Спосіб одержання імобілізованих протеолітичних ферментів

U J ДЛЯ СЛУЖЕБНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ ЭКЗ № СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК «9» SIL 1 С 12 N 1 1 / 1 4 , 11/00 ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫИЯМ ПРИ ГННТ СССР t , ,(21) 4474979/31-13 (22) 28.08.88 (71) Физико-химический институт им.А.Б.Богатского и Институт проблем материаловедения АН УССР (72) Е.В.Севастьянова, Т.И-Давиденко, В.П.Сергеев и П.П.Кондратюк (53) 577.15(088.0) (56) Сергеев В.П. и др. Активированный углеродный волокнистый материал медицинского назначения АУБМ "Днепр" МН. Тезисы IV республиканской конференции "Сорбенты медицинского назначения и механизмы их лечебного действия". Донецк, 1988, с.31. Давиденко Т.И. и др. Имі^ бїшизация протеолитических фермег гов и их ингибиторов на угольных ма ериалах. Тезисы докладов III Конфе] енции УССР. Днепропетровск, 1985, с.247. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Изобретение относится к биотехнологии, касается иммобилизации протеолитических ферментов на угольных материалах и может быть использовано в медицине. Целью изобретения является увеличение протеолитическей активности и связывания белка при иммобилизации, а также повышение стабильности целевого продукта. Способ заключается в ковалектном связывании протеолитическрїх ферментов на активированном углеродном волокнистом материале (АУВМ) марки "Днепр" МН, причем связывание проводят в присут36-90 \ * r (57) Изобретение относится к биотехнологии, касается иммобилизации протеолитических ферментов на угольных материалдх. Цель изобретения - увеличение протеолитической активности и связывания белка при иммобилизации, а также повышение стабильности целевого продукта. Способ предусматривает использование в'качестве носителя угольней ткани АУБМ "Днепр" МН, проведение иммобилизации в присутствии полиэтиленоксида, сшитого бурой при массовом соотношении фермент -бура -полиэтиленоксид, равном 1:0,1-0,4:0,31,]. Использование способа позволяет получать иммобилизованные протеолитические ферменты на угольной ткани со 100%-ным связыванием белка, 4080%~ным сохранением протеолитической активности, с 70%-ным сохранением исходной активности после v-стерилизации, стабильные при хранении. 2 табл. t ствии полнэтиленоксида после модификации носителя бурой. Соотношение фермент -бура -полиэтиленоксид устанавливают равным 1:0,1-0,4:0,3-1,1. Особенность способа заключается в модификации полиэтилейоксидом поверхности угольной ткани с последующей мягкой сшивкой бурой фермента,чтоослабляет ингибирующее действие угольного материала на протеолитические ферменты и способствует большей их стабильности при хранении и v-стерилизации. Данный способ позволяет получить иммобилизованные протеолитические фер эа 3 1596769 менты (металлопротеазу, щелочную протеазу, асперазу, террилнтин, химотрипсин) с протеолитической активностью до 200 ПЕ/г носителя, 100%-ным связыванием белка, 40-80%-ным сохранеІІИЄМ исходной протеолитической активности, после т-стерштзации (доза 2,5 Мрад) остается -«-70% протеолитической активности» после хранения в 10 течение 4,месяцев - 60%. П р и м е р 1. Для иммобилизации используют ткань АУВМ "Днепр" МН. Особенностями этого материала являются высокие емкостные и кинетические 15 характеристики (на порядок и более превышающие аналогичные характеристики гранулированных сорбентов); высокая бйосовместимость и нетоксичность; возможность получения на основе АУВМ 20 универсальной матрицы для иммобилизации ферментов; прочность, эластичность, виброу^ойчивосгь, что делает применение этих материалов удобным и надежным. 25 Основные т-ехнические характеристики АУБМ "Днепр" МН следующие: Суммарный объем пор по бензолу,см3/г 0,8-1,2 Прочность при объе1 П ме пор 1,2 см7Г,Н Не менее 25. Для иммобилизации 10x10 см угольной ткани пропитывают раствором 200 мг буры в 6 мл дистиллированной воды, высушивают при температуре 20°С. Пос35 ле этого угольную ткань пропитывают раствором 2000 мг щелочной протеазы (280 мг белка) и 600 мг полиэтиленоксида в 6 мл 0,03 М фосфатного буфера, рН 7,4. Массовое соотношение протеолитический фермент -бура -полиэтилекоксид 1:0,1:0,3 (табл.Іf № 1). Полученную таким образом угольную ткань с иммобилизованной щелочной протеазой высушивают при температуре 20°С, Протеолнтическая активность сос- 45 тавляет 170 ПЕ/г. После -у-сіррилизации дозой 2,5 Мрад остается л/70% исходной активности. При хранении в течение 4 месяцев сохраняется 60% исходной протеолктической активности. 50 П р и м е р ы 2-4. Последовательность выполнения операции та же, что и в примере 1, Данные представлены в табл.1 (примеры 2-4). Примеры поясняют осуществление способа при 55 массовых соотношениях щелочная протеаза - бура -полиэтиленоксид 1:0,4: !1,3; 1:0,1:1,1; 1:0,4:0,3. П р и м е р ы 5-8. Последовательность выполнения операций та же, что и в примере 1. Данные представлены в табл.1 (примеры 5-8). Примеры поясняют нецелесообразность осуществления способа при массовых соотношениях протеолитический фермент - б у р а - п о л и " этиленоксид 1 : 0 , 0 5 : 0 , 2 5 ; 1 : 0 , 4 5 : 1 , 1 5 ; 1:0,05:1,15; 1:0,45:0,25. П р и м е р 9. Выполняется аналогично примеру 1 ( т а б л . 1 , пример 9 ) , массовое соотношение прогеолитический фермент - б у р а - полиэтиленоксид 1 : 0 , 1 : 0 , 3 . Отличие в том, что используют металлопротеазу. Протеолитическая активность иммобилизованного препарата 60 ПЕ/г. После ^-стерилизации дозой 2,5 Мрад остается ^/70% исходной активности. При хранении в т е ч е ние 2 месяцев сохраняется 95% исход- . ной протеолитической активности. П р и м е р ы 10-12. Выполняются аналогично примеру 9 ( т а б л . 1 , примеры 10-12). Данные примеры поясняют осуществление способа иммобилизации металлопротеаз,ы при соотношениях 1:0,4:1,1; 1:0,1:1,1; 1:0,4:0,3. П р и м е р ы 13-16. Выполняются аналогично примеру 9 ( т а б л . 1 , примеры 13-16)* Примеры показывают нецелесообразность осуществления способа при массовых соотношениях металлопрот е а з а - бура-полиэтиленоксид 1:0,05: -.0,25; 1 : 0 , 4 5 : 1 , 1 5 ; 1:0,05:1 , 1 5 ; 1:0,45:0,25. П р и м е р 17. Выполняется аналогично примеру I ( т а б л , 1 , пример І 7 ) , массовое соотношение протести гический Фермент - б у р а - полиэтилеш.ксид 1 : 0 , 1 : 0 , 3 . Отличие в том, что используют асперазу. Протеолитическая активность иммобилизованного препарата 33 ПЕ/г. После -«-стерилизации дозой 2,5 Мрад остается ^100% исходной активности, При хранении в течение 4 месяцев сохраняется Гі0% исходной протеолитической активности. П р и м е р ы 18-20. Выполняются аналогично примеру 17 ( т а б л . 1 , примеры 18-20). Данные примеры поясняют осуществление способа иммобилизации асперазы при соотношениях 1 : 0 , 4 : 1 , 1 ; 1:0,1:1,1; 1:0,4:0,3. П р и м е р ы 21-24. Выполняю"ся аналогично примеру 17 ( т а б л . 1 , примеры 2 1 - 2 4 ) , Примеры показывают нецелесообразность осуществления способа при массовых соотношениях аспераза 1596769 Харьковского НИИ Х И М Ш Ї и технологии бура -полиэтиленоксид 1:0,05:0,25; лекарственных средств, тєррилнтин 1:0,45:1,15; 1:0,05:1,15; 1:0,45:0,25. производства "Мосмедпрепарат" П р н м е р 25. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1 , им.Л.Я.Карпова, химотрипсин Олайкского завода химических реактивов, поли(табл.1, пример 25),массовое соотноэтиленоксид 1500 производства Харьковшение протеолитическин фермент -бура ского химико-фармацевтического объеполиэтиленоксид 1;0,\:0,3. Отличие динения "Здоровье", завод "Красная в том, что используют террилиткн, Протеолитическая активность иммобили- Ю эованного препарата - 58 ПЕ/г. После Эффективность иммобилизации зависит также от рН, который должен со•^-стерилизации дозой 2,5 Мрад остаетответствовать рН-стабильности иммося 60% исходной активности. При храбилизуемых ферментов. нении в течение 4 месяцев сохраняется 90% исходной протеолитической ак- 15 В табл.2 представлены результаты, тивности. . полученные при лечении гнойных кожкомышечных ран у крыс. Как следует из П р и м е р ы 26~28, Выполняются этих данных, использование иммобилианалогично примеру 25 (табл.I, призованного по описанному выше способу меры 26-28) . Данные примеры поясняют осуществление способа иммобилиза- 20 террилитина позволяет сократить .роки заживления ран до 16,0 дней (очиции террилитина при массовых соотнощения ран 4,0 по сравнению с 22,5 шениях 1:0,4:1,1;1:0,1:1,1; 1:0,4:0,3, и 8,2 днями соответственно £дя нативП р и м е р ы 29-32, Выполняются ного фермента и с 18,2 6„8 днями соаналогично примеру 25 (табл.1, приме25 ответственно для самой угольной ткары 29-32). Примеры показывают нецени. Для контрольных животных(без лелесообразность осуществления способа чения) средние сроки (дни) заживления при массовых соотношениях террилитии ран составляли 29,4, а очищение ран бура -полиэтиленоксид 3:0,05:0,25; 11,6, т.е. при использовании иммоби1:0,45:1,15; 1:0,05:1,15; 1:0,45:0,25. П р и м е р 33. Порядок выполнения 30 лизованного наугольной ткакктеррилитина наблюдается уменьшение сроопераций аналогичен примеру 1 (табл.1, ков заживления и очищения гнойных пример 3 3 ) t массовое соотношение прокожио-мышечных ран. теолитический фермент - бура - полиТаким образом, предлагаемый способ этиленоксид 1:0,1:0.3. Отличие в том, позволяет получить иммобилизованные что используют химотрипсин, Протеоли35 протеолитическне ферменты с протеолитическая активность иммобилизованного тической активностью до 200 ПЕ/г нопрепарата 223 ПЕ/г. После -v-стерилисителя, со 10&%-ным связыванием белзации дозой 2,5 Мрад остается~ 70% ка, 40-80%~ным сохранением протеоли-исходной активности. При хранении в течение 4 месяцев сохраняется 75% 40 тической активности, с сохранением после v-стерилизации ^70% исходисходной протеолитической активности. ной активности, после эфенекия v П р и м е р ы 34-36. Выполняются течение 4 месяцев 60% протеолитичесаналогично примеру 33 (табл.1 , примекой активности. Тогда как в проры 34-36). Данные примеры поясняют тотипе степень связывания белка осуществление способа иммобилизации 45 "составляет 40%, процент сохранения химотрипсина при массовых соотношени~ протеолитической активности 10-20%, лх 1:0,4:1,1; 1:0,1:1,1; 1:0,4:0,3. при V--стерилизации и хранении пракП р и м е р ы 37-40. Выполняются тически полностью теряется протеолианалогично примеру 33 (табл.1, примеры 37-40) Примеры поясняют нецеле- 50 тическая активность. сообразность осуществления способа Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я при массовых соотношениях химотрнпскн:бура:полиэтиленоксид I:0,05:0,25; 1:0,45:1,15; 1:0,05:1,15; 1:0,45:0.25. Способ получения иммобилизованных Для иммобилизации используют следую-^ протеолитических ферментов, включающий ковалентное связывание фермента щие протеолитические ферменты: металс предварительно модифицированным сшилопротеазу и щелочную протеазу произвающим реагентом угольным носителем, водства Ладыжинского завода ферменто т л и ч а ю щ и й с я тем, что препаратов; асперазу производства 8 1596769 * с целью увеличения протеолитическои активности и связывания белка при иммобилизации, а также повышения стабильности целевого продукта, в качестве угольного носителя используют активированный углеродный волокнистый материал "Днепр" НН, в качестве сшивающего реагента используют буру, а связывание проводят в присутствии полиэтиленоксида,устанавливая соотношение фермент- бура- полиэтиленоксид равным 1:0,1-0,4:0,3-1,1. Т а б л и ц а Влияние массового соотношения протеолитический фермент - бура - полиэтиленоксид на сохранение протеолитическои активности (рН 7,4) При мер 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Массовое соотношение про- Сохранение протеолитическои теолитический фермент бура -полиэтиленоксид активности,% максимальной активности 3 2 Щелочная протеаза 1:0,1:0,3 1:0,4:1,1 1:0,1:1,1 1:0,4:0,3 1:0,05:0,25 1:0,45:1,15 1:0,05:1,15 1:0,45:0,25 Металлопротеаза 1:0,1:0.3 1:0,4:1,1 1:0,1:1,1 1:0,4:0,3 1:0,05:0,25 1:0,45:1,15 1:0,05:1,15 1:0,45:0,25 Аспераза 1:0,1:0,3 1:0,4:1,1 1:0,1:1,1 1:0,4:0,3 1:0,05:0,25 1:0,45:1,15 1:0,05:1,15 1:0,45:0,25 Террилитин 1:0,1:0,3 1:0,4:1,1 1:0,1:1,1 1:0,4:0^,3 1:0,05:0,25 1:0,45:1,15 1:0,05:1,15 1:0,45:0,25 Химотрипсин 1:0,1:0,3 1:0,4:1,1 100 100 90 100 72 81 . 60 70 100 100 95 95 73 61 80 72 •* 95 100 90 100 61 70 72 63 100 100 . 100 100 67 63 72 70 90 95 1596769 10 .Продолжение таблицы 1 2 1 35 36 37 38 39 40 1:0,1:1,1 1:0,4:0,3 1:0,05:0,25 1:0,45:1,15 1:0,05:1,15 1:0,45:0,25 100 95 64 72 67 60 Т а б л и ц а Результаты лечения гнойных кожио-мышечных ран у крыс* с применением иммобилизованного на угольной ткани террилитина Метод лечения pa Средние сроки, дни очищение проявление грануляций начало эпителизации заживление 11,6+1,4 6,8+0,3 8,2+1,0 18,5+2,0 8,8+0,4 10,0+1,0 20,1+1,9 10,1+0,8 11,2+0,8 29,4+2,1 18,2+0,9 22,5+1,8 4,0+0,6 5,5+0,5 6,5+0,8 16,0+0,8 ран Контроль (без лечения) Угольная ткань Нативный фермент Иммобилизованный на угольной ткани террилитин ран Под мягким наркозом в межлопаточной области наносится стандартная кожно-мышечная рана площадью 400 мм2(диаметром 22,6 м м ) , в рану вносится 2,0x10 микро-бных тел стандартной культуры патогенного стафилококка шт. 209. После внесения микробной культуры на рану накладывается стерильная вазелиновая повязка. Через 48 ч после нанесения и инфицирования раны развивалась классическая картина гнойного воспаления. В эти же сроки начинали лечение животных. Редактор Л.Павлова Составитель В.Муронец Техред М.Дидык Корректор В.Гирняк Заказ 3201/ДСП Тираж 311 • Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35; Раушская наб., д. ц/5 Производственно-издательский комбинат '*Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101