Комбінація інгібітору фосфатидилінозит-3-кінази (pi3k) і інгібітору mtor

Реферат: Винахід стосується застосування сполуки 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти або її фармацевтично прийнятної солі і інгібітору mTOR - еверолімусу (RAD001) або його фармацевтично прийнятної солі для одержання лікарського засобу для лікування захворювання, залежного від мішені рапаміцину (mTOR) кінази у ссавців, де вказане залежне від мішені рапаміцину (mTOR) кінази захворювання у ссавців являє собою рак. UA 110961 C2 (12) UA 110961 C2 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до фармацевтичної комбінації, що включає сполуку-інгібітор фосфатидилінозит-3-кінази (PI3K), яка є похідним 2-карбоксамідциклоаміносечовини , або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один інгібітор мішені рапаміцину (mTOR) у ссавців або його фармацевтично прийнятну сіль; фармацевтичної композиції, що містить таку комбінацію; і до застосування такої комбінації при лікування проліферативних захворювань, більш краще захворювань, залежних від мішені рапаміцину (mTOR ) кінази у ссавців. Рівень техніки Показано, що інгібування мішені рапаміцину (mTOR ) у ссавців може індукувати передачу сигналу розташованого вище рецептора інсулінподібного фактору росту 1 (IGF-1R), що приводить до активації AKT у ракових клітинах . Припускають, що це явище відіграє роль в ослабленні клітинних відповідей на інгібування mTOR і може зменшувати клінічну активність інгібіторів mTOR . Наприклад, збільшення вмісту pAKT виявлене приблизно у 50% пухлин у всіх пацієнтів у фазі I дослідження пацієнтів, у яких є запущені солідні пухлини (Taberno et al., Journal of Clinical Oncology, 26 (2008), pp. 1603-1610). Незважаючи на наявність численних засобів лікування проліферативного захворювання у пацієнтів, зберігається необхідність в ефективних і безпечних терапевтичних засобах і необхідність у їх кращому використанні в комбінованій терапії. Сполуки формули (A), запропоновані в даному винаході, які включають 1-(4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл)амід 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти, є високоселективними інгібіторами ізоформи альфа-фосфатидилінозит-кінази (PI3K). Несподівано було виявлено, що комбінація ефективної кількості альфа-специфічного інгібітору PI3K, сполуки формули (A), з ефективною кількістю щонайменше одного інгібітору mTOR приводить до несподіваного синергічного поліпшення при лікуванні захворювань, залежних від мішені рапаміцину (mTOR ) у ссавців, особливо раку. При введенні одночасно, послідовно або роздільно альфа-специфічний інгібітор PI3K і інгібітор mTOR винаходу взаємодіють і значно інгібують проліферацію клітин. Ця сприятлива взаємодія дає можливість зменшити необхідну дозу кожної сполуки, що приводить до зменшення побічних ефектів і збільшення тривалої клінічної ефективності сполук при лікуванні. Суть винаходу Згідно з даним винаходом виявлено, що альфа-ізоформа специфічного інгібітору фосфатидилінозит-3-кінази (PI3K) - сполуки формули (A), або її фармацевтично прийнятна сіль зменшує або блокує фосфорилювання і активацію AKT інгібіторами mTOR. Відповідно до цього даний винахід відноситься до фармацевтичної комбінації, що включає сполуку формули (A) або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль. У кращому варіанті здійснення сполукою формули (A), запропонованою у даному винаході, є 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1"). У кращому варіанті здійснення інгібітор mTOR, запропонований у даному винаході, вибраний із групи, що складається з RAD рапаміцину (сиролімус) і його похідних/аналогів, таких як еверолімус (RAD001), темсиролімус (CCI-779), зотаролімус (ABT578), SAR543, аскоміцин (етильний аналог FK506), деферолімус (AP23573/MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132 і EM101/LY303511. Одним аспектом даного винаходу є фармацевтична комбінація, що включає сполуку формули (A) або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль, для застосування при лікуванні або попередженні захворювання, залежного від кінази mTOR . Іншим аспектом даного винаходу є застосування сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі і щонайменше одного інгібітору mTOR або його фармацевтично прийнятної солі для одержання лікарського засобу для лікування або попередження захворювання, залежного від кінази mTOR . Іншим аспектом даного винаходу є спосіб лікування або попередження захворювання, залежного від кінази mTOR, шляхом уведення сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі і щонайменше одного інгібітору mTOR або його фармацевтично прийнятної солі. Іншим аспектом даного винаходу є комбінація сполуки формули (A) і щонайменше одного інгібітору mTOR, вибраного із групи, що складається з RAD рапаміцину (сиролімус) і його 1 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 похідних/аналогів, таких як еверолімус (RAD001), темсиролімус (CCI-779), зотаролімус (ABT578), SAR543, аскоміцин (етильний аналог FK506), деферолімус (AP23573/MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132 і EM101/LY303511, де активні інгредієнти в кожному випадку присутні у вільній формі або у формі фармацевтично прийнятної солі, і необов'язково щонайменше одного фармацевтично прийнятного носія для одночасного, роздільного або послідовного застосування при лікуванні захворювань, залежних від мішені рапаміцину (mTOR) кінази у ссавців. Іншим аспектом даного винаходу є спосіб зменшення або блокування фосфорилювання і активації AKT інгібіторами mTOR, що включає введення теплокровній тварині, яка цього потребує, сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі. В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до способу лікування проліферативного захворювання, залежного від набутого фосфорилювання і активації AKT під час лікування щонайменше одним інгібітором mTOR або його фармацевтично прийнятною сіллю, що включає введення теплокровній тварині, яка цього потребує, терапевтично ефективної кількості сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі. В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до способу лікування проліферативного захворювання, яке стало резистентним або має зменшену чутливість до лікування щонайменше одним інгібітором mTOR або його фармацевтично прийнятною сіллю, що включає введення теплокровній тварині, яка цього потребує, терапевтично ефективної кількості сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі. Резистентність обумовлена, наприклад, фосфорилюванням і активацією AKT. Іншим аспектом даного винаходу є спосіб підвищення ефективності лікування проліферативного захворювання щонайменше одним інгібітором mTOR або його фармацевтично прийнятною сіллю, що включає введення теплокровній тварині, яка цього потребує, комбінації, що включає сполуку формули (A) або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль. Одним аспектом даного винаходу є фармацевтична композиція, що містить інгібітор PI3K, сполуку формули (A) або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль. Докладний опис винаходу На фіг. 1 представлені ступені фосфорилювання AKT (S473); MAPK (T202/Y204); MEK1/2 (S217/S221) і вмісту актину в присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}аміду) 2аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1") і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах BT474 пухлини молочної залози, визначені аналізом вестерн-блотингу. На фіг. 2 представлені ступені фосфорилювання AKT (S473) у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах BT474 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази. На фіг. 3 представлені ступені фосфорилювання AKT (T308) у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах BT474 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази. На фіг. 4 представлені повні ступені експресії AKT у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах BT474 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази. На фіг. 5 представлені ступені фосфорилювання AKT (S473); MAPK (T202/Y204) і вмісту актину в присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, визначені аналізом вестерн-блотингу. На фіг. 6 представлені ступені фосфорилювання AKT (S473) у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази. На фіг. 7 представлені ступені фосфорилювання AKT (T308) у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази. 2 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На фіг. 8 представлені повні ступені експресії AKT у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази. На фіг. 9 представлені ступені фосфорилювання AKT (S473) (діаграма A) і повні вмісти AKT (діаграма B) у присутності еверолімусу (RAD001) і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, визначені шляхом вестернблотингу і додатково кількісно визначені шляхом програмного забезпечення Quantity One у другій групі експериментів. На фіг. 10 представлені ступені фосфорилювання AKT (S473) у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази в другій групі експериментів. На фіг. 11 представлені ступені фосфорилювання AKT (T308) у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази в другій групі експериментів. На фіг. 12 представлені повні ступені експресії AKT у присутності тільки одного засобу еверолімусу (RAD001), тільки одного засобу сполуки 1 і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 при порівнянні з розріджувачем як контролем в клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази в другій групі експериментів. На фіг. 13 наведені дані для матриці повної дози для проліферації клітин, отримані шляхом обробки засобом окремо і разом з еверолімусом (RAD001) і/або сполукою 1 на моделях клітин SKBR-3 раку молочної залози людини. На фіг. 14 наведені дані для матриці повної дози для проліферації клітин, отримані шляхом обробки засобом окремо і разом з еверолімусом (RAD001) і/або сполукою 1 на моделях клітин BT-474 раку молочної залози людини. На фіг. 15 наведені дані для матриці повної дози для проліферації клітин, отримані шляхом обробки засобом окремо і разом з еверолімусом (RAD001) і/або сполукою 1 на моделях клітин T47-d раку молочної залози людини. На фіг. 16 наведені дані для матриці повної дози для проліферації клітин, отримані шляхом обробки засобом окремо і разом з еверолімусом (RAD001) і/або сполукою 1 на моделях клітин ZR-75-1 раку молочної залози людини. Докладний опис винаходу Даний винахід відноситься до фармацевтичної комбінації, що включає (a) сполуку формули (A), як визначено в даному винаході, або її фармацевтично прийнятну сіль і (b) щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль. У даному описі використовуються наведені нижче визначення, якщо не зазначене інше: Терміни "що містить" і "що включає" використовуються в даному винаході у значенні, що допускає зміну в необмеженому сенсі, якщо не зазначено інше. При використанні у даному винаході (особливо у формулі винаходу) терміни, що використовуються в однині, включають як однину, так і множину, якщо в даному винаході не зазначено інше, і якщо це явно не суперечить контексту. Якщо для сполук, солей і т.п. використовується форма множини, це також означає і одну сполуку, сіль і т.п. "Комбінація" означає фіксовану комбінацію в одній одиничній дозованій формі або наборі компонентів для комбінованого введення, при якій сполука формули (A) і компонент комбінації (наприклад, інший лікарський засіб, як зазначено нижче, що також називається "компонентом комбінації" або "терапевтичним засобом") можна незалежно вводити одночасно або окремо через визначені проміжки часу, особливо, якщо ці проміжки часу дають можливість компонентам комбінації виявляти спільний, наприклад, синергічний вплив. "Фармацевтична комбінація" при використанні у даному винаході означає продукт, отриманий змішуванням або комбінуванням більше одного активного інгредієнта, і включає фіксовані й нефіксовані комбінації активних інгредієнтів. Термін "фіксована комбінація" або "фіксована доза" означає, що активні інгредієнти, наприклад, сполука формули (A) і компонент комбінації, обидва вводять пацієнту одночасно у вигляді однієї форми або дози. Термін "нефіксована комбінація" означає, що активні інгредієнти, наприклад, сполука формули (I) і компонент комбінації, обидва вводять пацієнту у вигляді окремих форм спільно, одночасно або 3 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 послідовно без установлених тимчасових обмежень, і таке введення забезпечує терапевтично ефективні вмісти цих двох сполук в організмі теплокровної тварини, яка цього потребує. Останнє також відноситься до змішаного лікування, наприклад, введення трьох або більше активних інгредієнтів. Термін "інгібітор фосфатидилінозит-3-кінази" у даному винаході визначений як такий, що означає сполуку, яка вибірково діє, зменшує вміст або інгібує PI 3-кіназу. Показано, що активність PI 3-кінази у відповідь на цілий ряд стимулюючих гормональних факторів і факторів росту, включаючи інсулін, тромбоцитарний фактор росту, інсуліноподібний фактор росту, епідермальний фактор росту, колонієстимулюючий фактор і гепатоцитарний фактор росту та бере участь у процесах, пов'язаних з ростом і трансформацією клітин. Термін "фармацевтична композиція" у даному винаході визначений як такий, що означає суміш або розчин, що містить щонайменше один активний інгредієнт або терапевтичний засіб для введення теплокровній тварині, наприклад, ссавцеві або людині, для попередження або лікування конкретного захворювання або патологічного стану, яким страждає теплокровна тварина. Термін "фармацевтично прийнятне" у даному винаході визначений як такий, що означає такі сполуки, матеріали, композиції і/або дозовані форми, які з погляду медичних норм застосовні для взаємодії з тканинами теплокровної тварини, наприклад, ссавця або людини, без прояву надмірної токсичності, подразнення, алергійної реакції й інших ускладнень у комбінації з прийнятним співвідношенням користь/ризик. Вислів "терапевтично ефективна кількість" використовується в даному винаході для позначення кількості, достатньої для такого, що складає щонайменше приблизно 15%, краще щонайменше приблизно 50%, ще краще щонайменше приблизно 90% ослаблення клінічно значимого дефіциту активності, функції і відповіді теплокровної тварини, яка цього потребує, ще краще його попередження. Альтернативно, терапевтично ефективна кількість достатня для забезпечення поліпшення клінічно значимого стану/симптому теплокровної тварини, яка цього потребує. Термін "лікування", "лікувати" при використанні у даному винаході включає лікування, полегшення, зменшення прояву або ослаблення щонайменше одного симптому у суб'єкта або затримку прогресування захворювання. Наприклад, лікування може приводити до ослаблення одного або більше симптомів порушення або повне усунення порушення, такого як рак. У даному винаході термін "лікування" також означає зупинку, затримку початку (тобто період до клінічного прояву захворювання) і/або зменшення небезпеки розвитку або погіршення протікання захворювання. Термін "захист" використовують у даному винаході для позначення затримки або лікування, або, якщо це прийнятно, розвитку, продовження або погіршення захворювання у суб'єкта. Термін "попередження", "попереджати" при використанні в даному винаході включає попередження щонайменше одного симптому, пов'язаного з патологічним станом, що попереджується, захворюванням або порушенням або викликаного ним. Термін "спільно терапевтично активні" або "спільний терапевтичний ефект" при використанні у даному винаході означає, що сполуки можна вводити окремо (хронологічно почерговим шляхом, переважно послідовно-специфічним шляхом) через такі проміжки часу, що вони, переважно у теплокровній тварині, переважно людині, що зазнає лікування, все-таки виявляють (переважно синергічну) взаємодію (спільний терапевтичний ефект). Спільний терапевтичний ефект, зокрема, можна виявити по визначенню вмістів у крові, яке проводиться щонайменше через деякі проміжки часу, які показують, що обидві сполуки містяться в крові людини, що зазнає лікування. В WO 2010/029082 описані конкретні похідні 2-карбоксамідциклоаміносечовини, для яких виявлено, що вони мають інгібуючу активність у відношенні PI 3-кіназ (фосфатидилінозит-3кіназ). Ці специфічні інгібітори фосфатидилінозит-3-кінази (PI3K) мають корисні фармакологічні характеристики і виявляють поліпшену селективність у відношенні PI 3-кінази альфа у порівнянні з підтипами бета і/або дельта, і/або гама. Конкретні похідні 2карбоксамідциклоаміносечовини, які є прийнятними для даного винаходу, їх одержання і придатні препарати, що їх містять, описані в WO 2010/029082 і включають сполуки формули (A): 55 4 UA 110961 C2 або їх фармацевтично прийнятну сіль, де A означає гетероарил, вибраний із групи, що складається з: 5 1 10 15 20 25 30 35 40 45 R означає один з наступних замісників: (1) незаміщений або заміщений, переважно заміщений C1-C7алкіл, де зазначені замісники незалежно обрані з одного або більше, переважно одного-дев'яти наступних фрагментів: дейтерію, фтору або одного-двох наступних фрагментів: C3-C5циклоалкілу; (2) необов'язково заміщений C3-C5циклоалкіл, де зазначені замісники незалежно обрані з одного або більше, переважно одного-чотирьох наступних фрагментів: дейтерію, C1-C4алкілу (переважно метилу ), фтору, ціаногрупи, амінокарбонілу; (3) необов'язково заміщений феніл, де зазначені замісники незалежно обрані з одного або більше, переважно одного-двох наступних фрагментів: дейтерію, галогену, ціаногрупи, C 1-C7алкілу, C1C7алкіламіногрупи, ди(C1-C7алкіл)аміногрупи, C1-C7алкіламінокарбонілу, ди(C1C7алкіл)амінокарбонілу, C1-C7алкоксигрупи; (4) необов'язково моно- або дизаміщений амін, де зазначені замісники незалежно обрані з наступних фрагментів: дейтерію, C 1-C7алкілу (який є незаміщеним або заміщеним одним або більше замісниками, обраними із групи, що складається з дейтерію, фтору, хлору, гідроксигрупи), фенілсульфонілу (який є незаміщеним або заміщеним одним або більше, переважно одним C1-C7алкілом, C1-C7алкоксигрупою, ди(C1-C7алкіл)аміно-C1C7алкоксигрупою); (5) заміщений сульфоніл, де зазначений замісник вибраний з наступних фрагментів: C1-C7алкілу (який є незаміщеним або заміщеним одним або більше замісниками, обраними із групи, що складається з дейтерію, фтору), піролідинової групи (яка є незаміщеною або заміщеною одним або більше замісниками, обраними із групи, що складається з дейтерію, гідроксигрупи, оксогрупи; переважно однієї оксогрупи); (6) фтор, хлор; 2 R означає водень; 3 R означає (1) водень, (2) фтор, хлор, (3) необов'язково заміщений метил, де зазначені замісники незалежно обрані з одного або більше, переважно одного-трьох наступних фрагментів: дейтерію, фтору, хлору, диметиламіногрупи; за винятком 1-({5-[2-(трет-бутил)піримідин-4-іл]-4-метилтіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)піролідин-1,2-дикарбонової кислоти. Радикали і символи, що використовуються у визначенні сполуки формули (A), мають значення, розкриті в WO 2010/029082, і ця публікація у всій своїй повноті включена в даний опис шляхом посилання. Кращою сполукою даного винаходу є сполука, яка спеціально описана в WO 2010/029082. Ще кращою сполукою даного винаходу є 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти (сполука 1) або її фармацевтично прийнятна сіль. Синтез 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}аміду) 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти описаний в WO 2010/029082 як приклад 15. Фармацевтичні комбінації даного винаходу включають щонайменше одну сполуку, яка спрямовано впливає, зменшує або інгібує активність/функцію серин/треонинкінази mTOR. Такі сполуки будуть називатися "інгібітор mTOR" і включають, але не обмежуються ними, сполуки, білки або антитіла, які спрямовано впливають/інгібує активність/функцію представників сімейства кіназ mTOR , наприклад, RAD рапаміцин (сиролімус, який також відомий за назвою РАПАМУН) і його похідні/аналоги, такі як еверолімус (RAD001, Novartis) або сполуки, які 5 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 інгібують активність кінази mTOR шляхом прямого зв'язування зі зв’язуючим АТФ (аденозинтрифосфат) поглибленням у ферменті. Еверолімус (RAD001) також відомий за назвою ЦЕРТИКАН або АФІНІТОР. Придатні інгібітори mTOR включають, наприклад: I. Рапаміцин, який є імунодепресивним лактамним макролідом, що продукується Streptomyces hygroscopicus. II. Похідні рапаміцину, такі як: a. заміщений рапаміцин, наприклад, 40-o-заміщений рапаміцин наприклад, описаний в US 5258389, WO 94/09010, WO 92/05179, US 5118677, US 5118678, US 5100883, US 5151413, US 5120842, WO 93/11130, WO 94/02136, WO 94/02485 і WO 95/14023, які всі включені в даний винахід шляхом посилання; b. 16-o-заміщений рапаміцин, наприклад, розкритий в WO 94/02136, WO 95/16691 і WO 96/41807, зміст яких включений в даний винахід шляхом посилання; c. 32-гідрований рапаміцин, наприклад, описаний в WO 96/41807 і US 5256790, які включені в даний винахід шляхом посилання; d. кращі похідні рапаміцину, якими є сполуки формули (B): де R1 означає CH3 або C3-C6алкініл , R2 означає H або -CH2-CH2-OH, 3-гідрокси-2-(гідроксиметил)-2-метилпропаноїл або тетразоліл, і X означає =O, (H,H) або (H,OH), за умови, що R2 не означає H, якщо X означає =O, і R1 означає CH3, або її проліки, де R2 означає -CH2-CH2-OH, наприклад, його фізіологічно здатний до гідролізу простий ефір. Сполуки формули (B) розкриті, наприклад, у міжнародних заявках PCT WO 94/09010, WO 95/16691 або WO 96/41807, які включені в даний винахід шляхом посилання. Їх можна одержати, як розкрито в зазначених публікаціях, або за аналогією з описаними в них методиками. Кращими сполуками є 32-дезоксорапаміцин, 16-пент-2-інілокси-32-дезоксорапаміцин, 16пент-2-інілокси-32(S)-дигідрорапаміцин, 16-пент-2-інілокси-32(S)-дигідро-40-O-(2гідроксиетил)рапаміцин і, ще краще, 40-O-(2-гідроксиетил )рапаміцин, розкритий як приклад 8 у міжнародній заявці PCT WO 94/09010. Особливо кращим похідними рапаміцину формули (B) є 40-O-(2-гідроксиетил)рапаміцин, 40[3-гідрокси-2-(гідроксиметил)-2-метилпропаноат]рапаміцин (також позначуваний, як CCI779), 40епі(тетразоліл)рапаміцин (також позначуваний, як ABT578), 32-дезоксорапаміцин, 16-пент-2інілокси-32(S)-дигідрорапаміцин або TAFA-93. e. Похідні рапаміцину також включають так звані рапалоги, наприклад, розкриті в міжнародних заявках PCT WO98/02441 і WO01/14387, наприклад, AP23573, AP23464 або AP23841. Виявлено, що рапаміцин і похідні, здатні внаслідок активності, що спостерігається, зв'язуватися, наприклад, з макрофіліном-12 (також відомим, як білок, що зв'язує FK-506, або FKBP-12), наприклад, як описано в міжнародних заявках PCT WO 94/09010, WO 95/16691 або WO 96/41807, застосовні, наприклад, як імуносепресант, наприклад, для лікування гострого відторгнення алотрансплантату. III. Аскоміцин, який є етильним аналогом FK506. IV. AZD08055 (Astrazeneca) і OSI-027 (OSI Pharmaceuticals), які являють собою сполуки, які інгібують активність кінази mTOR шляхом прямого зв'язування зі зв’язуючим АТФ поглибленням у ферменті. 6 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 V. SAR543, деферолімус (AP23573/MK-8669, Ariad/Merck & Co.), AP23841 (Ariad), KU0063794 (AstraZeneca /Kudos), INK-128 (Intellikine), EX2044, EX3855, EX7518, WYE-125132 (Wyeth), XL765 (Exelisis), NV-128 (Novogen), WYE-125132 (Wyeth), EM101/LY303511 (Emiliem). Для даного винаходу кращим інгібітором mTOR є еверолімус (RAD001). Еверолімус (RAD001) має хімічну назву ((1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R, 21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)1,18-дигідрокси-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-гідроксиетокси)-3-метоксициклогексил]-1метилетил}-19,30-диметокси-15,17,21,23,29,35-гексаметил-11,36-диокса-4азатрицикло[30.3.1.04,9]гексатриаконта-16,24,26,28-тетраен-2,3,10,14,20-пентаон). Еверолімус і його аналоги описані в патенті США 5665772, від стовпця 1, рядок 39 до стовпця 3, рядок 11. Структура активних агентів, у яких є кодові номери, родові або торговельні назви, наведена в останньому виданні довідника "The Merck Index" і в базах даних, наприклад, Patents International (наприклад, IMS World Publications). Відповідний їхній зміст включений у даний винахід шляхом посилання. В обсяг даного винаходу також входять їх фармацевтично прийнятні солі, відповідні рацемати, диастереоізомери, енантіомери, таутомери, а також відповідні кристалічні модифікації розкритих вище сполук (тобто сполук формули (A) і інгібіторів mTOR), якщо вони присутні, наприклад, сольвати, гідрати і поліморфні форми, які розкриті в даному винаході. Сполуки, що застосовуються як активні інгредієнти у комбінаціях, запропонованих у даному винаході, можна одержати і увести, як описано в цитованих документах, відповідно. В обсяг даного винаходу також входить комбінація більше двох окремих активних інгредієнтів, зазначених вище, тобто фармацевтична комбінація, що входить в обсяг даного винаходу, може включати три активні інгредієнти або більше. В одному варіанті здійснення даний винахід відноситься до фармацевтичної комбінації, що включає сполуку формули (A), або, більш конкретно, 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1"), або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль. В одному варіанті здійснення даний винахід відноситься до фармацевтичної комбінації, що включає сполуку формули (A), або, більш конкретно, 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1"), або її фармацевтично прийнятну сіль і інгібітор mTOR еверолімус (RAD001) або його фармацевтично прийнятну сіль. Фармацевтичні комбінації даного винаходу корисні при лікуванні або попередженні захворювання, залежного від кінази mTOR, у теплокровної тварини, що цього потребує. Таким чином, одним аспектом даного винаходу є фармацевтична комбінація, що включає сполуку формули (A), або, більш конкретно, 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1"), або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль, для застосування при лікуванні або попередженні захворювання, залежного від кінази mTOR . Термін "захворювання, залежні від кінази mTOR" включають, але не обмежуються ними, наступні: відторгнення трансплантата органа або тканини, наприклад, при лікуванні реципієнтів трансплантатів, наприклад, серця, легенів, об'єднаних серця-легенів, печінки, нирок, підшлункової залози, шкіри або роговиці; реакція "трансплантат проти хазяїна", така як після трансплантації кісткового мозку; рестеноз; синдроми гамартоми, такі як туберозний склероз або хвороба Коудена; лімфангіолейоміоматоз; пігментозний ретиніт; аутоімунні захворювання, включаючи енцефаломієліт, інсулінозалежний цукровий діабет, вовчак, дерматоміозит, артрит і ревматичні захворювання; стійкий до стероїдів гострий лімфобластний лейкоз; фіброзні захворювання, включаючи склеродермію, фіброз легенів, фіброз нирок, муковісцидоз; легеневу гіпертензію; імуномодуляцію; розсіяний склероз; синдром фон Хіппеля-Ліндау; комплекс Карні; 7 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сімейний аденоматозний поліпоз; синдром юнацького поліпозу; синдром Берта-Хогга-Дьюка; сімейну гіпертрофічну кардіоміопатію; синдром Вольфа-Паркінсона-Уайта; нейродегенеративні порушення, такі як хвороба Паркінсона, Гентінгтона, Альцгеймера і слабоумство, викликане мутаціями tau, спинально-церебелярна атаксія типу 3, бічний аміотрофічний склероз, викликаний мутаціями SOD1, неврональний цероїдліпофусциноз/хвороба Баттена (нейродегенеративне захворювання у дітей); мокру і суху дегенерацію жовтої плями; м'язову слабість (атрофія, кахексія) і міопатії, такі як хвороба Данона; бактеріальні і вірусні інфекції, включаючи M. tuberculosis, стрептокок групи A, вірус герпеса типу 1, інфекція ВІЛ (вірус імунодефіциту людини); нейрофіброматоз, включаючи нейрофіброматоз типу 1; синдром Пейтца-Егерса. Крім того, "захворювання, залежні від кінази mTOR " включають проліферативні захворювання, такі як ракові захворювання та інші споріднені злоякісні новотвори. Необмежуючий перелік ракових захворювань, пов'язаних з патологічними каскадами передачі сигналів mTOR включає рак молочної залози, нирковоклітинну карциному, пухлини кишечнику, нейроендокринні пухлини, лімфоми і рак передміхурової залози. Прикладами проліферативного захворювання є, наприклад доброякісна або злоякісна пухлина, карцинома головного мозку, нирок, печінки, надниркових залоз, жовчного міхура, молочної залози, шлунка, пухлини кишечнику, яєчників, товстої кишки, прямої кишки, передміхурової залози, підшлункової залози, легенів, піхви або щитовидної залози, саркома, гліобластома, множинна мієлома або шлунково-кишковий рак, переважно карцинома товстої кишки або колоректальна аденома, або пухлина голови і шиї, гіперпроліферація епідермісу, псоріаз, гіперплазія передміхурової залози, неоплазія, неоплазія епітеліального характеру, лімфоми, карцинома молочної залози або лейкоз. Іншим аспектом даного винаходу є застосування сполуки формули (A), або, зокрема, 1-({4метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин1,2-дикарбонової кислоти (сполука 1) або її фармацевтично прийнятної солі і щонайменше одного інгібітору mTOR або його фармацевтично прийнятної солі для одержання лікарського засобу для лікування або попередження захворювання, залежного від кінази mTOR . Іншим аспектом даного винаходу є спосіб лікування або попередження захворювання, залежного від кінази mTOR, шляхом уведення сполуки формули (A), або, зокрема, 1-({4-метил5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин-1,2дикарбонової кислоти (сполука 1), або її фармацевтично прийнятної солі і щонайменше одного інгібітору mTOR або його фармацевтично прийнятної солі. Іншим аспектом даного винаходу є комбінація сполуки формули (A), або, зокрема, 1-({4метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин1,2-дикарбонової кислоти (сполука 1), і щонайменше одного інгібітору mTOR, вибраного із групи, що складається з RAD рапаміцину (сиролімус) і його похідних/аналогів, таких як еверолімус (RAD001), темсиролімус (CCI-779), зотаролімус (ABT578), SAR543, аскоміцин (етильний аналог FK506), деферолімус (AP23573/MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132 іEM101/LY303511, де активні інгредієнти в кожному випадку присутні у вільній формі або у формі фармацевтично прийнятної солі, і необов'язково щонайменше одного фармацевтично прийнятного носія для одночасного, роздільного або послідовного застосування при лікуванні захворювань, залежних від мішені рапаміцину (mTOR) кінази у ссавців. Даний винахід відноситься до способу зменшення або блокування фосфорилювання і активації AKT інгібіторами mTOR, що включає введення теплокровній тварині, що потребує цього, сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі. В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до способу лікування проліферативного захворювання, залежного від набутого фосфорилювання і активації AKT під час лікування щонайменше одним інгібітором mTOR або його фармацевтично прийнятною сіллю, що включає введення теплокровній тварині, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі. В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до способу лікування проліферативного захворювання, яке стало резистентним або має зменшену чутливість до лікування щонайменше одним інгібітором mTOR або його фармацевтично прийнятною сіллю, 8 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що включає введення теплокровній тварині, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі. Резистентність обумовлена, наприклад, фосфорилюванням і активацією AKT. Іншим аспектом даного винаходу є спосіб підвищення ефективності лікування проліферативного захворювання щонайменше одним інгібітором mTOR або його фармацевтично прийнятною сіллю, що включає введення теплокровній тварині, що потребує цього, комбінації, що включає сполуку формули (A), або, зокрема, 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової (сполука 1), або її фармацевтично прийнятну сіль і щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль. Інгібітор mTOR, що застосовується згідно з даним винаходом, може бути вибраний із групи, що складається з RAD рапаміцину (сиролімус) і його похідних/аналогів, таких як еверолімус (RAD001), темсиролімус (CCI-779), зотаролімус (ABT578), SAR543, аскоміцин (етильний аналог FK506), деферолімус (AP23573/MK-8669), AP23841, KU-0063794, INK-128, EX2044, EX3855, EX7518, AZD08055, OSI-027, WYE-125132, XL765, NV-128, WYE-125132 і EM101/LY303511. Особливо кращими інгібіторами mTOR цього винаходу є сиролімус і/або еверолімус. Фармацевтичні композиції або комбінація, згідно з даним винаходом, можна вивчити в клінічних дослідженнях. Прийнятними клінічними дослідженнями можуть бути, наприклад, відкриті з підвищенням дози дослідження пацієнтів, що страждають проліферативними захворюваннями. Такі дослідження підтверджують, зокрема, синергізм активних інгредієнтів комбінації даного винаходу. Сприятливий вплив на проліферативні захворювання можна безпосередньо визначити за результатами досліджень, які відомі фахівцеві в цій галузі техніки. Такі дослідження, зокрема, можуть бути прийнятними для порівняння впливу монотерапії з використанням активних інгредієнтів і комбінації даного винаходу. Краще, якщо дозу засобу (a) підвищують до максимальної стерпної дози, і засіб (b) вводять у фіксованій дозі. Альтернативно, засіб (a) можна вводити у фіксованій дозі, і дозу засобу (b) можна підвищувати. Кожний пацієнт може одержувати дози засобу (a) щодня або періодично. У таких дослідженнях ефективність лікування можна визначити, наприклад, через 12, 18 або 24 тижні шляхом оцінки показників симптомів, проведеної кожні 6 тижнів. Введення фармацевтичної комбінації даного винаходу може привести не тільки до сприятливого ефекту, наприклад, синергічного ефекту лікування, наприклад, відповідно до полегшення протікання, затримки прогресування або пригнічення симптомів, але й до додаткових несподіваних сприятливих ефектів, наприклад, меншій кількості побічних ефектів, поліпшеній якості життя або зменшенню захворюваності у порівнянні з монотерапією з використанням тільки одного з фармацевтично активних інгредієнтів, що використовуються в комбінації даного винаходу. Іншою перевагою може бути те, що можна використовувати менші дози активних інгредієнтів комбінації даного винаходу, наприклад дози, часто не тільки повинні бути менше, але також часто можуть вводитися рідше, що може зменшити частоту або тяжкість побічних ефектів. Це відповідає бажанням і вимогам пацієнтів, що піддаються лікуванню. Одним завданням даного винаходу є одержання фармацевтичної композиції, що містить кількість, яка спільно терапевтично ефективна для спрямованого впливу або попередження у теплокровної тварини захворювання, залежного від мішені рапаміцину (mTOR ) кінази у ссавців, (a) сполуки формули (A) або її фармацевтично прийнятної солі і (b) щонайменше одного інгібітору mTOR або його фармацевтично прийнятної солі, і необов'язково щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. У даній композиції компонента комбінації (a) і (b) можна вводити спільно, один після іншого або окремо в одній об'єднаній одиничній дозованій формі або у двох окремих одиничних дозованих формах. Одинична дозована форма також може являти собою фіксовану комбінацію. Одним аспектом даного винаходу є фармацевтична композиція, що містить (a) сполуку формули (A) або її фармацевтично прийнятну сіль і (b) щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль, і необов'язково щонайменше один фармацевтично прийнятний носій. В одному варіанті здійснення фармацевтична композиція містить кількість сполуки формули (A) і щонайменше одного інгібітору mTOR, яка спільно терапевтично ефективна відносно захворювання, залежного від мішені рапаміцину (mTOR ) у ссавців. Іншим аспектом даного винаходу є фармацевтична комбінація, що включає (a) сполуку формули (A) або її фармацевтично прийнятну сіль і (b) щонайменше один інгібітор mTOR або його фармацевтично прийнятну сіль і необов'язково щонайменше один фармацевтично прийнятний носій для одночасного, роздільного або послідовного застосування. Компоненти комбінації (a) і (b) можна вводити спільно або окремо теплокровній тварині, що потребує цього. 9 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з даним винаходом, композиції для роздільного введення компонента комбінації (a) і компонента комбінації (b) або для введення у фіксованій комбінації, тобто однієї галенової композиції, що включає щонайменше 2 компонента комбінації (a) і (b), можна одержати за методикою, яка сама по собі відома, і вони придатні для ентерального, такого як пероральне, або ректального і парентерального введення ссавцям (теплокровним тваринам), включаючи людей, і містять терапевтично ефективну кількість щонайменше одного компонента комбінації окремо або в комбінації з одним або більше фармацевтично прийнятними носіями, що особливо прийнятні для ентерального або парентерального введення. Термін "носій" означає розріджувач, ад’ювант, ексципієнт або розчинник, разом з яким вводять сполуку. Такі фармацевтичні носії можуть являти собою стерильні рідини, такі як вода і олії, включаючи олії, отримані з нафти, і олії тваринного, рослинного або синтетичного походження, такі як арахісове масло, соєве масло, мінеральне масло, кунжутна олія і т.п. Як носії, особливо для розчинів для ін'єкцій, краще використовувати воду або водні фізіологічні розчини і водні розчини декстрози і гліцерину. Придатні фармацевтичні носії описані в публікації "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Фармацевтичними препаратами для комбінованої терапії при ентеральному або парентеральному введенні є, наприклад, препарати у вигляді одиничних дозованих форм, таких як таблетки, покриті цукром, таблетки, капсули або суппозиторії, або ампули. Якщо не зазначено інше, то їх одержують за відомими методиками, наприклад, за звичайними методиками змішування, гранулювання, нанесення покриття з цукру, розчинення або ліофілізації. Слід розуміти, що одинична кількість компонента комбінації, що міститься в окремій дозі кожної дозованої форми, сама по собі не повинна бути ефективною кількістю, оскільки необхідна ефективна кількість може бути забезпечене шляхом введення безлічі дозованих форм. Придатні фармацевтичні композиції можуть містити, наприклад, приблизно від 0,1% до приблизно 99,9%, краще приблизно від 1% до приблизно 60%, активного інгредієнта (інгредієнтів). Реальна кількість сполуки формули (A) і інгібітора mTOR , що вводиться згідно з даним винаходом, залежить від безлічі факторів, таких як тяжкість захворювання, що піддається лікуванню, вік і відносний стан здоров'я суб'єкта, активність використовуваної сполуки, шлях і форма введення та інші фактори. Лікарський засіб можна вводити більше одного разу на добу, краще один або два рази 3 на добу. Усі ці фактори входять у компетенцію лікаря. Сполуку формули (A) можна вводити в терапевтично ефективних кількостях у діапазоні приблизно від 0,05 до приблизно 50 мг/(кг маси тіла) реципієнта на добу; краще приблизно 0,125 мг/кг/добу, ще краще приблизно від 0,5 до 10 мг/кг/добу. Так, для введення суб'єктові масою 70 кг діапазон доз найкраще становить приблизно 35-700 мг/добу. Інгібітор mTOR еверолімус (RAD001) можна вводити людині в добових дозах, що перебувають у діапазоні від 0,5 до 1000 мг; краще в діапазоні від 0,5 мг до 15 мг; найкраще в діапазоні від 0,5 мг до 10 мг. Зокрема, терапевтично ефективну кількість кожного з компонентів комбінації даного винаходу можна вводити одночасно або послідовно і у будь-якому порядку, і компоненти можна вводити окремо або у вигляді фіксованої комбінації. Наприклад, спосіб попередження або лікування проліферативних захворювань даного винаходу може включати (i) введення першого засобу (a) у вільній формі або у формі фармацевтично прийнятної солі і (ii) введення засобу (b) у вільній формі або у формі фармацевтично прийнятної солі, одночасно або послідовно в будьякому порядку, у кількостях, які спільно є терапевтично ефективними, краще в синергічно ефективних кількостях, наприклад, у вигляді добових доз або доз, що періодично вводяться, які містять кількості, описані в даному винаході. Окремі компоненти комбінації даного винаходу можна вводити окремо в різні моменти часу протягом курсу лікування або одночасно у вигляді розділених або одиничних комбінованих форм. Крім того, термін "введення" також включає застосування проліків компонента комбінації, які in vivo перетворюються в сам компонент комбінації. Тому слід розуміти, що цей винахід включає всі такі режими одночасного і/або почергового лікування, і термін "введення" слід інтерпретувати відповідним чином. Ефективна використовувана доза кожного з компонентів комбінації, що застосовуються у комбінації даного винаходу, може мінятися залежно від конкретної застосовуваної сполуки або фармацевтичної композиції, шляху введення, патологічного стану, що зазнає лікування, тяжкості патологічного стану, що зазнає лікування. Таким чином, дозувальний режим комбінації даного винаходу вибирається залежно від безлічі факторів, включаючи шлях введення і функцію нирок та печінки пацієнта. Клініцист або лікар із загальною підготовкою в цій галузі техніки може легко визначити і призначити ефективну кількість одного з активних інгредієнтів, 10 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 необхідну для попередження, протидії або зупинки прогресування патологічного стану. Оптимальна точність при встановленні концентрацій активних інгредієнтів у діапазоні, у якому забезпечується ефективність без прояву токсичності, вимагає вибору режиму на підставі кінетики вступу активного інгредієнта в необхідні області організму. Даний винахід додатково включає наступні варіанти здійснення: синергічна комбінація для введення людині, що включає сполуку формули (A), якою є 1-({4метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин1,2-дикарбонової кислоти і щонайменше один інгібітор mTOR, у вільній формі або у формі його солі, у діапазоні сполуки, яка відповідає синергічному діапазону сполуки, що становить приблизно 330 нМ-3 мкМ і приблизно 1 нМ-27 нМ, відповідно, на моделі клітин SKBR-3 раку молочної залози або на моделі клітин BT-474 раку молочної залози; синергічна комбінація для введення людині, що включає сполуку формули (A), якою є 1-({4метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин1,2-дикарбонової кислоти і щонайменше один інгібітор mTOR, у вільній формі або у формі його солі, у діапазоні сполуки, яка відповідає синергічному діапазону сполуки, що становить приблизно 12 нМ-100 нМ і приблизно 1 нМ-27 нМ, відповідно, на моделі клітин T47-D раку молочної залози; синергічна комбінація для введення людині, що включає сполуку формули (A), якою є 1-({4метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)-піролідин1,2-дикарбонової кислоти і щонайменше один інгібітор mTOR, у вільній формі або у формі його солі, у діапазоні сполуки, яка відповідає синергічному діапазону сполуки, що становить приблизно 3 мкМ і приблизно 1 нМ-27 нМ, відповідно, на моделі клітин ZR-75-1 раку молочної залози. Наведені нижче приклади є тільки ілюстративними і не призначені для накладення обмежень. Приклад 1 Дослідження шляхом аналізу вестерн-блотингу впливу комбінації еверолімусу (RAD001) зі сполукою 1 на клітини пухлини молочної залози BT474 і MDA-MB-231 Матеріали і методики Одержання сполук: Сполуку еверолімус (RAD001) синтезують на фірмі Novartis Pharma AG. 20 мМ вихідний розчин готують у ДМСО (диметилсульфоксид) і зберігають при -20C. 10 мМ Вихідний розчин 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}аміду) 2-аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполуку 1") готують у ДМСО і зберігають при 20C. Клітини і умови використання клітинних культур: Клітини карциноми молочної залози BT474 людини (ATCC HTB-26) і MDA-MB-231 (ATCC HTB-20) одержують в American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Клітини BT474 витримують у середовищі Hybri-Care (ATCC), до якого додано 10% об./об. фетальна теляча сироватка і 2 мМ L-глутамін. Клітини MDA-MB-231 вирощують у середовищі RPMI 1640 (Amimed, Allschwil, Switzerland), до якого додано 10% об./об. фетальної телячої сироватки і 2 мМ L-глутаміну. До всіх середовищ додають 100 мкг/мл пеніцилін/стрептоміцин, і клітини витримують при 37C в 5% CO2. Обробка клітин і екстракція клітин: Клітини BT474 і MDA-MB-231 висівають при щільності, 4 2 4 2 рівній 3,3×10 клітин/см і 1,6×10 клітин/см , відповідно, і інкубують протягом 48 год при 37C і 5% CO2, потім обробляють розріджувачем ДМСО, 20 нМ RAD001 і/або сполукою 1 у різних концентраціях протягом 24 год. Лізати клітин одержують у такий спосіб. Культуральні планшети один раз промивають охолодженим льодом PBS (забуференний фосфатом фізіологічний розчин), що містять 1 мМ PMSF (фенілметилсульфонілфторид) і один раз охолодженим льодом екстракційним буфером [50 мМ Hepes (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 25 мМ β-гліцерофосфат, 25 мМ NaF, 5 мМ EGTA (етиленглікольтетраоцтова кислота), 1 мМ EDTA (етилендиамінтетраоцтова кислота), 15 мМ PPi (неорганічний пірофосфат), 2 мМ ортованадат натрію, 10 мМ молібдат натрію, лейпептин (10 мкг/мл), апротинін (10 мкг/мл), 1 мМ ДТТ (дитіотреїтол) і 1 мМ PMSF]. Інгібітори протеази купують у фірми SIGMA Chemical, St. Louis, Mo. Клітини екстрагують цим же буфером, що містить 1% NP-40 (SIGMA Chemicals). Екстракти гомогенізують, висвітлюють центрифугуванням, ділять на аліквоти і заморожують при -80C. Концентрацію білка визначають аналізом білка BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA). Імуноблотинг: 20 мкг екстракту клітин розділяють електрофорезом на поліакриламідних гелях (SDS-PAGE), що містять 12% денатуруючого додецилсульфату натрію, і переносять на фільтри з полівінілідендифториду (PVDF; Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) за допомогою 11 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 вологого промокального паперу (1 год при 250 мА) і досліджують протягом ночі при 4C з наступними первинними антитілами: (a) анти-фосфо-Akt (S473) (клон 14-05; 1:2000), одержують у фірми DAKO (Glostrup, Denmark) і розводять в PBS, 0,5% об./об. Tween, 0,5% мас./об. молока; (b) анти-фосфо-MAPK (T202/Y204) (клон ECA297; 1:50), одержують у фірми DAKO (Glostrup, Denmark) і розводять в PBS, 0,5% об./об. Tween, 0,5% мас./об. молока; (c) анти-фосфо-MEK 1/2 (S217/S221) (cat # 9154; 1:1000), одержують у фірми Cell Signaling Technology і розводять в PBS, 0,1% об./об. Tween, 0,5% мас./об. молока; (d) анти-Actin (cat # MAB1501; 1:20,000), одержують у фірми Chemicon (Billerica, MA, USA) і розводять в PBS, 0,1% об./об. Tween. Після інкубації з відповідними первинними антитілами (зазначеними вище), зв'язані білки виявляють за допомогою кон’югованих з пероксидазою хріну антимишачих або антикролячих імуноглобулінів з наступною посиленою хемілюмінесценцією (набір ECL Plus; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK) і кількісно визначають шляхом програмного забезпечення Quantity One (Bio-Rad, Munich, Germany). Кожний екстракт клітин додатково кількісно досліджують за методикою білкових біочипів зворотної фази, описаної нижче. Кожний екстракт клітин наносять на чипи білкових матриць ZeptoMARK® PWG (Zeptosens, Witterswil, Switzerland) за допомогою заснованого на п'єзоелектричному мікродозаторі безконтактного пристрою Nano-Plotter 2.1 (GeSiM, Grosserkmannsdorf, Germany). Після нанесення на білкові матриці ZeptoMARK® чипи інкубують протягом 1 год при 37C. Для забезпечення однорідних результатів блокування з використанням ультразвукового розпилювача вводять CeLyA блокувальний буфер BB1 (Zeptosens, cat. № 9040). Після 30 хв блокування чипи інтенсивно промивають деіонізованою водою (якості Milli-Q, 18 МОм×см) і сушать у потоці суміші азоту з повітрям. Після нанесення зразків і проведення процедури блокування, чипи ZeptoMARK® переносять в ZeptoCARRIER (Zeptosens, cat. № 1100), 6 проточних комірок якого окремо включають 6 рядів на чипі, і двічі промивають 200 мкл буфера для аналізу CAB1 CeLyA (Zeptosens, cat. № 9032). Потім буфер для аналізу відсмоктують і кожний компартмент інкубують зі 100 мкл первинних антитіл-мішеней (pAkt Ser473: CST#4060; pAkt Thr308: CST#2965, Akt1 pan: Epitomics#1085-1) при КТ протягом ночі. Після інкубації первинні антитіла видаляють, ряди двічі промивають буфером CAB1 і додатково інкубують зі 100 мкл Alexa fluor 647-мічених антикролячих фрагментів IgG Fib (Nitrogen; #Z25305) протягом 1 год у темряві при КТ. Після інкубації ряди двічі промивають 200 мкл буфера CAB1. Флуоресценцію пов'язаних з мішенню фрагментів Fib зчитують на зчитувальному пристрої ZeptoReader (Zeptosens, Witterswil, Switzerland) з використанням лазера (довжина хвилі збудження 635 нм) і камери CCD. Сигнал флуоресценції визначають при часі експозиції, що становить 1, 3, 5 і 10 с залежно від інтенсивності сигналу. Флуоресцентні зображення кожного ряду аналізують за допомогою програмного забезпечення ZeptoVIEW Pro 2.0 (Zeptosens, Witterswil, Switzerland) і розраховують RFI для кожного сигналу. Антитіла і розведення антитіл, використані в даному експерименті: Антиген pAkt Ser473 Akt 1 pan Zenon® Alexa Fluor 647 кролячий 45 50 55 Постачальник Cell Signaling Technology Epitomics Invitrogen Позначення 4060 1085-1 Z25305 Розведення 1/500 1/500 1/500 Результати: Ступінь фосфорилювання AKT (S473), MAPK (T202/Y204), MEK1/2 (S217/S221) і повний вміст актину в присутності еверолімусу (RAD001) і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах BT474 пухлини молочної залози, визначені шляхом аналізу вестернблотингу, представлені на фіг. 1. Ступінь фосфорилювання AKT (S473), AKT (T308) і повний вміст AKT у присутності еверолімусу (RAD001) і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах BT474 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази, представлені на фіг. 2-4, відповідно. Ступінь фосфорилювання AKT (S473), MAPK (T202/Y204) і повний вміст актину в присутності еверолімусу (RAD001) і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, визначені шляхом аналізу вестерн-блотингу, представлені на фіг. 5. 12 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ступінь фосфорилювання AKT (S473), AKT (T308) і повний вміст AKT у присутності еверолімусу (RAD001) і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, кількісно визначені за методикою білкових біочипів зворотної фази, представлені на фіг. 6-8, відповідно. Ступінь фосфорилювання AKT (S473) і повний вміст AKT у присутності еверолімусу (RAD001) і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, визначені шляхом аналізу вестерн-блотингу і кількісно визначені шляхом програмного забезпечення Quantity One у другій групі експериментів, представлені на фіг. 9. Ступінь фосфорилювання AKT (S473), AKT (T308) і повний вміст AKT у присутності еверолімусу (RAD001) і еверолімусу (RAD001) у комбінації зі сполукою 1 у клітинах MDA-MB231 пухлини молочної залози, кількісно визначені в другій групі експериментів за методикою білкових біочипів зворотної фази, представлені на фіг. 10-12, відповідно. Приклад 2 Вплив комбінації еверолімусу (RAD001) зі сполукою 1 на моделі клітин SKBR-3 раку молочної залози людини Матеріали і методики Клітини лінії SKBR-3 раку молочної залози людини купують в American Type Cell Collection. Клітини лінії SKBR-3 раку молочної залози людину ампліфіціюють з HER2. Клітини лінії SKBR-3 раку молочної залози людини вирощують при 37C в 5% CO2 в інкубаторі в середовищі RPMI 1640 (ATCC #30-2001) або інших рекомендованих середовищах, до яких додана 10% фетальної бичачої сироватки, 2 ммоль/л глутаміну і 1% пірувату натрію. Аналіз проліферації клітин: Життєздатність клітин оцінюють шляхом визначення в клітинах утримання АТФ за допомогою люмінесцентного аналізу життєздатності клітин CellTiter-Glo® (Promega #G7573) відповідно до протоколу виробника. Коротко, методика полягає в наступному: 1500-50000 клітин поміщають в 384- або 96-ямкові планшети в 25 мкл (384ямковий) або 100 мкл (96-ямковий) середовища для вирощування, клітинам дають прилипнути протягом ночі і потім протягом 72 год їх інкубують з лікарським засобами або комбінаціями лікарських засобів, узятих у різних концентраціях, після закінчення обробки лікарськими засобами в кожну лунку для лізису клітин додають однаковий об'єм реагенту CellTiter-Glo, і сигнали люмінесценції реєструють с використанням планшет-рідера Envision. Методика розрахунків впливу комбінації: Для дослідження впливу комбінації еверолімусу (RAD001) і 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1") і виявлення можливого синергічного ефекту при всіх можливих концентраціях дослідження комбінацій проводять за допомогою "матриці доз", коли комбінацію досліджують при всіх можливих перестановках доз серійно розведеного еверолімусу (RAD001) і використовуваного окремо засобу-сполуки 1, при всіх дослідженнях комбінації сполуки використовують одночасно. Залежність відповідей на дозу використовуваного окремо засобу, IC50, IC90, і синергію аналізують шляхом програмного забезпечення Chalice (CombinatoRx, Cambridge MA). Синергію оцінюють шляхом зіставлення відповідей на комбінацію з відповідями на використовувані окремо її засоби-компоненти при порівнянні з еталонною моделлю адитивних доз того самого лікарського засобу. Відхилення від адитивності для дози можна оцінити візуально по ізоболограмі або кількісно шляхом індексу комбінації. Для виявлення прояву синергії надлишкове у порівнянні з адитивним інгібування також можна представити графічно шляхом матричної діаграми повної дози. Для кількісного визначення повного впливу комбінації також розраховують об'ємний показник VHSA=ΣX,Y lnfX lnfY (Idata-IHSA) між даними і найвищою поверхнею для використовуваного окремо засобу, нормований на коефіцієнти розведення засобу fx,fy. Результати: Вплив впливу використовуваного окремо засобу і разом з еверолімусом (RAD001)/сполуку 1 на проліферацію клітин оцінюють шляхом аналізу CellTiter-Glo® (CTG), описаного вище. Клітини по 3000 клітин/лунку клітин поміщають в 384-ямкові планшети в групи по 3 лунки і обробляють сполукою протягом 72 год і потім проводять вимірювання (фіг. 13). У даному дослідженні "матриці доз" еверолімус (RAD001) піддають 4 серійним 3× розведенням при найбільшій дозі, рівній 27 нМ, і найменшій дозі, рівній 1 нМ, і сполуку 1 піддають 7 серійним 3× розведенням при найбільшій дозі, рівній 3 мкМ, і найменшій дозі, рівній приблизно 4 нМ. Результати даного дослідження представлені на фіг. 13. Сполука 1 при використанні окремо приводить до залежного від концентрації пригнічення росту клітин зі значенням Amax, максимальна частка пригнічення =0,40 (інгібування росту на 40% у порівнянні з контролем ДМСО); еверолімус (RAD001) приводить до подібного невеликого пригнічуючого впливу на проліферацію клітин при використанні окремо, ніколи не досягаючи IC50, зі значенням Amax=0,32. 13 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Обробка комбінацією еверолімус (RAD001)/сполуку 1 приводить до значного збільшення максимального ступеня пригнічення зі значенням Amax=0,63, у порівнянні з випадком використання тільки одного засобу (еверолімус (RAD001) Amax=0,32 і сполука 1 Amax=0,40). У всій матриці доз збільшена синергічна активність спостерігається для еверолімусу (RAD001) при всіх дозах (1 нМ-27 нМ) і в частині діапазону найбільших доз сполуки 1 (330 нМ-3 мкМ). У даному експерименті при відносно низьких концентраціях сполуки 1 (4 нМ-37 нМ) комбінація, очевидно, не приводить до додаткової переваги, у порівнянні зі сполукою 1 і еверолімусом (RAD001) при їхньому використанні окремо. Приклад 3 Вплив комбінації еверолімусу (RAD001) зі сполукою 1 на моделі клітин BT-474 пухлини молочної залози людини Матеріали і методики Клітини лінії BT-474 раку молочної залози людини одержують в American Type Cell Collection. Клітини лінії BT-474 раку молочної залози людини включають мутацію PIK3CA і ампліфікацію HER2. Клітини лінії BT-474 раку молочної залози вирощують при 37C в 5% CO2 в інкубаторі в середовищі RPMI 1640 (ATCC #30-2001) або інших рекомендованих середовищах, до яких додано 10% фетальної бичачої сироватки, 2 ммоль/л глутаміну і 1% пірувату натрію. Дослідження проліферації клітин: Життєздатність клітин оцінюють шляхом визначення в клітинах вмісту АТФ шляхом люмінесцентного аналізу життєздатності клітин CellTiter-Glo® (Promega #G7573) відповідно до протоколу виробника. Коротко, методика полягає в наступному: 1500-50000 клітин поміщають в 384- або 96-ямкові планшети в 25 мкл (384ямковий) або 100 мкл (96-ямковий) середовища для вирощування, клітинам дають прилипнути протягом ночі і потім протягом 72 год їх інкубують з лікарським засобами або комбінаціями лікарських засобів, узятих у різних концентраціях, після закінчення обробки лікарським засобами в кожну лунку для лізису клітин додають однаковий об'єм реагенту CellTiter-Glo і сигнали люмінесценції реєструють на планшет-рідері Envision. Методика розрахунків впливу комбінації: Для дослідження впливу комбінації еверолімусу (RAD001) і 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1") і виявлення можливого синергічного ефекту при всіх можливих концентраціях дослідження комбінацій проводять шляхом "матриці доз", коли комбінацію досліджують при всіх можливих перестановках доз серійно розведеного еверолімусу (RAD001) і використовуваного окремо засобу-сполуки 1, при всіх дослідженнях комбінації сполуки використовують одночасно. Залежність відповідей на дозу використовуваного окремо засобу, IC50, IC90, і синергію аналізують шляхом програмного забезпечення Chalice (CombinatoRx, Cambridge MA). Синергію оцінюють шляхом зіставлення відповідей на комбінацію з відповідями на використовувані окремо її засоби-компоненти при порівнянні з еталонною моделлю адитивних доз того самого лікарського засобу. Відхилення від адитивності для дози можна оцінити візуально по ізоболограмі або кількісно шляхом індексу комбінації. Для виявлення прояву синергії надлишкове у порівнянні з адитивним інгібування також можна представити графічно шляхом матричної діаграми повної дози. Для кількісного визначення повного впливу комбінації також розраховують об'ємний показник VHSA=ΣX,Y lnfX lnfY (Idata-IHSA) між даними і найвищою поверхнею для використовуваного окремо засобу, нормований на коефіцієнти розведення засобу fx,fy. Результати: Вплив впливу використовуваного окремо засобу і разом з еверолімусом (RAD001)/сполуку 1 на проліферацію клітин оцінюють за допомогою аналізу CellTiter-Glo® (CTG), описаного вище. Методика проведення експерименту ідентична експериментальній методиці, описаній вище для моделі SKBR-3 (фіг. 14). Використовують таку ж "матрицю доз" (еверолімус (RAD001): 4 дози, 3×, від 1 нМ до 27 нМ, сполука 1: 7 доз, 3×, від 4 нМ до 3 мкМ). Результати даного дослідження представлені на фіг. 14. Сполука 1 при використанні окремо приводить до залежного від концентрації пригнічення росту клітин зі значеннями IC 50, рівним приблизно 3 мкМ, і Amax, рівним приблизно 0,53 (пригнічення росту на 53% у порівнянні з контролем ДМСО); еверолімус (RAD001) приводить до невеликого пригнічуючого впливу на проліферацію клітин при використанні окремо, ніколи не досягаючи IC 50, і Amax=0,36. Обробка комбінацією (RAD001)/сполуку 1 приводить до значного збільшення максимального ступеня пригнічення зі значенням Amax=0,66, у порівнянні з випадком використання тільки одного засобу (еверолімус (RAD001) Amax=0,36 і сполука 1 Amax=0,53). У всій матриці доз збільшена синергічна активність спостерігається для еверолімусу (RAD001) при всіх дозах (1 нМ-27 нМ) і при великій дозі сполуки 1 (330 нМ-3 мкМ). У даному експерименті при менших концентраціях сполуки 1 (4 14 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нМ-37 нМ) комбінація, очевидно, не приводить до додаткової переваги, у порівнянні зі сполукою 1 і еверолімусом (RAD001) при їх використанні окремо. Приклад 4 Вплив комбінації еверолімусу (RAD001) зі сполукою 1 на моделі клітин T47-D раку молочної залози людини Матеріали і методики Клітини лінії T47-D раку молочної залози людини купують в American Type Cell Collection. Клітини лінії T47-D раку молочної залози людини включають мутацію PIK3CA. Клітини лінії T47D раку молочної залози вирощують при 37C в 5% CO2 в інкубаторі в середовищі RPMI 1640 (ATCC #30-2001) або інших рекомендованих середовищах, до яких додана 10% фетальна бичача сироватка, 2 ммоль/л глутамін і 1% піруват натрію. Дослідження проліферації клітин: Життєздатність клітин оцінюють шляхом визначення в клітинах вмісту АТФ за допомогою люмінесцентного аналізу життєздатності клітин CellTiter-Glo® (Promega #G7573) відповідно до протоколу виробника. Коротко, методика полягає в наступному: 1500-50000 клітин поміщають в 384- або 96-ямкові планшети в 25 мкл (384ямковий) або 100 мкл (96-ямковий) середовищ для вирощування, клітинам дають прилипнути протягом ночі і потім протягом 72 год їх інкубують з лікарським засобами або комбінаціями лікарських засобів, узятих у різних концентраціях, після закінчення обробки лікарськими засобами в кожну лунку для лізису клітин додають однаковий об'єм реагенту CellTiter-Glo і сигнали люмінесценції реєструють на планшет-рідері Envision. Методика розрахунків впливу комбінації: Для дослідження впливу комбінації еверолімусу (RAD001) і 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1") і виявлення можливого синергічного ефекту при всіх можливих концентраціях дослідження комбінацій проводять за допомогою "матриці доз", коли комбінацію досліджують при всіх можливих перестановках доз серійно розведеного еверолімусу (RAD001) і використовуваного окремо засобу-сполуки 1, при всіх дослідженнях комбінації сполуки використовують одночасно. Залежність відповідей на дозу використовуваного окремо засобу, IC50, IC90, і синергію аналізують шляхом програмного забезпечення Chalice (CombinatoRx, Cambridge MA). Синергію оцінюють шляхом зіставлення відповідей на комбінацію з відповідями на використовувані окремо її засоби-компоненти при порівнянні з еталонною моделлю адитивних доз того самого лікарського засобу. Відхилення від адитивності для дози можна оцінити візуально по ізоболограмі або кількісно за допомогою індексу комбінації. Для виявлення прояву синергії надлишкове у порівнянні з адитивним інгібування також можна представити графічно за допомогою матричної діаграми повної дози. Для кількісного визначення повного впливу комбінації також розраховують об'ємний показник VHSA=ΣX,Y lnfX lnfY (Idata-IHSA) між даними і найвищою поверхнею для використовуваного окремо засобу, нормований на коефіцієнти розведення засобу fx,fy . Результати: Вплив впливу використовуваного окремо засобу і разом з еверолімусом (RAD001)/сполуку 1 на проліферацію клітин оцінюють за допомогою аналізу CellTiter-Glo® (CTG), описаного вище. Методика проведення експерименту ідентична експериментальній методиці, описаній вище для моделі SKBR-3 (фіг. 15). Використовують таку ж "матрицю доз" (еверолімус (RAD001): 4 дози, 3×, від 1 нМ до 27 нМ, сполука 1: 7 доз, 3×, від 4 нМ до 3 мкМ). Результати даного дослідження представлені на фіг. 15. Сполука 1 при використанні окремо приводить до значного залежного від концентрації пригнічення росту клітин зі значеннями IC 50, рівним приблизно 330 нМ, і Amax, рівним приблизно 0,67 (пригнічення росту на 67% у порівнянні з контролем ДМСО); еверолімус (RAD001) приводить до невеликого пригнічуючого впливу на проліферацію клітин при використанні окремо, ніколи не досягаючи IC 50, і Amax=0,37. Обробка комбінацією еверолімус (RAD001)/сполуку 1 не приводить до значного збільшення максимального ступеня пригнічення зі значенням Amax=0,68, у порівнянні з випадком використання тільки одного засобу сполуки 1 (Amax=0,67). У всій матриці доз трохи збільшена і слабко синергічна активність спостерігається для еверолімусу (RAD001) при всіх дозах (1 нМ-27 нМ) і відносно великих дозах сполуки 1 (12 нМ-100 нМ). У даному експерименті при граничних високій і низькій концентраціях сполуки 1 (4 нМ, 330 нМ-3 мкМ) комбінація, очевидно, не приводить до додаткової переваги, у порівнянні зі сполукою 1 і еверолімусом (RAD001) при їхньому використанні окремо. Приклад 5 Вплив комбінації еверолімусу (RAD001) зі сполукою 1 на моделі клітин ZR-75-1 раку молочної залози людини Матеріали і методики 15 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Клітини лінії ZR-75-1 раку молочної залози людини купують в American Type Cell Collection. Клітини лінії ZR-75-1 раку молочної залози людини включають мутацію PTEN. Клітини лінії ZR75-1 раку молочної залози людини вирощують при 37C в 5% CO2 в інкубаторі в середовищі RPMI 1640 (ATCC #30-2001) або інших рекомендованих середовищах, до яких додано 10% фетальної бичачої сироватки, 2 ммоль/л глутаміну і 1% пірувату натрію. Методика розрахунків впливу комбінації: Для дослідження впливу комбінації еверолімусу (RAD001) і 1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2аміду (S)-піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполука 1") і виявлення можливого синергічного ефекту при всіх можливих концентраціях дослідження комбінацій проводять шляхом "матриці доз", коли комбінацію досліджують при всіх можливих перестановках доз серійно розведеного еверолімусу (RAD001) і використовуваного окремо засобу-сполуки 1, при всіх дослідженнях комбінації сполуки використовують одночасно. Залежність відповідей на дозу використовуваного окремо засобу, IC50, IC90, і синергію аналізують шляхом програмного забезпечення Chalice (CombinatoRx, Cambridge MA). Синергію оцінюють шляхом зіставлення відповідей на комбінацію з відповідями на використовувані окремо її засоби-компоненти при порівнянні з еталонною моделлю адитивних доз того самого лікарського засобу. Відхилення від адитивності для дози можна оцінити візуально по ізоболограмі або кількісно шляхом індексу комбінації. Для виявлення прояву синергії надлишкове у порівнянні з адитивним інгібування також можна представити графічно шляхом матричної діаграми повної дози. Для кількісного визначення повного впливу комбінації також розраховують об'ємний показник VHSA=ΣX,Y lnfX lnfY (Idata-IHSA) між даними і найвищою поверхнею для використовуваного окремо засобу, нормований на коефіцієнти розведення засобу fx,fy . Результати: Вплив впливу використовуваного окремо засобу і разом з еверолімусом (RAD001)/сполуку 1 на проліферацію клітин оцінюють за допомогою аналізу CellTiter-Glo® (CTG), описаного вище. Методика проведення експерименту ідентична експериментальній методиці, описаній вище для моделі SKBR-3 (фіг. 16). Використовують таку ж "матрицю доз" (еверолімус (RAD001): 4 дози, 3×, від 1 нМ до 27 нМ, сполука 1: 7 доз, 3×, від 4 нМ до 3 мкМ). Результати даного дослідження представлені на фіг. 16. Сполука 1 при використанні окремо не приводить до значного пригнічення росту клітин зі значенням Amax, рівним приблизно 0,16 (пригнічення росту на 16% у порівнянні з контролем ДМСО); еверолімус (RAD001) приводить до більшого пригнічуючого впливу на проліферацію клітин при використанні окремо зі значеннями IC50, рівним приблизно 15 нМ, і Amax=0,55. Обробка комбінацією еверолімус (RAD001)/сполуку 1 до значного збільшення максимального ступеня пригнічення зі значенням A max=0,67 у порівнянні з випадками використання тільки одного будь-якого засобу (еверолімус (RAD001) Amax=0,55 і сполука 1 Amax=0,16). Однак у всій матриці доз значна і трохи збільшена синергічна активність спостерігається при найбільшій дозі сполуки 1 (3 мкМ). У даному експерименті в діапазоні менших доз сполуки 1 (4 нМ-1 мкМ) комбінація, очевидно, не приводить до додаткової переваги, у порівнянні зі сполукою 1 і еверолімусом (RAD001) при їхньому використанні окремо. Приклад 6 Вплив комбінації еверолімусу (RAD001) зі сполукою 1 на моделі на голих мишах ксеротрансплантата карциноми передміхурової залози DU145 людини Методики і матеріали: Використовують самців голих мишей (nu/nu, Harlan) у віці 8 тижнів, у день 1 дослідження тих, що мають масу тіла (МТ), яка перебуває в діапазоні 21,0-31,3 г. Тваринам без обмежень надають воду (очищену шляхом зворотного осмосу, 1 ч./млн. Cl) і модифікований і опромінений кормовий раціон NIH 31lab Diet(R), що містить 18,0% неочищеного білка, 5,0% неочищеного жиру і 5,0% неочищених волокон. Мишей утримують на опроміненій підстилці для лабораторних тварин Enrich-o’cobs(TM) у статичних мікроізоляторах у циклі 12-годинного освітлення при 2122C і вологості, рівній 40-60%. Клітини лінії DU145 карциноми передміхурової залози людини одержують в American Type Culture Collection (ATCC). Клітини лінії DU145 підтримують у вигляді експоненційно зростаючих культур у середовищі RPMI-1640, до якого додано 10% фетальної бичачої сироватки, 2 мМ глутаміну , 100 Ед/мл натрієвої солі пеніциліну G, 100 мкг/мл сульфату стрептоміцину, 2 мкг/мл гентаміцину, 10 мМ HEPES і 0,075% бікарбонату натрію. Пухлинні клітини вирощують у матрацах для клітинних культур у зволоженому інкубаторі при 37C в атмосфері, що містить 5% CO2 і 95% повітря. Клітини DU145 карциноми передміхурової залози збирають під час експонентного росту і 7 повторно суспендують при концентрації, рівній 5×10 клітин/мл, у холодному PBS з додаванням 50% Matrigeltm (BD Biosciences). Кожній голій миші підшкірно в правий бік вводять 0,2 мл 16 UA 110961 C2 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 суспензії (1×10 клітин). Пухлини вимірюють штангенциркулем у двох напрямках для 3 моніторингу росту, поки їх середній об'єм не досягне необхідного діапазону 100-150 мм . Розмір 3 2 пухлини в мм розраховують за формулою: Об'єм пухлини=(ширина ×довжина)/2. Масу пухлини 3 можна оцінити при допущенні, що 1 мг еквівалентний 1 мм об'єму пухлини. Через 7 днів після імплантації пухлини, у день 1 дослідження, мишей з розмірами окремих пухлин, рівними 1443 196 мм , розподіляють на 11 груп по 10 мишей з середнім об'ємом пухлини в групі, рівним 1813 184 мм . 1-({4-Метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметилетил)піридин-4-іл]тіазол-2-іл}амід) 2-аміду (S)піролідин-1,2-дикарбонової кислоти ("сполуку 1") перемішують в N-метилпіролідоні (NMP; 10% від кінцевого об'єму) при кімнатній температурі до розчинення. Додають поліетиленгліколь 300 (ПЕГ300) (30% від кінцевого об'єму), потім Solutol® HSS15 (20% від кінцевого об'єму) і суміш перемішують до гомогенності. Кінцевий об'єм установлюють додаванням деіонізованої води (40% від кінцевого об'єму). Розріджувач для сполуки 1, NMP: ПЕГ300:Solutol® HS15:деіонізована вода (10:30:20:60), позначають, як "розріджувач 1". Розчини для менших доз одержують розведенням розчину, що містить більшу дозу, розріджувачем 1. Свіжі розчини доз готовлять раз на тиждень і зберігають при 4C у захищеному від світла місці. Еверолімус (RAD001) одержують у вигляді мікроемульсії, яка містить 2% (мас./мас.) 3 активного інгредієнта, тобто 20 мг RAD001/г; щільність мікроемульсії рівна 0,995 г/см . Мікроемульсію RAD001 ділять на аліквоти і спочатку зберігають при -20C. Аліквоту вихідної емульсії розморожують, ділять на відважені добові порції і зберігають при 4C. У кожен день лікування аліквоту RAD001 нагрівають до кімнатної температури і розводять декстрозою у воді (D5W), з одержанням розчину концентрації 1 мг/мл для найбільшої дози. Отриманий вихідний розчин розводять в D5W, з одержанням розчинів з меншими дозами. Мікроемульсію плацебо, розведену D5W, позначають, як "розріджувач 2". Схема лікування: Сполуку 1, RAD001 і їх розріджувач вводять шляхом перорального шлункового зонду (ПО) щодня протягом 21 дня (щодня ×21). При комбінованій терапії в дні 1-20 вводять RAD001 через 30 хв послу сполуки 1. У день 21 і в день 7 у групі 10 RAD001 вводять відразу після сполуки 1 послідовно тваринам, що перебувають у кожній клітині. Паклітаксел вводять болюсною ін'єкцією у хвостову вену через день, усього 5 доз (через день ×5). Об'єм дози (10 мл/кг, 2 мл/на мишу масою 20 г) визначають відповідно до маси кожної тварини, визначеної в день введення за винятком вихідних днів, для яких використовують МТ, визначену в п'ятницю. Голих мишей 11 груп (n=10 у групі) обробляють у такий спосіб: миші групи 1 одержують розріджувач 1 і розріджувач 2, і вони виступають як контрольні для всіх аналізів. Мишей груп 2-4 обробляють у режимі монотерапії 12,5, 25 і 50 мг/кг сполуки 1, відповідно. Мишей груп 5-7 обробляють у режимі монотерапії шляхом 2,5, 5 і 10 мг/кг RAD001, відповідно. Миші групи 8 одержують 12,5 мг/кг сполуки 1 у комбінації з 10 мг/кг RAD001. Миші групи 9 одержують 25 мг/кг сполуки 1 у комбінації з 5 мг/кг RAD001. Миші групи 10 одержують 50 мг/кг сполуки 1 у комбінації з 2,5 мг/кг RAD001;внаслідок токсичності обробку зупиняють після введення 7 доз кожного засобу (щодня ×7). Миші групи 11 одержують 25 мг/кг паклітаксел. Пригнічення росту пухлини: Ефективність лікування визначають у день 21. Для проведення статистичного і графічного аналізу для кожної тварини, що дожила до дня 21, визначають, ∆TV, різницю об'ємів пухлин у день 1 (початок введення) і в останній день дослідження. Для кожної групи відповідь в останній день дослідження розраховують за наступним співвідношенням: T/C(%)=100×∆T/∆C, при ∆T>0 де ∆T=(середній об'єм пухлини для групи, що одержувала лікування, в останній день дослідження)-(середній об'єм пухлини для групи, що одержувала лікування, у день 1) і ∆C=(середній об'єм пухлини для контрольної групи в останній день дослідження)-(середній об'єм пухлини для контрольної групи в день 1). Лікування, що приводить до значення T/C, рівного 40% або менше, можна вважати потенційно терапевтично активним. Критерії для випадків ремісії: Ефективність лікування також можна визначити за кількістю випадків ремісії. Обробка може привести до часткової ремісії (ЧР) або повної ремісії (ПР) пухлини у тварини. ЧР показує, що об'єм пухлини становить 50% або менше від об'єму в день 1 за даними трьох послідовних 3 вимірювань протягом курсу лікування і більше або рівний 13,5 мм за даними одного або 3 більшої кількості із цих трьох вимірювань. ПР показує, що об'єм пухлини рівний менше 13,5 мм за даними трьох послідовних вимірювань протягом курсу лікування. Токсичність: 17 UA 110961 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Тварин зважують у дні 1-5 і в кожний день обробки (за винятком вихідних днів) до завершення дослідження. Прийнятна токсичність для максимальної стерпної дози визначається, як середня для групи втрата МТ, що складає менше 15% протягом дослідження, і пов'язана з обробкою (TR) загибель не більше однієї з 10 тварин. Будь-яку тварину з втратою МТ, що перевищує 20% за даними одного вимірювання необхідно вмертвити і цей випадок віднести до TR загибелі, якщо це не перша загибель у групі. Не пов'язані з лікуванням випадки загибелі (NTR) розділяються на NTRa (внаслідок нещасного випадку або помилки), NTRu (з невідомих причин) або NTRm (підтверджене розтином поширення пухлини внаслідок інвазії і/або метастазування). Для збереження тварин з одержанням максимуму інформації першу загибель у групі відносять до NTRu, але загибель слід віднести до TR, якщо наступні дані для групи показують, що обробка є токсичною. Відбір зразків: У день 7 тварин № 1-4 у групі 10 через 2 год після введення шляхом проколу серця при анестезії CO2. У день 8 через 24 год після введення у аналогічний спосіб як зразок відбирають тварину № 5. У кожної тварини відбирають усю кров і окремо обробляють з відділенням плазми з використанням K-EDTA як антикоагулянту. Зразки плазми заморожують при -80C. Пухлини вирізають і швидко заморожують у рідкому N2. Через 2 і 24 год після введення останньої дози в день 21 по 4 тваринних груп 1, 4, 6 і 9 використовують для взяття крові і пухлин за описаною вище методикою. За попередніми даними в групі 4 тварини № 2, 6 і 7 виключаються з дослідження з причини TR загибелі; у групі 9 тварини 4 і 10 виключаються з дослідження з причини TR і NTR, відповідно. У дійсності ці тварини дожили до дня 21 і використані як зразки. Статистичний і графічний аналіз Статистичний і графічний аналіз проводять з використанням програмного забезпечення Prism 3.03 (Graph Pad) для Windows. Статистичну значимість різниць середніх значень ∆TV для груп мишей, яких піддавали обробці, і контрольних груп визначають за допомогою дисперсійного аналізу (ANOVA) з використанням критерію Бартлетта і апостеріорного критерію множинного порівняння Даннетта. Оскільки критерій Бартлетта вказує на статистично значиму різницю дисперсій (P0,05, значущі (позначені "*") при 0,01