Спосіб інактивації інфекційних агентів для виробництва біопрепаратів

Спосіб інактивації інфекційних агентів для виробництва біопрепаратів, що включає використання формальдегіду, який відрізняється тим, що як формальдегід застосовують фармакопейний уротропін в кінцевій концентрації 1-2,5% Передбачуваний винахід належить до галузі ветеринарної біотехнологм, зокрема до засобів інактивації інфекційних агентів при виготовленні з них вакцин та діагностикумів на підприємствах біологічної промисловості Існують різноманітні способи інактивації інфекційних агентів при виробництві діагностичних та вакцинних біопрепаратів Серед них - інактивація різноманітних інфекційних агентів фенолом [1,2], кристал-вюлетом [3, 4], 7-пропюнлактоном [5] чи етиленіміном [б] Ці речовини ефективно руйнують інфекційну активніть окремих збудників, майже не торкаючись їхньої антигенної активності, що є дуже цінним для бютехнолопчних цілей, проте вони, за винятком кристалвюлету, є вкрай токсичними і канцерогенними навіть у залишкових кількостях і праця з ними в умовах бювиробництва вимагає спеціальних запобіжних заходів Найбільш поширено використання в технології біопрепаратів формальдегіду, у ВІДПОВІДНИХ для кожного збудника концентраціях та умовах [7, 8] Цей шактиватор є універсальним і досить надійним в сенсі повноти інактивації! Проте його головною вадою є те, що в концентраціях, придатних для інактивації інфекЦІЙНОСТІ збудника, формальдегід частково інактивує більшість антигенів збудника, що вимагає збільшення у кінцевих продуктах концентрації "діючої речовини", тощо 20 12 98 г) Прототипом може бути спосіб застосування препарату "Теотропш" для інактивації широкого спектру інфекційних агентів з метою дезінфекцій (Зубаиров М М , Миколайчук С В , Бузун А И и др Препарат "Теотропин" для дезинфекции объектов санитарного надзора Патент РФ № 2123337 от За ХІМІЧНОЮ структурою "Теотропш" відноситься до штучних похідних уротропіну з виразними бактерю-, віро-, мікоплазмо-, хламідіємікоцидними властивостями і виробляється підприємствами військово-промислового комплексу Російської Федерації (РФ) Численими попередніми дослідженнями було встановлено, що "теотропш" може бути використано для інактивації різних вірусів та бактерій у процесі виготовлення захисних (вакцинних та діагностичних) препаратів, у тому числі - вірусів тешенської хвороби (Бузун А І , Жестерев В И , Середа А Д и др Способ изготовления вакцины против болезни Тешена Заявка Всероссийского НИИ ветвирусологии и микробиологии №2001103498/13(003677) приоритет 08 02 2001) та хвороби Ауєски (Бузун А I , Яковлев Ю С, Вербицький П І т і Спосіб виготовлення вакцини проти тешенської хвороби та псевдосказу свиней штрадермального застосування Заявка Держдепартаменту ветмедицини України) Діючою речовиною цього препарату також є формальдегід, що виділяється локально - у МІСЦІ ЙОГО взаємо дії з білковими структурами та нуклеїновими кислотами Це дозволяє значно точніше, ніж у випадку з формальдегідом, дозувати КІЛЬКІСТЬ шактиванта, яку достатньо для руйнування інфекційної активності, але ще замало для інактивації антигенної активності збудника Тому біопрепарати окремих збудників, отримані з застосуванням "Теотропшу" є значно більш активними в імунологічному відношенні, ніж при використанні формальдегіду Недоліками способів інактивації біопрепаратів з використанням "Теотропшу" є те, що фармакодинаміка цієї речовини ще вивчена недостатньо, як і довго (О ю тривалі наслідки її використання в біотехнологм та протиепізоотичній практиці "Теортопш", як ХІМІЧНИЙ продукт, наразі ще не стандартизовано і далеко не кожна його партія придатна для застережених цілей Нарешті цей препарат не виробляється в Україні і є малодуступним для вітчизняної бютехнолопчної промисловості В основу передбачуваного винаходу поставлено завдання підбір препарату з числа доступних для вітчизняної промисловості, який за принципом шактивуючої дії на збудників не відрізнявся б від "Теотропшу" -тобто діяв би локально, як зазначено вище, - але був би стандартним, а його біологічна небезпечність була б цілком відомою і прогнозованою Поставлена задача вирішується тим що в способі інактивації інфекційних агентів для виробництва біопрепаратів, включаючому використання 56794 формальдегіду, згідно винаходу, застосовують фармакопейний уротропін в кінцевій концентрації 1-2 5% Уротропін (синоніми гексаметилентетрамш, урізол, метенамш), розщеплюється з виділенням формальдегіду і має виразну протимікробну активність in vitro Цей препарат більш ніж 100 років використовується в КЛІНІЧНІЙ практиці як гуманної, так і ветеринарної медицини, його фармакодинаміка і бюнебезпечність вивчена з вичерпнутою повнотою і нешкідливість не визиває жодних сумнівів В той же час, як було з'ясовано перевіркою in vitro на моделях збудників тешенської хвороби, хламідюзу ВІВЦІВ, міксоматозу та стрептококозу кролів, уротропін в певних концентраціях цілком надійно руйнує структури мікробів, відповідальні за їхню інфекційну активність (таблиця) Таблиця Визначення ефективних доз уротропіну для інактивації різних збудників № з/п Назва тест-культур збудників і їх активність до дм уротропину Інактивація (%) після експозиції з уротропіном в концентрації 0,1 1 Тешовірус, шт "Бузун-ХДЗВА", 4,5 Ід 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 1,0 2,5 10 Н/Д 90 Н/Д 100 Н/Д 100 100 Н/Д 10 Н/Д Н/Д Н/Д 90 Н/Д 95 100 Н/Д 0 Н/Д Н/Д Н/Д 50 Н/Д 75 100 Н/Д 0 Н/Д Н/Д Н/Д 20 Н/Д 50 90 100 0 Н/Д Н/Д Н/Д 10 Н/Д 40 80 100 ТЦДбо/нл 2 Тешовірус, шт "Навля-96", 8,25 Ід ТЦДбо/нл 3 4 5 Вірус міксоматозу кролів, шт "МР" 4,5 Ід ТЦД50/мл Хламщія, шт ", ТЦДбо/нл 4,5 Стрептококк, млрд /мл Ід 1 Зауваження Тест-культури збудників в обсязі 5,0 мл кожна в 4-7 дублях обробляли зазначеними концентраціями уротропіну при 37°С протягом 48 годин і потім титрували у ВІДПОВІДНИХ тестсистемах - тешовіруси і хламідм в перещеплюваних клітинах РК-15, вірус міксоматозу в первинних клітинах тестесів кроленят, стрептококк - в МПБ у пробірках Проведені дослідження свідчать про високу шактивуючу активність уротропіну відносно інфекЦІЙНОСТІ вірусів, хламідій, бактерій Після обробки їх тест-культур протягом 48 годин при 37°С інфекційна активність вірусів тешенської хвороби і міксоматозу повністю руйнувалася 1%-ним уротропіном, а хламідм аборту ВІВЦІВ і стрептококку кролів 2,5% препаратом оброблені тест-культури не виявляли інфекційної активності після після трьох сліпих пасажів у ВІДПОВІДНИХ тест-системах Аналіз антигенної активності шактивованих тест-культур зазначених збудників в реакції зв'язування комплементу (віруси і хламідія) та реакції агглютинацм (стрептококк) не виявив розбіжності титрів специфічного антигену з вихідними нативними препара тами збудників Це свідчить про збереження антигених властивостей збудників після їх обробки уротропіном в концентраціях, що руйнують їхню інфекційність Стандартні умови застосування уротропіну Необхідну КІЛЬКІСТЬ фармацевтичного уротропіну (з розрахунку 1-2,5% кінцевої концентрацій) зважують на терезах з похибкою і І% і додають у рідину зі збудником, який треба шактивувати, з дотримання вимог септики та антисептики Після повного розчинення уротропіну зазначену рідину шкубують при 37°С протягом 24-72 годин (ефективну концентрацію уротропіну та термін і температуру інкубації оптимізують для кожного агенту окремими дослідженнями) Протягом інкубації оброблювану рідину кілька разів на добу (не менше 3-х) ретельно перемішують По закінченні інкубації визначають інфекційну активність обробленої уротропіном рідини і роблять висновок щодо повноти інактивації збудника Приклад 1 Інактивація віральної сировини До бутля з 5 л культуральної сировини вірусу тешенської хвороби (шт ХДЗВА-814) в умовах вірусологічного боксу з дотриманням вимог антисептики додають 50г фармакопейного уротропіну, зваженого на аптечних терезах Ретельно перемішують рідину в бутлі - до повного розчинення уротропіну Бутлю ставлять на шутель-апарат в термальній кімнаті (37°С) і шкубують на ньому протягом 48 годин Після закінчення терміну інкубації беруть зразок рідини на аналіз залишкової інфекційної активності і випробування антигенної специфічності Приклад 2 Контроль повноти інактивації препарату збудника, шактивованого уротропіном Зразок рідини за прикладом 1, паралельно зі зразком вихідної (не обробленої теотропіном) віральної сировини тітрують в пробірочній культурі перещеплюваних клітин нирки свині РК-15 з роз3 8 ведення 10 до 10 за стандартною методикою Титр вірусу "ХДЗВА-814" в зразку нешактивованої сировини становить не менше 7,5 Ід ТЦДбо/мл, тоді 56794 як зразок сировини після інактивації за прикладом 1 не визиває змін моношару РК-15 в жодній з пробірок Три сліпих пасажі досліджуваного зразку на клітинах РК-15 не приводять до накопичення вірусу "ХДЗВА-814", що свідчить про його повну інактивацію уротропіном Приклад 3 Контроль повноти інактивації та антигенної активності препарату збудника, шактивованого уротропіном Зразок рідини за прикладом 1, паралельно зі зразком вихідної (не обробленої теотропіном) віральної сировини тітрують в реакції звязування комплементу з розведення 1 2 до 1 16 з використання 4 одиниць комплементу та 8 комплементзв'язуючих одиниць специфічної сироватки, у загальному обємі 125 мкл (в 96-лункових планшетах) Постановку реакції супроводжують контролями специфічності реакції, гемтоксичності та антикомплементарності зразка Підписано до друку 05 06 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24