Спосіб експрес-детекції fusarium moniliforme sheldon var. lactis (pirotta et riboni) bilai у зерні кукурудзи

Спосіб екпрес-детекції Fusarium moniliforme Sheldon var. lactis (Pirotta et Riboni) Bilai у зерні кукурудзи включає ДНК-типування патогену у зразках насіння, який відрізняється тим, що дослідження проводять методом ПЛР-ампліфікації ДНК F.moniliforme з використанням видоспецифічних праймерів у багатокомпонентній системі, на фоні присутності ДНК кукурудзи та різних біологічних домішок. (19) (21) u200603513 (22) 31.03.2006 (24) 16.10.2006 (46) 16.10.2006, Бюл. № 10, 2006 р. (72) Сиволап Юрій Михайлович, Кожухова Наталія Едуардівна, Захарова Ольга Олександрівна (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР У РОСЛИННИЦТВІ 3 17730 4 молотого матеріалу, залити 500мкл TES-буфера 100В при кімнатній температурі. Електрофорез (100mM Тріс-НСІ, рН8,0; 10mM Nа3ЕDТА; 2% SDS) припинити згідно з довжиною пробігу ксиленциата 10мкл протеінази К для лізису клітин. Лізат інкунолу. Одна доріжка гелю повинна містити зразок ДНК з відомою молекулярною вагою: ДНК pUC 19, бувати 60хв при 60 С, після чого додати 140мкл рестриктовану Taq I, або маркер молекулярної 5М NaCl (попередньо довести концентрацію солі ваги pGEM. до 1,4М) і 1/10 V (близько 65мкл) 10% СТАВ. Інку4. Візуалізація продуктів ампліфікації. ДНК вібували 10хв при 65Т. Обробити рівним об'ємом зуалізувати фарбуванням бромистим етидієм консуміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за центрацією 1мкг/мл. об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії. Приклади конкретного використання запропоСуміш, що отримали, Інкубували 30хв при 0°С і нованого способу. центрифугувати 10хв при 14000об./хв на мікрофузі Приклад 1. Перевірка рівня чутливості та спе"Eppendorf 5415", водну фазу перенести у чистий цифічності способу. епендорф, додати 225мкл 5М ацетату амонію, Чутливість визначали шляхом встановлення обережно перемішати; помістити на лід на 30хв; найменшої кількості матричної ДНК F.moniliforme, центрифугувати 10хв при 14000об/мін. Супернащо достатня для ампліфікації специфічного фрагтант знову перенести у чисту пробірку, додати 0.5 менту і візуалізації його у агарозному гелі, забарвоб'єму ізопропилового спирту і витримати протяленому етідієм бромідом. Використовували суміші: гом часу при 0°С. Осадити ДНК центрифугуванням 1) ДНК кукурудзи та ДНК F.moniliforme у відповідпри 14000об./хв протягом 5хв на мікрофузі них концентраціях 1:1, 1:1х10-1, 1:1х10-2, 1:1х10-3, "Eppendorf 5415". Осад промити двічі 0,5мл 70% 1:1х10-4. Виявлено, що для детекції ДНК етанолу, підсушити при кімнатній температурі 15хв F.moniliforme у тканинах рослин достатньо концені розчинити у 100мкл ТЕ-буфера (10mM Тріс-НСІ трації 1% (1:1х10'2) грибної ДНК із суміші з фонорН7,4; 1mM Na3EDTA рН8,0). вою ДНК кукурудзи (Рис.1, доріжка 5). 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакСпецифічність тест-системи перевіряли при ції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5мкл-епендорфах з використанні ДНК F.graminearum, F.oxysporum, використанням ампліфікатора «Терцик» («ДНКSaccharomyces vini (рис.1, доріжки 8-10). У результехнологія», Росія). Реакційна суміш для проветаті ПЛР-ампліфікації видоспецифічний фрагмент дення ПЛР об'ємом 20мкл містить: буфер (50mM спостерігали тільки у зразках ДНК F. moniliforme з KCl, 10mM Тріс-НСІ рН 9,0 (25°С), 1,5mM MgCb, певною концентрацією (рис.1, доріжки 2-4). 0,01% желатин), по 0.2mM кожного dATP, dCTP, Приклад 2. Здійснювали детекцію dTTP, dGTP, no 0.25mkM прямого і зворотного F.moniliforme в зернах 17 качанів, які мали візуапраймерів, 5мкл ДНК і 1од. ДНК-пол і мерази Taq. льні ознаки враження грибковою інфекцією. На Поверх реакційного розчину нашаровувати 20 мкл електрофореграмі розподілу продуктів ампліфікамінеральної олії. Температурний режим ампліфіції 561 п.н.-фрагмент присутній на всіх доріжках кації такий: 93,0°С 1хв 30сек; 35 циклів: 93 С 0хв (Рис.2). ПЛР-амліфікація з використанням пари 30сек, 65 С 0хв 40сек, 70,0 С 1хв; 70 С 1хв 30сек; праймерів, специфічних до геному F.moniliforme, фінальна елонгація - 10хв. Послідовність праймепоказала, що всі качани вражені цим фітопатогерів (5'>3'): прямий - tttacgaggcggcgatgggt, зворотном. ний - ggccgtttacctggcttctt. Розмір специфічного Приклад 3. Здійснювали детекцію фрагменту ампліфікації геному F.moniliforme F.moniliforme в суміші 10 зерен з 10 візуально здо561п.н. рових качанів кукурудзи (№№1-10). На електро3. Електрофоретичний розподіл продуктів амфореграмі розподілу продуктів ампліфікації 561 пліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації (10мклп.н.-фрагмент присутній на двох доріжках, відповіаліквоту ПЛР-суміші) змішати з 2мкл буфера для дних качанам №2 і №8 (Рис.3). ПЛР-ампліфікація з нанесення наступного складу: 0,25% (w/v) бромвикористанням пари праймерів, специфічних до феноловий синій, 0,25% (w/v) ксиленцианол, 40% геному F.moniliforme, показала, що два качани (w/v) сахароза у воді. Фракціонувати в горизонтавражені цим фітопатогеном. льному "підводному" 1,5% агарозному гелі віх ТВЕ-буфері (89mM Tpic-HCS рН8,2; 89mM борна кислота; 2mM Na3EDTA) при постійній напрузі 5 Комп’ютерна верстка М. Мацело 17730 6 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601