Спосіб визначення активації процесів ліпопероксидації в крові людини

1 Спосіб визначення активації процесів ліпопероксидацм в крові людини, що включає визна чення в плазмі крові вмісту продуктів, що реагують з 2-тюбарбітуровою кислотою, без додавання (Тб) та при додаванні (Тс) в реакційне середовище розчину сірчанокислого заліза, який відрізняється тим, що при значеннях Тб, більших ніж (3,17+0,29хТс), визначають активацію процесів ліпопероксидацм 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що при розрахунку Тб і Тс враховують різницю екстинкцій бутанольної фази при довжині хвилі 535 і 580нм Винахід стосується медицини, зокрема клінічної біохімії Спосіб може бути використаний для визначення активації процесів ліпопероксидацм в крові людини при патологічних станах Відомий спосіб визначення активації процесів ліпопероксидацм в сироватці крові на підставі розрахунку фактора ризику пероксидацм ЛІПІДІВ (Чевари С , Андял Т, Панцел А Инициирование перекисного окислення липидов в сыворотке крови in vivo//Клин лаб диагностика -1992 -№11-12 С 34-37) Спосіб полягає у визначенні співвідношення між рівнем малонового діальдепду та концентрацією холестерину за ініціації процесів ліпопероксидацм іонами заліза (II) при насиченні проби киснем Недоліком відомого способу є те, що зміни вмісту продуктів ліпопероксидацм в плазмі хворих оцінюють при порівнянні з ВІДПОВІДНИМИ змінами в сироватці крові здорових осіб в той час, як індивідуальні коливання вмісту продуктів ліпопероксидацм мають широкий діапазон і змінюються не тільки при патологічних станах, а й на різних етапах розвитку процесів адаптації, що звужує область його застосування Для здійснення способу потрібен спеціальний пристрій та компресор, що обмежує можливість його використання в КЛІНІЧНІЙ практиці Відомий спосіб визначення активації процесів ліпопероксидацм шляхом оцінки пероксидного потенціалу ліпопротеїдів плазми, який дозволяє оцінити чутливість до ліпопероксидацм та полягає у визначенні вмісту продуктів пероксидацм жирних кислот (малонового діальдепду) і холестерину (переважно оксиду холестеролу) до та після інкубації 0,3-0,5мл плазми крові в присутності перекису водню та ацетату МІДІ (Plasma lipoprotem peroxidation potential a test to evaluate individual susceptibility to peroxidation / Arshad M A , Bhadra S, Cohen RM, Subbiah МТ//СІШ Chem -1991 - Vol 37, №10(Pt1) -P 1756-1758) Недоліком відомого способу, як і попереднього, є те, що зміни вмісту продуктів пероксидацм ЛІПІДІВ плазми хворих оцінюють при порівнянні з ВІДПОВІДНИМИ змінами в плазмі крові здорових осіб Необхідність використання складного газоаналізуючого обладнання для визначення продуктів пероксидацм холестерину ускладнює застосування способу Відомий також, обраний як прототип, спосіб визначення активації процесів ліпопероксидацм на підставі визначення вмісту малонового діальдепду в реакції з 2-тюбарбітуровою кислотою з урахуванням екстинкції забарвленого триметилового комплексу при довжині хвилі 532 та 580 нм (БІОХІМІЧНІ та біофізичні методи оцінки порушень окислювального гомеостазу в осіб, що зазнали радіаційного впливу внаслідок аварії на ЧАЕС Метод рекомендації / Овсяннікова Л М , Альохша С М , Дробінська О В , Атаманенко О М , Ляшенко Л О , Квіта Г І - К Чорнобилынтершформ, 1999 -с18) Недоліком відомого способу є недостатня чутливість визначення активації процесів ліпопероксидацм в діапазоні значень, що не перевищують показники середньостатистичної норми В основу винаходу поставлено задачу підвищення чутливості способу визначення активації 1 ю о (О 60157 процесів ліпопероксидацм шляхом порівняння базального рівня вмісту продуктів, що реагують з 2тюбарбітуровою кислотою (ТБК-АП), і показника, який залежить від рівня утворення цих сполук після додавання в реакційне середовища ІОНІВ заліза (II) Це надасть можливість визначати активацію процесів ліпопероксидацм в тих випадках, коли показники базального вмісту ТБК-АП не перевищують значень середньостатистичної норми Тут і далі абревіатурою ТБК-АП позначено сполуки, що при реакції з 2-тюбарбітуровою кислотою утворюють забарвлені комплекси Вміст ТБКАП, що визначається без додавання в реакційне середовище ІОНІВ заліза (II) позначено як базальний вміст (Тб) Вміст ТБК-АП, що визначається після додавання в реакційне середовище ІОНІВ заліза (II) позначено як стимульований вміст Л~с) Переважну більшість цих сполук становить малоновий діальдепд - вторинний продукт ліпопероксидацм В плазмі крові здорових осіб існує стале співвідношення між показниками Tg і Тс Підтримання цього співвідношення забезпечується функціонуванням антиоксидантної системи організму Якщо при активації процесів вільнорадикального окислення спроможність антиоксидантної системи є недостатньою для захисту ЛІПІДІВ ВІД ДІЇ вільнорадикальних сполук, посилення процесів ліпопероксидацм призводить до накопичення вторинних продуктів ліпопероксидацм, зокрема, малонового діальдепду Це супроводжується зменшенням рівня вмісту ЛІПІДІВ, що можуть окислитися за дії прооксидантних факторів В такому випадку при додаванні в реакційне середовище ІОНІВ заліза (II) рівень Тс є нижчим за той, який міг би бути при незміненому рівні вмісту них ЛІПІДІВ При дослідженні процесів ліпопероксидацм у практично здорових осіб встановлено, що співвідношення між Tg і Тс описується рівнянням Т б =3,17 + 0,29хТ с , де Tg -базальний вміст ТБК-АП, нмоль/мл, ''3,17 " - коефіцієнт штерцепцм, ''0,29 " - коефіцієнт лінійної регресії, с -стимульований вміст ТБК-АП, нмоль/мл Технічна задача вирішується за рахунок того, що порівнюють Тс та Tg і при рівні останнього більшому ніж (3,17+0,29) визначають активацію процесів ліпопероксидацм 6 визначають наступним чином до 0,15мл плазми крові (без гемолізу) додають Змл 1% ортофосфорної кислоти (рН=2,0), 1мл 0,6% розчину 2-тюбарбітуровоі кислоти та 0,05мл дистильованої води, після ретельного перемішування закриті пробками пробірки ставлять на киплячу водяну баню на 1 годину, потім проби охолоджують в холодній воді та додають 2мл бутанолу Після того проби ретельно перемішують і центрифугують протягом 10 хвилин при 3000об/хв Потім визначають оптичну густину верхньої (бутанольної) фази на спектрофотометрі при довжині хвилі 535 і 4 580нм з використанням в якості оптичного контролю бутанолу Розрахунок вмісту б проводять за формулою Т б = 85,47 х ДЕ, де Tg -базальний вміст ТБК-АП, нмоль/мл, 11 85,47 '' . розрахунковий показник, що включає об'єм плазми, об'єм проби, коефіцієнт молярної екстинкції малонового діальдепду та коефіцієнт перерахунку, нмоль/мл, ДЕ - різниця екстинкцій бутанольної фази при Я,= 535нЗ і Я,= 580н8, в одиницях оптичної густини Тс визначають за методикою описаною вище для визначення фактичного вмісту ТБК-АП, але замість 0,05мл дистильованої води до реакційної суміші додають 0,05мл розчину сірчанокислого заліза, приготованого з розрахунку 28мг FeSO4x7H2O на Юмл дистильованої води Перевагою способу, на відміну від прототипу, є те, що він дозволяє визначати активацію процесів ліпопероксидацм тоді, коли значення Tg не перевищують межу середньостатистичної норми і для цього не треба проводити повторні дослідження Чутливість способу становить 90% Приклад 1 Пацієнт Б , 45 р , учасник ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС 1986-1987рр Tg в плазмі крові становив 4,87нмоль/мл Тс -5,47 нмоль/мл Проводимо розрахунок 3,17 + 0,29хТ с =3,17 + 0,29x5,47 = 4,76 П о р | В Н Ю . ємо Tg з розрахованим значенням значення Tg є вищім за розраховане значення На підставі цього робимо висновок про наявність активації процесів ліпопероксидаци При подальшому дослідженні зразка крові в ізопропанольніи фазі ЛІПІДНОГО екстракту визначено підвищення вмісту дієнових і оксодієнових кон'югатів (первинні та проміжні продукти ліпопероксидації), а також основ Шиффа (кінцеві продукти ліпопероксидації - індикатори дистросфічних процесів) Приклад 2 Пацієнт Л , 48 р , учасник ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС 1986-1987рр Tg в плазмі крові становив 5,04нмоль/мл Проводимо Тс -9,74 нмоль/мл розрахунок 3,17 + 0,29хТ с =3,17 + 0,29x9,74 = 5,99 Порів нюємо Tg з розрахованим значенням, значення Т б є нижчим за розраховане значення Робимо висновок про відсутність активації процесів ліпопероксидацм При подальшому дослідженні зразка крові встановлено, що рівень вмісту дієнових, оксодієнових кон'югатів і основ Шиффа в ізопропанольніи фазі ЛІПІДНОГО екстракту крові знаходився в межах норми ПрикладЗ Пацієнт Р , 39р , учасник ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС 1986р Tg в плазмі крові становив 5,04нмоль/мл Тс - 5,64 нмоль/мл Проводимо розрахунок 3,17 + 0,29хТ с =3,17 + 0,29x5,64 = 4,80 Порів 60157 нюємо Tg з розрахованим значенням значення Т б є вищім за розраховане значення На підставі цього робимо висновок про наявність активації процесів ліпопероксидацм При подальшому дослідженні зразка крові в ізопропанольній фазі ЛІПІДНОГО екстракту визначено підвищення вмісту дієнових кон'югатів (первинні продукти ліпопероксидації) Приклад 4 Пацієнтка Щ , 55р , евакуйована з Прип'яті в 1986р Tg в плазмі крові становив 6,84нмоль/мл Тс -8,20 нмоль/мл Проводимо розрахунок 3,17 + 0,29хТ г =3,17 + 0,29x8,20 = 5,55 Комп'ютерна верстка Е Ярославцева нюємо Tg з розрахованим значенням значення Т б є вищім за розраховане значення На підставі цього робимо висновок про наявність активації процесів ліпопероксидацмПри подальшому дослідженні зразка крові в ізопропанольній фазі ЛІПІДНОГО екстракту визначено підвищення вмісту основ Шиффа (кінцеві продукти ліпопероксидації) Спосіб може бути використаний в установах охорони здоров'я для визначення активації процесів ліпопероксидацм в плазмі крові людини при патологічних станах, а також для контролю за перебігом процесів ліпопероксидацм при використанні засобів з антиоксидантною дією Порів Підписано до друку 06 10 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна