Спосіб культивування калусної тканини олеандра звичайного (nerium oleander l.)

Спосіб культивування калусної тканини олеандра звичайного (Nerium oleander L.), що включає виділення експланту, стерилізацію і культивування 3 38468 відомими способами, а культивування проводять на модифікованому живильному середовищі Мурасиге і Скуга, що містить фітогормони в наступних варіантах: 2,4-ди хлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 1,5-2,0мг/л, 6-бензиламінопурин (6-БАП) 0,2-0,5мг/л; кинетин - 0,2-0,5мг/л, індоліл-3оцетової кислоти (ИУК) - 0,2-0,5мг/л. Цикл вирощування складає близько 90-120 доби. Олеандр звичайний є перспективним лікарських рослиною для використання його в медичній практиці. У основі високої біологічної активності олеандра лежить наявність в листі серцевих глікозидів, серед яких зустрічаються аналогічні по структурі багатьом рослинам, що широко використовуються в сучасній медицині і фармакології. Клінічні випробування вітчизняного препарату нериолина (спиртної настоянки глікозидів листя олеандринів) на хворих з серцево-судинною недостатністю II-III ступеня на основі пороку серця у вигляді пігулок по 0,1мг 2-3 рази на день на протязі від 5 днів до 2 місяців надавали наступні фармакологічні ефекти: зменшення тахіаритмії і дефіциту пульсу, задишки і набряків, припинення набряків на тлі поліпшення діурезу. Поліпшувався кровообіг серцевого м'яза (на ЕКГ зникали негативні зубці Т в II-III відведенні), зменшувалася тривалість систоли, збільшувалася швидкість кровообігу. Артеріальний тиск не змінювався або приходив до норми, якщо було підвищено, унаслідок декомпенсації. Глікозиди олеандра рекомендують при пороках мітрального клапана з миготливою аритмією, і у випадках застійних явищ в малому крузі кровообігу. Значущість серцевих глікозидів олеандра звичайного, у зв'язку із спектром їх фармакологічної дії, викликає інтерес до вивчення накопичення їх в клітинних культура х рослин. Приклад 1 Готують живильне середовище Мурасиге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи і сахарозу за прописом Мурасиге і Скуга [Murashige Т., Skoog F.// Phisiol.Plant. - 1962. - Bd.15. - №13 P. 473-497], агар - 8000, тіамін - 0,5, піридоксин 0,5, нікотинова кислота - 5,0, аскорбінова кислота 10,0мг/л. Фітогормони: 2,4-дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 1,5мг/л, кинетин - 0,2мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 15х150мм), по 10мл живильного середовища, закривають ватяно-марлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листової пластинки Nerium oleander L.), заздалегідь простерилізовані в 100% розчині препарату брадофен протягом 5 хвилин, а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді в течії 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С в течії 90 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Частота калусоутворення складає 45%. Приклад 2 Готують живильне середовище Мурасиге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи і 4 сахарозу за прописом Мурасиге і Скуга [Murashige Т., Skoog F.// Phisiol.Plant. - 1962. - Bd.15. - №13 P. 473-497], агар - 8000, тіамін - 0,5, піридоксин 0,5, нікотинова кислота - 5,0, аскорбінова кислота 10,0мг/л. Фітогормони: 2,4-дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 2,0мг/л, кинетин - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 15х150мм), по 10мл живильного середовища, закривають ватяно-марлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (стеблові сегменти Nerium oleander L.), заздалегідь простерилізовані в 100% розчині препарату брадофен протягом 5 хвилин, а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С протягом 100 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Частота калусоутворення складає 40%. Приклад 3 Готують живильне середовище Мурасиге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу за прописом Мурасиге і Скуга [Murashige Т., Skoog F.// Phisiol.Plant. - 1962. Bd.15. - №13 - P. 473-497], агар - 8000, тіамін - 0,5, піридоксин - 0,5, нікотинова кислота - 5,0, аскорбінова кислота - 10,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 1,5мг/л, 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 0,2мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 15х150мм), по 10мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С в течії 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8.На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листової пластинки Nerium oleander L.), заздалегідь простерилізовані в 100% розчині препарату брадофен протягоч 5 хвилин, а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С в течії 110 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Частота калусоутворення складає 50%. Приклад 4 Готують живильне середовище Мурасиге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу за прописом Мурасиге і Скуга [Murashige Т., Skoog F.// Phisiol.Plant. - 1962. - Вd. 15. - №13 - P. 473-497], агар - 8000, тіамін - 0,5, піридоксин - 0,5, нікотинова кислота - 5,0, аскорбінова кислота - 10,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 2,0мг/л, 6-бензиламінопурин (6-БАП) - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 15х150мм), по 10мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (стеблові сегменти Nerium oleander L.), 5 38468 заздалегідь простерилізовані в 100% розчині препарату брадофен протягом 5 хвилин, а потім витримані в заздалегідь проавтоклавированной дистилюючій воді в течії 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С протягом 120 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Частота калусоутворення складає 55%. Приклад 5 Готують живильне середовище Мурасиге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу за прописом Мурасиге і Скуга [Murashige Т., Skoog F.// Phisiol.Plant. - 1962. Bd.15. - №13 - P. 473-497], агар - 8000, тіамін - 0,5, піридоксин - 0,5, нікотинова кислота - 5,0, аскорбінова кислота - 10,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 2,0мг/л, 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 0,5мг/л, ідоліл-3оцетової кислоти (ИУК) - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 15х150мм), по 10мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листової пластинки Nerium oleander L.), заздалегідь простерилізовані в 100% розчині препарату брадофен протягом 5 хвилин, а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С протягом 100 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Частота калусоутворення складає 60%. Приклад 6 Готують живильне середовище Мурасиге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу по пропису Мурасиге і Скуга [Murashige Т., Skoog F.// Phisiol.Plant. - 1962. - Bd.15. - №13 P. 473-497], агар - 8000, тіамін - 0,5, піридоксин 0,5, нікотинова кислота - 5,0, аскорбінова кислота 10,0мг/л. Фітогормони: 2,4-дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 2,0мг/л, кинетин - 0,5мг/л, індоліл3-оцетової кислоти (ИУК) - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 15х150мм), по 10мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (стеблові сегменти Nerium oleander L.), заздалегідь простерилізовані в 100% розчині препарату брадофен протягом 5 хвилин, а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С протягом 110 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Частота каллусоутворення складає 65%. 6 Приклад 7 Готують живильне середовище Мурасиге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу за прописом Мурасиге і Скуга [Murashige Т., Skoog F.// Phisiol.Plant. - 1962. Bd.15. - №13 - P. 473-497], агар - 8000, тіамін - 0,5, піридоксин - 0,5, нікотинова кислота - 5,0, аскорбінова кислота - 10,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 2,0мг/л, кинетин - 0,5мг/л, індоліл-3-оцетової кислоти (ИУК) - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 15x150мм), по 10мл живильного середовища, закривають ватяно-марлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,55,8. На поверхню середовища, що остигн уло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листової пластинки Nerium oleander L.), заздалегідь простерилізовані в 100% розчині препарату брадофен протягом 5 хвилин, а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С на протязі 115 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Частота калусо утворення складає 70%. Приклад 8 Готують живильне середовище Мурасиге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу за прописом Мурасиге і Скуга [Murashige Т., Skoog F.// Phisiol.Plant- 1962. - Bd.15. - №13 - P. 473-497], агар - 8000, тіамін - 0,5, піридоксин - 0,5, нікотинова кислота - 5,0, аскорбінова кислота 10,0мг/л. Фітогормони: 2,4дихлорфеноксиоцетова кислота (2,4-Д) - 2,0мг/л, 6-бензиламінопурин (6-БАП) - 0,5мг/л, індоліл-3оцетової кислоти (ИОК) - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 15x150мм), по 10мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С в течії 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (стеблові сегменти Nerium oleander L.), заздалегідь простерилізовані в 100% розчині препарату брадофен протягом 5 хвилин, а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С протягом 110 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Частота калусоутворення складає 68%. Використання замість інтактних рослин їх клітинних культур, одержаних біотехнологічними методами, має ряд переваг: зменшення антропогенного впливу на дику природу, можливість отримання фітомаси, що не містить полютантов (гербіцидів, пестицидів, важких металів і ін.), можливість управління процесом біосинтезу і накопичення цільових продуктів і т.д. 7 Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський 38468 8 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601