Спосіб отримання препарату тимоіндуктину

Спосіб отримання препарату тимоіндуктину, що включає гомогенізацію тканини тимусу, центрифугування, осадження ацетоном, який відрізняється тим, що осадження ацетоном здійснюють у дві стадії, при цьому перше осадження здійснюють додаванням ацетону до 50-55 % його об'ємного вмісту в розчині, а друге осадження після центрифугування здійснюють додаванням ацетону до надосадової рідини до 80-85 % об'ємного вмісту і після центрифугування осад розчиняють фізіологічним розчином, діалізують проти цього ж розчину і виділяють препарат Винахід відноситься до технології отримання лікарських препаратів з матеріалів ссавців, зокрема з вилочкової залози, і може бути використаний в медицині та ветеринарії Відомий спосіб отримання препарату з тимусу [Авторское свидетельство СССР № 662103, кл А61К 37/00 опубл 15 05 79] шляхом, гомогенізації тканини тимусу, діалізу гомогенату, осадження баластних речовин солями двовалентної ртуті, обробки надосадової рідини аміаком та газоподібним сірководнем, очищення та люфілізацм, при цьому звільнення від ртуті відбувається за допомогою сірководню Недоліком даного способу отримання препарату є використання в процесі отримання токсичних речовин Відомий спосіб отримання імуностимулятору [Авторское свидетельство СССР № 1112606, кл А61К 37/02, 37/24, опубл 1984 г ] , що складається з гомогенізації тканини тимусу, екстракції протягом 60 годин 3% оцтовою кислотою в присутності хлористого цинку, обробки надосадової рідини п'ятьма об'ємами ацетону і витримку 20 годин Недоліками виділеного імуностимулятору є невисока активність, наявність баластних речовин і потреба в значних витратах часу на його отримання Найбільш близьким до запропонованого способу за суттю є спосіб отримання препарату Тактившу з тканини тимусу [Иммунобиология гормонов тимуса под ред Ю А Гриневича, Б Э Чеботарева — Киев Здоров'я, 1989 — С 103 - 106] шляхом гомогенізації, аутолізу, багаторазового центрифугування, осадження ацетоном, люфіліза цм, розділення на колонці з сефадексом Недоліком даного способу отримання препарату є довготривалість (в середньому процес отримання готового продукту займає 72 - 120 годин) Виконання способу потребує складного апаратурного оформлення та значних енерговитрат В основу створення винаходу ставиться завдання отримання препарату тимоіндуктину шляхом осадження ацетоном в дві стадії та наступним розчиненням виділених поліпептидів фізіологічним розчином і діалізу їх проти цього ж розчину, що дозволить збільшити вихід високоактивного препарату тимоіндуктину, спростити технологію та значно скоротити час його отримання Покладене завдання досягається тим, що в способі отримання препарату тимоіндуктину шляхом гомогенізації тканини тимусу, центрифугування, осадження ацетоном здійснюють в дві стадії, при цьому перше осадження здійснюють додаванням ацетону до 50 - 55% його об'ємного вмісту в розчині, а друге осадження після центрифугування здійснюють додаванням ацетону до надосадової рідини до 80 - 85% об'ємного вмісту і після центрифугування осад розчиняють фізіологічним розчином, діалізують проти цього ж розчину і виділяють препарат В лабораторних умовах отримання препарату здійснювалось наступним чином Тканини тимусу подрібнювали, гомогенізували в 0,9% розчині NaCI при співвідношенні тканини до розчину 1 2,5 - 3,0, витримували 16 - 23 години при З - 8°С та центрифугували До надосадової рідини додавали охолоджений до -15 - -20°С ацетон до 50 - 55% об'ємного вмісту Витримували 20 - ЗО (О ю ю 55164 55мг/0,1кг тимусу Активність препарату склала 1,89мкг/мл Приклад З Гомогенізацію, витримку та центрифугування здійснювали аналогічно прикладу 1 До отриманої надосадової рідини (340мл) додавали 1,22 об'єму охолодженого до -20°С ацетону (390мл) до 55% об'ємного вмісту Витримували ЗО хвилин та центрифугували До знов отриманої надосадової рідини (720мл) додавали 1,25 об'єму охолодженого до -20°С ацетону (900мл) до 80% об'ємного вмісту, витримували ЗО хвилин та центрифугували Отриману надосадову рідину видаляли, осад змивали в 35мл фізіологічного розчину та діалізували проти цього ж розчину Отриманий об'єм після діалізу складав 47мл Концентрація білка - 1,09мг/мл Вихід препарату 51,2мг/0,1кг тимусу Активність препарату склала 3,01 мкг/мл Приклад 4 Гомогенізацію тканини тимусу здійснювали аналогічно опису в прикладі 1 Після центрифугування до отриманої надосадової рідини (315мл) додавали 0,67 об'єму охолодженого до -20°С ацетону (210мл) до 40% об'ємного вмісту Витримувала ЗО хвилин, та центрифугували (2500об/хв, 35хв, 4°С) До отриманої після цього надосадової рідини Отриманий об'єм після діалізу складав 53мл (525мл) додавали 0,2 об'єму охолодженого до Концентрація білка - 1,10мг/мл Вихід препарату 20°С ацетону (125мл) до 55% об'ємного вмісту, на 0,1кг тимусу склав 58,3мг витримували ЗО хвилин, центрифугували Після Активність препарату визначали за тестом видалення надосадової рідини, осад змивали [Bach J F , Dardanne M , Bach M A Transplant Ргас 45мл 0,9% розчину NaCI та діалізували проти цьо— 1973 — № 3 — Р 99-104] відновлення чутлиго ж розчину вості спонтанних розеткоутворюючих клітин селезінки тимектомованих мишей до анти-Thy-iОтриманий об'єм після діалізу складав 47мл сироватки Активність препарату склала Концентрація білка - 0,60мг/мл Вихід препарату 2,89мкг/мл, тобто та його мінімальна концентрація, 28,2мг/0,1кг тимусу при якій спостерігалась 50% редукція КІЛЬКОСТІ Активність препарату склала 15,1 мкг/мл розеткоутворюючих клітин Приклад 5 Приклад 2 Гомогенізацію, витримку та центрифугування Гомогенізацію тканини тимусу здійснювали здійснювали аналогічно прикладу 1 До отриманої аналогічно опису в прикладі 1 Після центрифугунадосадової рідини (ЗЗОмл) додавали 5,67 об'єму вання до отриманої надосадової рідини (ЗЮмл) охолодженого до -20°С ацетону (1870мл) до 85% додавали 1 об'єм, охолодженого до -20°С ацетону об'ємного вмісту Витримували ЗО хвилин та (ЗЮмл) до 50% об'ємного вмісту Витримували ЗО центрифугували До знов отриманої надосадової хвилин, та центрифугували (2500об/хв, 35хв, 4°С) рідини (2200мл) додавали 2 об'єму охолодженого До отриманої після цього надосадової рідини до -20°С ацетону (4400мл) де 95% об'ємного вміс(620мл) додавали 2,34 об'єму охолодженого до ту, витримували ЗО хвилин та центрифугували 20°С ацетону (1450мл) до 851 об'ємного вмісту, отриману надосадову рідину видаляли, осад завитримували ЗО хвилин, центрифугували Після мивали в 40мл фізіологічного розчину та діалізувидалення надосадової рідини, осад змивали вали проти цього ж розчину 40мл 0,9% розчину NaCI та діалізували проти цьоОтриманий об'єм після діалізу складав 41 мл го ж розчину Концентрація білка - 0,05мг/мл Вихід препарату 2,05мг/0,1кг тимусу Отриманий об'єм після діалізу складав 42мл Концентрація білка - 1,31мг/мл Вихід препарату Активністю препарат не володів хвилин та центрифугували До знов отриманої надосадової рідини додавали охолоджений ацетон до 80 - 85% об'ємного вмісту, витримували 25 ЗО хвилин та центрифугували Надосадову рідину видаляли, осад розчиняли фізіологічним розчином, діалізували проти цього ж розчину і виділяли препарат, який містить переважно суміш поліпептидів з молекулярною масою 10600, 13200 і 16600 дальтон Приклад 1 До 100г подрібненої тканини тимусу додавали 250мл 0,9% розчину NaCI та гомогенізували (14000об/хв, 1хв, 4°С) Отриману суміш витримували 16 годин при 4°С та центрифугували (3000об/хв, 1 год, 4°С) До отриманої надосадової рідини (ЗЗОмл) додавали 1,22 об'єму охолодженого до -20°С ацетону (ЗООмл} до 55% об'ємного вмісту ацетону Витримували ЗО хвилин та центрифугували (2500об/хв, 25хв, 3°С) До знов отриманої надосадової рідини (670мл) додавали 2,0 об'єму охолодженого до -20°С ацетону (1340мл) до 85% об'ємного вмісту, витримували ЗО хвилин та центрифугували (2500об/хв, 25хв, 4°С) Надосадову рідину видаляли, осад розчиняли 50мл 0,9% розчину NaCI та діалізували проти цього ж розчину Таблиця Порівняльна характеристика препарату тимоіндуктину та препарату Т-актившу Характеристика Час отримання Вихід Препарат тимоіндуктин Препарат Т-активін 22 - 24 години 72-120 годин 500 - 600мг/кг тимусу 100мг/кг тимусу АКТИВНІСТЬ 1,9 - 3,0мкг/мл 1 - 5 м кг/мл суміш поліпептидів з молекулярною масою суміш поліпептидів з молекулярною маСклад препарату 10600, 13200, 16600 дальтон сою від 1200 до 6000 дальтон 5 55164 Таким чином, запропонований спосіб отримання препарату тимоіндуктину дозволяє збільшити вихід високоактивного продукту в 5 - 6 разів, 6 скоротити час отримання препарату до 22 - 24 годин та значно спростити технологію його отримання Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24