Спосіб скринінгу рослин, що проявляють зменшене знебарвлення поверхні, спричинене пораненням

Реферат: Винахід належить до способу скринінгу популяції рослин або частин рослин на предмет наявності таких рослин або частин рослин, що проявляють зменшене знебарвлення порівняно із контрольною рослиною або частиною рослини, де спосіб включає забезпечення популяції рослин або частин рослин з популяції, інкубування рослин або частин рослин, що мають створену поверхню поранення, для того, щоб відбулося знебарвлення в ній або на ній, спостереження знебарвлення в або на рослинах або частинах рослин, порівняння знебарвлення, що спостерігається, зі знебарвленням, що спостерігається у контрольній рослині або частині рослини, для ідентифікації рослин або частин рослин, що не проявляють знебарвлення або проявляють зменшене знебарвлення, порівняно із контрольною рослиною чи частиною рослини, причому рослини або частини рослин, використовувані у скринінгу, є з іншої UA 99704 C2 (12) UA 99704 C2 стадії розвитку або тканини, ніж стадія або тканина, в якій має місце знебарвлення. UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується способу скринінгу популяції рослин або частин рослин на предмет наявності серед них таких рослин або частин рослин, що проявляють зменшене знебарвлення поверхні, спричинене пораненням, у порівнянні з контрольною рослиною чи частиною рослини. Передумови створення винаходу Через великий попит, обробка свіжих продуктів таких як латук, радіккіо, ендивій, та інші овочі, значно розширилася протягом останніх років. Збір та обробка листових овочів включає екстенсивну обрізку листя, що викликає сильну реакцію на поранення. Ця реакція на поранення призводить до швидкого псування оброблених продуктів. Це псування проявляється як знебарвлення через ферментне побуріння або порожевіння поверхні поранення та навколо рани, респірація та висихання, викликані транспірацією. Найбільш важливими вважаються ферментне побуріння або порожевіння, що безпосередньо чи опосередковано визначають загальну якість свіжозрізаних, упакованих листових овочів таких як латук та радіккіо. Крім того, внаслідок висихання, може значно зрости кількість мікроорганізмів, що може піддавати ризику безпеку вживання їжі. Природа обробленого латуку, що швидко псується, призводить до сильного знебарвлення, втрати запаху та текстури при сприйнятті споживачем, що перешкоджає зростанню так званого традиційного ринку. Інші овочі, такі, як картопля, гриби, селера, артишок та баклажан, та також фрукти та квіти, також можуть бути піддані небажаному знебарвленню. Наприклад, такі фрукти, як банан, яблуко, груша, авокадо, манго, персик та абрикос, та інш., швидко стають бурими при розрізанні на скибочки або при очищенні. При переведенні цих плодів в оброблену форму, таку, як форма нарізки скибочками, кубиками, очищена форма чи фруктові салати, необхідно вживати відповідні заходи. Зрізані стеблини квітів, наприклад, гербери чи хризантеми, також можуть піддаватися знебарвленню, що є небажаним з комерційної точки зору, тому що знебарвлення вважається непривабливим для споживача, та, таким чином, зменшує ліквідність продуктів. Для припинення процесу висихання овочів таких як латук, було розроблено численну кількість методів хімічної або фізичної обробки після збору врожаю, що можуть бути застосовані для уповільнення процесу висихання обробленого латуку. Серед них - упаковка свіжозрізаних листових овочів у модифікованій атмосфері, застосування їстівних покрить, обробка тепловим шоком та додавання хімікатів, що інгібують ферментне побуріння. Коли свіжозрізаний латук упаковують в атмосфері низького вмісту кисню при низькій температурі, ферментне побуріння може бути зменшено значною мірою. Проте таке модифіковане, збіднене киснем середовище викликає анаеробну аспірацію, що призводить до втрати запаху та аромату продуктів, що є дуже непривабливим. Їстівні покриття являють собою шари матеріалів, що діють як фізичні ізолюючі бар'єри та ефективно захищають продукти від різних форм висихання таких як випаровування та побуріння. Ці покриття можуть бути зроблені з, наприклад, смол, полісахаридів або протеїнів. Також було показано, що побуріння свіжозрізаного латуку можна попередити шляхом застосування короткочасного теплового шоку протягом 90 секунд при 45C, негайно після обробки. Можливо, тепловий шок відводить маршрут біосинтезу від ферментів, задіяних у знебарвленні, у протеїни теплового шоку, таким чином, знижуючи здатність до ферментного побуріння. Альтернативно, вплив обробки тепловим шоком на побуріння можна пояснити термочутливістю ферментів, задіяних у маршруті знебарвлення. Хімічними речовинами, що можуть бути застосовані, можуть бути, наприклад, такі агенти відновлення, як вітамін C, такі хелатори, як EDTA, такі комплексони, як циклодекстрин, та такі ферментні інгібітори, як L-цистеїн. Застосування хімічних речовин для свіжих продуктів, очевидно, стосується проблем безпеки їжі та потребує нормативного затвердження. Комбінації технологій обробки продуктів після збору, описані вище, можуть бути розглянуті та, остаточно, процедура, що застосовується, є компромісом між технологічною ефективністю, ціною та безпекою їжі. Незалежно від технології, що застосовується, покращення якості овочів, фруктів та квітів, що обробляють після збору врожаю, є дуже цінним, через існуючу у цій галузі велику потребу у забезпеченні альтернатив, що знищують чи зменшують потребу у застосуванні фізичних чи хімічних речовин після збору врожаю. Стислий опис винаходу Задачею даного винаходу є забезпечення способу скринінгу для селекції рослин, що проявляють зменшену реакцію знебарвлення, спричинене пораненням, для забезпечення рослин та їх потомства, що є стійкими до розладів при обробці після збору врожаю таких як 1 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментативне побуріння або порожевіння. Знебарвлення після поранення може також бути видимим на частинах рослин таких як стеблі, насіння, плоди, квіти, листи, бульби, паростки та інш. Тому додатковою задачею даного винаходу є забезпечення способу скринінгу для селекції рослин, що проявляють зменшене знебарвлення, спричинене пораненням, їх частин. Таким чином, даний винахід забезпечує спосіб скринінгу популяції рослин або частин рослин на предмет наявності таких рослин або частин рослин, що проявляють зменшене знебарвлення порівняно із контрольною рослиною, де спосіб включає a) забезпечення популяції рослин або частин рослин з популяції; b) необов'язкове створення поверхні поранення рослин чи частин рослин; c) інкубування рослин або частин рослини або поверхні рослин, створених таким чином, для того, щоб відбулося їх знебарвлення; d) спостереження знебарвлення рослин або частин рослин; е) порівняння знебарвлення, що спостерігається, з знебарвленням, що спостерігається у контрольній рослині або частині рослини для ідентифікації рослин або частин рослин, щ не проявляють знебарвлення, або проявляють зменшене знебарвлення, порівняно із контрольною рослиною чи частиною рослини. Спосіб за даним винаходом має два втілення. У першому втіленні, знебарвлення є результатом конверсії ендогенного субстрату. Таке знебарвлення виникатиме мимовільно після інкубування рослини або частини рослини у певному середовищі протягом певного періоду часу. Знебарвлення у цьому випадку викликано пораненням. Даний винахід особливо стосується ферментних реакцій порожевіння та побуріння, що відбуваються у природі. Спосіб скринінгу за даним винаходом призначений для ідентифікації рослин, що не проявляють таку реакцію або проявляють зменшену реакцію у порівнянні із контрольною рослиною. У другому втіленні, знебарвлення викликано перетворенням екзогенно доданого субстрату, що може бути перетворений у забарвлений субстрат, який стає видимим при проходженні реакції у рослинах. Така кольорова реакція може бути спричинена пораненням, а може не бути викликана ним. Вона відбувається, наприклад, також у оболонках насіння інтактного насіння. Спосіб скринінгу за даним винаходом призначений для ідентифікації рослин, що не проявляють таку реакцію або проявляють зменшену реакцію у порівнянні із контрольною рослиною. Останнє втілення стосується, більш конкретно, способу скринінгу популяції рослин або частин рослин на предмет наявності таких рослин або частин рослин, що проявляють зменшене знебарвлення порівняно з контрольною рослиною або частиною рослини, де спосіб включає а) забезпечення популяції рослин або частин рослин з популяції; c) інкубування рослин або частин рослини з субстратом, що може бути перетворений на забарвлений пігмент для того, щоб у рослинах чи у частинах рослин відбулося їх знебарвлення; d) спостереження знебарвлення рослин або частин рослин; е) порівняння знебарвлення, що спостерігалося, з знебарвленням, що спостерігається у контрольній рослині або частині рослини для ідентифікації рослин або частин рослин, що не проявляють знебарвлення, або проявляють зменшене знебарвлення, порівняно із контрольною рослиною чи частиною рослини. Спосіб за даним винаходом може бути застосований для будь-якої рослини, що може бути піддана знебарвленню, проте він є особливо корисним для одержання, зокрема, овочів або фруктів, або квітів. Спосіб, крім того, є придатним для листових овочів таких як латук, радіккіо або ендивій, для бульб таких як картопля або солодка картопля, для коренів таких як селера, для паростків таких як цикорій, або для грибів. Спосіб може бути додатково застосований для фруктів таких як яблуко, банан, авокадо, персик, груша, абрикос, манго, баклажан, та для квітів або стеблин квітів таких як стеблини гербери, квіти хризантеми, плоди артишоку та інш. Спосіб скринінгу за даним винаходом призначений для ідентифікації рослин, що мають зменшену реакцію знебарвлення поверхні, спричинену пораненням, в одній чи більше їх частинах чи тканинах Для проведення скринінгу тому дуже корисним є використання частини чи тканини, що піддається знебарвленню. Для латуку, це може бути лист або його частина, така, як листова частина, для бананів можуть бути придатно використані скибочки очищених плодів, та для квітів частини стеблин є дуже корисними тестовими основами . Проте, було знайдено, що знебарвлення також перевіряли на тканинах, що не були поранені. У Прикладах показано, що покриття інтактного насіння та кінці коренів також здатні викликати кольорову реакцію у присутності екзогенно доданого субстрату, що можуть бути перетворені у кольоровий пігмент без поранення. Зменшення чи відсутність цієї кольорової реакції можуть бути використані для скринінгу рослин, що мають зменшену реакцію знебарвлення 2 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У конкретному втіленні, спосіб особливо корисний для селекції рослин, що належать до сімейства Asteraceae, особливо рослин роду Lactuca, та, більш конкретно, видів Lactuca sativa або рослин, що належать до роду Cichorium та, зокрема, до видів Cichorium intybus та Cichorium endivia, що проявляють відсутність або зменшену реакцію знебарвлення поверхні, спричиненого пораненням. Популяцією рослин, що піддають скринінгу за способом за даним винаходом, може бути будь-яка популяція рослин, проте, переважно, змінна популяція рослин, до якої входять різні члени, для підвищення вірогідності знаходження рослини, що проявляє зменшену реакцію знебарвлення, спричинену пораненням. Такі змінні популяції можуть бути одержані за допомогою мутагенної обробки, з використанням, наприклад, хімічних речовин та/або випромінювання, та у цьому документі вони мають назву популяції мутантних рослин. Альтернативними популяціями є колекції ідіоплазм, що є колекціями рослин, що проявляють природні варіації. Також можуть бути використані трансгенні рослини. Спосіб за даним винаходом, відповідно, реалізують з частинами рослин, що мають поверхню поранення. Дуже корисними тестовими пробами є пластини, вирізані з листів, так звані листові пластини. Альтернативно, можуть бути використані тканини головної жилки листових овочів. Відповідно, пластини зрізають з таких жилок. У фруктів можуть бути оцінені поверхні зрізу розділених навпіл фруктів, або, альтернативно, скибочки чи кубики. Для квітів, частини стеблини є дуже корисними тестовими пробами. Інкубування, відповідно, відбувається в водному середовищі. Спосіб за даним винаходом може бути дуже добре реалізований з листовими пластинами, інкубованими між зволоженим фільтрувальним папером. Тому реакція знебарвлення дуже чітко спостерігається у країв поранення на папері. Альтернативно, водне середовище містить воду чи розчин. У конкретному втіленні, що буде додатково проілюстровано нижче, розчин містить субстрат, такий, як L-3,4-дигідроксифеніл аланін. Ця сполука перетворюється з одержанням чорного пігменту меланіну під дією ферментної поліфенольної оксидази. Альтернативні сполуки, що можуть бути використані для скринінгу рослин латуку у цьому відношенні включають, не обмежуючись наведеними, хлорогенову кислоту, ізохлорогенову кислоту, L-тирозин та катехол. Винахід може бути додатково реалізований з потомством батьківської рослини, що проявляє відсутність або зменшення реакції знебарвлення листів, спричинену пораненням, для того, щоб продемонструвати, що потомство все ще має відсутність чи зменшення реакції знебарвлення листів, спричиненої пораненням, аналогічну тому, що було знайдено у батьківській рослині. Винахід також може бути реалізований з частинами рослин. Такі частини рослин, як качани чи листя латуку чи ендивію, є, зазвичай, частинами, що мають поверхню зрізу, що може бути піддана знебарвлення. Іншими частинами є плоди, паростки, корені, насіння, бульби, квіти, стеблини та інш. У додатковому втілені даного винаходу насіння чи проросле насіння може бути використано як основа для реалізації способу скринінгу у присутності екзогенного доданого субстрату. У випадку пророслого насіння, у кольоровій реакції задіяні молоді кінчики коренів. Винахід є дуже цікавим з комерційної точки зору, для ідентифікації мутантних рослин, що можуть бути використані на ринку перероблених рослин. Як пояснено вище, знебарвлення продуктів, зокрема, свіжих фруктів та овочів, вважають небажаним через те, що знебарвлений продукт не користується попитом у споживачів. Детальний опис винаходу Коли латук збирають та обробляють шляхом різання, утворюється велика кількість поранених листових поверхонь, що призводить до сильної реакції" рослини чи частин рослини, що проявляється побурінням або порожевінням поверхні поранення або прилеглих поверхонь. Порожевіння можна також спостерігати у місцях, віддалених від поверхні поранення, на головній жилі листу, а також на черешку. Іноді порожевіння можна спостерігати на стадіях, що передують збору врожаю, що, як вважається, обумовлено абіотичним стресом чи перезрілістю сільськогосподарських культур. Інші рослини, зокрема інші овочі, фрукти та квіти, також можуть піддаватися знебарвленню. Тому спосіб за даним винаходом є дуже зручним способом скринінгу для ідентифікації інших рослин, зокрема, інших овочів, чи фруктів або квітів, що проявляють зменшене знебарвлення у відповідь на поранення. На різні форми знебарвлення впливає ферментна активність, що значно підвищується внаслідок поранення, та що призводить до утворення декількох форм поліфенолів та продуктів реакції, одержаних з них. 3 UA 99704 C2 5 10 15 Важливою ферментною активністю, що задіяна у реакції побуріння, є PPO. PPO активність по відношенню до ферментного побуріння не обмежується латуком, проте була описана для багатьох інших видів рослин, в яких спостерігається погіршення якості після збору врожаю таких як яблуко, банан та картопля. Фактично, PPO є одним з добре визнаних ферментів, задіяних у погіршенні якості після збору врожаю багатьох оброблених свіжих фруктів та овочів. Через це PPO був об'єктом багатьох технологій, що направлені на зниження чи попередження його активності з метою підвищення якості після збору врожаю продуктів харчування. PPO каталізує реакцію, в якій поліфеноли з рослинних тканин окисляються з утворенням о-хінонів. Відповідно, ферментні та неферментні реакції призводять до утворення коричневого чи чорного пігментів. У багатьох видах рослин PPO кодується невеликим сімейством генів, окремі члени якого можуть мати різні часові та просторові характеристики експресії, що вказує на функціональну дивіргентність. Так, наприклад, було показано, що латук містить різні ізоформи PPO у фотосинтетичних та судинних тканинах листка. У різних видах природні субстрати PPO можуть відрізнятися. У Таблиці 1 наведені субстрати PPO для різних овочів чи фруктів, що піддаються знебарвленню після поранення. Ці та інші субстрати можуть бути використані у заснованому на екзогенних субстратах способу скринінгу за даним винаходом. Таблиця 1 Джерело Яблуко Абрикос Авокадо Банан Баклажан Латук Манго Гриб Персик Груша Картопля Солодка картопля Фенольні субстрати хлорогенова кислота (м'якоть), катехол, катехін (шкірка), кавова кислота, глікозиди флаволонів, 3,4-дигідроксифеніл аланін (DOPA), 3,4-дигідробензойна кислота, пкрезол, 4-метил катехол, лейкоцианідін, п-кумарова кислота ізохлорогенова кислота, кавова кислота, 4-метил катехол, хлорогенова кислота, катехін, ерікатехін, пірогалол, катехол, флавоноли, похідні п-кумарової кислоти 4-метил катехол, допамін, пірогалол, катехол, хлорогенова кислота, кавова кислота, DOPA 3,4-дигідроксифеніл етиламін (допамін), лейкодельфінідін, лейкоцианідін хлорогенова кислота, кавова кислота, кумарова кислота, похідні коричної кислоти тирозин, кавова кислота, похідні хлорогенової кислоти допамін-НСІ, 4-метил катехол, кавова кислота, катехол, катехін, хлорогенова кислота, тирозин, DOPA, п-крезол тирозин, катехол, DOPA, допамін, адреналін, норадреналін хлорогенова кислота, пірогалол, 4-метил катехол, катехол, кавова кислота, галлова кислота, катехін, допамін хлорогенова кислота, катехол, катехін, кавова кислота, DOPA, 3,4-дигідробензойна кислота, п-крезол хлорогенова кислота, кавова кислота, катехол, DOPA, п-крезол, п-гідроксифеніл, пропіонова кислота, п-гідроксифеніл, піровиноградна кислота, м-крезол хлорогенова кислота, кавова кислота, кофеїламід 20 25 30 35 У багатьох рослинах, рівень ферменту PPO не індукується специфічно після поранення рослинних тканин, проте залишається в інактивованій формі у хлоропластах. Після поранення активується PPO, що проявляється завдяки тому, що фенольний субстрат, що знаходиться у вакуолях, контактує з PPO через руйнування тканин. У латуку, продукування поліфенолів, що є субстратом PPO, індукується після поранення. Тому, побуріння, що є можливим для тканин латуку, не обмежується кількістю PPO у тканинах листка, скоріше - швидкістю фенольного біосинтезу після поранення. У. цьому відношенні ситуація для різних рослин може відрізнятися. Наприклад, для яблук кількість поліфенолів є достатньою для одержання реакції побуріння плодів протягом однієї години після поранення, тоді як для латуку реакція побуріння займає кілька днів через те, що поліфеноли латуку мають бути синтезовані заново після поранення у більшому ступені. Синтез поліфенолів відбувається добре відомим біохімічним маршрутом, що має назву фенілпропаноїдного маршруту. Перша, активна стадія цього маршруту каталізується ферментом фенілаланін амоній ліазою (PAL, Hahlbrock, K and Scheel, D (1989) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant MoI. Biol. 40, 347-369). PAL перетворюється на амінокислоту фенілаланін синтезується через шикиматний маршрут у коричну кислоту. 4 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У латуку, поранення листів призводить до сильної індукції генної експресії PAL та активності PAL. Утворення поліфенолів корелює з ферментною активністю, що передбачає те, що індукування активності PAL пораненням латуку є важливим фактором, що відповідає за побуріння (Campos, R. et al. (2004) Physiologica Plantarum 121, 429-438 та посилання, наведені там). Проте, на даний час неясно, які інші фактори визначають результати реакцію знебарвлення, викликану пораненням. Наприклад, передбачалося, що важливою є активність пероксидаз (POD), також при встановленні остаточного рівня знебарвлення (Fukumoto, L.R. et аі. (2002) J. Agric. Food Chem. 540, 4503-4511; Martin-Diana A. et al (2005) Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, 1677-1685). Оскільки ферментна активність залежить від наявності внутрішнього пероксиду водню, то внесок POD у знебарвлення може бути обмежений. Це є додатковим свідченням того, що поранення деяким чином відчувається рослиною та, відповідно, сигнал генерується каскадом, що на даний час мало визначений для латуку. Очевидно, що ці активності будуть, головним чином, направлені на зцілення поранень та захист від патогенів. Тому, можливо, у реакції знебарвлення тканин латуку задіяна велика кількість генетичних факторів, кожен з яких є потенційною мішенню для генетичної модифікації для зменшення чи знищення реакції знебарвлення, спричиненої пораненням. Більшість з цих генетичних факторів на даний час невідома, а для тих, для яких відомо, що вони задіяні у процесі, є неясним, якою мірою ці фактори приймають безпосередню участь у реакції знебарвлення, або, можливо, мають більш загальну функцію по відношенню до фізіології пораненню рослин. Наприклад, хоча викликана пораненням активність PAL вважається такою, що визначає рівень побуріння латуку, відомо, що продукти фенілпропаноїдного маршруту задіяні, між тим, у біосинтезі стінок клітин або, також, у реакції захисту. Тому зниження активності PAL, що викликана пораненням, для зменшення можливості побуріння може піддавати ризику інші функції, крім спричиненого пораненням побуріння, що може бути менш бажаним по відношенню до інших аспектів культивування латуку. Аналогічно, передбачалося, що активність PPO задіяна у захисній реакції та, через це, зменшення можливості побуріння шляхом зниження рівнів PPO може збільшувати чутливість патогенів (Thipyapong, P. et al (2004) Planta 220, 105-117). Тому, винахідниками було обґрунтовано, що більш об'єктивний підхід може бути більш успішним у цьому відношенні. Такий підхід складається з наступних стадій: 1. Генерування варіантної популяції рослин, зокрема, мутантної популяції. Така мутатнта популяція може бути одержана шляхом обробки насіння або рослинних тканин мутагенними агентами, як етилметансульфонат (ems) або рентгенівське випромінювання. 2. Забезпечення ефективного фенотипічного скринінгу, в якому селекція заснована на знебарвленні рослини, зокрема, знебарвленні рослини, що спричинене пораненням, що направлено через PAL та/або PPO. 3. Характеристика мутантів, що мають модифіковану реакцію на поранення, на предмет можливості знебарвлення після збору врожаю та відсутності плейотропних ефектів модифікації, що піддає ризику зростання та обробку рослини, відповідно до загальноприйнятої практики. Таким чином, винахід стосується способу скринінгу для ідентифікації, селекції та одержання рослини, що проявляє зменшену реакцію знебарвлення, та розладів, пов'язаних з обробкою після збору врожаю таких як ферментне побуріння або порожевіння. У способі скринінгу, знебарвлення можна спостерігати на поверхні поранення, проте також було знайдено, що інтактні тканини також проявляють кольорову реакцію після додавання субстрату. Популяція мутантних рослин для використання у способі за даним винаходом може бути, наприклад, одержана таким чином: a) обробкою насіння M0 видів рослин, що мають бути модифіковані, мутагенним агентом з одержанням насіння М1; b) вирощування рослин з одержаного таким чином насіння М1 з одержанням рослин М1; c) необов'язковим повтором стадій b) та с) n разів з одержанням насіння М1+n; d) пророщуванням одержаного таким чином насіння МІ+n та вирощування рослин з цього насіння. Відповідно до даного винаходу, ці рослини піддають після цього аналізу реакції знебарвлення, що викликана пораненням. Добирають рослини, що не проявляють, або проявляють зменшену реакцію забарвлення, спричинену пораненням. Потім, потомство добраних рослин вирощують та вимірюють знебарвлення, спричинене пораненням. Для створення генетичної варіабельності можна використовувати мутагенез. Фахівцям у цій галузі відомі декілька фізичних або хімічних способів обробки, що можуть бути використані для 5 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виклику генетичних мутацій у видах рослин. Наприклад, можна обробляти насіння у розчині, що містить різні концентрації мутагену, такого, як ems. Ems алкілує, головним чином, G залишки спіралі ДНК, що протягом реплікації ДНК спричиняє спарювання T замість C. Тому, спарювання основ GC змінюється на спарювання основ AT з частотою, що визначається ефективною дозою ems та активністю системи репарації помилково спарених основ у рослині. Ефективна доза ems залежить від застосованої концентрації, розміру насіння та інших фізичних властивостей та часу інкубування насіння у розчині ems. Насіння, оброблене мутагенним агентом, типово, має назву насіння М1. Як результат обробки, тканини насіння М1 містять випадково-точкові мутації у геномах їх клітин та випадково-точкові мутації, наявні у субпопуляції клітин, що призводитимуть до утворення тканини зародкової лінії (зародкових клітин), будуть перенесені у наступне покоління, що має назву М2. Мутації або їх комбінації, що є гаплонедостатніми, та, через це, призводять до стерильності, або що викликають летальність зародків, не будуть перенесені у покоління M2. Процедуру, подібну описаній вище для використання ems, застосовують також для інших мутагенних агентів. Придатні мутагенні агенти добре відомі з рівня техніки. Особливо корисними є алкілуючі мутагенні агенти, такі. Як діетилсульфат (des), етиленімін (еі), пропан сульфон, Nметил-N-нітрозоуретан (mnu), Ν-нітрозо-Ν-метилсечовина (NMU), N-етил-N-нітрозосечовина (enu), азид натрію. Альтернативно, мутації викликають шляхом випромінювання, що вибирають, наприклад, з рентгенівського випромінювання, швидких нейтронів, УФ випромінювання. В іншому втіленні даного винаходу, мутації викликають за допомогою методів генної інженерії таких як використання химерних олігонуклеотидів, гомологічної рекомбінації, направленого впливу на гени, введення модифікованих генів-мішеней, що конкурують з ендогенним продуктом, дезактивації через втручання PHK та інш. Популяція М2, одержана внаслідок мутагенної обробки, може бути використана у процедурах скринінгу, направлених на реакцію на поранення, що направлена через PAL та PPO. Фахівцю у цій галузі очевидно, що будь-яка популяція рослин, що має генну варіацію, може бути взята як вихідний матеріал для такого фенотипічного скринінгу, це можуть бути колекції ідіоплазм, що є колекціями рослин, що проявляють природні варіації, або популяції трансгенних рослин. На продукування насіння М1 та М1+n, відповідним чином діє самозапилення. Для проведення фенотипічного скринінгу за даним винаходом, має бути одержана поверхня поранення, оскільки реакція ферментного знебарвлення індукується після поранення. Поранення може бути досягнуто шляхом зрізу, перфорації, нарізки на скибочки, тертям, плющенням, розриванням, очищенням, подрібненням, пресуванням, рублення, помелу, вприскуванням рідини, осмотичним шоком, відділенням, покосом, та задиранням. Було знайдено, що спосіб за даним винаходом, в якому використовують екзогенно доданий субстрат, може також бути реалізований на інтактних тканинах та частинах рослин таких як насіння, у ситуаціях, коли PPO може бути у зоні контакту із субстратом, наприклад, коли PPO секретується або знаходиться поза клітиною. Фермент, що викликає кольорову реакцію, потім також є доступним без попереднього поранення. Після поранення, або коли у пораненні немає потреби, фенотипічні характеристики мають бути ознакою, за якою визначають маршрут, що призводить до знебарвлення тканин, та що може бути дуже ефективно використаний при скринінгу мутантних популяцій. Несподівано було знайдено, що такі фенотипічні характеристики можуть бути одержані шляхом збору частин рослини та їх інкубування у дуже специфічних умовах, що сприяють різним формам знебарвлення, зокрема, знебарвлення поверхні поранення. Відповідно, такі аналізи можуть бути застосовані до більшої кількості рослин чи частин рослин таких як мутантні рослини, для селекції таких рослин, що проявляють зменшену реакцію знебарвлення, викликану пораненням. Одне з втілень даного винаходу засновано на тому, що несподівано було знайдено, що коли пластини листя, такого, як листя латуку, або листя ендивію або цикорію, збирають та інкубують між зволоженим фільтрувальним папером при 5C, то через, приблизно, 4 дні, стає помітним порожевіння на кромці листових пластин. Придатним фільтрувальним папером є фільтрувальний папір типу 1450 CV, № 10 313 281 від Schleier & Schuell, Microscience GmbH, Dassel, Germany. Після додаткового інкубування, сигнал стає більш інтенсивним, та через, приблизно, один тиждень, досягається максимальна інтенсивність. Порожевіння відбувається, головним чином, на поверхнях поранення. Знебарвлення можна вимірювати шляхом підрахунків за візуальною шкалою, починаючи від 0, що означає відсутність побуріння або порожевіння, до 10, що означає побуріння та 6 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порожевіння, як стандарт може бути підданий скринінгу сорт рослини (наприклад L. sativa для скринінгу латуку). У Прикладах, що відносяться до латуку, як стандарт для 10 використовують сорт L. sativa 'Troubadour'. Необов'язково, для порівняння можуть бути використані фотографії для оцінки проміжних класів від 0 до 10. Крім того, можуть бути одержані цифрові фотографії фільтрувального паперу з рожевим чи бурим барвником, з наступним підрахуванням у кожному положенні листової пластини кількості пікселів з інтенсивним рожевим чи бурим забарвленням. Використовуючи одне з цих вимірювань, можна виконати простий статистичний аналіз як перевірку за критерієм Стюдента, добре відому фахівцю у цій галузі, для встановлення того, чи має рослина чи група рослин значно менше порожевіння або побуріння порівняно зі стандартом. Застосовний рівень значимості однобічного критерію становить 0,001. Для мутантів, може бути проведене статистичне порівняння оцінок порожевіння оригінального сорту, що є найкращим наявним стандартом, та оцінки порожевіння для окремих мутантів та/або їх потомства. Для знаходження характеристик за даним винаходом в існуючих рослинах, можуть бути використані репрезентативні проби сортів, селекційні лінії та/або колекції генних банків. Потім статистичне порівняння може бути виконано між оцінками порожевіння окремого об'єкту, що досліджують, та частини популяції, що залишилася. При статистичній перевірці об'єктів на предмет суттєво меншого порожевіння може потребуватися застосування множинних критеріїв порівняння для збереження належних загальних рівнів значимості, наприклад, множинні критерії порівняння Дуннетта із застосуванням одного стандарту (Dunnett CW, J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121 (1955)). Додатково, було показано, що ця реакція може бути одержана з використанням багатьох різних видів тканин листя на різних стадіях розвитку. Наприклад, у тканинах головної жили латуку вона також може бути викликана пораненням. При застосуванні для різних видів латуку таких як кочанний, айсберг, кос, батавія або дуболистий, не було знайдено окремих груп, що проявляли значно менше порожевіння, ніж залишок популяції, що досліджували. Тому було зроблено висновок, що у культивованих видах латуку відсутні або є тільки дуже лімітовані генетичні варіації рожевого знебарвлення, спричиненого пораненням. Додатково було продемонстровано, що, відповідно до даного винаходу, специфічний інгібітор PPO, L-цистеїн, при застосуванні під час реакції, значною мірою пригнічує утворення рожевого барвника. Крім того, було знайдено, що утворення рожевого барвника інгібувалося альдегідом коричної кислоти, що являє собою інгібітор активності PAL та побуріння свіжозрізаного латуку (Fujita, N. et al (2006) Biosci. Biotechnol. Biochem. 70, 672-676). Ці відкриття вказують на те, що реакція рожевого знебарвлення латуку залежить від PAL та PPO. Відомо, що ферментне побуріння свіжозрізаного латуку дуже ефективно попереджають шляхом застосування короткотривалого теплового шоку. Ефект, що спостерігається, може бути пояснений шляхом припущення зміни маршруту біосинтезу протеїну з фенілпропаноїдного маршруту на протеїни теплового шоку, таким чином, знижуючи надходження метаболітів у бік утворення поліфенолів. Альтернативно, ефект може бути пояснено шляхом припущення, що ферменти, задіяні у процесі окиснення поліфенолів, такі, як PPO та POD, інактивуються при обробці тепловим шоком. При застосуванні теплового шоку до латуку, що після цього аналізували на предмет реакції порожевіння, було показано, що ця реакція, аналогічно ферментному побурінню, ефективно інгібувалася. Це вказує на те, що реакція порожевіння латуку, що входить до обсягу даного винаходу, є фізіологічно дуже подібною добре відомій реакції ферментного побуріння. Додатковим обґрунтуванням цього відкриття було застосування L-цистеїну як агенту відновлення. Відомо, що L-цистеїн, окрім того, що він є інгібітором PPO, також реагує із забарвленими о-хінонами, та перетворює їх назад, у безбарвні дифеноли, через реакцію хімічного відновлення. Коли рожевий барвник, утворений на листових пластинах латуку, обробляли L-цистеїном, було показано, що рожева сполука перетворювалася на безбарвну сполуку. Тому, можливо, рожевий барвник являє собою о-хінон, утворений PPO. Це було підтверджено відкриттям того, що такі агенти відновлення, як аскорбінова кислота або глутатіон, також перетворюють рожевий барвник на безбарвну сполуку. Додатково, коли рослини, зібрані на полях, що проявляють порожевіння, обробляють Lцистеїном, рожеве знебарвлення також зникає. Це вказує на те, що реакція порожевіння листових пластин являє собою явище порожевіння, що зустрічається у природі, що може іноді спостерігатися у рослин, що зростають у польових умовах. Додаткове втілення даного винаходу засновано на наступному експерименті. Частини листя або качану латуку одержували шляхом зрізання та інкубували при 16°С на повітрі. Реакція 7 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 являла собою побуріння поверхні поранення через, приблизно, 4 дні. Особливо чітко побуріння спостерігалося на поверхні поранення головної жилки. Додатково, реакція побуріння може також спостерігатися на рівні усієї рослини після пошкодження листя шляхом зрізання або стирання. Усі ці реакції побуріння можуть повністю інгібуватися L-цистеїном, інгібітором PPO, що вказує на те, що ці фенотипи проявлялися завдяки активності PPO, і тому можуть вважатися діагностичними засобами побуріння після збору врожаю, як це спостерігалося протягом обробки та упаковки латуку. Можуть бути ефективно одержані такі викликані пораненням реакції побуріння, що можна використати у процедурі фенотипічного скринінгу для ідентифікації мутантних рослин, що мають знижений потенціал побуріння, що викликається пораненням. Додаткове втілення даного винаходу засновано на знебарвленні поверхонь поранення тканин латуку або кольорової реакції, що спостерігається у інтактних тканинах латуку таких як оболонки насіння латуку, або біля них, які викликають шляхом накладання субстратів, що можуть бути перетворені фенол-окиснюючими ферментами на забарвлені сполуки. Наприклад, коли листові пластини латуку інкубують PPO субстратом L-3,4-дигідроксифеніл аланіном (L-DOPA), на поверхні поранення спостерігається знебарвлення від темно-бурого до чорного, що є проявом утворення меланіну завдяки PPO. Коли одночасно застосовували Lцистеїн, чорне знебарвлення повністю інгібувалося, що є підтвердженням припущення, що таке знебарвлення опосередковується PPO. Хоча L-DOPA не розглядають як природний субстрат PPO латуку, її можна використовувати в аналізах, направлених на ідентифікацію мутантів, що проявляють зменшену реакцію знебарвлення, спричинену пораненням. Для збільшення реакції знебарвлення можуть бути використані інші субстрати, так, як це описано для L-DOPA. Ці субстрати включають, але не обмежуються наведеними, хлорогенову кислоту, ізохлорогенову кислоту, L-тирозин, та катехол. Разом, утворення різних барвників на поверхнях поранення, одержували при моніторингу модифікацій рослин на маршрутах, що розпочиналися з виклику сигналу поранення, що передається через PAL та PPO та призводили до знебарвлення. Як описано, ці викликані пораненням реакції знебарвлення можна легко оцінити шляхом візуальної перевірки, що дозволяє проведення дуже ефективної процедури скринінгу мутантів. Пояснення основного способу, що описано у даному винаході, наведено на Фігурі 1. Відповідно до даного винаходу, таким чином було знайдено, що маршрут спричиненого пораненням знебарвлення листових пластин in vitro, значно перекривається із викликаним пораненням знебарвленням латуку, що був оброблений у промисловому масштабі, та може, через це, вважатися діагностичним для цього процесу. Це підтверджується тим фактом, що інгібітори PAL або PPO інгібують ферментне побуріння обробленого та упакованого латуку за практичних, промислових умов. Важливо, оскільки процедура включає стадію індукування, тобто, поранення та одне з остаточних метаболічних перетворень опосередковані PPO, то процедура дозволяє охоплювати усі генетичні фактори, безпосередньо чи опосередковано задіяні у цьому фізіологічному процесі. Більш того, оскільки ця реакція може бути одержана з використанням усього діапазону листових тканин листя різних стадій розвитку, скринінг мутацій може бути направлений на ці різні стадії або тканини, що вважатимуться релевантними. Мутантні рослини, що були ідентифіковані як модифіковані по відношенню до фізіологічного процесу, що призводить від поранення до PAL- та РРО-залежного знебарвлення, виходячи з одного чи більше фенотипічних аналізів, описаних вище, можуть бути описані додатково. Така характеристика може бути здійснена на різних рівнях, наприклад, на молекулярному, біохімічному, фізіологічному та фенотипічному рівнях. Фахівцю у цій галузі очевидно, що можуть спостерігатися різні рівні знебарвлення, що можуть відображати або наявність різних мутантних локусів, або різні алельні форми ідентичних локусів, що впливають на знебарвлення, властиве оригінальній популяції. У випадку рецесивних мутацій ці дві можливості можуть бути легко розрізнені шляхом проведення тестів алельності, що включають схрещення двох мутантних рослин та визначення фенотипу гібриду. У випадку алелізму мутацій, зменшений паттерн знебарвлення буде спостерігатися у F1, тоді як у випадку, коли фенотип мутантів визначають різними рецесивними локусами, це не так. Як в одному зі втілень даного винаходу, де випадковий мутагенез використовують для одержання вихідної популяції, мутації генетичного середовища можуть також робити внесок у варіацію фенотипу за експериментальних умов. Для розрізнення одинарних мутацій при різних інтенсивностях та сполученому впливу мутацій у генетичному середовищі, мають бути здійснені 8 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зворотні схрещення для одержання однорідного генетичного середовища у різних випадках зменшеної реакції знебарвлення. Така процедура є додатково релевантною для визначення того, чи задіяні мутації у конкретних локусах у прояві плейотропних ефектів знебарвлення, спричиненого пораненням. Рослини М2, добрані таким чином, виходячи зі зменшеної реакції знебарвлення, використовували для вирощування насіння М3. Після цього, інбредні лінії, одержані у випадках зменшеної реакції знебарвлення, повторно аналізували на предмет зменшеної реакції на поранення. Додатково, зменшене побуріння або порожевіння можуть бути оцінені у різних генетичних середовищах та за різних умов культивування та обробки сільськогосподарських культур. Способи скринінгу за даним винаходом можуть бути використані для усіх цих оцінок. Для дослідження питань, що відносяться до маршрутів, на які впливають генетичні модифікації, можуть бути проведені біохімічні аналізи. Молекулярні дослідження можуть бути проведені для визначення того, чи були модифіковані теоретично задіяні кандидатні гени у ферментному побурінні або порожевінні, подібно до генів, що кодують PAL, PPO або пероксидази. Додатково може бути проведений генетичний аналіз для того, щоб показати, чи є модифікація, знайдена у кандидатному гені, збудником по відношенню до зміненого фенотипу. Хоча індукований мутагенез є переважним способом забезпечення популяції рослин для використання у способі скринінгу за даним винаходом, фахівцю у цій галузі відомо про існування технології, що дозволяє модифікувати генні мішені, наявні у геномі рослини, особливим чином. Наприклад, було показано, що химерні олігонуклеотиди є ефективним мутагенами, що мають специфічний спосіб дії. Інший підхід полягає у модифікації генних мішеней шляхом гомологічної рекомбінації або направленого впливу на гени. При використанні цього підходу, генний фрагмент замінюють введеним ДНК фрагментом, що містить бажану модифікацію. Також можна здійснити трансгенні підходи, де вводять модифіковані генні мішені, що конкурують з ендогенним продуктом. Це може призвести до домінантних негативних ефектів. Крім того, є можливою специфічна дезактивація генної експресії шляхом PHK інтерференції. У випадку мутагенних олігонуклеотидів, коли направлений вплив на гени, або трансгенні підходи, використовують для модифікації генетичного фактору, задіяного у реакції знебарвлення, викликаній пораненням, очевидно, має бути відома первинна структура релевантних генів. Коли рослини-потомство конкретних мутантів, вирощених з насіння, одержаного шляхом самозапилення, піддавали аналізу на предмет порожевіння, спостерігалося його зменшення, подібне до зменшення первісно ідентифікованого мутанта. Це вказує на те, що зменшена реакція рожевого знебарвлення може успадковуватися та до неї може призводити модифікація геному. Також було несподівано знайдено, що, коли рослини-потомство мутантів, визначені як такі, що проявляють зменшене знебарвлення, спричинене пораненням, вирощують до зрілості та аналізують на предмет ферментного побуріння поранених тканин головної жилки, ця реакція також інгібується у значному ступені. Це є ознакою того, що аналіз порожевіння листових пластин причинно пов'язаний із ферментним побурінням латуку, та того, що аналіз порожевіння може бути використаний для передбачення рівня ферментного побуріння зрілої рослини латуку. Тому, аналіз порожевіння листової пластини може бути використаний як засіб селекції для ідентифікації рослин латуку, що мають знижений потенціал ферментного побуріння. Такий засіб може бути використаний для ідентифікації рослин латуку, що мають знижений потенціал ферментного побуріння, з будь-якого виду популяції рослин, незалежно від причини генетичної варіації, присутньої у цій популяції. Наприклад, крім популяції ems, можна використовувати природні колекції або популяції. Спосіб скринінгу може також бути використаний для скринінгу інших рослин, що проявляють спричинене пораненням знебарвлення. Один чи більше способів скринінгу, забезпечених даним винаходом, можуть, наприклад, бути застосовані до будь-яких сортів, якість обробки яких після збору врожаю потребує покращення. Додатково до культивованого латуку, цей винахід може також бути використаний для інших сортів рослин, наприклад, що належать до Asteraceae таких як род Lactuca, або сорти рослин, що належать до роду рослин Cichorium, до яких належать такі сорти, як ендивій (Cichorium endivia), цикорій та вітлуф (Cichorium intybus). Додатково, інші сільськогосподарські культури, такі, як яблуко, радіккіо, картопля, солодка картопля, селера, гриби, банан, авокадо, персик, груша, абрикос, манго, баклажан, та квіти або стеблини квітів, такі, як стеблини герберів, квіти хризантеми, плоди артишоку та інш., можуть бути піддані скринінгу з використанням способів за даним винаходом. 9 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується способу детекції фенотипічної ознаки у рослин шляхом проведення одного зі способів скринінгу, що описані у цій заявці. Наявність цієї ознаки визначають за допомогою одного чи більше з трьох тестів знебарвлення, а саме, наявності порожевіння або побуріння, або здатності перетворювати субстрат на забарвлений пігмент, наприклад, L-DOPA на меланін. Термін "контроль", як вживається у цій заявці, означає будь-яку рослину, що, як відомо, проявляє одну чи більше з реакцій знебарвлення - порожевіння, побуріння та перетворення LDOPA на меланін, ці реакції можуть інгібуватися L-цистеїном або альдегідом коричної кислоти. Відповідно, використовують рослину, листова пластина якої або інша частина рослини, при інкубуванні між зволоженим фільтрувальним папером при 5°С протягом 7 днів, проявляє рожеве знебарвлення на краях пластини або частини рослини. Даний винахід буде додатково проілюстрований Прикладами, що наведені нижче, та що не призначені для будь-якого обмеження винаходу. Приклади відносяться до листів та насіння латуку, цикорію та баклажану, проте замість латуку можуть бути використані інші рослини чи їх частини, зокрема, свіжі фрукти чи овочі. У Прикладах наведені посилання на наступні Фігури. Фігура 1: Схематичне зображення обґрунтування розробки процедури скринінгу мутантів популяцій латуку на предмет зменшеного ферментного знебарвлення після збору врожаю. Вхідний сигнал скринінгу являє собою поранення листової тканини, що відчувається рослиною та що генерує дивергентну сигнальну реакцію, що призводить до виникнення ряду фізіологічних процесів, включаючи старіння, респірацію та знебарвлення тканин. Цей вхідний сигнал може бути скомбінований шляхом використання фенольних сполук як PPO субстратів. Вихідним сигналом скринінгу є буре або рожеве знебарвлення, в залежності від використаних умов, поверхні поранення, що є ознакою побуріння та порожевіння після збору врожаю. Це випливає з того, що вихідний сигнал повністю інгібується коричним альдегідом та Lцистеїном, що є специфічними інгібіторами PAL та PPO, відповідно. Фігура 2: Репрезентативне зображення вихідного фенотипу скринінгу, на основі рожевого знебарвлення листових пластин. Листові пластини рослин латуку (1 пластина на рослину) розташовували між зволоженим фільтрувальним папером та інкубували при 5°С протягом 7 днів. Рожеве знебарвлення можна чітко спостерігати навколо кожної листової пластини на поверхні поранення. Фігура 3: Аналіз порожевіння листової пластини (4 пластини на планшету) проводили у присутності різних концентрацій інгібітору PAL альдегіду коричної кислоти. Число над кожною планшетою відповідає % використаного коричного альдегіду. Фігура 4: Вплив інгібування інгібітору PPO L-цистеїну на рожеве знебарвлення листових пластин латуку (4 пластини на планшету), інкубованих між зволоженим фільтрувальним папером. Число над кожною планшетою відповідає % використаного L-цистеїну. Фігура 5: Вплив інгібування інгібітору PPO L-цистеїну на чорне знебарвлення листових пластин латуку (4 пластини на планшету), інкубованих між зволоженим фільтрувальним папером у присутності 1,5 мМ L-DOPA. Число над кожною планшетою відповідає мМ концентрації використаного L-цистеїну. Фігура 6: Вплив попередньої обробки тепловим шоком на порожевіння листової пластини латуку. Тепловий шок застосовували протягом 90 секунд для інтактного листя при температурі, вказаної для кожної планшети. Фігура 7: Перетворення рожевого барвника, утвореного в результаті реакції при пораненні латуку, на безбарвну сполуку під дією L-цистеїну. Верхній ряд планшет вказує аналіз L-DOPA, тоді як нижній ряд планшет вказує аналіз порожевіння. Нижню з двох пластин у кожній планшеті обробляли L-цистеїном після завершення реакції на поранення. Використані концентрації Lцистеїну становили 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 та 10 мМ, як наведено вище. Фігура 8: Зменшення порожевіння у латуку, вирощеного у польових умовах, під дією Lцистеїну. На верхній панелі вказано типові симптоми порожевіння листя латуку, зібраних з рослини, що піддавали надзвичайно сильному стресу шляхом затоплення водою. В основних жилках знайдена присутність рожевого барвника. У верхній правій панелі наведено пластину, взяту з листа, що проявляє симптоми порожевіння після обробки 1 мМ L-цистеїном протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. На нижній лівій панелі показано аналогічну листову пластину після обробки водою протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Фігура 9: Панель А: Фенотипічний аналіз окремих рослин латуку М2 (розділених по групам) на предмет знебарвлення листових пластин, відповідно до способу, описаного у даному винаході. Усього на цій панелі показано 138 проб з 12000, де проби, вказані стрілкою, проявляли значно зменшене знебарвлення порожевіння. Панель В: Повторний аналіз добраних рослин, вказаних на панелі А, де була підтверджена практична відсутність утворення рожевого 10 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 знебарвлення (проба посередині) порівняно із контрольними пробами, що проявляють чітку реакцію знебарвлення. Фігура 10: Фенотипи рослин латуку М2. Рослини, позначені 1, 2, 4, 5, 7, 10 та 12 проявляють зменшене рожеве знебарвлення листових пластин, при проведенні аналізу за даним винаходом. Рослини 3, 6, 8, 9, та 11 являють собою рослини, що проявляли рівень рожевого знебарвлення листових пластин, порівнянний із рівнем знебарвлення контрольних рослин дикого типу. Рослина 1 є єдиним прикладом мутанту, що проявляє значне зменшення рожевого знебарвлення та нормальний габітус росту. Рослини 2, 4, 5, 7, 10 та 12 проявляють зменшене рожеве знебарвлення та уповільнений знебарвлений фенотип. Фігура 11: Аналіз потомства мутантів латуку, що проявляють зменшене знебарвлення. Ліворуч наведено 25 контрольних проб, що проявляють нормальну реакцію знебарвлення, спричинену пораненням. Праворуч наведено групу проб, взятих з серії з 35 рослин, що є потомством одного мутанту, що має значно зменшену реакцію знебарвлення, спричиненого пораненням. Фігура 12: Репрезентативне зображення вихідного фенотипу скринінгу, заснованого на бурому знебарвленні частин головної жилки листя, взятого від зрілих рослин латуку. На фігурі наведено пластини тканин головної жили зовнішнього листя латуку після інкубування протягом 3 днів при 16C. Типове буре знебарвлення можна чітко спостерігати на поверхні поранення. Кожна планшета містить 3 пластини, взяті у різних положеннях головної жилки (зелена, світлозелена та біла). Число над планшетою означає мМ концентрацію L-цистеїну, що додавали до фільтру. Фігура 13: Перетворення L-DOPA на листовій поверхні латуку на меланін. На панелі А показано аналіз у 1,5 мМ розчині L-DOPA. Верхня пробірки являє собою негативний контроль, інші 3 пробірки є ідентичними. На панелі В наведено результат інкубування листових пластин між зволоженим фільтрувальним папером, що містить 1,5 мМ L-DOPA. Фігура 14: Аналіз потомства мутантних рослин латуку, що проявляють зменшене спричинене пораненням рожеве знебарвлення побуріння головної жилки. На панелі А наведені пластини головної жилки 8 рослин-нащадків, пронумерованих від 1 до 8 (3 пластини на одну рослину) мутанту, що проявляє зменшене порожевіння. На панелі В наведені пластини головних жилок 8 контрольних рослин, пронумерованих від 9 до 16 (3 пластини на одну рослину), що проявляють нормальну реакцію побуріння. Фігура 15: Оцінка мутантного латуку, що проявляє зменшене спричинене пораненням рожеве знебарвлення або реакцію побуріння після зрізання та упаковки в атмосфері оточуючого середовища. Листові частини качану контрольної рослини наведені на лівій та правій частинах мутанту, що проявляє зменшене знебарвлення, що наведений праворуч. Свіжозрізаний листовий матеріал зберігали протягом 6 днів при 4С. Буре знебарвлення можна чітко спостерігати на контрольних пробах, тоді як мутантні проби залишалися незмінними. Фігура 16: Аналіз порожевіння Cichorium endivia (ліва панель) та Cichorium intybus (права панель). Фігура 17: Аналіз хлорогенової кислоти листових пластин латуку. Фігура 18: Реакція побуріння у зрізаних баклажанах. Фігура 19: L-DOPA аналіз насіння латуку (верхній рядок) та баклажану (нижній рядок). Фігура 20: L-DOPA аналіз пророслого насіння латуку. Фігура 21: Катехоловий аналіз пророслого насіння латуку. ПРИКЛАДИ ПРИКЛАД 1 Генетична модифікація латуку з використанням ems. Приблизно 2000 насіння сортів латуку Troubadour, Apache, Yorvik та Roderick інкубували у аерованому розчині або 0,05% (в/в), або 0,07% (в/в) ems протягом 24 годин при кімнатній температурі. Після обробки ems насіння М1 промивали водою та висаджували у теплиці при 20°С у режимі 16 годин світла, 8 годин темряви для вирощування зрілих рослин та виклику виходу у стрілку та цвітіння для одержання насіння М2. Після дозрівання, насіння М2 збирали, зсипали та зберігали для подальшого використання. Частоту мутацій визначали, виходячи з відносної кількості окремих рослин знебарвленого фенотипу, що задіяні у біосинтезі хлорофілів. ПРИКЛАД 2 Розробка фенотипічного скринінгу, що є засобом діагностики спричиненого пораненням знебарвлення латуку, виходячи з утворення рожевого пігменту. Був розроблений фенотипічний аналіз, в якому можна легко оцінити знебарвлення листя латуку, що викликано пораненням. Цей підхід дозволяє проведення скринінгу молодих рослин на предмет знебарвлення. Листові пластини діаметром 5 мм були взяті від молодих чи зрілих рослин та розміщені між зволоженим фільтрувальним папером на планшеті. Систему 11 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 інкубували при 5C протягом 7 днів. Протягом інкубування у місці поранення на листовій пластині утворювався рожевий барвник, що ставав чітко видимим як друковане коло на фільтрувальному папері (Фігура 2). Для того, щоб продемонструвати, що продукування рожевого барвника потребує активного фенілпропаноїдного маршруту, у цьому аналізі піддавали тестуванню вплив інгібіторів PAL (альдегід коричної кислоти, Фігура 3) та PPO (L-цистеїн, Фігура 4). Коли протягом аналізу застосовували альдегід коричної кислоти, рожеве знебарвлення повністю інгібувалося при концентрації 0,01% чи вище. Аналогічні результати були одержані при використанні L-цистеїну у концентрації 0,001% та вище, тоді як інші амінокислоти, такі, як L-лейцин або L-аланін, не виявили жодного ефекту. Це вказує на те, що L-цистеїн може інгібувати реакцію порожевіння листових пластин латуку, та що інгібуючий вплив L-цистеїну є специфічним. Для того, щоб продемонструвати, що L-цистеїн, дійсно, діє як інгібітор активності PPO у цій системі, листові пластини латуку інкубували з субстратом PPO L-3,4-дигідроксифенілаланіном (L-DOPA). Хоча L-DOPA не вважають природним субстратом для латуку PPO1 знебарвлення від темно-коричневого до чорного спостерігалося на поверхні рани, що є проявом утворення меланіну через дію PPO. При одночасному застосуванні 1мМ або більшої концентрації Lцистеїну, знебарвлення повністю інгібувалося, як показано на Фігурі 5. Порожевіння листових пластин латуку додатково характеризували шляхом застосування теплового шоку перед тим, як викликати реакцію на поранення. Відокремлене листя інкубували протягом 90 секунд при 21, 40, 50 та 60°C. Після цієї обробки листові диски збирали та аналізували на предмет порожевіння. Порожевіння повністю інгібувалося при проведенні теплового шоку при температурі 50°С або вище. Цей результат наведено на Фігурі 6. Оскільки відомо, що L-цистеїн реагує з о-хінонами, що є продуктами PPO, шляхом перетворення їх назад у знебарвлені дифеноли, визначали вплив L-цистеїну на додавання рожевого барвника листових пластин латуку. Паралельно визначали вплив L-цистеїну на утворення меланіну після інкубування з L-DOPA. Листові пластини збирали та інкубували відповідно до описаних вище процедур. Після завершення протікання реакції на поранення, додавали концентраційні серії L-цистеїну до листових пластин, та контролювали зміну кольору. Результат наведено на Фігурі 7. Експеримент чітко показав, що L-цистеїн перетворював рожевий барвник на знебарвлену сполуку, тоді як на чорний меланін, утворений в аналізі L-DOPA, L-цистеїн не впливав. Це вказує на те, що рожевий барвник, дуже ймовірно, є о-хіноном, утвореним поліфенольною окисною системою латуку. Для того, щоб продемонструвати, що реакція, що спостерігалася in vitro, відображає реакцію, що є фізіологічно релевантною, знебарвлення, спричинене L-цистеїном, застосовували до рослинного матеріалу, вирощеного у польових умовах. Цю процедуру проводили шляхом збору листя з рослин латуку, вирощеного у польових умовах, що проявляло дуже виражені симптоми порожевіння наряду з жилками. Це типово спостерігалося, коли рослини піддавали стресу, наприклад, в умовах значного затоплення водою. Листя використовували для одержання листових пластин, що негайно інкубували 1 мМ L-цистеїном. Через, приблизно, 30 хвилин інкубування при кімнатній температурі, рожеве знебарвлення зникало, як показано на Фігурі 8. Взяті разом, ці експериментальні дані демонструють, що поранення листових пластинах латуку може викликати рожеве знебарвлення, яке залежить від PAL та PPO. Цей фенотип дозволяє проведення ефективної процедури скринінгу мутантів латуку, що мають модифіковану реакцію на поранення, яке спричиняє знебарвлення, направлене через PAL, PPO або обидва з них. ПРИКЛАД 3 Скринінг мутантів, що проявляють зменшене знебарвлення, спричинене пораненням. Для того, щоб ідентифікувати мутантів латуку, що мають низький потенціал спричиненого пораненням ферментного побуріння або порожевіння, використовували аналіз листових пластин, описаний у Прикладі 2, для рослин латуку мутантної популяції. 12000 рослин вирощували у теплиці (місце розташування: De Lier, висівали 28 березня, висаджували 18 квітня; вирощували за стандартних умов вирощування латуку) та з кожної окремої рослини була взята листова пластина (проби брали, починаючи з 15 травня) та інкубували як групи (у середньому) з 25 проб між зволоженим фільтрувальним папером при 5°С протягом 7 днів. Кожну листову пластину оцінювали візуально в залежності від інтенсивності рожевого знебарвлення. Виходячи з результатів цієї оцінки, добирали рослини, де листові 12 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пластини не проявляли або проявляли низький ступінь знебарвлення поверхні поранення. Рослину з ледь видимими слідами знебарвлення нумерували як 06D.210202. З 12000 рослин остаточно добирали 1 рослину, що проявляла тільки сліди знебарвлення, що були ледь видимі, та 11 рослин, що проявляли відносно низький рівень знебарвлення. Результат одного з цих аналізів показано на Фігурі 9. Аналіз знебарвлення повторювали для початково добраних 12 рослин, та для більшості випадків первісний результат був підтверджений. Для додаткового аналізу та продукування насіння добирали лише підтверджені рослини. ПРИКЛАД 4 Скринінг мутантів, що проявляють зменшене знебарвлення, спричинене пораненням. Для того, щоб ідентифікувати мутанти латуку, що мають низький потенціал до ферментного побуріння, спричиненого пораненням, для рослин латуку мутантної популяції використовували аналіз листових пластин, описаний у Прикладі 2. 8500 рослин вирощували у теплиці до досягнення віку у 3 тижні (стадія листя 6-8), та з кожної окремої сполуки була взята листова пластина, яку інкубували між фільтрувальним папером при 5°С протягом 7 днів. Кожну листову пластину оцінювали візуально в залежності від інтенсивності рожевого знебарвлення. Виходячи з результатів цієї оцінки, добирали рослини, де листові пластини не проявляли або проявляли низький ступінь знебарвлення поверхні поранення. З 8500 рослин добирали 8, що не проявляли видимого знебарвлення, та 10, що проявляли відносно невелике знебарвлення. Аналіз знебарвлення повторювали для 18 рослин, що були первісно добрані, та у більшості випадків первісний аналіз був підтверджений. Дванадцять рослин показано на Фігурі 10. Для додаткового аналізу та продукування насіння добирали лише підтверджені рослини. Одній мутантній рослині без плейотропних бічних ефектів (наприклад, знебарвлення, уповільнення росту) був присвоєний номер 05D.202539. Насіння, одержане шляхом самозапилення цієї рослини, одержало номер 05D.810596. Насіння, одержане шляхом самозапилення трьох рослин, вирощених з насіння 05D.810596, одержало номер 07G.9979 та було депоновано у NCIMB. Номер NCIMB - 41441 (депоновано 10 жовтня 2006 p.). ПРИКЛАД 5 Фенотипічний аналіз добраних мутантів, що проявляють зменшене знебарвлення, спричинене пораненням. З 12 мутантів, добраних шляхом скринінгу, наведеного у Прикладі 3, 6 проявляли фенотип зі значно зменшеним ростом та зі знебарвленням. Інші мутанти розвивалися нормально, тобто, відповідно до типу вихідної популяції мутагенного експерименту. Уповільнені та знебарвлені мутанти, ймовірно, задіяні у функціонуванні хлоропластів. Оскільки PPO знаходиться у цих клітинних органелах, це може пояснити відносно зменшену реакцію в аналізах листових пластин. Оскільки такі плейотропні мутації є небажаними, ці мутанти вважали менш релевантними. Мутантна рослина 06D.210202, що проявляла найбільш сильне зменшення знебарвлення листової пластини, мала нормальний фенотип, через це мутацію вважали специфічною для знебарвлення без виражених плейотропних ефектів. ПРИКЛАД 6 Підтвердження практичної відсутності фенотипу знебарвлення у потомства. Для того, щоб продемонструвати, що зменшене знебарвлення мутантів латуку, подібно до рослини 06D.210202 з Прикладів 3 та 5 спричинено генетичним впливом, що був викликаний мутагенною обробкою, описаною у цій заявці, насіння одержували шляхом самозапилення. Насінню, одержаному самозапиленням рослини 06D.210202, був присвоєний номер 06D.819784. Насіння пророщували у фунті, а рослини аналізували на предмет знебарвлення за допомогою аналізу порожевіння листових пластин. Цей експеримент чітко продемонстрував, що змінений фенотип мав генетичну основу в усіх рослинах-нащадках, що мали аналогічний фенотип, тобто, значне зменшення рожевого знебарвлення, подібно до мутантів, що були використані для продукування цього насіння. Цей результат проілюстровано на Фігурі 11. Насіння, одержане шляхом самозапилення трьох рослин, що були вирощені з насіння 06D.819784, одержало номер 06D.863B2 та було депоновано у NCIMB. Номер у NCIMB - 41454 (депоновано 3 січня 2007 p.). ПРИКЛАД 7 Розробка фенотипічного скринінгу, що є засобом діагностики спричиненого пораненням знебарвлення латуку, виходячи з утворення бурого пігменту. Рослини латуку вирощували до зрілості, та частини зовнішнього листя були взяті шляхом зрізання пластин з тканин жилок. Пластини інкубували на зволоженому фільтрувальному папері 13 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 при 16°С. Через, приблизно, 72 години, поверхня поранення побуріла. У присутності 10 мМ Lцистеїну реакція побуріння інгібувалася, що було ознакою того, що знебарвлення, яке спостерігалося, опосередковувалося PPO. Репрезентативний результат цього експерименту наведено на Фігурі 12. Оскільки реакція, як показано на Фігурі 12, є опосередкованою PPO реакцією побуріння, то процедура скринінгу, описана у цьому прикладі, може вважатися ефективною та об'єктивною для скринінгу мутантів, що проявляють зменшене знебарвлення побуріння, що відбувається протягом обробки латуку. ПРИКЛАД 8 Розробка фенотипічного скринінгу, що є засобом діагностики спричиненого пораненням знебарвлення латуку, виходячи з перетворення L-3,4-дигідроксифеніл аланіну (L-DOPA) на чорний пігмент, що має назву меланін. Додатково до аналізів, що направлені на спричинене пораненням знебарвлення у широкому сенсі, спосіб відповідно до даного винаходу також дозволяє проведення скринінгу більш специфічним чином, для мутантів, що мають знижену активність PPO. Фенотипічний аналіз, що є показовим для активності PPO, був розроблений шляхом використання листових пластин, що були інкубовані у присутності 1,5 мМ L-DOPA. Оскільки чорне знебарвлення стає видимим, можна дійти до висновку, що L-DOPA може бути легко перетворений системою окиснення поліфенолів на поверхні поранення листя латуку на чорний пігмент під назвою меланін. L-DOPA перетворюється під дією PPO на реакційноздатний L-DOPA-хінон, що перетворюється неферментним чином через допахром та індолхінон на чорний меланін. Додатково, було показано, що реакцію можна інгібувати шляхом додавання 1 мМ L-цистеїну під час реакції (Фігура 5). Тому цей аналіз придатний для ідентифікації мутантів, модифікованих за здатністю збільшувати активність PPO на поверхні поранення листя. Реакцію листових пластин латуку у присутності L-DOPA можна спостерігати як у розчині, так і між зволоженим фільтрувальним папером, як показано на Фігурі 13. ПРИКЛАД 9 Аналіз потомства мутантів, що проявляють практичну відсутність знебарвлення на предмет зменшеної реакції побуріння за допомогою аналізу побуріння пластин жилок. Для того, щоб продемонструвати, що зменшене знебарвлення мутантів латуку, подібно до рослини номер 06D.210202 з Прикладів 3, 5 та 6, що має значно зменшене рожеве знебарвлення поверхонь поранення листових пластин, також ефективно зменшується при викликаній пораненням реакції побуріння, до зрілості було вирощено ряд рослин-нащадків. На цій стадії розвитку, було взято 3 пластини головних жилок зовнішнього листя ряду рослин-нащадків. Ці пластини жилок інкубували відповідно до процедури, описаної у Прикладі 7. Було показано, що рослини-нащадки мутанту, що раніше проявляв значне зменшення спричиненого пораненням рожевого знебарвлення, також проявляють значно зменшене побуріння головних жилок, спричинене пораненням. Результат цього експерименту показано на Фігурі 14. ПРИКЛАД 10 Аналіз потомства мутанту, що проявляє практичну відсутність знебарвлення, на предмет зменшеної реакції побуріння, з використанням свіжозрізаних качанів латуку, упакованих у пластикові пакети. Зрілі качани рослин латуку, вирощені з насіння номер 06D.819784 з Прикладу 6, що має значно зменшене рожеве знебарвлення поверхонь поранення листових пластин, розрізали на частини за допомогою ножа, та упаковували у пластиковий пакет в атмосфері оточуючого середовища. Контрольні рослини, що проявляли стандартну реакцію рожевого знебарвлення листових пластин, обробляли аналогічно. Пакети зберігали при 4°С протягом 6 днів, після чого листовий матеріал оцінювали на предмет побуріння. За допомогою цього експерименту було показано, що рослини-нащадки мутанту, що, як було показано раніше, проявляють значно зменшене рожеве знебарвлення, спричинене пораненням, також проявляють значно зменшене побуріння жилок внаслідок поранення при обробці та зберіганні у пластикових пакетах в атмосфері оточуючого середовища. Результати цього експерименту наведено на Фігурі 15. ПРИКЛАДИ Порожевіння цикорію Для визначення мутантів, що мають знижений потенціал ферментного порожевіння, спричиненого пораненням, використовували аналіз листових пластин, описаний у Прикладі 2, для рослин мутантної популяції Cichorium. Результати наведені на Фігурі 16. Звідси випливає, що реакція порожевіння відбувається також у Cichorium. Спосіб скринінгу за даним винаходом, 14 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 таким чином, є ефективним засобом селекції рослин Cichorium, що проявляють зменшене знебарвлення, спричинене пораненням. До теперішнього часу аналіз реакції побуріння ендивію та цикорію можна було здійснити лише шляхом спостереження зрілих рослин. Спосіб за даним винаходом, що можна використовувати для молодого рослинного матеріалу, є дуже ефективним та швидким. ПРИКЛАД 12 Знебарвлення баклажану Баклажани розрізали навпіл та інкубували усю ніч при кімнатній температурі. Як наведено на Фігурі 18, реакція знебарвлення, головним чином, спричинена насінням. Тому насіння є придатним кандидатом для аналізу знебарвлення на основі субстрату, наприклад, L-DOPA. ПРИКЛАД 13 Фенотипічний скринінг, що є засобом діагностики для спричиненого пораненням знебарвленням латуку, виходячи з перетворення хлорогенової кислоти Листові пластини латуку інкубували з 10 мМ хлорогенової кислоти на фільтрувальному папері. На Фігурі 17 показано побуріння пластин. Після додавання L-цистеїну забарвлення зникало, що додатково вказує на те, що знебарвлення залежить від PPO. Цей приклад демонструє, що хлорогенова кислота є приданим субстратом для скринінгового аналізу на основі субстрату. ПРИКЛАД 14 Фенотипічний скринінг з використанням субстратів, що є засобом діагностики спричиненого пораненням знебарвлення насіння Насіння латуку та баклажану інкубували з 0, 2,5 та 5 мМ L-DOPA. На Фігурі 19 показано, що кольорова реакція, що спостерігалася у насіння, залежить від концентрації. Реакція залежить від PPO, через те, що її можна інгібувати L-цистеїном. Проросле насіння латуку інкубували з L-DOPA. На Фігурі 20 показано, що оболонка насіння та коренева зона безпосередньо за кінчиком кореню проявляють кольорову реакцію. Ця кольорова реакція може бути використана для скринінгу насіння, що проявляє зменшене знебарвлення Насіння латуку інкубували з 0, 100, 250, 500, 750 та 1000 мг/л катехолу. На Фігурі 21 показано, що рослини проявляють кольорову реакцію, що залежить від концентрації. Реакція є РРО-залежною, оскільки було знайдено, що вона інгібується L-цистеїном. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 40 45 50 55 1. Спосіб скринінгу популяції рослин або частин рослин на предмет наявності таких рослин або частин рослин, що проявляють зменшене знебарвлення порівняно із контрольною рослиною або частиною рослини, де спосіб включає: a) забезпечення популяції рослин або частин рослин з популяції; б) інкубування рослин або частин рослин, що мають створену поверхню поранення, для того, щоб відбулося знебарвлення в ній або на ній; в) спостереження знебарвлення в або на рослинах або частинах рослин; г) порівняння знебарвлення, що спостерігається, зі знебарвленням, що спостерігається у контрольній рослині або частині рослини, для ідентифікації рослин або частин рослин, що не проявляють знебарвлення або проявляють зменшене знебарвлення, порівняно із контрольною рослиною чи частиною рослини, де рослини або частини рослин, використовувані у скринінгу, є з іншої стадії розвитку або тканини, ніж стадія або тканина, в якій має місце знебарвлення. 2. Спосіб за п. 1, де знебарвлення є знебарвленням, спричиненим пораненням. 3. Спосіб за п. 1 або 2, де рослини є овочевими рослинами, плодоносними рослинами або квітучими рослинами. 4. Спосіб за п. 3, де рослини є овочевими рослинами, вибраними з латуку, ендивію, вітлуфу, картоплі, солодкої картоплі, селери, грибів, артишоків та баклажанів. 5. Спосіб за п. 3, де рослини є плодоносними рослинами, вибраними з яблунь, бананів, авокадо, персиків, груш, абрикосів та манго. 6. Спосіб за п. 3, де рослини є квітучими рослинами, вибраними з гербери та хризантеми. 7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, де рослини належать до сімейства Asteraceae, зокрема, до роду Lactuca, більш конкретно, до виду Lactuca sativa. 8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, де рослини належать до роду Cichorium, зокрема, до видів Cichorium intybus та Cichorium endivia. 15 UA 99704 C2 5 10 15 20 25 30 35 9. Спосіб за п. 1, 2 або 3, де частини рослин вибирають з листя, качанів, паростків, коренів, бульб, стеблин, квітів, плодів, насіння, пророслого насіння або їх частин та клітин. 10. Спосіб за п. 7 або 8, де частинами рослин є листові пластини. 11. Спосіб за п. 7 або 8, де частинами рослин є пластини головних жилок рослин. 12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, де популяція рослин є популяцією мутантних рослин, колекцією ідіоплазм або популяцією трансгенних рослин. 13. Спосіб за п. 12, де популяцію мутантних рослин одержують шляхом мутагенної обробки з використанням хімічних речовин та/або випромінювання. 14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, де інкубування відбувається у водному середовищі, що містить змочений фільтрувальний папір. 15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, де водне середовище містить воду чи розчин. 16. Спосіб за п. 14 або 15, де водне середовище містить сполуку, вибрану з L-3,4дигідроксифенілаланіну, хлорогенової кислоти, ізохлорогенової кислоти, L-тирозину та катехолу. 17. Спосіб за п. 14 або 15, де водне середовище містить сполуку, вибрану зі сполук, наведених у Таблиці 1. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, де контрольна рослина є рослиною, листова пластина якої, при інкубуванні між двома аркушами зволоженого фільтрувального паперу протягом 7 днів при 5 °C, проявляє порожевіння на краях. 19. Спосіб скринінгу популяції рослин або частин рослин на предмет наявності таких рослин чи частин рослин, що проявляють зменшене знебарвлення порівняно із контрольною рослиною чи частиною рослини, де спосіб включає: a) забезпечення популяції рослин або частин рослин з популяції; b) інкубування рослин або частин рослин з субстратом, що може бути перетворений на забарвлений пігмент для того, щоб відбулося знебарвлення рослин або частин рослин; с) спостереження знебарвлення рослин або частин рослин; d) порівняння знебарвлення, що спостерігається, зі знебарвленням, що спостерігається у контрольній рослині або частині рослини, для ідентифікації рослин або частин рослин, що не проявляють знебарвлення або проявляють зменшене знебарвлення, порівняно із контрольною рослиною чи частиною рослини. 20. Спосіб за п. 19, де субстрат вибирають зі сполук, наведених у Таблиці 1. 21. Спосіб за п. 20, де сполукою є L-DOPA. 22. Спосіб за п. 19, 20 або 21, де рослині або частині рослини наносять поранення перед інкубуванням у субстраті та спостерігають знебарвлення у місці поранення або навколо місця поранення. 16 UA 99704 C2 17 UA 99704 C2 18 UA 99704 C2 19 UA 99704 C2 20 UA 99704 C2 21 UA 99704 C2 22 UA 99704 C2 23 UA 99704 C2 24 UA 99704 C2 25 UA 99704 C2 26 UA 99704 C2 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 27