Спосіб визначення придатності зразків гомогенату лейкоцитів для вимірювання активності арилсульфатази а

Спосіб визначення придатності зразків гомогенату лейкоцитів для вимірювання активності арилсульфатази А, який відрізняється тим, що додатково здійснюють визначення КІЛЬКОСТІ білка в гомогенаті лейкоцитів для відбору лише придатних для постановки реакції зразків сті арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів за стандартним методом Baum et al [1] Для цього з З - 5мл венозної гепаринізованої крові виділяють лейкоцити за стандартною методикою [2] До 0,2мл гомогенату лейкоцитів додають 0,2мл субстратної суміші такого складу ЮмМ пнітрокатехолсульфат у ацетатному буфері рН5,0, що містить 10% хлорида натрію та 0,5мМ пірофосфата натрію Зразки інкубують при 37°С на протязі 1 години Реакцію зупиняють додаванням 2,5н гідроксиду натрію КІЛЬКІСТЬ звільненого субстрату оцінюють визначенням оптичної ЩІЛЬНОСТІ зразків при 515нм Результати виражають у нмоль/год/мг білку КІЛЬКІСТЬ білку в гомогенаті лейкоцитів визначають за стандартним методом Крістіана та Варбурга [3] Отримані показники порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А, що визначається дослідним шляхом для кожної лабораторії окремо Недоліком цієї методики є відсутність належних нормативних показників оптимальної концентрації білку в пробі для отримання достовірних результатів виміру активності арилсульфатази А Задачею заявляемого винаходу є отримання однозначних результатів вимірювання активності арилсульфатази А біохімічним методом завдяки попередньому встановленню придатності зразків для аналізу На фіг, представлені результати дослідження активності арилсульфатази А в трьох серіях проб з концентрацією білку від 10 до бООмкг в ЮОмкл Кожна серія була отримана шляхом розведення первинного гомогенату лейкоцитів однієї здорової особи Видно, що постійною активність арилсульфатази А зберігається при умові викори ю (О ю 56511 стання в реакції зразків з КІЛЬКІСТЮ білку в межах 200 - 400мкг Поставлена задача досягається тим, що, додатково вводиться підготовчий етап дослідження, при якому обов'язковим є визначення КІЛЬКОСТІ білку в гомогенаті лейкоцитів для відбору лише придатних для постановки реакції зразків Спосіб здійснюється наступним чином Лейкоцити отримують з гепаринізованої крові за стандартною методикою згідно прототипу Перед постановкою реакції за методом Ваші et al визначають концентрацію білку в гомогенаті лейкоцитів за стандартним методом Крістіана та Варбурга Придатними для аналізу визнаються лише ті проби, концентрація білку в яких знаходиться в межах 200 - 400мкг в ЮОмкл Якщо КІЛЬКІСТЬ білку в зразку вища за 400мкг, його розводять до необхідної концентрації, а якщо меньша за 200мкг визнають непридатним до аналізу В якості субстрату використовують ЮмМ пнітрокатехолсульфат у ацетатному буфері рН5,0, що містить 10% хлорида натрію та 0,5мМ пірофосфата натрію Реакційну суміш готують, змішуючи 0,2мл гомогенату лейкоцитів та 0,2мл субстрату Інкубацію зразків проводять при 37°С на протязі 1 години Після інкубації реакцію зупиняють додаванням 0,1мл 2,5н NaOH КІЛЬКІСТЬ звільненого субстрату визначають шляхом вимірювання оптичної ЩІЛЬНОСТІ розчину при 515нм Результати виражають у нмоль/год/мг білку для зразків Отримані показники порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А Це дозволяє з великою достовірністю встановити рівень активності арилсульфатази А 517, Приклад Пацієнтка П , 8 років , історія хвороби № 18 Направлена на медико-генетичне консультування з попереднім діагнозом лейкодистрофія зі стійким судомним синдромом, резистентним до антиконвульсантів При визначенні активності арилсульфатази А в родині П отримані наступні результати Пацієнтка П - 17нмоль/год/мг білку Мати - 65нмоль/год/мг білку При порівнянні результатів з областю нормальних значень видно, що активність арилсульфатази А пацієнтки Ш при інкубації зразків при 37°С знаходиться в зоні патологічних значень, тобто не виключено наявність МЛД у пацієнтки При аналізі отриманих результатів визначено, що концентрація білку в пробах родини П Була недостатньою і складала Пацієнтка П - 96мкг Мати - Юбмкг Після повтору обстеження родини з приготуванням зразків з оптимальною кількостю білку були отримані такі результати Пацієнтка П - 110нмоль/год/мг білку Мати -150 нмоль/год/мг білку В результаті, активність арилсульфатази А як у пацієнта, так і у батьків знаходиться в області нормальних значень, що дозволило виключити діагноз метахроматичної лейкодистрофм Таким чином, впровадження способу визначення придатності зразків для визначення активності арилсульфатази А у 25 випадках на базі кафедри медичної генетики, клінічної імунологи та алергології КМАПО їм П Л Шупика та лабораторії медичної генетики УДСЛ "ОХМАТДИТ" дозволило зробити такі висновки завдяки заявляемому способу отримано однозначні результати ідентифікації дефіциту арилсульфатази А, впровадження способу визначення дефіциту арилсульфатази А дозволить значно покращити медико-генетичне консультування сімей диференційно-діагностичної групи, проспективне консультування подружніх пар у випадку непідтвердженого біохімічно діагнозу метахроматичнохі лейкодистрофм в родоводі, при родинному шлюбі та ш завдяки заявляемому способу досягається економія коштовних реактивів за рахунок проведення попереднього відбору проб Література 1 Ваші Н, Dodgson KS, Spenser В The assay of arylsulfatases A and В in human urine// Clm Chim Acta-1959-Vol 4-P 453-455 2 Цветаева И В , Бахарев В А , Казн 3 , Осипова ГЛ , Розенфельд ЕЛ , Розовский И С Выявление недостаточности арилсульфатазы А при метахро мати чес кой лейкодистрофии и пренатальный диагноз заболевания // Вопр мед химии 1980-вып 4-С 464-464 3 Досон Р , Эллиот Д , Эллиот У, Джонс К Справочник биохимика - М Мир, 1991 -543 с 56511 Залежність показників активності АСА від кількості білку* —зразок 1 •зразок 2 •зразок З 100 200 З» 400 500 600 7