Спосіб детекції proteus vulgaris та proteus mirabilis

Спосіб детекції бактерій роду Proteus за допомогою полімеразної ланцюгової реакції шляхом створення набору родоспецифічних праймерів, які відрізняються тим, що використовують праймери, що складаються з таких послідовностей: Рr1 5'- gta gaa acg ctg atg aat gag aag ctg gt - 3' Pr2 5'- cgt cag cgc caa ttt agg gcc a - 3' Pr3 5' - gtc gga cac gag cag etc gc - 3' (19) (21) 20040604513 (22) 10.06.2004 (24) 10.09.2007 (46) 10.09.2007, Бюл. № 14, 2007 р. (72) Циганенко Анатолій Якович, Лиманська Ольга Юріївна, Лиманський Олександр Петрович, Мінухін Валерій Володимирович (73) Харківський державний медичний університет (56) UA A 66255, 15.04.2004 Samra Z., Heifetz M., Talmor J., Bain E., Bahar J. Evalution of use of a new chromogenic agar in 3 80264 4 gene expression by uropathogenic Proteus mirabilis цифічності розробленого способу детекції. during experimental ascending urinary tract infection Найбільш близьким є спосіб детекції протеїв, // Infect. Immun. -1998. - V.66, N1. - P.330-335], зазаснований на можливості утворення мікроорганіснований на візуалізації комплексу, що утворений змами забарвлених колоній на хромогенному сегеном, який кодує зелений флуоресцентний білок редовищі Chromagar orientation внаслідок взаємо(GFP), та активатором транскрипції Ure R P. дії родо- та видоспецифічних білків з відповідним mirabilis. Недоліком цього способу типування хромогенним субстратом [Samra Z., Heifetz Μ., P.mirabilis є нестабільність комплексу Ure R-GFP і, Talmor J., Bain E., Bahar J. Evaluation of use of a як наслідок, неможливість отримання коректного new chromogenic agar in detection of urinary tract результату аналізу. Існує спосіб детекціїР. penneri pathogens // J. of Clinical Microbiology. - 1998. [Hoffmann G., Gajdos G., Czako M. et al. Diversity V.36, No.4. - P.990-994]. Можливості застосування among clinical isolates of Proteus penneri detected by хромогенного середовища Chromagar orientation random amplified polymorphic DNA analysis // Zenдля детекції та диференціації мікроорганізмів було tralbl. Bacteriol. - 1998. - V.288, N3. - P.351-360]. В оцінено для грампозитивних та грамнегативних основі цього способу є дослідження плазмідного патогенних мікроорганізмів, зокрема Proteus sp., профілю бактерій за допомогою ПЛР з довільно на 900 клінічних зразках сечі від госпіталізованих вибраними короткими праймерами, що ампліфікухворих. Характеристики нового хромогенного сеють випадкові фрагменти геному P.penneri, та наредовища були оцінені у порівнянні з характерисступним ПДРФ-аналізом (поліморфізм довжини тиками трипсиново-го сойового агару з 5%-ою крорестрикційних фрагментів). Було показано, що всі в'ю вівці та агару MacConkey, що протягом штами, які досліджували, містили дві великі плазбагатьох років використовують для детекції патоміди розміром приблизно 60 та 70 тисяч пар нукгенів сечового тракту людини. Було показано, що леотидів (пн). Крім того, чотири штами мали малеChromagar orientation при детекції мікроорганізмів ньку плазміду ~ 6 тисяч пн. Істо тнім недоліком виявляє такі ж самі можливості, як і комбінація вище згаданого способу є те, що він базується на двох ви щезгаданих середовищ. Середовище, що виявленні плазмідної, тобто екстрахромосомної, пропонується, дозволяє детектувати бактерії ДНК. Це не дозволяє проводити надійну детекцію Proteus sp., оскільки вони утворюють характерні бактерій, оскільки плазмідні профілі можуть змінюколонії коричневого кольору на дифузному фоні. ватися з часом, а плазміди, що повністю відрізняНедоліком цього способу детекції Proteus sp. є ються, можуть бути однакового розміру. Тому інші його недостатньо висока специфічність, а саме молекулярно-біологічні методи, що дозволяють неможливість диференціювати Proteus mirabilis від детектувати хромосомну ДНК Proteus sp., замінили близько спорідненого виду Morganella morgami, цей один з перших методів молекулярного аналізу оскільки ці бактерії утворюють після 18-24 годин геному бактерій. інкубації на хромогенному середовищі колонії одІснує спосіб детекції протеїв на основі біохімінакової морфології та кольору. Внаслідок цього чних та молекулярно-генетичних методів, в тому виникає необхідність проведення додаткового біочислі на основі ПЛР [Mansy Μ., Fadl Α., Ashour M., хімічного тесту на індол, що. значно ускладнює та Khan Μ. Amplification of Proteus mirabilis подовжує процедуру детекції протеїв. chromosomal DNA using the polymerase chain reacУ зв'язку з ви щевикладеним в основу винаходу tion // Molecular and Cellular Probes. -1999. - V.13. покладено задачу підвищення надійності виявленP.133-140]. В даній роботі було досліджено 89 ня протеїв шляхом забезпечення родоспецифічної штамів різних бактерій, в тому числі 7 штамів детекції Proteus sp. Задача, яку покладено в осноР.vulgaris та 18 штамів P.mirabilis. Для проведення ву винаходу, вирішується тим, що у відомому споПЛР використовували сконструйовані на основі собі детекції протеїв за допомогою полімеразної знання послідовності рекомбінантного клонованоланцюгової реакції шляхом створення набору рого фрагмента ДНК P.mirabilis праймери ММКАР1 доспецифічних праймерів, згідно з винаходом, та ММКАР2, що мали однакову температуру плаввикористовують праймери, що складаються з талення і характеризувалися відсутністю самокомпких послідовностей: лементарних ділянок. Праймери, що пропонуютьРrі 5'- gta gaa acg ctg atg aat gag aag ctg gt - 3' ся, дозволяли визначати фрагмент бактеріальної Pr2 5'- cgt cag cgc caa ttt agg gcc a - 3' ДНК довжиною 3500пн. Мінімальна кількість ДНК, Рr3 5' - gtc gga cac gag cag etc gc - 3' що детектували, складала 10фг. В той же час у цій При розробці набору праймерів було проанароботі було продемонстровано, що оскільки набір лізовано різні гени Proteus sp. - гени, що кодують праймерів ММКАР1-ММКАР2 є видоспецифічним гіразу, сечовину, плазмідну та хромосомну bдо бактерій P.mirabilis, результати ПЛР-аналізу лактамази, 16S РНК, фрагменти яких можуть бути для інших представників родини мішенями для родоспецифічної детекції протеїв. Enterobacteriaceae були негативними, в тому числі Незважаючи на те, що в базах даних для 7 штамів P.vulgaris, 5 штамів P.penneri та одEMBL/GenBank/DDBJ присутня достатньо велика ного ізоляту P.myxofaciens. Таким чином було підкількість секвенованих генів та фрагментів штамів тверджено специфічність сконструйованих прайР.mirabilis (понад 150 ізолятов), P.vulgaris (понад мерів для детекції P.mirabilis. Недоліком даної 100 ізолятів), інших близькоспоріднених бактерій роботи є відсутність секвенованої послідовності [Morganella sp., Providencia sp.], на момент провеампліфікованого фрагменту ДНК Р.mirabilis у базах дення комп'ютерного аналізу було відомо тільки 4 даних EMBL, GenBank та DDBJ, що робить немоізоляти Р.реnnеrі. Враховуючи вищенаведене, ген жливим теоретичну перевірку послідовностей gyrB, що кодує b-суб'одиницю гірази, був вибраний створених праймерів, а також надійності та спеяк мішень для праймерів. Кількість же ізолятів 5 80264 6 протеїв, що мають спільні фрагменти вибраного Приклад 1. маркерного гена, значно менше. Так, наприклад, Множинне вирівнювання висококонсервативдля gyrB гена нами було вибрано тільки 2 ізоляти ного фрагмента gyrB гена, що кодує b-суб'одиницю P.mirabilis [AJ300546 та AJ300506] та один ізолят гірази, для 2 ізолятів P.mirabilis та одного ізоляту P.vulgaris [AJ300544], для яких були відомі спільні P.vulgaris. Представлено один з розроблених секвеновані послідовності. праймерів (РгI) для родоспецифічної детекції проНезважаючи на те, що gyrB ген має достатню теїв. Для ізолятів наведено номери у базах даних дискримінуючу потужність для диференціації блиEMBL/GenBank/ DDBJ. Точками показано нуклеозькоспоріднених видів та підвидів, нами були витиди, що збігаються з консенсусною послідовністю значені консервативні фрагменти gyrB гена, спеізоляту P.mirabilis AJ300546, а маленькими буквацифічні тільки для бактерій роду Proteus у ми - некомплементарні нуклеотиди для комплекса порівнянні з іншими ентеробактеріями. праймер - однонитковий амплікон. За допомогою комп'ютерного та термодинамічного аналізу було створено два набори родоспецифічних праймерів Prl-Pr2 та Prl-Рг3, які дозволяють ампліфікувати фрагмент геца gyrB, що кодує b-суб'одиницю гірази, хромосомної ДНК P.vulgaris довжиною 186 пар нуклеотидів та 109 пн Приклад 2 відповідно. Розроблені набор праймерів було тесДетекція продуктів ампліфікації фрагмента товано на шести лабораторних та клінічних штахромосомної ДНК протеїв після проведення полімах P.mirabilis та P.vulgaris, люб'язно наданих меразної ланцюгової реакції з родоспецифічними Salmonella Genetic Stock Centre [SGSC, Канада]. праймерами Prl-Рr3 та електрофорезу у 2% агароЗа допомогою стандартної ПЛР з наборами прайзному гелі. 1-100 пн маркер молекулярної маси; мерів Prl-Pr2 та Prl-Рг3 амплікони очікуваної дов2,3 - негативний контроль ампліфікації; 4, 5 - положини 186 пн та 109пн було детектовано як для си, що відповідають амплікону довжиною 109 пн штамів P.vulgaris, так і для ізолятів P.mirabilis. Родля клінічного ізоляту P.mirabilis та лабораторного доспецифічні праймери Prl-Pr2 оптимізовано таштама P.vulgaris ATCC 13315 відповідно. ким чином, що можливе проведення мультиплексної ПЛР з видоспецифічними праймерами. Винахід, що пропонується, ілюстровано конкретними прикладами. Таким чином, у даному винаході представлено два набори праймерів для полімеразної ланцюгової реакції для родоспецифічної детекції протеїв, які дозволяють за допомогою стандарт Комп’ютерна в ерстка В. Мацело ної ПЛР детектувати широко розповсюджені патогени сечового тракту людини Proteus mirabilis та P.vulgaris та Р.реnnеrі. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601