Живильне середовище для культивування штаму ч-03 дереворуйнівного гриба irpex lacteus fr. – продуцента молокозсідального ферменту

Живильне середовище для культивування штаму Ч-03 дереворуйнівного гриба Irpex lacteus Fr. - продуцента молокозсідального ферменту, що містить пептон, калій фосфорнокислий однозамі 3 60690 K2НРО4 - 0,4, MgSO47H2O - 0,4, СаСl2 - 0,04, ZnSO47H2O - 0,001 та дистильована вода до 1л. 4 Кращі показники молокозсідальної активності наведені у таблиці. Таблиця Показники молокозсідальної активності культурального фільтрату (КФ) штаму Ч-03 Irpex lacteus Fr. на 15 добу в залежності від складу живильних середовищ Живильні середовища з різною концентрацією речовин 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Середнє значення МЗА (ОД/МЛ) культурального фільтрату штаму Ч-03 З таблиці видно що, найвищі показники молокозсідальної активності має культуральний фільтрат (КФ) живильного середовища №8. Задовільній вплив гриба на активність молокозсідального ферменту здійснювався на живильних середовища №2, 3, 4, 5, 7, 10, 11, 12, 14, та 16, нижчі показники у продуцента при зростанні на живильних середовищах №1, 6, 9, 15. Як показав дисперсійний аналіз, вплив факторів цілком вірогідний. Порівняння результатів середніх проводилося за методом Дункана [7]. З отриманих даних випливає, що від основних факторів, якими є сахароза, пептон, котрі є джерелами вуглецю та азоту, сірчанокислий магній і ++ ++ хлористий кальцій - джерела іонів Mg i Са , що активують діяльність ферментативних систем, залежить біосинтетична активність [8, 9, 10] продуцента. Повний факторний експеримент дає можливість виявити найбільш ефективний вплив кожного окремого фактора та їх взаємозв'язок в біосинтезі протеїназ молокозсідальної дії штаму Ч-03 Irpex lacteus Fr. Живильне середовище готували шляхом послідовного розчинення його компонентів з наступним доведенням дистильованою водою до 1л. Кислотність середовища доводили до 3,4-3,6 рН за допомогою 10% НСl. Живильне середовище розливали по 50мл. в конічні колби на 250мл, стерилізували в автоклаві АГ-1 при 0,8-1 атм протягом 40 хв. Гриб вирощували протягом 15 діб., за оптимальною температурою 32С. Молокозсідальну активність культурального фільтрату визначали за методом Каваї і Мукаї [9, 10], а розрахунок проводили за формулою. 952,4 ± 36,5 1581,0 ± 27,3 1724,1± 11,3 1980,1 ± 9,3 1183,4 ± 48,1 913,2 ± 1,7 1568,6 ± 74,1 2531,6 ± 52,9 754,7 ± 8,9 1612,9 ± 19,2 2234,6 ± 43,5 1659,7 ± 27,9 907,0 ± 19,1 1166,1 ± 37,2 968,5 ± 4,6 1612,9 ± 16,9 1179,9 ± 13,6 Формула 1 40  100  K МЗА кф  од / мл П де K - коефіцієнт розведення культурального фільтрату /КФ/; П - час зсідання молока; протягом якого з 100 мл молока при добавленні 1 мл. КФ утворюється щільний згусток, хв. 40 - середній час зсідання молока при виробництві сиру, хв.; (МЗА - молокозсідальна активність). Приклади конкретного виконання Приклад 1. Готують живильне середовище такого складу, г/л: сахароза - 3,49, пептон - 3, KН2РО4 - 0,09, K2НРО4 - 0,06, MgSO47H2O - 0,4, СаСl2 - 0,4, ZnSO47H2O - 0,00015, дистильована вода до 1л. Живильне середовище розливають по 50 мл. в конічні колби на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 0,8-1 атм протягом 40 хв. Кислотність середовища після стерилізації становить 3,53,6 рН. Після охолодження середовища його інокулюють шматочком міцелію розміром, приблизно 1010мм, вирощують продуцент в термостаті ТС 80М за температури 32°С протягом 15 діб. Активність ферменту дорівнювала 952,4 од./мл (Активність ферменту визначали за формулою 1). Приклад 2. Готують живильне середовище такого складу, г/л: сахароза - 7,49, пептон - 5, KН2РО4 - 0,09, K2НРО4 - 0,06, Mg SO47H2O - 0,4, СаСl2 - 0,04 ZnSO47H2О - 0,00015, дистильована вода до 1л. Живильне середовище розливають по 50 мл. в конічні колби на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 0,8-1 атм протягом 40 хв. Кислотність середовища після стерилізації становить 3,53,6 рН. Після охолодження середовища його іно 5 60690 кулюють шматочком міцелію розміром, приблизно 1010мм, вирощують продуцент в термостаті ТС – 80М за температури 32С протягом 15 діб. Активність ферменту дорівнювала 1980,1 од./мл. Приклад 3. Готують живильне середовище такого складу, г/л: сахароза - 7,49, пептон - 5, KН2РО4 - 0,6, K2НРО4 - 0,4, Mg SO47H2O - 0,2, СаСl2 - 0,04, ZnSO47H2O - 0,001, дистильована вода до 1л. Живильне середовище розливають по 50 мл. в конічні колби на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 0,8-1 атм протягом 40 хв. Кислотність середовища після стерилізації становила 3,53,6 рН. Після охолодження середовища його інокулюють шматочком міцелію штама Ч-03 розміром, приблизно 1010мм, вирощують продуцент в термостаті ТС - 80М за температури 32°С протягом 15 діб. Активність ферменту дорівнювала 2531,6 од./мл. Приклад 4. Готують живильне середовище такого складу, г/л: сахароза - 3,49, пептон - 5, KН2РО4 - 0,6, K2НРО4 - 0,4, Mg SO47H2O - 0,4, СаСl2 - 0,08, ZnSO47H2O - 0,001 дистильована вода до 1л. Живильне середовище розливають по 50 мл. в конічні колби на 250 мл, стерилізували в автоклаві АГ-1 при 0,8-1 атм протягом 40 хв. Кислотність середовища після стерилізації становить 3,5-3,6 рН. Після охолодження середовища його інокулюють шматочком міцелію продуцента розміром, приблизно 1010мм, вирощують продуцент в термостаті ТС - 80М за температури 32°С. протягом 15 діб. Активність ферменту дорівнювала 968,5 од./мл. Таким чином, нове модифіковане живильне середовище, яке містить: г/л, сахарозу - 7,49, пептон - 5, KН2РО4 - 0,6, K2НРО4 - 0,4, Mg SO47H2O 0,2, СаСl2 - 0,04, ZnSO47H2O - 0,001, дистильовану воду - 1л, є оптимальним для культивування штаму Ч-03 Irpex lacteus Fr. Як показник, на живильному середовищі №8 самий високий рівень МЗА (2531,6 од./мл.), тобто це живильне середовище можна використовувати для культивування штаму Ч-03 з метою одержання ферментного препарату. Як видно з даних таблиці, та складу нового модифікованого живильного середовища сахароза в кількості - 7,49 г/л, пептон – 5 г/л, магній сірчанокислий - 0,2, кальцій хлористий - 0,04, максимально сприяють росту міцелію та накопиченню молокозсідального ферменту. При інших концентраціях даних сполук накопичення необхідного ферменту у рідині культурального фільтрату відбувається дуже повільно і не набуває необхідної кількості для отримання щільного молочного згустку. Джерела інформації: 1. Бойко М.И. Определение оптимальных значений рН и температуры для культивирования Irpex lacteus Fr. А-Дон-02 - продуцента протеиназ Комп’ютерна верстка М. Ломалова 6 молокосвертывающего действия / М.И. Бойко И.А., Кузнецова, А.В Белун.// Совр. микология в России, тезисы докладов. - М, 2008. - С. 121; 2. Кузнецова І.А. Вплив високих та низьких температур на вихід протеїназ молокозсідальної дії у гриба Irpex lacteus Fr. /Кузнецова І.А// Вісник Харківського нац. ун-ту. - 2008. - №2 (14). - С. 96-99. 3. Кузнецова І.А. Біосинтетичні властивості гриба Irpex lacteus Fr. в залежності від якісного складу пептону в живильному середовищі / І.П. Парасій, І.А Кузнецова // Сучасні проблеми природничих наук: III Всеукр. студ. наук, конф.: матер, конф. - Ніжин, 2008. - С. 129 4. UA 23877 U А 23С 19/032 (2007.01) С12 N 5/00. Корисна модель на живильне середовище для виділення та пересіву чистих культур базидиального гриба Irpex lacteus Fr.. /Кузнецова I.А., Клименко Г.В, Бойко M.I. А; опубл 11.06.2007, Бюл. №8. 5. Максимов В.Н. Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования эксперимента /В.Н. Максимов, М.Н. Пименова, Н. Н. Гречушкина // Практикум по микробиологии - М, 1976. - С. 53-163. 6. Патент СССР №1211288 кл С 12 N 15 //00 С 12 R 9/58, С 12 R. Живильне середовище для росту штаму М-81 Hirshioporus laricinus – продуценту молокозсідального ферменту// Бойко МЛ, Негруцький С.Ф., Федотов О.В, Борисенко О.О. №22915 UA; опубл. 15.02.86 Бюл №4. 7. Присецький Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів./ Ю.Г. Присецький - Донецьк: Кассиопея, 1999. - 210с. 8. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - (Справочник) /С.М. Семенов - М: В.О. «Агропромиздат», 1990, 240с. 9. Федорова Л.П.. Влияние различных источников углеродного питания на молокосвертывающую активность микоризного гриба / Л.Н. Федорова, Т.Н Дроздова. //Микол, и фитопатол., 1982. Т.16, вип. 2. - С. 133-138. (прототип) 10. Типограф Д.Я. Условия культивирования гриба Aspergillus candidus и его ферментные комплексы /Д.Я. Типограф, Т.А. Петина // Прикл. биохим. и микробиол., 1966. - Т-2, - С.417-424. 11. Kawai M. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes// Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes //Kawai M, Mukai N. // Agric. Biol. Chem, 1970. -V.34, 2. - P. 159-163. 12. Koshland D.E., Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis // Koshland D.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1958 Feb; 44(2): S. 98-104. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601