Спосіб культивування калусної тканини діоскореї кавказької (dioscorea caucasica l.)

Спосіб отримання калусної тканини діоскореї кавказької (Dioscorea caucasica L.), що включає 3 Згідно одержаної моделі як експланти використовують надземні частини рослин: сегменти молодих і зрілих листових пластинок, вузли пагонів рослин діоскореї кавказької. Стерилізацію проводять відомим способом, а одержані асептичні експланти культивують в умовах освітленості на модифікованих живильних середовищах Мурасіге і Скуга, що містить регулятори росту в наступних варіантах: 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота (2,4Д) - 1,0-2,0мг/л, кинетин (6-фурфуриламінопурин) 0,25-0,5мг/л, 6-бензиламінопурин (БАП) - 0,250,5мг/л, протягом 80-90 діб, що забезпечує індукцію калусоутворення і одержання біомаси калусної тканини для подальшого застосування. Діоскорея є однією з широко використовуваних в медицині лікарських рослин. У деяких країнах дана рослина є традиційним джерелом лікарських препаратів і широко використовується в офіційній і народній медицині. У основі високої біологічної активності діоскореї кавказькою лежить наявність в біомасі біологічно активних речовин терпенової природи (діогенін, диосцин і тігогенін). Екстракти («Діоспонін») використовується у фармакології та сучасній медицині, зокрема, при лікуванні атеросклерозу судин головного мозку. Приклад 1 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи і сахарозу за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige, Т., Skoog, F. //Phisiol. Plant. - 1962. – V.15 №13. P.473–497), агар - 8000мг/л, тіамін - 1,0мг/л, піридоксин - 0,5мг/л, нікотинова кислота - 0,5мг/л, аскорбінова кислота - 5,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксіоцтова кислота - 2,0мг/л, кінетин 0,5мг/л, 6-бензиламінопурин - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 2×20см) по 20мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при температурі 121°С в протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню живильного середовища, в стерильних умовах вводять експланти (вузли стебел діоскореї кавказької (Dioscorea caucasica L.), заздалегідь простерилізовані 50% розчином преперату «Брадофен» (3 хвилини), з подальшим промиванням стерильною дистильованою водою. Культивують експланти на світлі при температурі +25-28°С протягом 90 діб, після чого калус виймають з пробірок, відокремлюють від експланту і висаджують на живильне середовище того ж складу. Частота калусоутвореня при цьому складає 76,6%. Приклад 2 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи і сахарозу за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige, Т., Skoog, F. //Phisiol. Plant. - 1962. – V.15 №13. P.473–497), агар - 8000мг/л, тіамін - 1,0мг/л, піридоксин - 0,5мг/л, нікотинова кислота - 0,5мг/л, аскорбінова кислота - 5,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксіоцтова кислота - 2,0мг/л, 6бензиламінопурин - 0,5мг/л, кінетин - 0,25мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 2×20см.), по 20мл живильного середовища, закривають ватяно-марлевими пробками, стерилізують в автоклаві при температурі 121°С протягом 30 50062 4 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,55,8. На поверхню живильного середовища, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти зрілих листових пластинок діоскореї кавказької (Dioscorea caucasica L.), заздалегідь простерилізовані 50% розчином преперату «Брадофен» (3 хвилини), з подальшим промиванням стерильною дистильованою водою. Культивують експланти на світлі при температурі +25-28°С протягом 80 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту і висаджують на живильне середовище того ж складу. Частота калусоутворення при цьому складає 51,3% Приклад 3 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи і сахарозу за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige, Т., Skoog, F. //Phisiol. Plant. - 1962. – V.15 №13. P.473–497), агар - 8000мг/л, тіамін - 1,0мг/л, піридоксин - 0,5мг/л, нікотинова кислота - 0,5мг/л, аскорбінова кислота - 5,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксіоцтова кислота - 1,0мг/л, 6бензиламінопурин - 0,25мг/л, кінетин - 0,25мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 2×20см.), по 20мл живильного середовища, закривають ватяно-марлевими пробками, стерилізують в автоклаві при температурі 121°С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,55,8. На поверхню живильного середовища, в стерильних умовах вводять експланти (вузли стебел діоскореї кавказької (Dioscorea caucasica L.), заздалегідь простерилізовані 50% розчином преперату «Брадофен» (3 хвилини), з подальшим промиванням стерильною дистильованою водою. Культивують експланти на світлі при температурі +25-28°С протягом 100 діб, після чого калус виймають з пробірок, відокремлюють від експланту і висаджують на живильне середовище того ж складу. Частота каллусоутворення при цьому складає 58,4%. Приклад 4 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить мінеральні солі, мікроелементи і сахарозу за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige, Т., Skoog, F. //Phisiol. Plant. - 1962. – V.15 №13. P.473–497), агар - 8000мг/л, тіамін - 1,0мг/л, піридоксин - 0,5мг/л, нікотинова кислота - 0,5мг/л, аскорбінова кислота - 5,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксіоцтова кислота - 1,0мг/л, 6бензиламінопурин - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 20×20см.), по 20мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при температурі 121°С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню живильного середовища, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти молодих листових пластинок діоскореї кавказької (Dioscorea caucasica L.), заздалегідь простерилізовані 50% розчином преперату «Брадофен» (3 хвилини), з подальшим промиванням стерильною дистильованою водою. Культивують експлантина світлі при температурі +25-28°С протягом 90 діб, після чого каллус виймають з пробірок, відокремлюють від експланту і висаджують на живильне середовище 5 50062 того ж складу. Частота каллусоутвореня при цьому складає 47,4%. Використання замість інтактних рослин їх клітинних культур одержаних біотехнологічними методами, має ряд переваг: зменшення антропогенного впливу на дику природу, зниження собіварто 6 собівартості виробництва фітомаси, можливість отримання фітомаси, що не містить полютантів (гербіцидів, пестицидів, важких металів і ін.), можливість управління процесом біосинтезу цільових продуктів і т.д. Таблиця Частота калусоутвореня в культурі ізольованих тканин діоскореї кавказької залежно від умов культивування і складу живильного середовища № п/п 1 2 3 4 Тип і кількість регуляторів росУмови і тривалість культу середовищі, мг/л Тип експланту Частота калусоутворення, % тивування, діб 2,4-Д БАП Кінетин На світлі при t +25-28°C, 2,0 0,5 0,5 Вузли стебел 76,6 90 діб Сегменти зріНа світлі при t +25-28°C, 2,0 0,5 0,25 лих листових 51,3 80 діб пластинок На світлі при t+25-28°C, 1,0 0,25 0,25 Вузли стебел 58,4 100 діб Сегменти моНа світлі при t +25-28°C, 1,0 0,5 лодих листо47,4 90 діб вих пластинок Комп’ютерна верстка О. Рябко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601