Спосіб посилення протилейкозної активності циклофосфану

Изобретение относится к области медицины в частности к экспериментальной гематологии, и может быть использовано для лечения лейкозов. Наиболее близким к предлагаемому способу, выбранным нами в качестве прототипа, является химиоиммунотерапия экспериментального лейкоза L1210, включающая циклофосфан (ЦФ) и модифицированные Кон А лейкозные клетки [1]. Способ заключается в 2-кратной внутрибрюшинной иммунизации мышей (на 1-е и 7-е сутки после трансплантации лейкоза) вакциной из модифицированных лейкозных клеток того же штамма лейкоза и внутрибрюшинного введения циклофосфана (ЦФ) в дозе 100 мг/кг массы животного (на 6-е сутки после трансплантации лейкоза). Вакцина по прототипу представляет собой девитализированные глутаральдегидом лейкозные клетки, обработанные по холоду конканавалином А (Кон А) в дозе 165 мкг/мл. Терапевтический эффект такого способа химиоиммунотерапии у мышей с лейкозом L1210 составил 6,6 %. Такое техническое решение обладает рядом недостатков. Вакцина представляет собой взвесь мертвых клеток, антигенность, а следовательно, и иммуногенность, которых ниже, чем живых. Применение ЦФ не до иммунотерапии, а в промежутках между вакцинациями. Химиотерапия должна предшествовать иммунотерапии и быть направленной на устранение основного пула злокачественных клеток, а иммунотерапия - остаточных клеток. Перечисленные недостатки, по-видимому, явились причиной того, что предложенная химиоиммунотерапевтическая схема лечения лейкоза, перевитым животным минимальным количеством клеток (2x102), хотя и существенно удлиняла продолжительность жизни животных с 12,1±0,7 до21,4±0,7 дня, но полное выздоровление обеспечивала только 6,6% животных. Задачей предлагаемого изобретения является повышение лечебной эффективности ЦФ за счет разработки условий для синергичного действия цитостатика и активной специфической иммунотерапии модифицированными лейкозными клетками. Поставленная задача достигается тем, что в способе усиления противолейкозной активности циклофосфана, включающий введение циклофосфана и иммунизацию идентичными заболеванию лейкозными клетками, согласно изобретению, циклофосфан вводят до достижения ремиссии, после чего осуществляют многократную подкожную иммунизацию живыми лейкозными клетками, предварительно обработанными конкановалином А. Лейкозные клетки при температуре 37°С в течение 30-90 мин обрабатывают конкановалином А из расчета 50-150 мкг на 5*106 клеток. Модификация лейкозных клеток осуществлялась следующим образом. 5x10 нативных клеток асцитической жидкости животных с лейкозом NK/LY инкубировали в среде 199 с 50-150 мкг/мл Кон А (фирма "Serra") при 37°С в течение 30-90 мин, центрифугировали при комнатной температуре 5 мин при 1000 д, надосадок сливали, осадок расуспендировали в ср. 199. При разработке предлагаемого способа иммунотерапии исследованиями in vitro, проведенными с целью оценки влияния Кон А на жизнеспособность лейкозных клеток, доказано мало существенное влияние различных доз Кон А (в интервале 50-150 мкг/мл) и сроков инкубации с ним (в интервале 3,0-90 мин) на пролиферативный потенциал и морфологическую сохранность лейкозных клеток различных штаммов (табл. 1). В опытах in vivo на мышах с лейкозом NK/LY оценено иммуномодулирующее влияние и клиническая эффективность предлагаемой вакцины, использованной в качестве самостоятельного терапевтического средства. Так, 3-кратная подкожная иммунизация животных вакциной в последовательно возрастающих дозах (курсовая доза 7x10 клеток) тормозила развитие лейкоза до 26-х суток в контроле до 10-х суток), отчетливо тормозила накопление, асцита (почти в 2 раза) и достоверно удлиняла продолжительность жизни мышей на 4,3 суток, сохраняла на достаточно высоком уровне содержание Т- и В- лимфоцитов в периферический крови. Эти данные свидетельствовали о выраженном иммуномодулирующем эффекте жизнеспособных модифицированных Кон А клеток и существенном преимуществе живой вакцины в сравнении с девитализированной, использованной в качестве прототипа. Сочетанное применение ЦФ и предлагаемой вакцины осуществлено с лечебной целью на 350 беспородных и 52 мышах линии СВА с трансплантированным лейкозом NK/LY. Результаты лечения представлены в табл. 2. Как видно из представленных в этой таблице данных, предлагаемый способ на 6-7 дней удлинял продолжительность жизни животных по сравнению с животными, леченными одним ЦФ, и обладал во много раз более высоким терапевтическим эффектом, чем ЦФ и предлагаемая по прототипу схема, терапевтический эффект которой при перевивке лейкоза минимальным количеством клеток (на три порядка меньше, чем в наших экспериментах) составлял лишь 6,6%. Реализация способа поясняется следующими примерами. Пример 1. Мышь беспородная, самка, масса 19,7 г, исходные показатели периферической крови: гемоглобин - 170 г/л, эритроциты -9,9-1012/л лейкоциты - 11,3 · 10 9/л Тобщ.-96%,В-42%. Лейкоз NK/LY перевит 1 · 10 лейкозных клеток внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл. Циклофосфан в дозе 100 мг/кг вводили внутрибрюшинно на 1 и 6 сутки после перевивки лейкоза. После завершения курса асцит пальпаторно не определялся. Показатели крови: гемоглобин - 152 г/л, эритроциты - 7,6-1012/л, лейкоциты 6,45-10д/л, Тобщ.-35%,В-11 %. Иммунизацию осуществляли на 12,15 и 18 сутки после перевивки лейкоза живыми лейкозными клетками того же штамма, обработанными конканавалином А при 37°С, в течение 30-90 минут из расчета 120 мкг/мл на 5·106 клеток. На 21 сутки после перевивки лейкоза показатели периферической крови составили: гемоглобин 158 г/л, эритроциты - 7-1012/л, лейкоциты - 12,1 ·10 /л, Тобщ-68%,В-12%. Мышь наблюдалась до 120 суток, рецидивы лейкоза не выявлены. Пример 2. В 3 сериях опытов использовали 790 мышей, из которых 60 являлись интактными, 290 контрольными, которых после перевивки лейкоза не подвергали лечению, 290 мышей лечили циклофосфаном и 180 мышей лечили циклофосфаном с последующей иммунотерапией, как в примере 1. Модификацию лейкозных клеток осуществляли конкановалином А как описано в примере 1. Результаты опыта на 20 сутки после перевивки лейкоза приведены в табл. 3. Пример 3. Больная ННВ, 1958 года рождения, история болезни № 5985. После перенесенной острой респираторной инфекции начала ощущать общую слабость, кашель и периодическое повышение температуры до 39,0°С. При поступлении: жалобы на боли в горле при глотании, кашель, общую слабость. Температура 39.0°С, кожные покровы бледные, в легких ослабленное дыхание и очаговые хрипы в нижних отделах, тоны сердца приглушены, границы сердца расширены влево, печень выступает из под края реберной дуги на 3,5-4,5 см, безболезненная, лимфатические узлы и селезенка в норме. Анализ крови: гемоглобин - 94 г/л, эритроциты 2,5*1012/л, лейкоциты - 1,6*109/л тромбоциты - 2,37•109/л, властные клетки - 68%, палочкоядерные нейтрофилы - 1%, сегментоядерные нейтрофилы - 13%, эозинофилы - 4%, лимфоциты - 14%. На основании клиникогематологического обследования и данных цитохимических реакций поставлен диагноз острый миелобластный лейкоз, первый острый период. Сопутствующие заболевания: двухсторонняя нижнедолевая пневмония, тромбофлебит нижних конечностей. Специфическое лечение проводилось по схеме 7+3 [Ковалева Л. Г. Острые лейкозы, М., Медицина, 1976, с. 75] и сопровождались гемотрансфузиями. Для лечения сопутствующи х заболеваний использовались антибиотики, витаминные препараты, симптоматические средства. После специфического лечения наступала полня клинико-гематологическая ремиссия, что подтверждено данными стернальной пункции. Иммунологические показатели резко снижены: Тобщ. - 7%, Такт - 30%, Τх -13%, Тс - 0. В-2%, ЕК-О, ЕКА-7%. Под контролем иммунологических показателей проведена 5-кратная подкожная иммунизация в 4 точки живыми аллогенными криоконсервированными клетками, обработанными конканавалином А п8 схеме, описанной в примере 1. Интервалы между иммунизациями составили от 16 до 36 суток. После 3-й иммунизации показатели периферической крови составили: палочкоядерные нейтрофилы -3%, сегментоядерные нейтрофилы - 46%, эозинофилы- 8%, лимфоциты -36%, моноциты - 6%. Иммунологический статус: Тобщ. -41%. Такт. - 26 %, Тх -42%, Те - 0, В-20%, ЕК-39%. Общее состояние удовлетворительное, жалоб нет. Через 3,5 месяца от начала иммунизации миелограмма: властные клетки - 3,5%, промиелоциты - 2%, миелоциты нейтро-фильные - 14,5%, миелоциты эозинофильные - 2%, метамиелоциты - 8%, палочкоядерные нейтрофилы - 14,5%, сегментоядерные нейтрофилы - 15,5%, лимфоциты - 6,5%, плазматические - 0,5%, эритробласты - 0,5%, пронормоциты - 1.5%, нормоциты базофильные - 3%, нормоциты полихроматофильные - 27,5%. Гемограмма: палочкоядерные нейтрофилы - 3%, сегментоядерные нейтрофилы-52%, лимфоциты 8%. Содтояние больной удовлетворительное. В связи с полной клинико-гематологической и иммунологической ремиссией, нет показаний к проведению повторного курса цитостатическими препаратами. Использование циклофосфана в сочетании с активной специфической иммунотерапией идентичными заболеванию живыми лейкозными клетками, модифицированными конкановалином А, обеспечивает высокий терапевтический эффект. Такой результат достигнут благодаря значительной активации отдельных звеньев иммунитета, обусловленной влиянием иммунотерапии модифицированными клетками.