGF-IR, яке є людським що містить 0,5 % фетальної телячої сироватки антитілом IgGl- або IgG3-типу і є глікозилованим інактивованої тепловою обробкою (FCS) в порівцукровим ланцюгом на залишку Asn297, де антитінянні з фосфорилуванням в аналізі без антитіла; ло відрізняється тим, що кількість залишків фукози г) здійснює понижуючу регуляцію на 50 % або в цукровому ланцюзі складає щонайменше 98 % більше IGF-IR, що експресуються на пухлинних ("повністю фукозиловане антитіло", переважні веклітинах (наприклад, лінії НТ29) через 24 год. після рсії приведені нижче) і, крім того, кількість залишдодавання антитіла до клітин. ків NGNA складає 1 % або менше і/або кількість 7 95284 8 Антитіла, пропоновані у винаході, володіють б) легкий ланцюг антитіла, що містить як CDR сприятливою дією для пацієнта, що потребує проCDR1 (ак 24-34), CDR2 (ак 50-56) і CDR3 (ак 89-98) типухлинної терапії, і забезпечують зниження роспослідовності, представлений в SEQ ID NО:2 або ту пухлини і значне збільшення часу до прогресу 4. захворювання. Антитіла, пропоновані у винаході, Переважно антитіло є моноклональним антиволодіють новими і такими, що мають ознаки витілом і, крім того, химерним антитілом (що містить находу властивостями, справляють сприятливу людський константний ланцюг), гуманізованим дію на пацієнта, що страждає захворюванням, яке антитілом і найбільш переважно людським антитіасоціюється з порушенням регуляції IGF, перш за лом. все захворюванням, пов'язаним з пухлиною. АнтиАнтитіло переважно конкурує з антитілом 18 тіла, пропоновані у винаході, відрізняються вказаза зв'язування з людським IGF-IR (КФ ними вище властивостями. 2.7.1.112,SwissProt P08069). При створенні винаходу несподівано було Крім того, антитіло переважно характеризу-8 встановлено, що антитіло, пропоноване у винаході ється афінністю до зв'язування, що складає 10 М -9 ("повністю фукозиловане антитіло"), не викликає (KD) або менше, переважно від приблизно 10 до -13 ADCC (антитіло-обумовлена клітиннозалежна ци10 М. тотоксичність) (її величина відхиляється не більше Переважно антитіло не володіє визначуваною ніж на 3хС.К.О. (стандартне відхилення) від викозалежністю здатності інгібувати зв'язування інсуліристовуваного як еталон стандартного антитіла ну з рецептором інсуліну від концентрації. Пере(референс-антитіло) (антитіло до гемоціаніну лімважно антитіло є антитілом IgGl-типу. фи равлика, тобто антитіло до KLH)) як продемонАнтитіло, пропоноване у винаході, значно збістровано в ADCC-аналізі, описаному в прикладі). льшує час до прогресу захворювання на моделях з Переважно антитіло, яке володіє здатністю використанням відповідних ксенотрансплантатів специфічно зв'язуватися з IGF-IR, інгібувати зв'япухлин в порівнянні з тваринами, обробленими зування IGF-I і IGF-II з IGF-IR у вказаному вище наповнювачем, і уповільнює ріст пухлини. Антитіло співвідношенні, є антитілом IgGl-ізотипу і воно не інгібує зв'язування IGF-I і IGF-II з IGF-IR in vitro і in активує передачу сигналу IGF-IR навіть в клітинах, vivo, переважно в приблизно однаковому ступені що надекспресують IGF-IR, при концентраціях, що як стосовно IGF-I, так і IGF-II. перевищують в 200 разів його значення ІС50. Переважно антитіла, пропоновані у винаході, Антитіла, що зв'язуються з IGF-IR, які не воломістять як гіперваріабельні ділянки (CDR) наступні діють "IGF-1-подібною активністю" і характеризупослідовності: ються "повним фукозилуванням", мають виражену а) важкий ланцюг антитіла, що містить як CDR перевагу при застосуванні як терапевтичного заCDR1 (ак 31-35), CDR2 й (ак 50-66) і CDR3 (ак 99собу. 107) послідовності, представлений в SEQ ID NО:1 Переважно антитіла, пропоновані у винаході, в або 3; концентрації 5нМ повністю інгібують трансдукцію б) легкий ланцюг антитіла, що містить як CDR опосередкованого IGF-I сигналу IGF-IR в пухлинCDR1 (ак 24-34), CDR2 (ак 50-56) і CDR3 (ак 89-98) них клітинах. послідовності, представлений в SEQ ID NО:2 або Нижче перераховані кодовані нуклеїновими 4. кислотами поліпептиди, які володіють здатністю до Переважні варіабельні області і CDR, перш за збирання з відповідним іншим ланцюгом антитіла з все CDR3 важкого ланцюга антитіл, пропонованих утворенням антитіла, що пропонується у винаході: у винаході, отримують з клону 18 HUMAB а) важкий ланцюг антитіла, що містить як CDR (антитіло 18) і клону 22 HUMAB (антитіло CDR1 (ак 31-35), CDR2 (ак 50-66) і CDR3 (ак 9922), що депонують в Німецькій колекції мікроорга107) послідовності, представлений в SEQ ID NO:1 нізмів і клітинних культур НМБН (DSMZ), Німеччиабо 3; на. Лінія клітин клон 18 HUMAB клон 22 HUMAB Реєстраційний номер DSMACC2587 DSMACC2594 Вказані антитіла детально описані в WO2005/005635. Інші переважні варіабельні області і CDR, перш за все CDR3 важкого ланцюга антитіл, пропонованих у винаході, отримують з клону 1a HuMab (антитіло 1A, Aт 1А або Ak 1A), клону 23 HuMab (антитіло 23) і клону 8 HuMab (антитіло 8), що депонують в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур НМБН (DSMZ), Німеччина: Реєстраційний номер DSMACC2586 DSMACC2588 DSMACC2589 Вказані антитіла детально описані в WO2005/087756. Винахід відноситься також до способів рекомбінантного одержання таких антитіл. Дата депонування 10.04.2003 09.05.2003 Дата депонування 10.04.2003 10.04.2003 24.04.2003 Винахід відноситься також до способів лікування раку, що полягають в тому, що пацієнтові, у якого діагностований рак (і який, отже, потребує протипухлинної терапії), вводять в ефективній 9 95284 10 кількості антагоністичне антитіло до IGF-IR, що ну область, тобто зв'язуючу область, з одного пропонується у винаході. Антитіло можна вводити джерела або видів і щонайменше частину констаіндивідуально у вигляді фармацевтичної композинтної області з іншого джерела або інших видів, ції або в альтернативному варіанті у поєднанні з яке, як правило, отримують за допомогою методів цитотоксичним лікуванням, таким як радіотерапія, рекомбінантної ДНК. Особливо переважними є або з цитотоксичним засобом або його проліками. химерні антитіла, що містять мишачу варіабельну Крім того, винахід відноситься до застосуванобласть і людську константну область. Такі мишаня антитіла, пропонованого у винаході, для лікучі/людські химерні антитіла є продуктом експресовання раку і для приготування фармацевтичної ваних генів імуноглобуліну, які містять ДНКкомпозиції, пропонованої у винаході. Винахід відсегмент, кодувальні варіабельні області мишачого носиться також до способу приготування фармаімуноглобуліну, і ДНК-сегмент, що кодує константні цевтичної композиції, пропонованої у винаході. області людського імуноглобуліну. Інші форми Крім того, винахід відноситься до фармацев"химерних антитіл", що підпадають під об'єм дійстичної композиції, що містить антитіло, пропононого винаходу, є такими формами, в яких клас або ване у винаході, у фармацевтично ефективній підклас модифікований або замінений щодо вихідкількості необов'язково у поєднанні з буфером ного антитіла. Такі "химерні" антитіла позначають і/або ад'ювантом, який можна застосовувати у фатакож як "антитіла переключеного класу". Методи рмацевтичних цілях для приготування лікарських одержання химерних антитіл включають загальноформ. прийняті методи, засновані на застосуванні рекоУ винаході запропоновані також фармацевтимбінантної ДНК і генної трансфекції, які в даний чні композиції, що містять такі антитіла у фармачас добре відомі в даній галузі (див., наприклад, цевтично прийнятному носієві. У одному з варіанMorrison S.L. і ін., Proc.Nail.Acad Sci.USA81,1984, тів здійснення винаходу фармацевтичну ее. 6851-6855;US5202238 і 5204244). композицію можна включати до складу виробу або Поняття "гуманізоване антитіло" відноситься набору. до антитіл, в яких каркасна ділянка або "гіперваріКрім того, винахід відноситься до способу абельні ділянки" (CDR) модифіковані таким чином, одержання рекомбінантного людського антитіла, що вони містять CDR імуноглобуліну іншої специпропонованого у винаході, що відрізняється тим, фічності в порівнянні з батьківським імуноглобуліщо здійснюють експресію нуклеїнової кислоти, що ном. У переважному варіанті здійснення винаходу кодує антитіло, яке володіє здатністю зв'язуватися для одержання "гуманізованого антитіла" мишачі з IGF-1R, в клітині-господарі, що є СНО-клітиною, CDR трансплантують в каркасну ділянку людськовнаслідок чого відбувається повне фукозилування го антитіла (див., наприклад, Riechmann L. і ін., антитіла, і виділяють антитіло з клітини. Винахід Nature332,1988, сс. 323-327; і Neuberger M.S. і ін., відноситься також до антитіла, яке можна отримуNature314,1985, сс. 268-270). Найбільш переважні вати таким методом рекомбінації. CDR відповідають репрезентативним послідовносКороткий опис креслення тям, які розпізнають антигени, вказані вище для На кресленні показана стовпчикова діаграма, химерних і біфункціональних антитіл. що ілюструє ADCC-активність (або її відсутність) У контексті дійсного опису мається на увазі, антитіл, пропонованих у винаході, і контролю, і що поняття "людське антитіло" відноситься до антитіл, що використовуються для порівняння. антитіл, що має варіабельну і константну області, Докладний опис винаходу одержані з послідовностей імуноглобуліну людсьПоняття "антитіло" відноситься до різних форм кої зародкової лінії. Варіабельний важкий ланцюг антитіл, включаючи (але не обмежуючись тільки переважно отримують з послідовності зародкової ними) повні антитіла, фрагменти антитіл, людські лінії DP-50 (GenBank LO6618), а варіабельний легантитіла, гуманізовані антитіла і створені за допокий ланцюг переважно отримують з послідовності могою генної інженерії антитіла, якщо вони зберізародкової лінії L6 (GenBank X01668), або варіагають відмінні ознаки, пропоновані у винаході. бельний важкий ланцюг переважно отримують з Поняття "фрагменти антитіла" відноситься до DP-61 (GenBank М99682), а варіабельний легкий частини повнорозмірного антитіла, як правило, ланцюг переважно отримують з послідовності защонайменше до його антигензв'язуючого центру родкової лінії L15 (GenBank КО 1323). Константабо варіабельної області. Прикладами фрагментів ними областями антитіла є константні області антитіл є подвійні антитіла, молекули одноланцюлюдського імуноглобуліну IgGl-типу. Такі області гових антитіл, імунотоксини і мультиспецифічні можуть бути алотиповими, вони описані, наприантитіла, утворені з фрагментів антитіл. клад, у Johnson G. і Wu T.T., Nucleic Acids Поняття "моноклональне антитіло" або "комRes.28,2000, сс. 214-218, і у вказаних в цій публіпозиція моноклонального антитіла" в контексті кації посиланнях. дійсного опису відносяться до препарату, що місПоняття "рекомбінантне людське антитіло" вітить молекули антитіла, які мають однаковий дноситься до антитіл, що мають варіабельну і консклад амінокислот. Відповідно поняття "людське стантну області, які одержані з послідовностей моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, імуноглобуліну людської зародкової лінії і знахощо володіють однаковою специфічністю до зв'язудяться в перетвореній формі. Рекомбінантні людвання, які мають варіабельну і константну області, ські антитіла, пропоновані у винаході, були піддані одержані з послідовностей імуноглобуліну людсьin vivo соматичній гіпермутації. Так, амінокислоткої зародкової лінії. ними послідовностями VH- і VL-областей рекомбіПоняття "химерне антитіло" відноситься до нантних антитіл є послідовності, які, хоча і виведемоноклонального антитіла, що містить варіабельні з послідовностей VH- і VL-областей людської 11 95284 12 зародкової лінії і є спорідненими їм, можуть не в'язуючий центр. CDR3-ділянки важкого і легкого зустрічатися in vivo в спектрі зародкової лінії людланцюга антитіла грають найбільш важливу роль в ського антитіла. специфічності зв'язування/афінності антитіл, проУ контексті дійсного опису поняття "зв'язуванпонованих у винаході, і внаслідок цього є додатконя" відноситься до зв'язування антитіла з IGF-IR, вим об'єктом винаходу. яке характеризується афінністю, що складає приПоняття "гіперваріабельна ділянка" або "анти-13 -8 близно від 10 до 10 М (KD), переважно приблигензв'язуючий центр антитіла" в контексті дійсного -13 -9 зно від 10 до 10 М. опису відносяться до амінокислотних залишків У контексті дійсного опису мається на увазі, антитіла, які відповідальні за зв'язування з антигещо поняття "молекула нуклеїнової кислоти" вклюном. Гіперваріабельна ділянка містить амінокислочає молекули ДНК і молекули РНК. Молекула нуктні залишки з "областей, що визначають комплелеїнової кислоти може бути одноланцюговою або ментарність" або "CDR". "Каркасні" або "FR»дволанцюговою, але переважно вона є дволанцюділянки є ділянками варіабельної області, залишки говою ДНК. яких відмінні від залишків гіперваріабельної ділянЛюдські константні області IgG1- або IgG3ки, як вони визначені в дійсному описі. Таким читипу детально описані у Kabat E.А. і ін., Sequences ном, легкі і важкі ланцюги антитіла містять в наof Proteins of Immunological Interest, 5-е видавницпрямі від Nдо С-кінця домени тво, вид-во Public Health Service, National Institutes FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3 і FR4.CDR3 важof Health, Bethesda, MD., 1991, і у Bruggemann М. і кого ланцюга є ділянкою, яка забезпечує головним ін., J.Exp.Med.166,1987,cc.1351-1361;Love T.W. і чином зв'язування з антигеном. До CDR- і FRін., Methods Enzymol.178,1989,cc.515-527. Їх прикділянок відносять ділянки, які визначають згідно з ладами є послідовності, представлені в SEQ ID стандартним визначенням Кеботу і ін. (Sequences NO:5-8. Іншими придатними і переважними консof Proteins of Immunological Interest, 5-е видавництантними областями є константні області антитіл, тво, вид-во Public Health Service, National Institutes які можна отримувати з ліній клітин гібридоми, що of Health, Bethesda, MD, 1991) і/або залишки з "гідепонують в DSMZ для цілей дійсного винаходу. перваріабельної петлі". Константні області IgG1- або IgG3-типу глікоУ контексті дійсного опису поняття "зв'язуванзильовані на залишку Asn297. У контексті дійсного ня з IGF-IR" означає зв'язування антитіла з IGF-IR, опису "Asn297" означає амінокислоту аспарагін, що виявляється в аналізі in vitro, переважно в аналокалізовану приблизно в положенні 297 в Fcлізі зв'язування, в якому антитіло зв'язують з повефрагменті; унаслідок невеликих варіацій послідоврхнею і зв'язування IGF-IR вимірюють за допомоностей антитіл Asn297 може знаходитися також на гою резонансу поверхневого плазмону (SPR). декілька амінокислот (як правило, не більше ніж на Наявність зв'язування означає, що афінність до -8 +3 амінокислоти) вище або нижче. Наприклад, в зв'язування (KD) складає 10 М або менше, пере-13 -9 одному з антитіл, пропонованих у винаході, важно від 10 до 10 М. "Asn297" знаходиться в положенні 298 амінокислоЗв'язування з IGF-IR можна досліджувати за тної послідовності. допомогою ВІАсоге-аналізу (фірма Pharmacia Глікозилювання людського IgGl або IgG3 має Biosensor АВ, Уппсала, Швеція). Афінність до скрімісце на Asn297 у вигляді глікозилювання, що плення визначають в поняттях ка (константа швиздійснюється за допомогою складного біантенного дкості асоціації антитіла при формуванні комплеколігосахариду з коров'ячим фукозилуванням, на су антитіло/антиген), kd (константа дисоціації) і KD кінцях якого розташовуються аж до 2 залишків Gal. (kd/ka). Антитіла, пропоновані у винаході, характе-10 Ці структури позначені як гліканові залишки G0, G1 ризуються значенням KD, що складає 10 М або менше. (1, 6 або 1, 3) або G2, залежно від кількості кінАнтитіла, пропоновані у винаході, інгібують тацевих залишків Gal (Raju T.S., BioProcess кож зв'язування IGF-I і IGF-II з IGF-IR. Інгібування Int.1,2003,cc.44-53). СНО-тип Fc-фрагментів антиоцінюють за величиною ІС50 в аналізі зв'язування тіла описаний, наприклад, у Routier F.H., IGF-I/IGF-II з IGF-IR на пухлинних клітинах. Такий Glycoconjugate J.14,1997,cc.201-207. аналіз описаний в прикладі 7. У такому аналізі виПоняття "варіабельна область" (варіабельна мірюють кількість IGF-I або IGF-II, що несе радіоаобласть легкого ланцюга (VL), варіабельна обктивну мітку або їх IGF-IR-зв'язуючих фрагментів, ласть важкого ланцюга (VH)) в контексті дійсного зв'язаних з IGF-IR, що знаходиться на поверхні опису відноситься до кожної з пари легких і важких вказаних пухлинних клітин (наприклад, лінії НТ29), ланцюгів, які безпосередньо беруть участь в зв'яу відсутності антитіла і у присутності зростаючих зуванні антитіла з антигеном. Домени варіабельконцентрацій антитіла. Значення ІС5о для антитіл, них областей легких і важких ланцюгів мають одпропонованих у винаході, що характеризують інгінакову загальну структуру і кожен домен містить 4 бування зв'язування IGF-I і IGF-II з IGF-IR, складакаркасних ділянки (FR), послідовності яких є висоють не більше 2нМ і відношення значень ІС50, що коконсервативними, зв'язаних трьома "гіперваріахарактеризують інгібування зв'язування IGF-I/IGFбельними ділянками" (або такими, що визначають II з IGF-IR, складає приблизно від 1:3 до 3:1. Знакомпліментарність областями, CDR). Каркасні дічення ІС50 визначають як середні або медіанні лянки адаптовані до в-складчатої конформації, а значення за результатами щонайменше трьох CDR-ділянки можуть формувати петлі, що сполунезалежних вимірювань. Окремі значення ІС50 чають -складчату структуру. CDR в кожному ланможуть випадати з вказаного діапазону. цюзі підтримуються у вигляді своєї тривимірної У контексті дійсного опису поняття "інгібування структури за допомогою каркасних ділянок і форзв'язування IGF-I і IGF-II з IGF-IR" відноситься до мують з CDR-ділянками іншого ланцюга антигенз 13 95284 14 інгібування зв'язування міченого за допомогою ПААГ і вимірюють фосфорилування IGF-IR метоІ125 IGF-I або IGF-II з IGF-IR, що знаходяться на дом Вестерн-блоттінга з використанням антитіла, поверхні пухлинних клітин лінії НТ29 (АТСС НТВспецифічного відносно фосфорильованого залиш38), в аналізі in vitro. Наявність інгібування ознаку тирозину. Вважається, що має місце повне інгічає, що значення ІС50 складає 2нМ або менше. бування трансдукції сигналу, якщо на ВестернПоняття "клітини, що експресують IGF-IR" відблоті візуально не можна виявити смуги, що відпоноситься до таких клітин, в яких відбувається навідають фосфорильованому IGF-IR. декспресія рецептора IGF-I з рівнем, що складає Антитіла, пропоновані у винаході, переважно щонайменше приблизно 20000 рецепторів/клітину. володіють здатністю зв'язуватися з тим самим Такими клітинами є, наприклад, лінії пухлинних епітопом IGF-IR, що і антитіло 18, або має місце клітин, такі як NCI H322M або НТ29, або лінія кліінгібування їх зв'язування з IGF-IR унаслідок стетин (наприклад, ЗТЗ АТСС CRL1658), яка надексричної перешкоди, обумовленої зв'язуванням з пресує IGF-IR після трансфекції експресійним векантитілом 18. Інгібування зв'язування можна виявтором, що забезпечує експресію IGF-IR. Кількість ляти за допомогою SPR-аналізу з використанням рецепторів на клітину оцінюють згідно методу, іммобілізованого антитіла 18 і IGF-IR в концентраописаного у Lammers, R. і ін., ЕМВО J.8,1989, сс. ції 20-50нМ і антитіла, що підлягає виявленню, в 1369-1375. концентрації 100нМ. Зменшення сигналу на 50 % Поняття "інгібування фосфорилування IGF-IR" або більше означає, що антитіло конкурує з антивідноситься до інгібування, яке виявляють за дотілом 18. Такий аналіз можна здійснювати аналогіпомогою клітинного аналізу фосфорилування з чним чином з використанням антитіла 22 як іммовикористанням клітин лінії ЗТЗ, що експресує по білізованого антитіла. 400000-600000 молекул IGF-IR на клітину в сереПоняття "епітоп" позначає білкову детермінандовищі, що містить 0,5 % фетальної телячої сироту, що володіє здатністю специфічно зв'язуватися ватки (FCS) інактивованої тепловою обробкою, з антитілом. Епітопи, як правило, складаються з при порівнянні з результатами такого аналізу без хімічно активних розташованих на поверхні груп присутності антитіла. Фосфорилування виявляють молекул, таких як бічні ланцюги амінокислот або методом Вестерн-блоттінга з використанням антицукрів, і, як правило, мають специфічні характеритіла, специфічного відносно білків з фосфорильостики тривимірної структури, а також специфічні ваним залишком тирозину. Такий аналіз описаний характеристики зарядів. Конформаційні і неконфов прикладі 11. Теплову інактивацію FCS здійснюрмаційні епітопи розрізняються тим, що зв'язуванють шляхом короткочасного нагріву до 56 °C з меня з епітопами першого, але не другого типу, потою інактивації системи комплементу. рушується у присутності денатуруючих Поняття "інгібування фосфорилування протеїрозчинників. нкінази В (РКВ)» відноситься до інгібування, яке Антитіла, пропоновані у винаході, інгібують виявляють за допомогою клітинного аналізу фосфосфорилування тирозину IGF-IR і переважно форилування з використанням клітин лінії ЗТЗ, що також фосфорилування тирозину РКВ в близькій експресують по 400000-600000 молекул IGF-IR на мірі. клітину в середовищі, що містить 0,5 % фетальної Антитіла, пропоновані у винаході, переважно телячої сироватки (FCS) інактивованої тепловою здійснюють знижуючу регуляцію рівня білка IGF-IR обробкою, при порівнянні з результатами такого в пухлинних клітинах і в пухлинах, наприклад, в аналізу без присутності антитіла. Фосфорилування ксенотрансплантованих пухлинах. виявляють методом Вестерн-блоттінга з викорисАнтитіла, пропоновані у винаході, переважно танням антитіла, специфічного відносно РКВ, фоінгібують тривимірне розростання пухлинних клісфорильованої на залишку серіну в положенні 473 тин в аналізі утворення колоній, а також проліфеРКВ (Акт 1,Swiss Prot Ace.No.P31749). Такий анарацію клітин, що експресують IGF-IR (наприклад, ліз описаний в прикладі 11. клітини лінії NIH ЗТЗ). Поняття "антитіло-обумовлена клітиннозалежАнтитіла, пропоновані у винаході, переважно на цитотоксичність (ADCC)» відноситься до лізису не інгібують зв'язування інсуліну з рецептором людських пухлинних клітин-мішеней за допомогою інсуліну в аналізі конкурентного зв'язування на антитіла, пропонованого у винаході, у присутності клітинах лінії ЗТЗ, що надекспресують рецептор ефекторних клітин. ADCC переважно вимірюють інсуліну, в концентрації 200 нмолей/л. шляхом обробки препарату клітин, які експресують Антитіла, пропоновані у винаході, отримують IGF-IR, антитілом, пропонованим у винаході, у методом рекомбінації в СНО-клітинах, де відбуваприсутності ефекторних клітин, таких як свіжовидіється повне фукозилування антитіла. Для здійслені РВМС (мононуклеарні клітини периферичної нення експресії білка нуклеїнові кислоти, що кодукрові) або очищені ефекторні клітини з лейкоцитють легкий і важкий ланцюги або їх фрагменти, них плівок, такі як моноцити або NK-клітини (привбудовують в експресійні вектори за допомогою родні клітини-кілери). стандартних методів. Експресію здійснюють в таПоняття "повне інгібування опосередкованої ких СНО-клітинах і антитіло виділяють з клітин (з IGF-I трансдукції сигналу" відноситься до інгібусупернатанту або клітин після лізису). вання опосередкованого IGF-I фосфорилування Придатні СНО-клітини-господарі можна отриIGF-IR. У такому аналізі клітини, що експресують мувати за допомогою методу, що полягає в тому, IGF, переважно клітини лінії Н322М, стимулюють що культивують СНО-клітини, трансфектовані нукIGF-I і обробляють антитілом, пропонованим у леїновою кислотою, яка кодує антитіло, пропоновинаході (можна застосовувати антитіло в конценване у винаході, в умовах тиску відбору з використрації 5нМ або більше). Потім здійснюють ДСНтанням DHFR, відбирають окремі клони, 15 95284 16 розмножують клони і відбирають клон, що продуся для котрансфекції, є аденозиндезаміназа кує антитіло, що має схему глікозилювання, про(Kaufman R.J. і ін., Ргос. Natl.Acad.Sci.USA83,1986, поновану у винаході. Переважно культивування ее. 3136-3140), аспарагінсинтетаза (Cartier М. і ін., здійснюють протягом щонайменше двох, переважМоl.Cell Biol.7,1987, cc. 1623-1628), ген trpB E.coli і но щонайменше трьох тижнів. СНО-клітина переген hisD Salmonella (Hartman S.C. і Mulligan R.C., важно є клітиною лінії DG44. Proc.Natl.Acad.Sci.USA85,1988,cc.8047-8051), миПоняття "СНО-клітина" відноситься до різних шача рибонуклеотидредуктаза M2 (Thelander М. і форм клітин яєчника китайського хом'яка (СНО), Thelander L., EMBO J.8,1989,cc.2475-2479), людсьзаснованих на двох неактивних, переважно видакий ген, що обумовлює стійкість до багатьох лікарлених шляхом делеції алелях dhfr (дефіцит дигідських засобів (Kane S.E. і ін., Gene84,1989, с. 439рофолатредуктази (dhfr )). Такі dhfr - клітини і ме446), глутамінсинтетаза (Bebbington C.R. і ін., DNA тоди їх одержання описані, наприклад, у Urlaub G. Cloning, том III, під ред. D.M.Glover, вид-во IRL І ін., Cell 33,1983, сс. 405-412;Chasin L. і ін., Press, 1987,cc.163-188), ксантин-гуанінSom.Cell Molec.Genet.12, 1986, сс. 555-556; фосфорибозилтрансфераза (gpt) (Mulligan R.C. і Kolkekar A.S. і ін., Biochemistry 36,1997, сс. 10901Berg, P., Science209,1980,cc.1422-1427), гігроміцин 10909. Переважно клітина є клітиною лінії DG44. В (Santerre R.F. і ін., Gene30,1984,cc.147-156), ген Такі dhfr -клітини СНО можна отримувати з виконеоміцину (Southern PJ. і Berg P., J. Моl. ристанням гамма-випромінювання для видалення Appl.Genet.1,1982,cc.327-341). Селектовані маркевсього локусу dhfr. У клітках дикого типу, що не ри можуть також бути основою, за допомогою якої мають мутації, dhfr є ферментом, необхідним для можна здійснювати ампліфікацію генів, що кодусинтезу de novo гліцину, пуринів і тимідилату. Це ють антитіло. При здійсненні котрансфекції лінії дозволяє використовувати ген dhfr, що кодується клітин СНО векторні ДНК часто інтегрують в хроплазмідами, як домінантного селектованого мармосому клітини в один і той самий локус. Таким кера і гена-ампліфікатора для експресії білків в чином, використання тільки одного з селектованих dhfr -клітинних лініях (клітинних лініях з дефіцитом маркерів як основи для ампліфікації, як правило, dhfr). dhfr -мутація у клітках лінії DG44 є стабільпризводить до паралельного збільшення кількості ною і необоротною. СНО-клітини, успішно котранкопій обидвох генів. Одним з конкретних селектосфектовані експресійним(и) вектором(ами), що ваних маркерів, що застосовуються таким шляхом, несуть антитіло людського IgGl- або IgG3-типу і є dhfr, який дозволяє здійснювати необхідну амп+ ген DHFR, повинні мати фенотип dhfr і їх можна ліфікацію при використанні зростаючих концентлегко відбирати шляхом вирощування колоній на рацій МТХ. Другим переважним селектованим масередовищах, що не містять тимідин і гіпоксантин і ркером є GS, який дозволяє здійснювати що необов'язково містять метотрексат (МТХ) для ампліфікацію при додаванні метионінсульфоксиампліфікації. міну (MSX). Клітини лінії DG44 добре відомі з існуючого ріСелектовані маркери, звичайно, знаходяться вня техніки і їх можна купувати у вигляді клітин під контролем регуляторних елементів ДНК, що ліній, що надходять на ринок, наприклад, від фірзабезпечує їх експресію. У разі використання dhfr ми Invitrogen Corp. (США). Клітини лінії DG44 мояк селектованого маркера переважно застосовужуть рости в прикріпленому стані, в суспензії і/або ють регуляторні елементи з вірусних джерел, з в безсироватковому середовищі. У контексті дійстаких, як ДНК пухлинних вірусів. Особливо переного опису поняття "клітина", "клітинна лінія" і "кліважно застосовувати головний пізній промотор тинна культура" використовуються зі взаємозаміSV40 або аденовірусу. В цьому випадку особливо ною, і всі такі позначення стосовно dhfr -клітинних переважно видаляти енхансерний елемент з проліній СНО (з делецією двох алелей dhfr) включамотору, тим самим ефективно "ушкоджуючи" його. ють потомство. Так, поняття "трансформанти" і Така модифікація дозволяє підвищувати рівні ам"трансформовані клітини" відносяться до первинпліфікації гена при кожній вибраній концентрації ної даної клітини і одержаних з неї культур безвідметотрексату, що в іншому випадку досягається носно до кількості пересівань. Слід розуміти також, при використанні сильного промотору. У разі защо все потомство може не бути повністю ідентичстосування неоміцину як селектованого маркера, ним за складом ДНК через навмисні або випадкові прикладом придатного промотору є мишачий промутації. Під об'єм винаходу підпадають варіанти мотор металотіонеїну. потомства, що мають такі ж особливості схеми Загальні методи рекомбінантного одержання глікозилювання, які вибрані шляхом скринінгу поантитіл добре відомі з існуючого рівня техніки, і чаткових трансформованих клітин. вони описані, наприклад, в оглядових статтях Переважно dhfr -клітинну лінію СНО піддають Makrides S.C., Protein Expr.Purif.17,1999, ее. 183коампліфікації щонайменше з DHFR, як єдиного 202;Geisse S. і ін., Protein Expr. Purif.8,1996,cc.271селектованого маркерного гена. Наприклад, здійс282;Kaufman R.J., Моl. Biotechnol.16,2000,cc.151нюють сумісну трансфекцію клітин-реципієнтів 161;Werner R.G., Drug Res.48,1998,cc.870-880. СНО експресійним вектором для експресії в клітиАнтитіла можуть бути присутніми в цілих клінах ссавцям, що містять селектований(і) маркер(и) тинах, в супернатанті, клітинному лізаті або моі ген антитіла. Колонії, що утворилися, можна піджуть знаходитися в частково очищеній або пракдавати селекції, колонії, що володіють очікуваним тично чистій формі. Очищення для видалення фенотипом, володіють здатністю експресувати інших клітинних компонентів або інших домішок, антитіло. Додаткові селектовані маркери не є або наприклад, інших клітинних нуклеїнових кислот можуть не бути домінантними. Прикладами додатабо білків, здійснюють за допомогою стандартних кових селектованих маркерів, що використовуютьметодів, включаючи обробку лугом/ДСН, CsCl 17 95284 18 бендінг, хроматографію на колонках, електрофоAleuritesfordii, білки діантину, білки Phytolaca рез в агарозному гелі і інші методи, добре відомі в americana (РАРІ, РАРІІ, і РАР-S), інгібітор даній галузі (див. в Current Protocols in Molecular Momordica charantia, курцин, кротин, інгібітор Biology, під ред. Ausubel F. і ін., вид-во Greene Sapaonaria officinalis, гелонін, мітогелін, рестрикPublishing and Wiley Interscience, New York, 1987). тоцин, феноміцин, еноміцин і трикотецени. Контролюючі послідовності, які можна застоКон'югати антитіла і цитотоксичного агента совувати для прокаріотичних організмів, являють отримують з використанням різноманітних біфунксобою, наприклад, промотор, необов'язково опеціональних агентів для зшивання білків, таких як раторну послідовність і сайт зв'язування рибосом. N-сукцинімідил-3-(2-піридилдитіол) пропіонат Відомо, що для еукаріотичних клітин застосовують (SPDP), імінотіолан (IT), біфункціональні похідні промотори, енхансери і сигнали поліаденілування. складних імідоефірів (такі як диметиладипімідатНуклеїнова кислота "функціонально зв'язана", НСІ), активні складні ефіри (такі як дисукцинімідиколи вона знаходиться у функціональному зв'язку лсуберат), альдегіди (такі як глутаровий альдегід), з іншою нуклеотидною послідовністю. Наприклад, біс-азидопохідні (такі як біс(пара-азидобензоїлу) ДНК передпослідовності або лідерної секреторної гександіамін), похідні біс-діазонію (такі як біс(парапослідовності функціонально зв'язана з ДНК полідіазонійбензоїл) етилендіатнін), діізоціанати (такі пептиду, якщо при її експресії утворюється передяк толуол-2,6-діізоціанат) і біс-активні фторвмісні білок, який бере участь в секреції поліпептиду; сполуки (такі як 1,5-дифтор-2,4-динітробензол). промотор або енхансер функціонально пов'язаний Наприклад, імунотоксин рицину можна отримувати з кодувальною послідовністю, якщо він спричиняє згідно методу, описаному у Vitetta E.S. і ін., вплив на транскрипцію послідовності; або сайт Science238,1987, сс. 1098-1104). Мічена за допо14 зв'язування рибосом функціонально пов'язаний з могою С 1-ізотіоціанатбензил-3кодувальною послідовністю, якщо він розташоваметилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (MXний так, що полегшує трансляцію. Як правило, DTPA) є прикладом хелатуючого агента, що застопоняття "функціонально зв'язана" означає, що совується для кон'югації радіонуклеотиду з антитіпослідовності ДНК, будучи зв'язані, є суміжними, а лом (див. WO94/11026). у разі лідерної секреторної послідовності, є суміжНаступним об'єктом дійсного винаходу є комними і знаходяться в рамці зчитування. Проте не позиція, наприклад, фармацевтична композиція, потрібно, щоб енхансери були суміжними. Зв'язуяка містить антитіло, пропоноване в дійсному вивання здійснюють шляхом лігування у відповідних наході, включене до складу препаративної форми сайтах рестрикції. Якщо такі сайти не існують, то у поєднанні з фармацевтично прийнятним носієм. відповідно до прийнятої практики застосовують Фармацевтичні композиції, пропоновані у висинтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери. наході, можна застосовувати також в сумісній теМоноклональні антитіла можна відокремлюварапії, тобто у поєднанні з іншими засобами. Нати від культурального середовища гібридоми за приклад, для сумісної терапії можна застосовувати допомогою загальноприйнятих методів очистки композицію, пропоновану в дійсному винаході, в імуноглобулінів, таких, наприклад, як, хроматогпоєднанні щонайменше з одним протипухлинним рафія на протеїн А-сефарозі, хроматографія на засобом, таким як агент хіміотерапії, цитотоксичгідроксилапатиті, гель-електрофорез, діаліз або ний агент або проліки, або іншою загальноприйняафінна хроматографія. ДНК і РНК, які кодують мотою терапією. ноклональні антитіла, можна легко виділяти з гіб"Засобом хіміотерапії" є хімічна сполука, яку ридоми і секвенірувати за допомогою загальнопможна застосовувати при лікуванні раку. Прикларийнятих методів. Клітини гібридом можуть дами хіміотерапевтичних засобів є адриаміцин, служити джерелом такої ДНК і РНК. Після ідентидоксорубіцин, 5-фторурацил, цитозину арабіносид фікації і виділення ДНК можна вбудовувати в екс("ARA-C"), циклофосфамід, тіотепа, таксотер (докпресійні вектори, якими потім трансфектують сетаксел), бусульфан, гемцитабін, цитоксин, такСНО-клітини, які інакше не можуть продукувати сол, метотрексат, цисплатин, мелфалан, вінбласбілок імуноглобуліну, для синтезу рекомбінантних тин, блеоміцин, етопосид, іфосфамід, мітоміцин С, моноклональних антитіл в клітинах-господарях. мітоксантрон, вінкристин, вінорелбін, карбоплатин, Винахід відноситься також до імунокон'югатів, теніпосид, дауноміцин, карміноміцин, аміноптерін, що містить антитіло, пропоноване у винаході, дактиноміцин, мітоміцини, еспераміцини (див. кон'юговане з цитотоксичним агентом, таким як US4675187), мелфалан і інші споріднені похідні агент хіміотерапії, токсин (наприклад, що володіє гірчичного газу. ферментативною активністю токсин бактеріальноУ контексті опису поняття "цитотоксичний заго, грибного, рослинного або тваринного похосіб" відноситься до субстанції, яка інгібує або педження або його фрагменти), радіоактивний ізотоп решкоджає функції клітин і/або викликає деструк(тобто радіокон'югат) або проліки цитотоксичного цію клітин. Слід розуміти, що поняття включає агента. Агенти, яких можна застосовувати для радіоактивні ізотопи, засоби хіміотерапій і токсини, одержання таких імунокон'югатів, описані вище. До такі токсини бактерійного, грибного, рослинного токсинів і їх фрагментів, що володіють ферментаабо тваринного походження, що володіють фертивною активністю, які можна застосовувати, відментативною активністю. носяться ланцюг А токсину дифтерії, активні фраУ контексті дійсного опису поняття "проліки" гменти токсину дифтерії, що не зв'язуються, відноситься до попередника або похідної субстанланцюг А ендотоксину (з Pseudomonas ції, що володіє фармацевтичною активністю, яке aeruginosa), ланцюг А рицину, ланцюг А абрину, володіє меншою цитотоксичністю відносно пухланцюг А модецину, альфа-сарцин, білки линних клітин, ніж батьківський лікарський засіб, і 19 95284 20 володіє здатністю активуватися або перетворювастерильні порошки для приготування стерильних тися під дією ферментів в активнішу батьківську ін'єкційних розчинів або дисперсій безпосередньо форму (див., наприклад, Wilman D.E., Biochemical перед введенням. Застосування таких середовищ і Society Transactions14,1986, cc. 375-382, і Stella агентів для субстанцій, що володіють фармацевV.J. і ін., "Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted тичною активністю відомо в даній галузі. Drug Delivery", в: Directed Drug Delivery, під ред. У контексті дійсного опису поняття "парентеBorchardt R.T., вид-во Humana Press, Clifton, New ральне введення" і "введення парентеральним Jersey, 1985,cc.247-267). До проліків, пропоновашляхом" означають шляхи введення, відмінні від них в дійсному винаході, відносяться (але не обентерального і місцевого введення, як правило, межуючись тільки ними) фосфатвмісні проліки, вони відносяться до введення шляхом ін'єкції і тіофосфатвмісні проліки, сульфатвмісні проліки, включають (але не обмежуючись тільки ними) внупептидвмісні проліки, проліки з модифікованими Dтрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоарамінокислотами, глікозильовані проліки, що містеріальну, підоболонкову, внутрішньоочну, внутрітять (-лактамове кільце проліків, проліки, що місшньосерцеву, внутрішньошкірну, тять необов'язково заміщений феноксиацетамід внутрішньочеревну, транстрахеальну, підшкірну, або проліки, що містять необов'язково заміщений субкутикулярну, внутрішньосуставну, субкапсуляфенілацетамід, 5-фторцитозині інші 5рну, субарахноїдальну, інтраспинальну, епідурафторурідинвмісні проліки, які можуть перетворюльну і інтрастернальну ін'єкцію і інфузію. ватися на вільні лікарські засоби, що володіють Вказані композиції можуть містити також ад'юбільшою цитотоксичною активністю. Прикладами ванти, такі як консерванти, змочуючі агенти, емуцитотоксичних лікарських засобів, які можна дерильгатори і диспергуючі агенти. Відсутність мікроорватизувати з одержанням форми у вигляді проліків ганізмів можна забезпечувати як за допомогою для застосування згідно дійсного винаходу, є (але процедур стерилізації (див. вище), так і шляхом не обмежуючись тільки ними), вказані вище хіміовключення різних антибактеріальних і протигрибтерапевтичні засоби. кових засобів, таких, наприклад, як парабен, хлорУ контексті дійсного опису поняття "фармацебутанол, фенол, сорбінова кислота і тощо. Може втично прийнятний носій" включає будь-який і всі виявитися доцільним включати в композиції агенти розчинники, дисперсійні середовища, покриття, для надання ізотонічності, такі як цукри, хлорид антибактеріальні і протигрибкові агенти, агенти, натрію і тощо. Крім того, можна пролонгувати абщо додають ізотонічність і уповільнюють абсорбсорбцію ін'єкційної фармацевтичної форми шляцію, і тощо, які є фізіологічно сумісними. Переважхом включення речовин, які уповільнюють абсорбно носій можна застосовувати для внутрішньовенцію, таких як моностеарат алюмінію і желатин. ного, внутрішньом'язового, підшкірного, Незалежно від вибраного шляху введення парентерального, спинального або епідермальносполуки, пропоновані в дійсному винаході, які мого введення (наприклад, шляхом ін'єкції або інфужна застосовувати в придатній гідратованій формі, зії). і/або фармацевтичні композиції, пропоновані в У контексті дійсного опису поняття "фармацедійсному винаході, готують у вигляді фармацевтивтично прийнятна сіль" відноситься до солі, яка чно прийнятних форм лікарського засобу за допозберігає необхідну біологічну активність антитіла і могою загальноприйнятих методів, відомих фахівне надає ніяких небажаних токсикологічних дій цям в даній галузі. (див., наприклад, Berge S.M. і ін., Фактичні рівні доз речовин, що діють, у фарJ.Pharm.Sci.66,1977, сс. 1-19). Такі солі підпадають мацевтичних композиціях, пропонованих в дійснопід об'єм винаходу. Прикладами таких солей є му винаході, можна варіювати для одержання кікислотно-адитивні солі і солі приєднання основ. До лькості діючої речовини, яка є ефективною для кислотно-адитивних солей відносяться солі, утводосягнення необхідної терапевтичної відповіді у рені з нетоксичними неорганічними кислотами, такі конкретного пацієнта при використанні конкретної як гідрохлориди. композиції і шляху введення, але не є токсичною Композицію, пропоновану в дійсному винаході, для пацієнта. Вибраний рівень доз повинен залеможна вводити за допомогою різних методів, відожати від різних фармакокінетичних факторів, мих в даній галузі. Як повинно бути очевидно фавключаючи активність конкретних застосовуваних хівцеві в даній галузі, шлях і/або форма введення композицій, пропонованих в дійсному винаході, може варіюватися залежно від необхідних резульшлях введення, час введення, швидкість екскреції татів. конкретної застосовуваної сполуки, тривалість Для введення сполуки, пропонованої у виналікування, інші лікарські засоби, сполуки і/або маході, за допомогою певних шляхів введення може теріали, які використовують у поєднанні з конкретвиявитися необхідним наносити на сполуку покними застосовуваними композиціями, вік, стать, риття з матеріалу, що перешкоджає його інактивавагу, стан, загальний стан здоров'я і попередню ції, або здійснювати введення сполуки сумісно з історію хвороби пацієнта, що піддається лікувантаким матеріалом. Наприклад, сполуку можна ню, і інші подібні фактори, добре відомі в галузі вводити індивідуумові у відповідному носієві, намедицини. приклад, в ліпосомах або в розчиннику. До фарКомпозиція повинна бути стерильною і текумацевтично прийнятних розчинників відносяться чою в тій мірі, щоб її можна було вводити за допофізіологічний розчин і водні забуферовуючі розчимогою шприца. Окрім води переважним носієм є ни. ізотонічний забуферений фізіологічний розчин. До фармацевтично прийнятних носіїв відноВідповідну текучість можна підтримувати, насяться стерильні водні розчини або дисперсії і приклад, шляхом використання покриття, такого як 21 95284 22 лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру Лінії клітин частинок у разі дисперсії і шляхом застосування Батьківська лінія клітин, яку використовували поверхнево-активних речовин. У багатьох випаддля створення лінії клітин, що експресують рекомках переважно включати в композицію агенти для бінантний IgG, була лінією клітин яєчника китайсьнадання ізотонічності, наприклад, цукри, багатоакого хом'яка (СНО) CHO-DG44 (Flintoff W.F. і ін., томні спирти, такі як маніт або сорбіт, і хлорид Somat.Cell Genet.2,1976, ее. 245-261;Flintoff і ін., натрію. Моl. Cell.Biol.2,1982, сс. 275-285;Urlaub G. і ін., Переважно повністю фукозиловане антитіло, Cell33,1983, сс. 405-412;Urlaub G. і ін., Somat.Cell пропоноване у винаході, слід застосовувати для Моl. Genet.12,1986, сс. 555-566). У клітинах лінії лікування недрібноклітинного раку легені (NSCLC) CHO-DG44 відсутні обидва ендогенних локуса у поєднанні з ерлотинібом (Tarceva®), для лікуферменту дигідрофолатредуктази (DHFR). вання раку молочної залози - у поєднанні з Клітини лінії CHO-DG44 вирощували в сереHerceptin® (трастузумаб) і пухлин підшлункової довищі MEM alpha Minus (фірма Gibco № 22561), залози - переважно у поєднанні з гемцитабіном доповненому 10 % діалізованою FCS (фірма Gibco (Gemzar®). № 26400-044) і 2 ммолями/л L-глутаміну, 100 мкМ Нижче приведені приклади, креслення і перегіпоксантином, ібмкМ тимідином (НТ-добавка). лік послідовностей для полегшення розуміння дійПлазміди сного винаходу, дійсний об'єм якого викладений у Експресійна система містила промотор CMV і формулі винаходу, що додається. Слід мати на вона описана в таблиці 1. Як антитіло використоувазі, що в описані процедури можна вносити мовували антитіло до IGF-1R (WO2005005635; АК18 дифікації без відхилення від суті винаходу. або АК22). Приклади 23 Приклад 1 Трансфекція і відбір Трансфекцію експресійною плазмідою здійснювали за допомогою препарату Fugene (фірма Roche Diagnostics GMBH). Через один день після трансфекції клітини лінії DG44 піддавали тиску відбору в середовищі, що є середовищем MEM alpha Minus, доповненим 10 % діалізованою FCS і 2 ммолями/л L-глутаміну і 20нМ метотрексатом (МТХ). Після витримки протягом 3 тижнів в умовах тиску відбору з планшета відбирали окремі клони і розмножували. Збирали супернатанти і присутність антитіла виявляли за допомогою специфічного відносно людського IGG ELISA. Потім субклони розмножували і аналізували відносно продукування специфічного антитіла. Клони адаптували до росту в суспензійній культурі і безсироватковому середовищі HYQ SFM4CHO-Utility (HyClone № SH30516), доповненому 20нМ МТХ. Паралельно визначали профіль глікозилювання. Відбирали субклони, які характеризувалися мірою дефукозилування, що становить 2,0 % або менше (по відношенню до загальної молярної кількості олігосахаридів). Приклад 2 Культивування і очищення 5 Клітини (3 х 10 ) вирощували в колбах, що струшувалися, місткістю 125 мл (фірма Corning), 95284 24 що містять по 30 мл середовища, при 37 °C, 5 % СО2;100 об./хв. Щільність клітин вимірювали за допомогою лічильника типу CASY Counter і супернатант відбирали для визначення концентрації антитіла за допомогою афінної хроматографії на протеїні А. Приблизно по 20 мл кожного супернатанту очищали для подальшої біохімічної характеризації за допомогою хроматографії на протеїні А (урівноваження ЗФР, відмивання 25мМ натрійцитратним буфером, рН 5,2, елюювання 100мМ натрій-цитратним буфером, рН 2,8, СІР з використанням 10мМ NaOH). Приклад 3 Аналіз глікоструктури антитіла Матеріал, що є очищеним антитілом, аналізували з використанням пептидної карти, одержаної за допомогою рідинної хроматографії/масспектрометрії (РХ-МС). Зразки відновлювали (0,4М Tpic/hcl, 8M гуанідин/НСІ, рН 8,5, ДТТ (3 мг/мл), карбоксикінці метилювали (йодоцтова кислота) і розщеплювали трипсином. Пептиднуглікопептидну суміш розділяли за допомогою ОФРХВР і аналізували в он-лайновому режимі за допомогою мас-спектрометрії з іонізацією електроспреєм. Інтегрували m/z-спектри пептиду, що містить глікоструктуру, результати представлені в таблиці 2. 25 95284 26 Таблиця 2 Відносна кількість глікозильованих варіантів Клон № 1 2 3 4 5 6 7 8 1 G0 [%] 38,4 44,3 42,8 49,2 62,7 60,4 40,4 46,9 G1 [%] 51,4 47,6 48,7 43,6 33,0 35,5 49,8 45,9 Man: структури з високим вмістом манози, які несуть чотири і п'ять залишків манози відповідно; G0, G1, G2: відновлені важкі ланцюги з фукозилованим вуглеводом біантенного складного типу, що має 1,2 або 3 кінцевих залишків галактози; NonFuc: відновлені важкі ланцюги з вуглеводом біантенного складного типу без фукозних залишків. Клон 5 ліній клітин СНО (hu MAbBl4E10_9-16) депонував відповідно до Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей процедури патентування в Німецькій колекції мікроорганізмів і клітинних культур НМБН (DSMZ)), Німеччина, 21 червня 2006 р. під реєстраційним номером DSM АСС 2795. Середовища, що застосовуються для культивування різних клонів, отримували від фірми Hyclone (HYQ SFM4CHO-Utility застосовували для G2 [%] 10,2 8,1 8,5 7,2 4,3 4,2 9,8 7,3 NonFuc[%] 0,1 0,1 0,2 0,3 0,6 0,5 0,3 0,3 1 Man [%] 0,5 0,6 0,8 1,2 1,0 1,2 0,6 1,1 клонів 4-6) або фірми Sigma (C-8862 застосовували для клонів 1-3 і 7). Аналіз одержаної з допомогою РХ-МС пептидної карти здійснювали шляхом інтеграції специфічних іонних хроматограм всіх заряджених станів для всіх глікопептидів. Розгалужені GlcNac, NGNA і структури з високим вмістом манози визначали таким самим чином. Розгалужені GlcNac і NGNA не були виявлені. Отже, кількість NGNA складає 0,5 % або менше, а також 0,1 % або менше. Кількість розгалужених GlcNac також складає 0,5 % або менше, і 0,1 % або менше. Приклад розрахунку ступеня глікозилювання представлений в таблиці 3 (таблиця 2а: клон 3, таблиця 36: клон 5; пептид, asn298, що містить, позначений як Н27). 27 площа: площа піку; H27_G0-H27_G4: глікопептид Н27 (що містить Asn298) з фукозилованим вуглеводом біантенного складного типу, що містить х-кінцеву галактозу (наприклад, G4 з 4 одиницями галактози); відносна кількість без Fuc: процентний вміст Fuc по відношенню до всіх G0, G1, G2 без манозної (4 і 5) глікоструктури (високий вміст манози); H27_G1_1NGNA-H27_G3_2NGNA: глікопептид Н27 (що містить Asn298) з фукозилованим вугле 95284 28 водом біантенного складного типу, що містить хкінцеві галактозні ланки (наприклад, G2 з 2 ланками галактози), який має один-два залишку Nгліколілнейрамінової кислоти; відносна кількість без Fuc: процентний вміст Fuc по відношенню до всіх G0, G1, G2 без манозної (4 і 5) глікоструктури (з високим вмістом манози). 29 Для вивчення дії антитіл на ADCC, клітки раку передміхурової залози лінії DU145 (НТВ081 АТСС; 6 1x10 в 2-4 мл середовища RPMI-FM), що експресують IGF-IR, мітили з використанням 1 мкл розчину біс(ацетоксіметил)-2,2':6'2"-терпіридин-6,6"дикарбоксилата (BATDA) протягом 25 хв при 37 °C в інкубаторі для клітин. Клітини відмивали чотири рази за допомогою 10 мл середовища RPMI-FM і центрифугували протягом 10 хв при 200xg з гальмуванням. Після цього концентрацію кліток дово5 дили до 1 x 10 клітин/мл. Клітини висівали з розрахунку 5000 клітин/лунку в круглодонний планшет в об'ємі, що відповідає 50 мкл. Антитіла HuMAb додавали в кінцевій концентрації 25-0,1 нг/мл в 50 мкл середовища для культури клітин. Потім додавали 50 мкл ефекторних клітин, таких як РВМС, свіжовиділених з цілісної крові, або очищених ефекторних клітин з лейкоцитних плівок, в співвідношенні Е:Т, що становить 25:1. Відразу після цього планшети центрифугували протягом 1 хв при 200xg з гальмуванням і інкубували протягом 2 год. при 37 °C. Після інкубації клітини центрифугували протягом 10 хв при 200xg і 20 мкл супернатанта переносили в титрувальний мікропланшет типу Optiplate 96-F. Додавали 200 мкл розчину європію (при кімнатній температурі) і суміш інкубували протягом 15 хв на шейкері. Флуоресценцію, що випускається, вимірювали за допомогою флуориметра з тимчасовим дозволом з використанням протоколу EU-TDA фірми Perkin Elmer. 95284 30 Ступінь лізису клітин в результаті ADCC виражали у вигляді % від максимального вивільнення TDA з клітин-мішеней, що піддалися лізису в результаті дії поверхнево-активної речовини, скоректованої на спонтанне вивільнення TDA з відповідних клітин-мішеней. Як використовуваний для порівняння стандарт антитіла, "що не володіє ADCC", використовували (моноклональне) антитіло до KLH (гемоціанін лімфи равлика) такого ж IgG-типу або суміші IgG, одержаної приблизно від 35000 донорів ("Redimune"). Як позитивний контроль використовували антитіло до IGF-IR із зменшеним на 75 % вмістом фукози. Антитіло, пропоноване у винаході, викликало вивільнення TDA, яке знаходилося в межах 3хС.К.О. щодо вивільнення TDA, що викликається стандартним антитілом (фіг. 1). Приклад 5 Визначення афінності антитіл IGF - IR до IGF - IR прилад: BIACORE ® 3000 чіп: СМ 5 амінове поєднання: поєднання HBS (HEPES, буфер: NaCl), pH 7,4,25 °C Для оцінки афінності антитіла до людського FC (з кролика) зв'язували з поверхнею чіпу з метою презентації антитіла для IGF - IR. Додавали позаклітинний домен IGF - IR в різних концентра 31 95284 32 ціях в розчині. Асоціацію оцінювали, здійснюючи ром протягом 5 хв. Результати оцінки афінності ін'єкцію IGF - IR протягом 3 хв; дисоціацію оцінюантитіл 18 і 22 представлені в таблиці 4. вали, здійснюючи відмивання поверхні чіпу буфеТаблиця 4 Результати оцінки афінності, одержані за допомогою SPR (BIACORE ®3000) Антитіло 18 22 ka (1/мс) 5 1,49 x 10 5 1,47 x 10 Приклад 6 Інгібування зв'язування IGF - I і IGF - II з пухлинними клітинами, що експресують IGF - IR Для оцінки здатності антитіла, пропонованого у винаході, блокувати зв'язування лігандів IGF - I і IGF - II з рецептором IGF - I (IGF - IR) здійснювали експерименти по конкурентному зв'язуванню з використанням радіоактивномічених пептидів лігандів. Людські пухлинні клітини (НТ29,NCI H322M, 5 0,5 - 1 x 10 /мл) висівали в середовище RPMI1640 (фірма РАА, каталожний номер Е15 - 039), доповнену 2мМ L - глутаміном, 1 ч замінимими амінокислотами (фірма Gibco, каталожний номер 11140 035), імМ піруватом натрію (фірма Gibco, каталожний номер 11360 - 039) і 10 % FCS інактивованої тепловою обробкою (фірма РАА, каталожний номер А15 - 771). Для здійснення експерименту інокулювали шість колб формату ТІ7520 мл клітин у відповідному середовищі і культивували протягом двох днів при 37 °C і 5 % СО2 до одержання конфлюентних моношарів клітин. Для збору індивідуальних клітин додавали по 2 мл 1 трипсин/ЕДТК (фірма Gibco, каталожний номер 25300 - 054) на Т175-колбу і спостерігали за відділенням клітин за допомогою мікроскопа типу Zeiss Axiovert25. Клітини збирали і додавали описане вище середовище, що містить 10 % FCS, до одержання кінцевого об'єму 50 мл. Клітини повторно виділяли шляхом центрифугування протягом 10 хв при 1000 об/хв (фірма Heraeus sepatech, центрифуга типу Omnifuge 2.0 RS) і ресуспендували в 50 мл буфера для зв'язування (120мМ NaCl, 5мМ КС1,1,2мМ MgSO4, 1мМ ЕДТК, 10мМ D(+) глюкоза, 15мМ NaAc, 100мМ Hepes, pH 7,6,1 % БСА). Клітини підраховували, повторно виділяли шляхом центрифугування і доводили їх концент6 рацію до 1 х 10 клітин/мл за допомогою буфера для зв'язування. 125 Мічені за допомогою І пептиди IGF - I і IGF II (фірма Amersham- 2000 Ки/ммоль, каталожні номери ІМ172 і ІМ238), солюбілізовані в 0,1 % СН3СООН, розводили в буфері для зв'язування до досягнення кінцевої активності, що становить 4 ч 5 10 імпульсів /(хв ч мл). 75 мкл антитіла в певних концентраціях разом з 25 мкл заздалегідь розве125 деного міченого за допомогою 1 пептиду IGF - I або IGF - II додавали до 200 мкл суспензії клітин і інкубували протягом 3,5 год. при 4 °C. Клітини повторно виділяли шляхом центрифугування протягом 5 хв при 2000 об/хв (фірма Eppendorf, центрифуга типу 5415С) і видаляли супернатант. Після двократного відмивання в 1 мл буфера для зв'язування клітини ресуспендували в 1 мл буфера для kd (1/с) -7 1,03 × 10 -5 9,64 x 10 KD(M) -13 6,95 x 10 -10 6,56 × 10 зв'язування і переносили в сцинтиляційні флакони. Кількість радіоактивного пептиду, зв'язаного з рецепторами клітинної поверхні, вимірювали за допомогою сцинтиляційного лічильника. Середні значення ІС50 для антитіла 18 складали 0,3нМ. Не було виявлено інгібування зв'язування IGF - II, що можна виявити. Приклад 7 Аналіз конкурентного зв'язування антитіла з IGF - IR Для епітопного картування моноклональних антитіл до IGF - IR був вибраний формат, аналогічний формату для оцінки афінності (приклад 5), але IGF - IR заздалегідь інкубували щонайменше протягом 0,5 год. при КТ з антитілом в розчині. Цю суміш ін'єктували і виявляли зв'язування з IGF - IR (або його інгібування). Цей аналіз дозволяє оцінювати реципрокну інгібуючу активність моноклональних антитіл відносно зв'язування з IGF - IR. Було встановлено, що антитіла, пропоновані у винаході, конкурують за зв'язування з IGF - IR з антитілом  IR3, яке, як відомо, зв'язується з ак 217 - 274 (Gustafson Т.А. і Rutter, W.J., J.Biol.Chem.265,1990, сс. 18663 - 18667). Приклад 8 Інгібування опосередковаго IGF - I фосфорилування IGF - IR і Akt/PKB Для оцінки здатності антитіла, пропонованого у винаході, інгібувати активацію і фосфорилування рецептора IGF - I (IGF - IR) здійснювали експерименти по вивченню конкурентного зв'язування з використанням пептиду IGF - I і подальший аналіз методом Вестерн - блоттінга з використанням антитіл, що володіють специфічністю відносно фосфорильованого тирозину. Людські пухлинні клітини (НТ29,NCI H322M, 5 4 х 10 /мл) висівали в середовище RPMI 1640 (фірма РАА, каталожний номер Е15 - 039), доповнену 2мМ L - глутаміном, їх замінними амінокислотами (фірма Gibco, каталожний номер 11140 - 035), 1мМ піруватом натрію (фірма Gibco, каталожний номер 11360 - 039) і 0,5 % FCS інактивованої тепловою обробкою (фірма РАА, каталожний номер А15 771). Для оцінки величин ІС50 для кожного експерименту здійснювали інокуляцію 12-лункових планшетів з використанням 1 мл клітин у відповідному середовищі і культивували протягом 2 днів при 37 °C і 5 % СО2. Після культивування протягом 48 год. в середовищі з низьким вмістом сироватки середовище обережно видаляли і замінювали антитілом, розбавленим відповідним середовищем до різних концентрацій. Після інкубації протягом 5 хв при 37 °C і 5 % СО2 додавали пептид IGF - I в кінцевій 33 95284 34 концентрації 2нМ і клітини ще раз інкубували про11140 - 035), 1мМ піруватом натрію (фірма Gibco, тягом 10 хв у вказаних вище умовах. Середовище каталожний номер 11360 - 039) і 10 % FCS інактиобережно видаляли шляхом аспірації і в кожну вованої тепловою обробкою (фірма РАА, каталожлунку додавали по 100 мкл холодного буфера для ний номер А15 - 771). Для кожного періоду інкубалізису (50мМ Hepes, pH 7,2,150мМ NaCl, ІмМ ції здійснювали інокуляцію одного 12-лункового ЕГТК, 10 % гліцерину, 1 % Triton®-X100, 100мМ планшета з використанням 1 мл клітин у відповідNaF, 10мМ Na4P2O7, інгібітор протеаз Complete®). ному середовищі для кожного експерименту і куКлітки відокремлювали за допомогою скрібка для льтивували протягом 24 год. при 37 °C і 5 % СО2. клітин (фірма Corning, каталожний номер 3010) і Середовище обережно видаляли і замінювали вміст лунок переносили в реакційні пробірки Еппеантитілом, розведенням у відповідному середондорфа. Фрагменти клітин видаляли центрифугувищі в різних концентраціях. У двох контрольних ванням протягом 10 хв при 13000 об/хв і 4 °C і полунках середовище замінювали або середовищем, ловину супернатанту додавали до 2 х буфера що не містить антитіло, або тким, що містить контLaemmli для зразка в співвідношенні 1:1 (об./об.). рольне антитіло (АВ- 1, фірма Oncogene, каталожДля імунопреципітації IGF - IR супернатант клітинний номер GR11). Клітини інкубували при 37 °C і них лізатів, що залишилися, піддавали освітлюва5 % СО2 і через 15 хв, 24 год. і 48 год. відбирали льному центрифугуванню (10 хв при 13000 об/хв і індивідуальні планшети для подальшого процеси4 °C) безпосередньо перед додаванням 1 мкл понгу. ліклонального антитіла до IGF - IR (C- 20, фірма Середовище обережно видаляли шляхом асSanta Cruz Biotechnologies) або мишачого монокпірації і в кожну лунку додавали по 100 мкл холодлонального антитіла (IgGl), яке розпізнає епітоп в ного буфера для лізису (50мМ Hepes, pH положеннях 440 - 586 амінокислотної послідовнос7,2,150MMNaCl, 1мМЕГТК, 10 % гліцерину, 1 % Triton®-X100, 100MMNaF, 10мМ Na4P2O7, інгібітор ті позаклітинного домену ( - ланцюг) людського протеаз Complete®). Клітини відокремлювали за рецептора IGF типу 1 (МАт 24 - 55, фірма GroPep). допомогою скрібка для клітин (фірма Corning, каПісля інкубації протягом 2 год. при 4 °C в реакційталожний номер 3010) і вміст лунок переносили в ній пробірці Еппендорфа, що обертається, додареакційні пробірки Еппендорфа. Фрагменти клітин вали 25 мкл гранул протеїн G Sepharose® (фірма видаляли шляхом центрифугування протягом 10 Amersham Biosciences, каталожний номер 17 хв при 13000 об/хв і 4 °C і супернатант додавали 0618 - 01), після чого здійснювали ще одну стадію до 2х буфера Laemmli для зразка в співвідношенні інкубації протягом 1 год. при 4 °C. Гранули із зв'я1:1 (об./об.). Клітинні білки розділяли за допомозаними комплексами антитіло - білок виділяли гою ДСН - ПААГ і переносили на нітроцелюлозну центрифугуванням (1 хв при 2000 об/хв і 4 °C) і мембрану (PROTRAN® ВА 85, фірма відмивали тричі буфером для відмивання (буфер Schleicher&Schuell, каталожний номер 10401196) для лізису, Triton®-X100, що міститься, в концентза допомогою напівсухого Вестерн - блоттінга. рації, що складає тільки 0,1 %). Після кип'ятіння Для визначення рівнів білка IGF - IR застосогранул в буфері Laemmli для зразка клітинні білки вували антитіло, специфічне відносно IGF - IR (Cвиділяли за допомогою ДСН - ПААГ і переносили 20, фірма Santa Cruz Biotechnologies, каталожний на нітроцелюлозну мембрану (PROTRAN® ВА 85, номер sc- 713). фірма Schleicher&Schuell) за допомогою напівсухоБуло встановлено, що антитіло, пропоноване го Вестерн - блоттінга. у винаході, індукує знижуючу регуляцію IGF - IR Для визначення статусу фосфорилування імуменше ніж через 24 год. після додавання антитіла. ноочищеного IGF - IR використовували специфічне Приклад 10 відносно фосфотирозину антитіло (фірма Upstate, Інгібування зв'язування інсуліну з ЗТЗ клон 4G10, каталожний номер 05 - 321). Для виявклітинами, що експресують людський рецептор лення фосфорильованої Akt/PKB використовували інсуліну антитіло, що володіє специфічністю відносно фоДля визначення того, чи блокує також антитісфорильованого Ser473 (фірма Cell Signalling, кало, пропоноване у винаході, зв'язування інсуліну з таложний номер 9271). рецептором інсуліну (IR), проводили експерименти Було встановлено, що антитіло 18 володіє по конкурентному зв'язуванню з використанням здатністю інгібувати опосередковане IGF - I фоспептиду - ліганда, що несе радіоактивну мітку. форилування IGF - IR і РКВ, яка характеризується 5 Клітини лінії ЗТЗ (1 х 10 /мл), що рекомбінантзначенням ІС5о, що складає 0,5нМ. но експресують у великих кількостях людський IR Приклад 9 5 (>10 ), висівали в модифіковану за способом ДуІндукція опосередкованої антитілом знижуючої льбекко середовище MEM (DMEM) з високим вмісрегуляції IGF - IR in - vitro том глюкози (фірма РАА, каталожний номер Е15 Для оцінки дій антитіла, пропонованого у ви009), доповнену 2мМ L - глутаміном (фірма Gibco, наході, на кількість рецептора IGF - I (IGF - IR) в каталожний номер 25030 - 024) і 10 % FCS інактипухлинних клітинах проводили експерименти за вованої тепловою обробкою (фірма РАА, каталожоцінкою їх залежності від часу і подальший аналіз ний номер А15 - 771). Шість колб формату Т175 методом Вестерн - блоттінга з використанням спеінокулювали 20 мл клітин у відповідному середоцифічних відносно IGF - IR антитіл. вищі для кожного експерименту і культивували Використовували людські пухлинні клітки (лінія 4 протягом двох днів при 37 °C і 5 % СО2 до одерНТ29,5 х 10 клітин/мл) в середовищі RPMI1640 жання конфлюентних моношарів клітин. (фірма РАА, каталожний номер Е15 - 039), доповДля збору індивідуальних клітин додавали по неному 2мМ L - глутаміном, 1 ч замінними аміно2 мл їх трипсин/ЕДТК (фірма Gibco, каталожний кислотами (фірма Gibco, каталожний номер 35 95284 36 номер 25300 - 054) на Т175-колбу і відділення кліго експерименту і культивували протягом двох днів тин виявляли за допомогою мікроскопа. Клітини при 37 °C і 5 % СО2. збирали і додавали середовище, доповнене як Після культивування протягом 48 год. в сереописано вище 10 % FCS, до одержання загального довищі з низьким вмістом сироватки середовище об'єму 50 мл. Клітини повторно виділяли шляхом обережно видаляли і замінювали антитілом в різцентрифугування протягом 10 хв. при 1000 об/хв. і них концентраціях, розведенням у відповідному ресуспендували в 50 мл буфера для зв'язування середовищі. Клітини інкубували протягом 15 хв у (120мМ NaCl, 5мМ КСl,1,2мМ MgSO4,1мМ ЕДТК, вказаних вище умовах. Середовище обережно 10мМ D(+) глюкоза, 15мМ NaAc, 100мМ Hepes, pH видаляли шляхом аспірації і додавали в кожну 7,6,1 % БСА). Клітини підраховували, повторно лунку по 100 мкл холодного буфера для лізису виділяли шляхом центрифугування і доводили за (50мМ Hepes, рН 7,2,150мМ NaCl, 1мМ ЕГТК, 10 % допомогою буфера для зв'язування концентрацію гліцерину, 1 % Triton – X100, 100мМ NaF, 100мМ 6 клітин до 1 x 10 клітин/мл. Na4P2O7, інгібітор протеаз Complete™). Клітини 125 Мічений за допомогою І пептид інсуліну (фівідокремлювали за допомогою скрібка для клітин рма Amersham, каталожний номер ІМ166 - 2000 (фірма Corning, каталожний номер 3010) і вміст Ки/ммоль), солюбілізований в 0,1 % СН3СООН, лунок переносили в реакційні пробірки Еппендоррозводили в буфері для зв'язування до кінцевої фа. Фрагменти клітин видаляли шляхом центри5 активності 4 Ч 10 імпульсів/(хв - мл). Додавали 75 фугування протягом 10 хв при 13000 об/хв і 4 °C мкл антитіла разом з 25 мкл заздалегідь розведе(центрифуга Еппендорфа 5415R) і половину супе125 ного міченого за допомогою І пептиду інсуліну рнатанту додавали до 2 x буфера Laemmli для до 200 мкл суспензії клітин (кінцева концентрація зразка в співвідношенні 1:1 (об./об.). Для імунопантитіла 200нМ) і інкубували протягом 3,5 год. при реципітації IGF - IR супернатант клітинних лізатів, 4 °C. Клітини повторно виділяли шляхом центрищо залишився, піддавали освітлювальному фугування протягом 5 хв при 2000 об/хв і видаляцентрифугуванню (10 хв при 13000 об/хв і 4 °C) ли супернатант. Після двократного відмивання в 1 безпосередньо перед додаванням 1 мкл антитіла мл буфера для зв'язування клітини ресуспенували до IGF - IR (C- 20, фірма Santa Cruz в 1 мл буфера для зв'язування і переносили в Biotechnologies, каталожний номер sc- 713, або сцинтиляційні флакони. Кількість пептиду, що несе МАт 24 - 55, фірма GroPep, каталожний номер радіоактивну мітку пов'язаного з рецепторами кліMAD1). Після інкубації протягом 2 год. при 4 °C в тинної поверхні, вимірювали за допомогою сцинреакційну пробірку Еппендорфа, що обертається, тиляційного лічильника. додавали 25 мкл гранул протеїн G Sepharose Результати продемонстрували, що антитіло, ®(фірма Amersham Biosciences, каталожний номер пропоноване у винаході, не впливає на зв'язуван17 - 0618 - 01), після чого здійснювали ще одну ня ліганда - інсуліну з рецептором інсуліну. стадію інкубації протягом 1 год. при 4 °C. Гранули Приклад 11 із зв'язаними комплексами антитіло - білок виділяФосфорилування IGF - IR і Akt/PKB у відсутноли центрифугуванням (1 хв при 2000 об/хв і 4 °C) і сті стимуляції відмивали тричі буфером для відмивання (буфер Для того, щоб виключити стимулюючу IGF - IR для лізису, що містить тільки 0,1 % Triton – X100). активність антитіла, пропонованого у винаході, Після кип'ятіння гранул в буфері Laemmli для зрапроводили оцінку фосфорилування IGF - IR у відзка клітинні білки виділяли за допомогою ДСН сутності ліганда IGF - I, але у присутності антитіла, ПААГ і переносили на нітроцелюлозну мембрану пропонованого у винаході і референс - антитіла ( (PROTRAN ВА 85, фірма Schleicher&Schuell) за допомогою напівсухого Вестерн - блоттінга. IR3, фірма Oncogene, Німеччина). Цей аналіз Для визначення статусу фосфорилування імупроводили методом Вестерн - блоттінга з викорисноочищеного IGF - IR використовували специфічне танням специфічних відносно статусу фосфорилувідносно фосфотирозину антитіло (фірма Upstate, вання антитіл. Клітини лінії ЗТЗ (АТСС CRL1658), 4 клон 4G10, каталожний номер 05 - 321, що розпітрансфектовані IGF - IR (5x10 клітин/мл, знає білки з фосфорильованим залишком тирозиPietrzkowski, Z. і ін., Cell Growth Differ.4,1992, cc. ну). Для виявлення фосфорильованої Akt/PKB 199 - 205) висівали в модифіковане за способом використовували антитіло до Aktl, що володіє спеДульбекко середовище MEM (DMEM) з високим цифічністю відносно фосфорильованого Ser473 вмістом глюкози (фірма РАА, каталожний номер (фірма Cell Signalling, каталожний номер 9271). Е15 - 009), доповнену 2мМ L - глутаміном (фірма Було встановлено, що відбувалася істотна акGibco, каталожний номер 25030 - 024) і 0,5 % FCS тивація кінази Akt/PKB, що знаходиться нижче на інактивованої тепловою обробкою (фірма РАА, шляху передачі сигналу IGF - IR, референс каталожний номер А15 - 771) або людські пухлинні 4 антитілом в концентраціях, що перевищують 5нМ, клітини (лінія НТ29,NCI Н322М, 5х10 /мл) в сереале не відбувалася активація антитілом, пропонодовищі RPMI1640 (фірма РАА, каталожний номер ваним у винаході, в концентраціях аж до 10000нМ. Е15 - 039), доповненому 2мМ L - глутаміном, їх Приклад 12 замінними амінокислотами (фірма Gibco, каталожІндукція знижуючої регуляції рецептора на моний номер 11140 - 035), імМ піруватом натрію (фіделях з використанням ксенотрансплантату рма Gibco, каталожний номер 11360 - 039) і 0,5 % Н322М інактивованої тепловою обробкою FCS (фірма Здійснювали індукцію пухлин в організмі бесРАА, каталожний номер А15 - 771). Для визначентимусних мишей і одноразову обробку антитілом, ня величин ІС50 12-лункові планшети інокулювали пропонованим у винаході, узятим в різних концен1 мл клітин у відповідному середовищі для кожнотраціях. Через 24 год. після обробки пухлини ви 37 95284 38 даляли і гомогенізували в рідкому азоті. Додавали Крім того, з використанням цієї ж моделі тесхолодний буфер для лізису (50мМ Hepes, рН тували антитіло 18 в комбінації з гемцитабіном. 7,2,150мМ NaCl, 1мМ ЕГТК, 10 % гліцерину, 1 % Пухлини індукували як описано вище, і лікування Triton – X100, 100мМ NaF, 1мМ Na3V04, 10мМ починали, коли пухлини розвивалися і зростали до 3 Na4P2O7, інгібітор протеази Complete™, 1мМ феніоб'єму, що складав в середньому 170 мм для всіх лметилсульфоніл - фторид (PMSF)) в співвідногруп. Антитіло вводили і.р. один раз в тиждень в шенні об'єм буфера:маса пухлини, рівному 3:1, і дозах 6 і 0,6 мг/кг і в комбінації з гемцитабіном в обережно змішували з гомогенатом пухлини, що дозі 62 мг/кг для дози антитіла 0,6 мг/кг. Здійснювідтанув. Після солюбілізації тканини протягом 15 вали один цикл введення гемцитабіну, а саме, хв на льоду нерозчинні фрагменти видаляли шлякожен третій день, в цілому чотири рази. І в цьому хом центрифугування протягом 10 хв при 13000 випадку також лікування починали шляхом ввеоб/хв і 4 °C (центрифуга Еппендорфа 5415R). Кондення подвійних доз антитіла. Результати експецентрацію білка в зразках визначали з викорисрименту показали, що обробка антитілом 18 шлятанням реагентів Micro BCA™ (фірма Pierce) і дохом його введення один раз в кожні сім днів само давали буфер для лізису до досягнення однакових по собі інгібує ріст пухлини і підвищує ефективконцентрацій. Частину супернатанту додавали до ність гемцитабіну, відомого антиметаболічного 2xбуфера Laemmli для зразка в співвідношенні 1:1 засобу. (об./об.). Клітинні білки розділяли за допомогою Приклад 14 ДСН - ПААГ і переносили на мембрану (PROTRAN Інгібування росту пухлин лінії ЗТЗ ВА 85, фірма Schleicher&Schuell, каталожний ноПухлини індукували у бестимусних мишей в мер 10401196) нітроцелюлози за допомогою напіосновному як описано в прикладі 15 за винятком всухого Вестерн - блоттінга. Для виявлення IGF того, що застосовували мишачі фібробласти ЗТЗ, IR застосовували специфічне відносно IGF - IR що надекспресують людський IGF - IR. Мишей з антитіло (С- 20, фірма Santa Cruz Biotechnologies, розвиненими пухлинами масою приблизно 180 мг каталожний номер sc- 713). обробляли шляхом внутрішньочеревного введенПісля обробки антитілом, пропонованим у виня один раз в тиждень, яке здійснювали в цілому наході, було виявлено залежне від концентрації сім разів, по 18,6 або 0,6 мг/кг антитіла 18. І в цьозменшення рівнів IGF - IR, що характеризується му випадку також лікування починали шляхом значенням ЕС50, що становить 0,6 мг/кг. введення як ударної дози подвійних доз антитіла Приклад 13 (36,12 і 1,2 мг/кг). Результати експерименту покаІнгібування росту пухлин лінії Н322М зали, що лікування антитілом може призводити до Дію антитіла 18in vivo досліджували шляхом уповільнення росту пухлини при введенні доз 18 і індукції пухлин у бестимусних мишей згідно за6 мг/кг один раз в тиждень. тверджених для цієї мети методів. Людські клітки Приклад 15 NSCLC лінії Н322М вводили шляхом сумісної підІндукція опосередкованою антитілом, що знишкірної ін'єкції з матригелем (Matrigel) бестимусжує регуляцію IGF - IR in vitro ним (nu/nu) мишам 6 - 7-тижневого віку. Для цієї Для виявлення дії антитіла, пропонованого у 6 мети концентрували 5 x 10 клітин лінії Н322М в винаході, на кількість рецептора IGF - I (IGF - IR) в 100 мкл культурального середовища і змішували з пухлинних клітинах проводили експерименти за 100 мкл матригелю. 200 мкл цієї суміші вводили оцінкою залежності від часу і подальший аналіз шляхом ін'єкції в правий бік мишей. Об'єм пухлини методом Вестерн - блоттінга з використанням сперозраховували на основі вимірювання діаметрів цифічних відносно IGF - IR антитіл. пухлини за допомогою штангенциркулів з ноніусом У дослідах застосовували людські пухлинні 4 двічі в тиждень за формулою, вперше опубліковаклітини (лінія НТ29,5 х 10 клітин/мл) в середовищі ною Geran із співавторами ("Protocols for screening RPMI1640 (фірма РАА, каталожний номер Е15 chemical agents and natural products against animal 039), доповненому 2мМ L - глутаміном, їх замінtumors and other biological systems", Cancer ними амінокислотами (фірма Gibco, каталожний Chemother.Rep.11.301,1972), згідно якої об'єм пухномер 11140 - 035), 1мМ піруватом натрію (фірма 3 2 лини [мм ] = (довжина x (ширина) ). Антитіло ввоGibco, каталожний номер 11360 - 039) і 10 % інакдили внутрішньочеревно (і.ч·) в дозі 10 мл/кг. Лікутивованої тепловою обробкою FCS (фірма РАА, вання починали з використанням подвійних доз каталожний номер А15 - 771). Для кожного періоду антитіла, які вводили в подвійних об'ємах. Пухлиінкубації здійснювали інокуляцію одного 12ни індукували у бестимусних мишей як описано лункового планшета з використанням 1 мл клітин у вище. Після того, як пухлини зростали до середвідповідному середовищі для кожного експерименьої маси, що становить 160 мг, мишей обробляли нту і культивували протягом 24 год. при 37 °C і 5 % шляхом внутрішньочеревного введення шість раСО2. зів на тиждень по 6,0,6 і 0,06 мг/кг антитіла у виСередовище обережно видаляли і замінювали гляді подальших доз після введення ударних доз, антитілом, розведенням у відповідному середощо становлять 12,1,2 і 0,12 мг/кг відповідно, які вищі в різних концентраціях. У двох контрольних вводили один раз в перший день лікування. Релунках середовище замінювали або середовищем, зультати експерименту свідчать про те, що блокущо не містить антитіло, або середовищем, що місвання IGF - IR - вісі за допомогою рекомбінантного тить контрольне антитіло (АВ- 1, фірма Oncogene, (rhu) МАт 18 до IGF - IR надавало протипухлинну каталожний номер GR11). Клітини інкубували при дію у разі введення як індивідуального агента в 37 °C і 5 % СО2 і через 15 хв, 24 год. і 48 год. віддозах 6 і 0,6 мг/кг. На відміну від цього доза 0,06 бирали індивідуальні планшети для подальшого мг/кг не надавала впливу на ріст пухлини. процесингу. 39 95284 40 Середовище обережно видаляли шляхом асгою ДСН - ПААГ і переносили на нітроцелюлозну пірації і в кожну лунку додавали по 100 мкл холодмембрану (PROTRAN® ВА 85, фірма ного буфера для лізису (50мМ Hepes, pH Schleicher&Schuell, каталожний номер 10401196) 7,2,150MMNaCl, імМЕГТК, 10 % гліцерину, 1 % за допомогою напівсухого Вестерн - блоттінга. Triton®-X100,100мMNaF, 10мМ Na4P2O7, інгібітор Для визначення рівнів білка IGF - IR застосопротеаз Complete®). Клітини відокремлювали за вували антитіло, специфічне відносно IGF - IR (Cдопомогою скрібка для клітин (фірма Corning, ка20, фірма Santa Cruz Biotechnologies, каталожний таложний номер 3010) і вміст лунок переносили в номер sc- 713). реакційні пробірки Еппендорфа. Фрагменти клітин Було встановлено, що антитіло, пропоноване видаляли шляхом центрифугування протягом 10 у винаході, індукувало знижуючу регуляцію IGF хв при 13000 об/хв і 4 °C і супернатант додавали IR на 50 % або більш через 24 год. після додадо 2х буфера Laemmli для зразка в співвідношенні вання антитіла. 1:1 (об./об.). Клітинні білки розділяли за допомо 41 95284 42 43 95284 44 45 95284 46 47 95284 48 49 95284 50 51 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 95284 Підписне 52 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601