Спосіб визначення остеоінтегративних якостей матеріалів

1. Спосіб визначення остеоінтегративних якостей матеріалів для імплантатів, згідно з яким виділяють і культивують мезенхімальні стовбурові клітини, переносять їх на носій, визначають цитотоксичність носія по життєздатності зазначених 3 кістковою тканиною з подальшим визначенням стадії регенерації кісткової тканини, згідно з корисною моделлю, носій обирають з групи матеріалів, таких як біоколаген, або колапан, або біо-ген, або остеоапатит, або кергап. Регенерацію здійснюють шляхом транспортування стовбурових клітин в зону дефекту на обраному носієві. Стадію регенерації визначають на 30 та 60 добу. Завдяки застосуванню запропонованого способу досягається інформативність визначення остеоінтегративних якостей матеріалів, одержання якісних показників поведінки стовбурових клітин на досліджуваному носієві, що дозволяє якісно і повноцінно проводити регенерацію кісткової тканини як в губчатій так і в компактній кістці, досягається збільшення швидкості остеогенезу і формування нової кісткової тканини. Спосіб здійснюють таким чином. Експерименти in vitro проводять на двох групах кістково-пластичного матеріалу. Ксеногенні (природний гідроксиапатит): - Біо-Ген - кістково-пластичний матеріал кінського походження, що представляє собою мінеральний матрикс; - Біоколаген - ліофілізована кінська колагенова мембрана для прямої тканинної регенерації. Остеотропні з керамічного гідроксиапатиту та трикальційфосфату: Періоглас - біоактивне скло; Остеоапатит - порошок; Кергап - блок; 47705 4 Кергап - порошок. Виділяють і культивують первинну культуру кістково-мозкових стромальних клітин криси та кролика. Кістковий мозок виділяють з стегнових кісток крис та клубових кісток кролика. Кістково-мозкові стромальні клітини криси наносять на кістково-пластичний матеріал хімічної та біологічної природи для аналізу, на яких матеріалах проходить краще їх приживлення та розмноження, тобто які матеріали можуть бути використані як носії. Як носій застосовують біоколаген, або колапан, або біо-ген, або остеоапатит, або кергап. Експериментальні дослідження по порівняльному аналізу процесу заживання кісткових дефектів тіла нижньої щелепи проводять на 10 кроликах породи Шиншилла вагою 3 - 4кг. Під внутрішньовенним трипталовим наркозом скелетують тіло нижньої щелепи, порожнистою фрезою створюють дефект кортикальної пластинки на всю її товщу 3 4мм круглої форми діаметром 10мм. Дефект заповнюють остеотропним матеріалом, який містить стовбурові клітини на носієві і щоб не вростала слизова оболонка дефект закривають двошаровою мембраною, що розсмоктується. Операційну рану ушивають. Стадію регенерації визначають на 30 та 60 добу. Тварин виводили з експерименту на 30, 60 добу. Схема експериментальних досліджень для аналізу процесів заживання кісткових дефектів представлена в таблиці 1. Таблиця 1 №№пп 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Чим заповнений дефект Дефект - кров'яний густок + мембрана Дефект - кров'яний згусток + мембрана Дефект - колапан Л+150тис. стовбур, клітин + мембрана Дефект - колапан Л+150тис. стовбур, клітин + мембрана Дефект - Біо-Ген+150тис. стовбур, клітин + мембрана Дефект - Біо-Ген+150тис. стовбур, клітин + мембрана Дефект - колапан Л+ мембрана Дефект - колапан Л+ мембрана Дефект - стовбурові клітини в суміші з плазмою людини з кальцієм Дефект - стовбурові клітини в суміші з плазмою людини з кальцієм Експеримент на тваринах проводять відповідно до Міжнародних вимог про гуманне поводження з тваринами. Нижні щелепи вичленують, фіксують в формаліні, декальцинують і проводять через целоїдин. Гістологічні зрізи товщиною 7-10мкм фарбують гематоксиліном, еозином і пікрофуксином по Ван Гізону. Дослідження зрізів і фотографування проводять під мікроскопом "Carl Zeiss" з допомогою цифрової фотокамери "Canon". В результаті дослідження виявлена цитотоксичність одного з матеріалів - Періо-Гласу. Після нанесення на нього культури стовбурових клітин, останні швидко дегенерували та зпливали, а рН середовища зростав і ставав лужним. В присутності інших субстратів, які досліджувалися, клітини нормально ділилися і по морфо Стоки 30 діб 60 діб 30 діб 60 діб 30 діб 60 діб 30 діб 60 діб 30 діб 60 діб логії і кількості не відрізнялися від контрольних клітин. Таким чином, з 6 субстратів, які досліджувалися, - 5, а саме : Біо-Ген, Біоколаген, остеоапатит, кергап-порошок, кергап-блок не виявляють цитотоксичної дії на кістково-мозкові стромальні клітини і можуть бути використані як носії в клітинній терапії. В результаті дослідження остеоінтегративних процесів одержані наступнірезультати.При заповненні дефекту кров'яним згустком + мембраною. Мікроскопічно на 30 добу виявили в тілі щелепи дефект круглої форми, заповнений фіброретикулярною тканиною, остеоїдом та губчатою кістковою тканиною. Серед тканин регенерату переважала фіброретикулярна тканина з високою 5 47705 щільністю клітин фібро пластичного і остеобластичного диферонів. На 60 добу область дефекту була заповнена губчатою кістковою тканиною крупноплетистою по організації з тонкими рідко розташованими кістковими трабекулами. В міжтрабекулярних просторах розташована пухка з'єднувальна тканина, яка по клітинному складу була представлена фібропластами і лімфоцитами. Щільність клітин низька. Клітини остеобластичного диферону були локалізовані лише на невеликих територіях по периметру кісткових трабекул. В пухкій з'єднувальній тканині виявлено велику кількість тонкостінних кровоносних судин з розширеними просвітами. Таким чином, особливості організації кісткової тканини в області дефекту показують низькі міцності якості структури регенерату. При заповненні дефекту колапаном Л + мембраною. На 30 добу область дефекту в щелепі кролика була заповнена в основному губчатою кістковою тканиною з невеликими ділянками пухкої з'єднувальної тканини з високою щільністю остеобластів. На 60 добу в області дефекту виявлена в основному компактна і губчата кісткова тканина. Виявлені невеликі стрічковидні острівки фібро ретикулярної тканини з обширними вогнищами остеоїду. Таким чином, при заповненні області дефекту колапаном Л і мембраною в травмованій області на 30 добу формується губчата кісткова тканина мілкоплетиста по організації, а на 60 добу область пошкодження заповнена в основному компактною і губчатою тканиною. Колапан Л в регенераті знаходиться в вигляді одиничних невеликих фрагментів, замурованих в кісткову Комп’ютерна верстка Л. Купенко 6 тканину. Подібна структура регенерату свідчить про його високі міцності характеристики. При заповненні дефекту колапаном Л + стромальними клітинами + мембраною. При заповненні дефекту колапаном в поєднанні зі стовбуровими клітинами і мембраною на 30 добу область дефекту була заповнена в основному губчатою кістковою тканиною мілкоплетистою по організації. Кісткові трабекули характеризуються високою щільністю остеоцитів на поверхні. По периферії кісткових трабекул в вигляді частоколу розташовуються остеобласти. Міжтрабекулярні простори заповнені фіброретикулярною тканиною з перевагою клітин остеобластичного диферону. На 60 добу в області дефекту виявили в основному компактну і губчату кістки. В області розташування компактної кістки розміщені мілкі фрагменти залишків колапану, замуровані в кісткову тканину без формування з'єднувальнотканної капсули. Виявили невеликі ділянки грубоволокнистої кісткової тканини, що розташовані між генераціями компактної кістки. Таким чином, відрізняльною особливістю від попереднього досліду на 30 добу є формування щільної сітки кісткових трабекул з високою щільністю остеоцитів на їх поверхні і виражена остеоблпстичне диференціювання клітин. На 60 добу в тканинах регенерату переважає компактна кістка. Таким чином, стовбурові клітини, що введені в область дефекту, кісткової тканини на носієві, забезпечують якісну повноцінну регенерацію кісткової тканини і запропонований спосіб може бути рекомендований до клінічного застосування. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601