Спосіб визначення індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів in vitro

Корисна модель відноситься до галузі медицини та експериментальної біології і може бути використана в клінічній практиці та експериментальних дослідженнях для визначення індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів in vitro з метою оцінки одного з механізмів елімінації бактеріальних патогенів - програмованої смерті інфікованих ними клітин. Відомий спосіб визначення індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів in vitro, шляхом інкубації фагоцитів в поживному середовищі з відповідною культурою бактерій і подальшим підрахуванням відсотку апоптичних клітин [див. Bonecini-Almeida M.G. Flow cytometry as a tool to identify Mycobacterium tuberculosis interaction with the immune System and drug Suscebility // J. Immunol. - 2000. - V. 95 (4), №8. - P. 491 - 494]. Проте даний спосіб не точний, тому що не вра ховує інфікованість клітин, яка обумовлена їх здатністю до поглинання цих бактерій, а також наявність апоптичних клітин у вихідній популяції фагоцитів, що спотворює отримані результати при їх підрахунку після інкубації з бактеріями. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб визначення індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів in vitro, в якому шля хом використання популяції адгерентних фагоцитів, додаткового визначення інтенсивності поглинання ними бактерій і здійснення інкубації клітин в лунках предметних скелець з обмежувальними кільцями досягається підвищення точності визначення індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів in vitro. Поставлене завдання вирішується тим, що у способі визначення індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів in vitro, шля хом їх інкубації в поживному середовищі з культурою бактерій, мікроскопії отриманих препаратів з підрахуванням відсотку апоптичних клітин, згідно корисної моделі, попередньо виділяють моношар адгерентних фагоцитів, індукцію апоптозу здійснюють в лунках предметних скелець з обмежувальними кільцями, після чого додатково підраховують відсоток клітин, що містять бактерії внутрішньоклітиннo - показник інтенсивності поглинання бактерій та розраховують показник індукованого бактеріями апоптозу за формулою: П ІБА=100*П А/ІБ(%), де: П ІБА - показник індукованого бактеріями апоптозу; П А - процент апоптичних фагоцитів; ІБ - показник інтенсивності поглинання бактерій і при отриманні показника індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів менше 65% визначають його пригнічення, а при отриманні показника індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів понад 135% визначають його посилення. Відомо, що різноманітні бактерії (Mycobacterium tuberculosis, Salmonella, Candida albicance та інші) здатні регулювати інтенсивність програмованої смерті клітин (апоптоз) не лише інфікованих ними фагоцитів, але й клітин, вільних від даних мікроорганізмів. Так, мікобактерії туберкульозу (особливо з високими вірулентними та патогенними властивостями) безпосередньо виділяють інгібітори апоптозу, які попереджують його розвиток в макрофагальних та моноцитарних фагоцитах, а також індуктори апоптозу, що ініціюють останній в нейтрофільних фагоцитах та цитотоксичних лімфоцитах і забезпечують таким чином збереження та недоторканість своєї оселі. Ті ж самі процеси відтворюються цитокінами (монокінами), що продукуються інфікованими клітинами. Одночасно імунна система хазяїна, яка зацікавлена у якомога швидкому й ефективному знищенні патогену, включає механізми протилежної спрямованості, в тому числі ті, які призводять до активації апоптозу в інфікованих фагоцита х і сприяють елімінації чужорідного організму бактеріального агента. Співвідношення індукторів та інгібіторів апоптозу у вн утрішньоклітинному та позаклітинному середовищі, кінець кінцем, і визначає долю фагоцитів - як інфікованих бактеріями, так і вільних від них. Але інфікованість фагоцитів бактеріями, яка відбувається за рахунок активного їх поглинання, неоднакова. Це обумовлене різним станом поверхневих рецепторів фагоцитів та різною присутністю в позаклітинному середовищі опсонінів і гуморальних факторів, які блокують відповідні рецептори на фагоцитах. Тому, той же самий показник апоптозу фагоцитів при високій інфікованості останніх може бути недостатнім, а при низькій інфікованості надмірним. Отже, для коректного визначення показника індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів необхідно враховувати й те, скільки клітин було цими бактеріями інфіковано. Крім того, відомо, що в нейтрофільних фагоцитах генетична програма апоптозу вважається включеною. Саме тому ці клітини в зрілому та старому стані мають сегментоване ядро, що є прямою морфологічною ознакою апоптозу. Відомо також, що хоча більшість зрілих моноцитарних фагоцитів стійкі до індукції апоптозу, він може ініціюватися в цих клітинах при нестачі ростових факторів мікрооточення та активації, яка має місце при багатьох захворюваннях. Отже, у вихідній популяції нейтрофільних та моноцитарних фагоцитів можуть бути присутні й клітини з ознаками апоптозу. Апоптичні фагоцити нездатні до адгезії, і тому використання лише адгерентної їх популяції для проведення дослідження призводить до елімінації з вихідної популяції клітин з морфологічними ознаками апоптозу, що підвищує точність дослідження. Через цю ж втрату здатності до адгезії апоптичні фагоцити можуть при інкубації відклеюватися від скла, а тому центрифугування препаратів перешкоджає втраті цих клітин, що також сприяє підвищенню точності дослідження. Спосіб здійснюють в декілька етапів. З гепаринізованої крові хворого (2мл) на одинарному (1,078) чи подвійному (1,090 та 1,078) градієнті щільності виділяють популяції фагоцитів (нейтрофільних та/або моноцитарних). Їх моношар отримують шляхом адгезії до скла - інкубацією 50-100мкл суспензії цих фагоцитів в робочій концентрації 106/мл в лунках 2-х предметних скелець діаметром 5-10мм (з них одна - з обмежувальним кільцем) у вологій камері при температурі 37°С протягом 10-15 хвилин (для нейтрофільних фагоцитів) та 60 хвилин (для моноцитарних), та наступним відмиванням препаратів в повному поживному середовищі (RPMI з HEPES та L-глютаміном, 10% ембріональною телячою сироваткою та антибіотиками або середовище 199, що містить 10% ембріональної телячої сироватки та 100мкг/мл стрептоміцину). З культури бактерій готують їх робочу суспензію в поживному середовищі, яка майже завжди відповідає тій, що звичайно використовується для постановки фагоцитарних реакцій (наприклад, для визначення індукції апоптозу фагоцитів мікобактріями туберкульозу (МБТ) застосовують концентрацію 100мкг їх ліофілізованої культури на 1мл поживного середовища). Для інфікування фагоцитів бактеріями в лунки 2-х предметних скелець з моношаром фагоцитів вміщують по 50-100мкл суспензії бактерій, відповідно, інкубують у вологій камері 60 хвилин при 37°С та двічі промивають в повному поживному середовищі. Після чого одне з них висушують, а в лунку з обмежувальним кільцем іншого вміщують 50-100мкл цього ж поживного середовища та продовжують інкубацію у вологій камері при 37°С ще протягом 60 хвилин. По завершенні інкубації рідину, яка міститься в лунці предметного скельця з обмежувальним кільцем, обережно перемішують, скельце піддають центрифугуванню 2 хвилини при 500-1000об/хвил., надосад обережно елімінують, а препарат висушують на відкритому повітрі. Фарбування отриманих в лунках скелець препаратів здійснюють після їх фіксації метанолом та висушування в 2 етапи: на першому протягом 4 хвилин карболовим фуксином Циля, розведеним у 10 разів, фарбують бактерії та висушують. На другому е тапі протягом 2 хвилин дофарбовують фа гоцитуючі клітини 1% спиртовим розчином діамантового зеленого з подальшим промиванням їх у воді. Після остаточного висушування препаратів здійснюють їх мікроскопію під масляною імерсією на світловому мікроскопі (при збільшенні х 500 х 900). В першому препараті підраховують відсоток клітин, які містять внутрішньоклітинно бактерії (показник інтенсивності поглинання бактерій), в другому препараті підраховують відсоток клітин з морфологічними ознаками апоптозу, тобто процент апоптичних фагоцитів та розраховують показник індукованого бактеріями апоптозу (П ІБА) за формулою: П ІБА=100*П А/ІБ(%), де: П ІБА - показник індукованого бактеріями апоптозу; П А - процент апоптичних фагоцитів; ІБ - показник інтенсивності поглинання бактерій і при отриманні показника індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів менше 65% (нижній рівень здорових осіб) визначають його пригнічення, а при отриманні показника індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів понад 135% (верхній рівень здорових осіб) визначають його посилення. Наводимо конкретні приклади здійснення способу. Приклад 1 (за способом, що заявляється). Г-н А.С., донор крові. При обстеженні за способом, що заявляється, було отримано такі результати дослідження: показник інтенсивності поглинання нейтрофільними фагоцитами МБТ становив 27%, процент апоптичних нейтрофільних фагоцитів також дорівнював 27%. Таким чином, показник індукованого мікобактеріями апоптозу нейтрофільних фагоцитів склав 100% (П ІБА = 100*27:27), що входить у межі нормальних значень цього показника. У цієї ж особи показник інтенсивності поглинання моноцитарними фагоцитами МБТ становив 17%, процент апоптичних моноцитарних фагоцитів дорівнював 21%. Таким чином, показник індукованого мікобактеріями апоптозу моноцитарних фагоцитів склав 123,5% (П ІБА = 100*21:17%), що також входить у межі нормальних значень (65,0% - 135%). Приклад 2 (за способом, що заявляється). Хворий Д-й Н.А., історія хвороби №457. Перебував на стаціонарному лікуванні в Інституті фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського з діагнозом інфільтративний туберкульоз легень. При обстеженні за способом, що заявляється, було отримано такі результати дослідження: показник інтенсивності поглинання нейтрофільними фагоцитами МБТ становив 51%, процент апоптичних нейтрофільних фагоцитів дорівнював 27%. Отже, показник індукованого мікобактеріями апоптозу нейтрофільних фагоцитів склав 52,9% (П ІБА = 100*27:52%), що менше нормального значення цього показника. Отримані дані свідчать про пригнічення індукованого мікобактеріями апоптозу нейтрофільних фагоцитів, що може призводити до уповільнення елімінації бактеріальних патогенів і хронізації інфекційного процесу. Приклад 3 (за способом, що заявляється). Хворий М-р Л.В., історія хвороби №228. Поступив на стаціонарне лікування в Інституту фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського з діагнозом вперше виявлений інфільтративний туберкульоз легень. При обстеженні за способом, який заявляється, було отримано такі результати дослідження: показник інтенсивності поглинання нейтрофільними фагоцитами МБТ становив 15%, процент апоптичних нейтрофільних фагоцитів дорівнював 37%. Таким чином, показник індукованого мікобактеріями апоптозу нейтрофільних фагоцитів склав 247% (П ІБА = 100*37:15%), що перевищує нормальні значення цього показника. Отримані дані свідчать про посилення індукованого мікобактеріями апоптозу нейтрофільних фагоцитів, що може призводити до розвитку нейтропенії і зменшення внаслідок цього неспецифічних факторів імунологічної резистентності. Всього за способом, що заявляється, обстежено 57 осіб, в т.ч. 11 хворих на туберкульоз легень, 25 пацієнтів з хронічним обструктивним захворюванням легень та 21 здоровий донор крові. В таблиці наведені відомості про середні значення проценту апоптичних нейтрофільних фагоцитів, показників інтенсивності поглинання ними МБТ та індукованого цими бактеріальними патогенами апоптозу нейтрофільних фагоцитів у осіб ци х 3-х гр уп. Таким чином, спосіб, що заявляється, на відміну від прототипу, дозволяє підвищити точність визначення індукованого бактеріями апоптозу фагоцитів in vitro за рахунок: використання адгерентної популяції фагоцитів, яка не містить клітини з апоптичною морфологією, проведення індукції апоптозу в лунках предметних скелець з обмежувальними кільцями, які дозволяють проводити центрифугування препаратів і перешкоджають втраті фагоцитів, що набули апоптичних ознак і через це втратили здатність до адгезії та додаткового визначення показника інтенсивності поглинання фагоцитами бактерій. Це дозволяє виявити повноцінність елімінації бактеріальних патогенів в організмі пацієнтів та виявити ті механізми, які можуть сприяти виникненню нейтропенії (наприклад, у хворих на туберкульоз) або хронізації інфекційного процесу (зокрема у пацієнтів з неспецифічними захворюваннями легень). Таблиця Процент апоптичних клітин, показники інтенсивності поглинання МБТ та індукованого ними апоптозу нейтрофільних фагоцитів у донорів крові та хворих на туберкульоз та неспецифічні захворювання легень Групи обстежених Показники Інтенсивність поглинання МБТ (%) Вміст апоптичних клітин після інкубації (%) Показник апоптозу, індукованого МБТ Здорові особи (n=21) Хворі на туберкульоз легень (n=11) Хворі на неспецифічні запальні захворювання легень (n=25) 30,6±3,1 18,5±1,7* 27,0±2,8¨ 30,1±0,1 43,5±5,3* 36,0±3,1* 118,0±12,3 247,3±29,5* 166,8±21,3*¨ Примітки. 1. * - різниця показника в порівнянні з показником групи здорових осіб вірогідна (р < 0,05). 2. ¨ - різниця показника в порівнянні з показником групи хвори х на туберкульоз легень вірогідна (р < 0,05). Спосіб, що заявляється, простий у виконанні і може бути застосований у лабораторіях науково-дослідних установ медико-біологічного профілю.