Спосіб визначення цинку в клітинах тканин організму

Спосіб визначення цинку в клітинах тканин організму, що включає фіксацію шматочків тканини в холодному 70° спирті, насиченому сірководнем, проведення їх через спирти зростаючої міцності, ксилоли, суміш ксилолу та парафіну, замикання у 3 дослідження зрізів під люмінесцентним мікроскопом, визначення цинку за жовто-зеленим світінням гранул у клітинах. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення цинку в клітинах тканин організму, який шляхом забарвлення зрізів спиртовим розчином 8-(п-толуолсульфоніламіно)хіноліну (8-ТСХ) та дослідження інтенсивності люмінесцентної реакції за допомогою мікрофлуориметра з використанням калібрувальній кривої дозволяє отримувати стабільні і порівняльні результати, проводити кількісне визначення цинку в клітинах. Суттєвими ознаками способу, що заявляється, є: - фіксація шматочків тканини у 70° холодному спирті, насиченому сірководнем; - проведення шматочків через спирти зростаючої міцності, 2 ксилоли, суміш 50% ксилолу та 50% парафіну, 2 рідкі парафіни; - замикання шматочків у парафін; - приготування зрізів; - депарафінування їх; - забарвлення зрізів 0,1% спиртовим розчином 8-ТСХ; - промивання 0,1 н гарячим розчином їдкого натру; - висушування зрізів на повітрі; - замикання у гліцерин; - визначення цинку за жовто-зеленим світінням гранул у клітинах та вимірювання інтенсивності люмінесцентної реакції 8-ТСХ за допомогою мікрофлуориметра (світлофільтри ФС-1, ЖС-18); - кількісне визначення цинку в клітинах за допомогою калібрувальної кривої, яка відображає залежність інтенсивності люмінесцентної реакції від вмісту цинку в стандартних розчинах 8-ТСХ. Відмінними від найближчого аналогу ознаками способу, що заявляється, є: - забарвлення зрізів 0,1 % спиртовим розчином 8-ТСХ; - промивання їх 0,1 н гарячим розчином їдкого натру; - вимірювання інтенсивності люмінесцентної реакції 8-ТСХ за допомогою мікрофлуориметра; - кількісне визначення цинку в клітинах за допомогою калібрувальної кривої яка відображає залежність інтенсивності люмінесцентної реакції від вмісту цинку в стандартних розчинах 8-ТСХ. Спосіб здійснюють таким чином: шматочки тканини фіксують упродовж 4 год. у холодному 70° спирті, насиченому сірководнем; проводять їх через спирти зростаючої міцності (80°, 90°, 96°, 100° - по 4 год. у кожному), через два ксилоли (по 15 хв. у кожному), суміш 50% ксилолу та 50% парафіну 30хв. при 40 °С, два рідкі парафіни - по 1,5 год. у кожному при 56 °С; замикають у парафін. Готують зрізи 5мкм завтовшки, депарафінують їх обробкою 2 ксилолами та 2 спиртами по 3 хв. у кожному, забарвлюють протягом 3 хв. 0,1% спиртовим розчином 8-ТСХ, промивають 0,1 н розчином їдкого натру, підсушують зрізи на повітрі, замикають у гліцерин та визначають цинк за жовто-зеленим світінням гранул клітин, вимірюють інтенсивність люмінесцентної реакції 8-ТСХ за допомогою мік 57367 4 рофлуориметра (світлофільтри ФС-1, ЖС-18), визначають кількість цинку в клітинах за допомогою калібрувальної кривої, яка відображає залежність інтенсивності люмінесцентної реакції від вмісту цинку в стандартних розчинах 8-ТСХ. Для побудови калібрувальної кривої спочатку готують основний розчин, для чого змішують 0,43г сірчанокислого цинку, 91мл 1% ацетонового розчину 8-ТСХ, 1л дистильованої води, отриману суміш фільтрують через беззольний фільтр, осад підсушують до постійної ваги, 100 мг його розчиняють у 100 мл ацетону, отриманий основний розчин містить в 1 мл (0,8 г) 100 мкг цинку; Стандартні розчини для мікрофлуометрії готують розбавленням ацетоном основного розчину, так щоб у 1 мл містилося 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 мкг/мл цинку. На основі даних інтенсивності люмінесцентної реакції в клітинах на калібрувальній кривій визначають відповідне значення вмісту цинку. Саме поєднання забарвлення клітин, що містять цинк, 0,1% спиртовим розчином 8-ТСХ, з їх промиванням гарячим 0,1н розчином їдкого натру та дослідження зрізів за допомогою мікрофлуориметра з використанням калібрувальної кривої дозволяє проводити кількісне визначення вмісту цинку в клітинах. Приклад 1. Шматочки підшлункової залози контрольних (інтактних) кролів фіксували впродовж 4 год. у 70° холодному спирті, насиченому сірководнем; проводили через спирти зростаючої міцності (80°, 90°, 96°, 100° - по 4 год. у кожному), через два ксилоли - по 15 хв. у кожному, суміш 50 % ксилолу та 50 % парафіну - впродовж 30 хв. при 40°С, два рідкі парафіни - по 1,5 год. У кожному при 56 °С; замикали у парафін. Готували зрізи 5мкм завтовшки, депарафінували зрізи обробкою 2 ксилолами та 2 спиртами по 3 хв. у кожному, забарвлювали їх упродовж 3 хв. 0, 1% спиртовим розчином 8-ТСХ, промивали 0,1н гарячим розчином їдкого натру, підсушували зрізи на повітрі, замикали в гліцерин та визначали цинк за жовто-зеленим світінням гранул клітин, вимірювали інтенсивність люмінесцентної реакції 8-ТСХ за допомогою мікрофлуориметра (світлофільтри ФС-1, ЖС-18), визначали кількість цинку в клітинах підшлункової залози за допомогою калібрувальної кривої, яка відображувала залежність інтенсивності люмінесцентної реакції від вмісту цинку в стандартних розчинах 8ТСХ. У контрольних (інтактних) кролів вміст цинку у В-інсулоцитах складав 90±6,2 мкг/г. Приклад 2. У кролів, які голодували впродовж двох діб, досліджували підшлункову залозу за прикладом 1. Вміст цинку у В-інсулоцитах був підвищений на 34% порівняно з контролем (121 ± 10,3 мкг/г, Р