Спосіб виділення біологічно активних речовин з кори осики, які виявляють антимікробну, репаративну, протизапальну, анальгетичну та діуретичну активність

Винахід відноситься до фармації та медицини, а саме до способів одержання біологічно активних речовин з рослинної сировини. Відомий спосіб отримання суми поліфенолів (Патент 44321, Україна, МПК 7А61К35/78, С07Н3/02, заявл. 19.1297, опубл. 15.02.02 Бюл. №2) шляхом екстракції суплідь вільхи 70% водним етанолом з подальшим концентруванням екстракту і екстракцією ацетоном з отриманням цільового продукту висушуванням ацетонового екстракту. До недоліків відомого способу можна віднести високу вартість екстрагентів, їх горючість та вогненебезпечність. До того ж, ацетон є прекурсором, стосовно яких встановлені заходи контролю. Крім того, з можливих біолоігчно активних комплексів використовують лише сум у поліфенолів. Відомий також спосіб одержання фенольних сполук, які проявляють гепатозахисну властивість (Патент 20932А, Україна, МПК 6А61К31/05, А61К35/78, заявл. 27.10.93, опубл. 27.02.98 Бюл. №1) шляхом екстракції карагани гарячою водою при перемішуванні протягом 40-50 хвилин при температурі 90°С з наступним настоюванням протягом 10 хвилин, упарюванням та сушкою. До недоліків зазначеного способу, як і у попередньому випадку, можна віднести використання у якості цільового продукту тільки фенольних сполук. Завданням винаходу є створення безвідходного способу переробки лікарської рослинної сировини, зокрема кори осики, в результаті чого одержують два біологічно активних комплексу: ліпофільну фракцію та фенольний комплекс, які можуть бути використані у якості лікарських субстанцій для одержання лікарських засобів. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у безвідходному способі одержання біологічно активних засобів з лікарської рослинної сировини, що включає екстракцію гарячою водою, упарювання та сушку передбачено використання у якості лікарської рослинної сировини кору осики, вичерпною екстракцію останньої хлорорганічним розчинником у співвідношенні 1:8 з упарюванням фільтрату до одержання ліпофільної фракції, висушування сировини до видалення хлорорганічного розчинника з наступною екстракцією знежиреної сировини гарячою водою тричі протягом 30 хвилин з об'єднанням водних екстрактів і наступним упарюванням та сушкою для одержання фенольного комплексу. В якості хлорорганічного розчинника може бути використаний хлороформ, хлористий метилен або інший фармацевтично прийнятий розчинник. Вибір екстрагентів та параметрів заявленого способу здійснено експериментальним шляхом з урахуванням ступеня біологічної активності одержаних комплексів, ефективності, доступності та нешкідливості реактивів, практичного відтворення способу у промислових умовах. Використання у якості екстрагента хлорорганічного розчинника, зокрема хлороформу, обумовлено найбільш повним вилученням ліпофільної фракції з сировини. Інші знежирюючи розчинники, наприклад, петролейний ефір, диетиловий ефір та інші не забезпечують повне виділення ліпофільної фракції з кори осики, при цьому існують суто те хнологічні недоліки використання таких розчинників: пари ефіру отруйні, горючі та вибухонебезпечні, при роботі з ними необхідно дотримуватись особливих умов безпеки. Крім того, ефір також відноситься до прекурсорів, стосовно яких встановлені заходи контролю. Експериментально встановлено, що використання у якості екстрагента гарячої води при одержанні фенольного комплексу з кори осики забезпечує найбільш повну екстракцію фенольного комплексу. Варіанти дослідів з використанням у якості екстрагенту спирту етилового різної концентрації представлені у таблиці 1. Таблиця 1 Кількісний вихід екстрактивних речовин Екстрагент Кількісний вихід екстрактивних речовин,% вода 11,83 30% 50% 70% етанол етанол етанол 10,22 8,17 7,48 Аналіз даних свідчить, що максимально ефективна екстракція досягається при використанні у якості екстрагенту води. Крім того, підвищення температури води до 90-100°С і трикратна заміна екстрагенту інтенсифікує процес екстрагування, що дозволяє максимально вилучити БАР з сировини при найменшій витраті часу. В результаті здійснення заявленого способу одержують два біологічно активних комплексу: - ліпофільну фракцію, яка має вигляд густої маси темно-зеленого кольору зі специфічним запахом, яка розчиняється у хлороформі, петролейному ефірі, гексані; - фенольний комплекс - порошок світло-коричневого кольору зі специфічним запахом, гіркувато-кислий на смак, добре розчинний у воді, практично нерозчинний в ефірі, хлороформі. Спосіб здійснюється таким чином, що шля хом екстракції кори осики хлорорганічним розчинником у співвідношенні сировина-екстрагент 1:8 з упарюванням фільтрату одержують ліпофільну фракцію, знежирену сировину піддають сушці до видалення хлорорганічного розчинника, екстрагують гарячою водою у співвідношенні 1:10 тричі протягом 30 хвилин з об'єднанням водних екстрактів і наступним упарюванням та сушкою, одержують фенольний комплекс. Таким чином, з одного виду сировини виділені субстанції різної хімічної природи з різноманітною фармакологічною активністю. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. 1,2кг подрібненої повітряно-сухої кори осики, яка була зібрана ранньою весною на початку сокоруху, екстрагували хлороформом у апараті Сокслету. Циркуляцію хлороформом повторювали 9 разів до повного знежирення сировини. Отриманий ліпофільний екстракт (7,2л) концентрували відгонкою хлороформу. Знежирену сировини сушили до видалення хлороформу при кімнатній температурі. Суху знежирену сировину заливали гарячою водою у співвідношенні сировина-екстрагент 1:10, нагрівали на киплячому водяному огрівнику протягом 30 хвилин, фільтрували. Операцію повторювали 3 рази. Отриманий водний екстракт (28,3л) упарювали та висушували в ротаційно-вакуумному випарювачі при температурі 90-100°С. Вихід фенольного комплексу осики склав 10,3%., ліпофільного екстракту - 9,1%. Приклад 2. Антимікробну активність ліпофільного комплексу, одержаного за заявленим способом, вивчали, використовуючи метод дифузії в агар та набір еталонних штамів: Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escher-ichia coli АТСС 25922, Bacilus subtilis АТСС 6633, Candida albicans ATCC 885653. Дані експерименту наведені у таблиці 2. Таблиця 2 Результати визначення протимікробної активності ліпофільного екстракту кори осики (500мг/мл) по відношенню до контролю Штами Staphylococcus Escherichia Bacilus Candida мікроорганізмів aureus coli subtilis albicans Діаметр зон 25/0 20/17 28/18 13/20 затримки росту, мм Встановлена виражена антимікробна активність ліпофільного екстракту кори осики по відношенню до Staphylococcus aureus і Bacilus subtilis, діаметр зон затримки росту Staphylococcus aureus - 25мм, Bacilus subtilis - 28мм. Протимікробна активність до Escherichia coli перевищує фонову. Таким чином, можна зробити висновок, що ліпофільний екстракт, одержаний у відповідності з заявленим способом, має виражену протимікробну активність у відношенні до грамнегативних та грампозитивних мікроорганізмів. Приклад 3. - Протизапальну активність фенольного комплексу кори осики вивчали на моделях карагенінового і формалінового набряків на білих щурах, які були розподілені на 6 груп: дослідні; ті, яких лікували фенольним комплексом кори осики в дозах 15, 20, 25, 50мг/кг; ті, яких лікували препаратом порівняння, і контрольні. В якості препарату порівняння використовували вольтарен. Критерієм протизапальної активності був відсоток пригнічення набряку. Результати представлені в таблиці 3. Таблиця 3 Протизапальна активність фенольного комплексу кори осики на моделях карагені нового та формалінового набряків лапок щурів Вид набряка Карагені-новий набряк Формаліновий набряк Контроль (дист. Вольтарен вода) (ЕД50=8мг/кг) 11,6±0,7 26,8±1,7 56,7% 3,4±1,1 9,8±0,5 64,5% Фенольний комплекс кори осики 15мг/кг 20мг/кг 25мг/кг 50мг/кг 20,0±0,2 14,8±1,1 11,2±0,9 16,2±0,9 25,3% 44,7% 52,9% 39,5% 7,2±0,6 5,7±0,4 2,8±0,5 4,8±0,6 26,5% 40,6% 70,8% 50,0% Аналіз даних таблиці свідчить, що на моделях карагенінового і формалінового набряків фенольний комплекс кори осики виявляє виражений протизапальний ефект в дозі 25мг/кг и практично не поступається препарату порівняння - вольтарену. Приклад 4. Репаративну активність фенольного комплексу кори осики вивчали на моделі експериментальної ультрафіолетової ерітеми на морських свинках, яких розподіляли на 6 груп: дослідні; ті, яких лікували фенольним комплексом кори осики в дозах 15, 20, 25, 50мг/кг; ті, яких лікували препаратом порівняння вольтареном, і контрольні. Про репаративну активність фенольного комплексу кори осики свідчила ступінь пригнічення гіперемії шкіри тварин. Результати представлені в таблиці 4. Таблиця 4 Репаративна активність фенольного комплексу кори осики на моделі експериментальної УФ-ерітеми у морських свинок Об'єкт дослідження Контроль (дист. вода) Вольтарен (ЕД50=8мг/кг) Фенольний комплекс кори осики (доза 15мг/кг) Фенольний комплекс кори осики (доза 20мг/кг) Фенольний комплекс кори осики (доза 25мг/кг) Фенольний комплекс кори осики (доза 50мг/кг) Оцінка ступеня гіперемії, бали 15,4±2,6 7,6±0,4 12,4±0,6 8,4±0,5 8,2±0,3 8,8±5,2 % пригнічення гіперемії по відношенню до контролю 50,6 20,0 45,4 46,7 42,8 Аналіз даних таблиці показує, що фенольний комплекс кори осики виявляє виражену репаративну активність. Приклад 5. Анальгізуючу активність фенольного комплексу кори осики вивчали на моделі "оцтовокислих корчів" на білих щурах, які були розподілені на 6 груп: дослідні; ті, яких лікували фенольним комплексом кори осики в дозах 15, 20, 25, 50мг/кг; ті, яких лікували препаратом порівняння анальгіном, і контрольні. Анальгізуючу активність оцінювали за здатністю зменшувати кількість "оцтовокислих корчів" і виражали у відсотках. Результати наведені в таблиці 5. Таблиця 5 Анальгізуюча активність фенольного комплексу кори осики на моделі "оцтовокислих корчів" на щура х Об'єкт дослідження Контроль (дист. вода) Фенольний комплекс кори осики Фенольний комплекс кори осики Фенольний комплекс кори осики Фенольний комплекс кори осики Анальгін Доза, мг/кг 15 20 25 50 50 Кількість корчів за 30хв 76,6±10,9 48,4±5,7 34,0±2,7 28,6±5,4 38,4±4,0 46,2±6,9 Анальгізуюча активність, % 36,8 55,6 62,7 49,8 39,7 Аналіз даних таблиці свідчить про те, що фенольний комплекс кори осики має виражену анальгізуючу активність, яка перевищує препарат порівняння анальгін. Приклад 6. Діуретичну активність вивчали за дією фенольного комплексу кори осики на екскреторну функцію нирок після водного навантаження у білих щурів, які були розподілені на 6 груп: дослідні; ті, яких лікували фенольним комплексом кори осики в дозах 15, 20, 25, 50мг/кг; ті, яких лікували препаратом порівняння гіпотіазидом, і контрольні. Результати наведені в таблиці 6. Таблиця 6 Вплив фенольного комплексу кори осики на екскреторну функцію нирок після водного навантаження у щурів в порівнянні з гіпотіазидом Об'єкт дослідження Контроль Гіпотіазид Фенольний комплекс кори осики Фенольний комплекс кори осики Фенольний комплекс кори осики Фенольний комплекс кори осики Доза, мг\кг Діурез за 4год, мл/100г Активність в% по відношенню до контролю 4,5±0,19 50 9,7±0,15 115,6 50 9,6±0,11 113,3 25 8,8±0,09 95,5 20 7,0±0,29 55,6 25 6,2±0,33 37,7 Фенольний комплекс кори і препарат порівняння гіпотіазид у рівних дозах виявляють однаковий діуретичний ефект. При використанні фенольного комплексу кори осики у менших дозах спостерігається діуретична дія. В результаті здійснення заявленого способу одержують дві біологічно активні субстанції (ліпофільну і фенольну) з вираженими фармакологічними активностями: протимікробною, репаративною, протизапальною, анальгетичною, діуретичною, які перспективні для використання у якості лікарських субстанцій для створення лікарських препаратів з широким спектром фармакологічної активності. Заявлений спосіб дає змогу раціонального використання вітчизняних сировинних ресурсів, є економічним, безпечним способом безвідходної комплексної переробки сировини, яка дозволяє з одного виду сировини отримати дві фармакологічно активні субстанції з широким спектром дії, має високий вихід цільового продукту.