Спосіб детекції збудника бактеріального раку agrobacterium tumefaciens у хмелю звичайного

Спосіб детекції збудника бактеріального раку Agrobacterium tumefaciens у хмелю звичайного, що включає ДНК-типування фітопатогену у зразках хмелю, який відрізняється тим, що проводять ідентифікацією ipt-онкогену та гену вірулентності virD2 агробактерій у багатокомпонентній системі (на фоні присутності ДНК хмелю та різних біологічних домішок). (19) (21) u201107475 (22) 14.06.2011 (24) 26.12.2011 (46) 26.12.2011, Бюл.№ 24, 2011 р. (72) СИВОЛАП ЮРІЙ МИХАЙЛОВИЧ, КОЖУХОВА НАТАЛІЯ ЕДУАРДІВНА, ВЕНГЕР АНДРІЙ МИКОЛАЙОВИЧ (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР В РОСЛИННИЦТВІ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК 3 66205 що свідчить про наявність/відсутність інфекції, відповідно. Відмінними від найближчого аналога ознаками у корисній моделі, що заявляється, є: спосіб підготовки зразків до аналізу; показник, за яким ідентифікують наявність патогену; ідентифікація онкогенів і генів вірулентності. Запропонований спосіб забезпечує високу точність та можливість оцінки великої кількості зразків за короткий час (один робочий день), не потребує наявності дорогого обладнання та реактивів. Спосіб здійснюється таким чином. Проводять виділення ДНК. Гомогенізують 5-50 мг рослинного матеріалу (листя, бруньки, мікропагони) у 1,5-мл мікропробірці. Додають 1,5 мл буферу для екстракції ДНК такого складу: 100 мМ Трис-НСl (рН 8,0), 2,0 Μ NaCl, 20 мМ Na3EDTA (pH 8,0), 2 % (вага/об'єм, в/о) СТАВ, 1 % (в/о) полівінілпіролідон (Κ10, MW 10000), 0,5 % (в/о) активоване вугілля. Інкубують 30 хв. при 55 °C. Центрифугують 10 хв. при 16000 об./хв. при кімнатній температурі. Переносять супернатант у нову мікропробірку. Додають один об'єм суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом) та перемішують до утворення білої емульсії. Центрифугують 10 хв. при 16000 об./хв. при кімнатній температурі. Переносять водну фазу у нову мікропробірку. Вносять до водної фази 0,45 об'єму ізопропілового спирту, перемішують шляхом перевертання пробірки. Інкубують 1 год. при 25 °C. Центрифугують 10 хв. при 700 об./хв., зливають супернатант. Вносять у пробірку з осадом 1 мл розчину для промивання (15 мМ ацетат амонію, 4 75° етанол). Центрифугують 10 хв. при 900 об./хв., зливають супернатант. Підсушують 15-20 хв. за кімнатної температури, розчиняють в 50 мкл ТЕбуферу (10 мМ Трис-НСl (рН 8,0), 1 мМ Na3EDTA (pH 8,0)). Додають РНКазу А до кінцевої концентрації 1 мкг/мл, інкубують 30 хв. при 37 °C. Розчин ДНК зберігають в холодильнику при температурі 4 °C протягом проведення дослідження. Постановка полімеразної ланцюгової реакції. Стерильні пробірки (залежно від типу термоциклера можуть бути 0,2-, 0,5-, 1,5-мл пробірки чи планшети) необхідної кількості з урахуванням проб позитивного та негативного контролів підписують та розміщують в штативі, який знаходиться на льоду. В окремій 1,5-мл пробірці формують ПЛРсуміш для необхідної кількості зразків у відповідності з табл. 1. Компоненти у ПЛР-суміш додають строго у послідовності, наведеній в табл. 1. Для запобігання забрудненню приготування ПЛР-суміші проводять в одноразових гумових рукавичках в боксі. Під час приготування ПЛР-суміші всі розчини повинні знаходитись на льоду. ПЛРсуміш перемішують на струшувачі типу вортекс та центрифугують за 1500 об./хв. 10 сек. для видалення повітряних бульбашок. Утворення піни або бульбашок під час перемішування не допускається. В табл. 2 наведено інформацію про досліджені гени та послідовності праймерів, що їх фланкують (дизайн праймерів - Haas J., Moore L., Ream W., Manulis S. Universal PCR Primers for Detection of Phytopathogenic Agrobacterium strains // Appl. enviroment. microbiol. - 1995. - P. 2879-2884.). Таблиця 1 Приготування ПЛР-суміші Компонент Бідистильована стерильна вода 10-кратний ПЛР-буфер 1 мМ суміш дНТФ 5 мкМ прямий праймер 5 мкМ зворотний праймер 3 5 од/мм ДНК-полімераза Taq Всього Кінцева концентрація 1-кратний 0,2 мМ 0,25 мкМ 0,25 мкМ 1 од Кількість на 1 реакцію, мкл 12,0 2,5 4,0 1,0 1,0 0,2 20,7 Таблиця 2 Нуклеотидні послідовності праймерів Ген ipt vir D2 Довжина амплікона, п.н. 427 224 Послідовність праймерів (3' ·5') прямого зворотного gatcgggtccaatgctgt gatatccatcgatctctt atgcccgatcgagctcaagt cctgacccaaacatctcggctgccca Аліквоти отриманої ПЛР-суміші об'ємом 17 мкл розливають у підготовлені пробірки. Додають 4,5 мкл розчину ДНК. В пробірку позитивного контролю замість розчину ДНК додають 4,5 мкл розчину-ДНК Agrobacterium tumefaciens. В пробірку негативного контролю замість розчину ДНК додають 4,5 мкл бідистильованої стерильної води. Поверх реакційного розчину нашаровують 25 мл мінеральної олії для запобігання википанню компонентів реакції. Центрифугують за 1500 об./хв. 10 сек для видалення повітряних бульбашок. Підготовлені проби переносять в штатив термоциклера. Температурний режим ампліфікації такий: початкова денатурація - 2 хв за 94 °C, далі 1 хв за 94 °C; відпал праймерів - 1 хв. за 55 5 °C; елонгація - 2 хв. за 72 °C, фінальна елонгація - 10 хв. Кількість циклів - 35. Електрофоретичний розподіл продуктів ПЛР. Продукти ПЛР-ампліфікації (10 мкл-аліквоту ПЛРсуміші) змішати з 2 мкл буфера для нанесення (0,25 % (в/о) бромфеноловий синій, 0,25 % (в/о) бромфеноловий синій, 40 % (в/о) цукроза у воді). Фракціонувати в горизонтальному "підводному" 2,0 % агарозному гелі в 1 х ТВЕ-буфері (89 mМ Трис-НС1 (рН 8,2), 89 мМ борна кислота; 2 mM Na3EDTA) при постійній напрузі 100 В при кімнатній температурі. Електрофорез припинити згідно з довжиною пробігу бромфенолового синього, рух якого у 2,0 % агарозному гелі співпадає з рухом фрагментів ДНК розмірами 400-500 п.н. Візуалізація продуктів ПЛР. Гелеву пластину промивають деіонізованою водою та кладуть·на 10 хв. у розчин 1 x ТВЕ-буферу з бромистим етидієм концентрацією 1 мкг/мл. Відеозображення електрофореграм отримують за допомогою цифрової фотокамери. Документування результатів. Після електрофорезу на доріжках, що відповідають аналізованим пробам, повинно бути по одній чіткій смузі, які відповідають дослідженим генам, або не повинно бути ніяких смуг. На доріжках, що відповідають позитивним контрольним пробам за кожним дослідженим геном, повинно бути по одній чіткій смузі. На доріжці, що відповідає негативній контрольній пробі, не повинно бути ніяких смуг. Поява смуги в електрофоретичному спектрі нега Комп’ютерна верстка Мацело В. 66205 6 тивної контрольної проби свідчить про наявність у робочих розчинах ДНК. У таких випадках повторюють ПЛР, використовуючи нові робочі розчини. Опрацювання результатів. Облік результатів ПЛР-аналізу проводити за наявністю чи відсутністю на доріжках електрофореграми специфічних смуг ампліфікованої ДНК. Визначити розміри фрагментів ампліфікації у парах нуклеотидів (п.н.) на підставі порівняння зі смугою в відповідній пробі позитивного контролю. Довжина специфічних фрагментів ампліфікації генів така: ipt 427 п.н., vir D2 - 224 п.н. Інфікованими Agrobacterium tumefaciens вважати зразки, для яких встановлено наявність продуктів ампліфікації за обома генами. Приклад використання способу. Здійснювали детекцію Agrobacterium tumefaciens в бруньках рослин сорту Альта без візуальних симптомів ураження. Відмічено відсутність продуктів ампліфікації при ПЛР-аналізі генів ipt та vir D2 в досліджених зразках, хмелю (креслення), де зображено електрофореграму продуктів ампліфікації генів ipt (1-6,8) та vir D2 (7, 9-13) Agrobacterium tumefaciens в зразках ДНК 1, 7, 8 - чистої культури А. tumefaciens (позитивний контроль), 2,-5, 912 - бруньок хмелю. 6, 13 - негативний контроль. М - маркер молекулярної маси ДНК з UC19/MspI. Дані зразки вибрано для введення в культуру in vitro для клонального мікророзмноження. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601