Спосіб діагностики нейродегенеративних захворювань з когнітивними розладами

Спосіб діагностики нейродегенеративних захворювань з когнітивними розладами за даними вмісту теплового протеїну тау в крові пацієнта, який відрізняється тим, що застосовують імунофлюоресцентний метод, при якому визначення концентрації тау протеїну здійснюється в імунофлюоресцентній реакції з використанням моноклональних мишачих анти-тау (Anti- t ) антитіл та вторинних моноклональних антитіл IgG ( g ) FITC, фірми SIGMA. (19) (21) u200901572 (22) 23.02.2009 (24) 25.09.2009 (46) 25.09.2009, Бюл.№ 18, 2009 р. (72) ВОЛОШИН ПЕТРО ВЛАСОВИЧ, ВОЛОШИНА НАТАЛІЯ ПЕТРІВНА, ЄГОРКІНА ОЛЬГА ВІКТОРІВНА, ГОРБАЧ ТЕТЯНА ВІКТОРІВНА, ПЕРЕПАДЯ СЕРГІЙ ВІТАЛІЙОВИЧ, ЛЕКОМЦЕВА ЄВГЕНІЯ ВОЛОДИМИРІВНА, ГАПОНОВ ІВАН КОСТЯНТИНОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ НЕВРОЛОГІЇ, ПСИХІАТРІЇ ТА НАРКОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ" 3 44124 cerebrospinal fluid for neurodegenerative diseases // J. Alz. Dis. - 2005. - Vol. 8(4). - P. 377-386). Серед недоліків прототипу звертає на себе увагу низька специфічність методу. Специфічність діагностики нейродегенеративних захворювань, особливо хвороби Альцгеймера та бічного аміотрофічного склерозу, складає 70-78 %. Церебральна біопсія є одним із самих надійних методів діагностики всіх нейродегенеративних захворювань, однак вона використовується лише в якості дослідницької методики (Sussmuth S. et all. Amyotrophic lateral sclerosis: disease stage related changes of tau protein and S100 beta in cerebrospinal fluid and creatine kinas in serum // Eur. Neurol. - 2003. - Vol. 43. P.232-244.). У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу підвищення ефективності діагностики нейродегенеративних захворювань з когнітивними розладами шляхом визначення вмісту теплового тау протеїну в крові хворих імунофлюоресцентним методом з використанням первинних й вторинних моноклональних антитіл, що забезпечить покращення специфічності та однозначності способу діагностики дегенеративних захворювань нервової системи. Суть корисної моделі полягає в тому, що в крові вивчається вміст тау протеїну модифікованим імуногістохімічним методом в імунофлюоресцентній реакції з використанням первинних й вторинних моноклональних мишачих антитіл. Імуногістохімічний метод дає змогу виявлення субклітинного компоненту (антигену) за допомогою імунологічної флюоресцентної реакції, цей метод відзначається високою специфічністю (99 %) та чутливістю, та основане на конкурентному зв'язуванні моноклональних антитіл, які є специфічними до різних епітопів IgG (г) та IgM дослідних високоглобулярних молекул тау (ф) протеїну. Таким чином, застосування корисної моделі у клініці за допомогою нейроімунологічного дослідження надасть можливість прижиттєвої, ранньої та своєчасної діагностики нейродегенеративних захворювань. Спосіб діагностики виконують таким чином. У пацієнта одержують кров і заморожують при – 20 С°. Зразки, отримані від хворих, та стандарти, отримані від контрольної групи, а також, у зв'язку, з відсутністю стандартної калібровочної кривої, в якості контрольної групи згідно з методикою Zemlan (Zemlan P. US Patent 6589746 - Method of de 4 tecting axonally-derived protein tau in patients with traumatic CNS injury // Traumatic CNS injury, 2003, US Patent), додають до контрольної групи, так званий, «неврологічний контроль», який складається із хворих на епілепсію у міжнападний період. Зразки й подвійні стандарти (контроль та неврологічний контроль) інкубують з першим моноклональним мишачим Anti-ф (Tau, clon 2) антитілом протягом 30 хвилин у термостаті при температурі +37 С° в присутності вторинного антитіла, міченого ізотіоціанід (FITC) флюоресцентом специфічним до IgG (г). Після інкубації зміст відмивається тричі у буферному розчині для вилучення не зв'язувальних комплексів антитіл до тау. Для визначення тау протеїну в імунофлюоресцентної реакції використовують стандартні набори фірми Sigma (USA). Далі формують базу даних з показників здорових осіб (контрольна група) і порівнюють з нею показники пацієнтів з нейродегенеративними захворюваннями (основана клінічна група) і показники пацієнтів з епілепсією (група порівняння). Приклад. В ході дослідження було обстежено 3 клінічні групи - 1 клінічна група (основна дослідницька група), яка складалася з 9 хворих на нейродегенеративні захворювання з когнітивними порушеннями у віці від 38 до 55 років; 2 клінічна група (група неврологічного контролю), яка складалася з 9 хворих на епілепсію у віці від 24 до 43 років, та 3 група (контрольна), яка складалася з 10 здорових осіб у віці від 27 до 33 років. Середній вік пацієнтів 1 групі складав 46,05±11,5 років, середній вік хворих 2 групи - 33,78±11,09 років; середній вік контрольної групи - 29,11±7,14 років. Хворі на дегенеративні захворювання нервової системи з когнітивними розладами мають патологічний тау протеїн в крові та статистичне підвищення його рівню на 0,49 ум. од. оптичної щільності (ОЩ, D) порівняно зі здоровим контролем (р0,05). Вміст тау протеїну у хворих 1 групи порівняно з даними вмісту тау у хворих 2 групи суттєво не відрізнявся: хворі на нейродегенеративні захворювання мають підвищення рівню тау на 0,2 D порівняно з рівнем тау у хворих на епілепсію (р>0,05). Показники даних рівню тау протеїну наведені у діаграмі у табл.1. Таблиця 1 Показники рівню теплового тау протеїну в крові хворих на нейродегенеративні захворювання (І клінічна D = log10 F0 / F1 група), хворих на епілепсію (ІІ клінічна група) та контролю оптична цільність Показник Тау протеїн 1 клінічна група, (n=9) 0,53±0,05* 2 клінічна група, (n=9) 0,33±0,02 контрольна група, (n=10) 0,04±0,01 Примітка: * - р0,05) (табл. 1). 5 44124 В даному дослідженні було з'ясовано, що хворі на епілепсію та нейродегенеративні захворювання з когнітивними порушеннями мають патологічний тау протеїн в крові, але хворі на нейродегенеративні захворювання з когнітивними розладами мають високій рівень тау. Тобто, лише у хворих на нейродегенеративні захворювання з когнітивними розладами відмічається достовірне підвищення Комп’ютерна верстка Д. Шеверун 6 рівню теплового тау (ф) протеїну в крові порівняно з контролем. Таким чином, дані теперішнього дослідження переконливо показують ефективність діагностики нейродегенеративних захворювань з когнітивними розладами за даними визначення в крові вмісту теплового протеїну тау. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601