Злитий білок таці-імуноглобулін
Формула / Реферат
1. Злитий білок, що містить:
а) фрагмент трансмембранного активатора і кальцієвого модулятора та взаємодіючого з циклофіліновим лігандом рецептора (ТАСІ), причому фрагмент рецептора ТАСІ являє собою поліпептид, що складається з послідовності довжиною 32-80 амінокислот, причому фрагмент рецептора ТАСІ включає в себе принаймні один з (і) амінокислотних залишків з 34 по 66 SEQ ID NO:2 та іі) амінокислотних залишків з 71 по 104 SEQ ID NO:2, причому фрагмент рецептора ТАСІ зв'язує принаймні один з ZTNF2 або ZTNF4, і
б) фрагмент імуноглобуліну, який містить константну зону імуноглобуліну.
2. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 66 SEQ ID N0:2 і амінокислотні залишки з 71 по 104 SEQ ID N0:2.
3. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 104 послідовності SEQ ID N0:2.
4. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент рецептора ТАСІ має амінокислотні залишки з 30 по 110 послідовності SEQ ID NO:2.
5. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент імуноглобуліну містить константну зону важкого ланцюга.
6. Злитий білок за п. 5, в якому фрагмент імуноглобуліну містить константну зону важкого ланцюга людини.
7. Злитий білок за п. 6, в якому константною зоною важкого ланцюга є константна зона важкого ланцюга IgG1.
8. Злитий білок за п. 7, в якому фрагмент імуноглобуліну являє собою Fc-фрагмент IgG1, який містить домени СH2 і СH3.
9. Злитий білок за п. 8, в якому фрагмент імуноглобуліну являє собою Fc-фрагмент IgGl, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID N0:33.
10. Злитий білок за п. 9, в якому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну має амінокислотну послідовність, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID N0:54.
11. Злитий білок за п. 17, в якому злитий білок ТАСІ-Імуноглобуліну являє собою димер.
12. Молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок за п. 1.
13. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 12, яка має нуклеотидну послідовність, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID N0:53.
14. Фармацевтична композиція, що містить фармацевтично прийнятний носій і злитий білок трансмембранного активатора і кальцієвого-модулятора, взаємодіючого з циклофіліновим лігандом (ТАСІ), з імуноглобуліном, причому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну має амінокислотну послідовність, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID N0:54.
15. Фармацевтична композиція за п. 14, в якій злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну являє собою димер.
16. Використання злитого білка трансмембранного активатора і кальцієвого модулятора, взаємодіючого з циклофіліновим лігандом (ТАСІ) з імуноглобуліном у виробництві медикаменту для зниження рівнів ZTNF4 в циркулюючій крові ссавця, при якому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну містить:
а) фрагмент рецептора ТАСІ, який являє собою поліпептид, що складається з послідовності довжиною 32-80 амінокислот, причому фрагмент рецептора ТАСІ включає в себе принаймні один з (і) амінокислотних залишків з 34 по 66 SEQ ID N0:2 та іі) амінокислотних залишків з 71 по 104 SEQ ID N0:2, причому фрагмент рецептора ТАСІ зв'язує ZTNF4, і
б) фрагмент імуноглобуліну, який містить константну зону імуноглобуліну.
17. Використання за п. 16, при якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 66 SEQ ID N0:2 і амінокислотні залишки з 71 по 104 SEQ ID N0:2.
18. Використання за п. 16, при якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 104 SEQ ID N0:2.
19. Використання за п. 16, при якому фрагмент рецептора ТАСІ має амінокислотну послідовність амінокислотних залишків з 30 по 110 SEQ ID N0:2.
20. Використання за п. 16, при якому фрагмент імуноглобуліну містить константну зону важкого ланцюга.
21. Використання за п. 20, при якому фрагмент імуноглобуліну містить константну зону важкого ланцюга людини.
22. Використання за п. 21, при якому константною зоною важкого ланцюга є константна зона важкого ланцюга IgG1.
23. Використання за п. 22, при якому фрагментом імуноглобуліну є Fc-фрагмент IgG1, який містить домени СH2 і СH3.
24. Використання за п. 8, при якому фрагментом імуноглобуліну є Fc-фрагмент IgG1, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:33.
25. Використання за п. 24, при якому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну має амінокислотну послідовність, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID N0:54.
26. Використання за п. 16, при якому злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну являє собою димер.
Текст
1. Злитий білок, що містить: а) фрагмент трансмембранного активатора і кальцієвого модулятора та взаємодіючого з циклофіліновим лігандом рецептора (ТАСІ), причому фрагмент рецептора ТАСІ являє собою поліпептид, що складається з послідовності довжиною 32-80 амінокислот, причому фрагмент рецептора ТАСІ включає в себе принаймні один з (і) амінокислотних залишків з 34 по 66 SEQ ID NO:2 та іі) амінокислотних залишків з 71 по 104 SEQ ID NO:2, причому фрагмент рецептора ТАСІ зв'язує принаймні один з ZTNF2 або ZTNF4, і б) фрагмент імуноглобуліну, який містить константну зону імуноглобуліну. 2. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 66 SEQ ID N0:2 і амінокислотні залишки з 71 по 104 SEQ ID N0:2. 3. Злитий білок за п. 1, в якому фрагмент рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з 34 по 104 послідовності SEQ ID N0:2. 2 (19) 1 3 82830 4 15. Фармацевтична композиція за п. 14, в якій 19. Використання за п. 16, при якому фрагмент злитий білок ТАСІ-імуноглобуліну являє собою рецептора ТАСІ має амінокислотну послідовність димер. 16. Використання злитого білка трансмембранного амінокислотних залишків з 30 по 110 SEQ ID N0:2. активатора і кальцієвого модулятора, 20. Використання за п. 16, при якому фрагмент взаємодіючого з циклофіліновим лігандом (ТАСІ) з імуноглобуліну містить константну зону важкого імуноглобуліном у виробництві медикаменту для ланцюга. зниження рівнів ZTNF4 в циркулюючій крові 21. Використання за п. 20, при якому фрагмент ссавця, при якому злитий білок ТАСІімуноглобуліну містить константну зону важкого а) фрагмент рецептора імуноглобуліну містить: ТАСІ, який являє собою ланцюга людини. поліпептид, що складається з послідовності 22. Використання за п. 21, при якому константною довжиною 32-80 амінокислот, причому фрагмент зоною важкого ланцюга є константна зона важкого рецептора ТАСІ включає в себе принаймні один з ланцюга IgG1. (і) амінокислотних залишків з 34 по 66 SEQ ID N0:2 23. Використання за п. 22, при якому фрагментом та іі) амінокислотних залишків з 71 по 104 SEQ ID імуноглобуліну є Fc-фрагмент IgG1, який містить N0:2, причому фрагмент рецептора ТАСІ зв'язує домени СH2 і СH3. ZTNF4, і 24. Використання за п. 8, при якому фрагментом б) фрагмент імуноглобуліну, який містить імуноглобуліну є Fc-фрагмент IgG1, який містить константну зону імуноглобуліну. амінокислотну послідовність SEQ ID NO:33. 17. Використання за п. 16, при якому фрагмент 25. Використання за п. 24, при якому злитий білок рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з ТАСІ-імуноглобуліну має амінокислотну 34 по 66 SEQ ID N0:2 і амінокислотні залишки з 71 послідовність, яка містить амінокислотну по 104 SEQ ID N0:2. послідовність SEQ ID N0:54. 18. Використання за п. 16, при якому фрагмент 26. Використання за п. 16, при якому злитий білок рецептора ТАСІ містить амінокислотні залишки з ТАСІ-імуноглобуліну являє собою димер. 34 по 104 SEQ ID N0:2. Даний винахід відноситься до поліпшених злитих білків, що включають частку рецептора фактора пухлинного некрозу та імуноглобулінову частку. Зокрема, даний винахід стосується поліпшених злитих білків ТАСІ-імуноглобулін. Цитокіни - це невеликі розчинні білки, які є посередниками багатьох біологічних дій, в тому числі регулювання росту та диференціювання багатьох типів клітин [див., наприклад, Аrаі et al., Annu.Rev.Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Сиrr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76:241 (1994)). Білки, які складають групу цитокінів, включають інтерлейкіни, інтерферони, колонієстимулюючі фактори, фактори пухлинного некрозу та інші регуляторні молекули. Наприклад, інтерлейкін-17 людини - це цитокін, який стимулює експресію інтерлейкіну-6, молекули 1 внутрішньоклітинної адгезії, інтерлейкіну-8, колонієстимулючого фактора макрофага гранулоциту та експресію простагландину та відіграє певну роль у селективному дозріванні кровотворних попередників CD34+ у нейтрофіли [Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez et al, J. Exp. Med. 183:2593 (1996)]. Рецептори, які зв'язують цитокіни, складаються, як правило, з одного або більше інтегральних мембранних білків, які зв'язують високоафінний цитокін і трансдукують цей акт зв'язування до клітин через цитоплазматичні ділянки конкретних субодиниць рецептора. Рецептори цитокіну було згруповано в декілька класів на основі подібності їхніх позаклітинних доменів зв'язування ліганду. Наприклад, ланцюги рецептора, які відповідають за зв'язування та/або трансдукцію ефекту інтерферонів, є членами сімейства рецепторів цитокіну типу II, яке базується на позаклітинному домені з характерним залишком 200. Клітинні взаємодії, які відбуваються під час імунної реакції, регулюються членами декількох сімейств рецепторів клітинних поверхонь, в тому числі сімейства рецептора фактора пухлинного некрозу (РФПН). Сімейство РФПН складається з ряду інтегральних мембранних глікопротеїдних рецепторів, багато з яких, у поєднанні з їх відповідними лігандами, регулюють взаємодії між різними послідовностями поколінь кровотворних клітин [див., наприклад, Cosman, Stem Cells 12:440 (1994); Wajant et al., Cytokine Growth Factor Rev. 10:15 (1999); Yeh et al., Immunol Rev. 169:283 (1999); Idriss and Naismith, Microsc. Res. Tech. 50:184 (2000)]. Одним таким рецептором є ТАСІ, трансмембранний активатор та CAML-інтерактор [von Bülow and Bram, Science 228:138 (1997); Bram and von Bülow, US Patent No. 5969102 (1999)]. ТАСІ є зв'язаним з мембраною рецептором, який має позаклітинний домен, що містить два збагачені цистеїном псевдо-повтори, трансмембранний домен та цитоплазматичний домен, який взаємодіє з CAML (кальцій-модулятор та циклофіліновий ліганд), інтегральний мембранний білок, розташований у внутрішньоклітинних везикулах, який є коіндуктором NF-AT активації при надекспресії у клітинах Jurkat. ТАСІ є асоційованим з B-клітинами та субпопуляцією Т-клітин. Нуклеотидні послідовності, що кодують ТАСІ та його відповідну амінокислотну послідовність, позначені в даному описі SEQ ID NOS: 1 зв'язує два члени сімейства Рецептор ТАСІ і 2, відповідно. лігандів фактора пухлинного некрозу (ФПН). Окремо один ліганд позначено як ZTNF4, "BAFF", "нейтрокін-a", "BlyS", "TALL-1" і "THANK" (Tu et al., международная заявка №WO98/18921 (1998), 5 82830 6 Як описано нижче, даний винахід пропонує Moore et al., Science 285:269 (1999); Mukhopadhyay злиті білки трансмембранний активатор і кальційet al., J. Biol. Chem. 274:15978 (1999); Schneider et модулятор та циклофіліновий ліганд-інтерактор al, J. Exp. Med. 189:1747 (1999); Shu et al., (ТАСІ)-імуноглобулін і спосіб використання злитих J.Leukoc. Biol. 65:680 (1999)). Амінокислотна білків ТАСІ-імуноглобулін. Наприклад, даний послідовність ZTNF4 позначена як SEQ ID NO:3. винахід пропонує способи інгібування проліферації Інший ліганд позначили як "ZTNF2", "APRIL" і пухлинних клітин, який передбачає введення в ці "смертельний ліганд-1 TNRF" [Hahne et al., J. Exp. пухлинні клітини композиції, яка містить злитий Med 188:1185 (1998); Kelly et al., Cancer Res. білой ТАСІ-імуноглобулін. Таку композицію можна 60:1021 (2000)]. Амінокислотна послідовність вводити в клітини, культивовані in vitro. З іншого ZTNF2 позначена як SEQ ID NO:4. Обидва ліганди боку, згадана композиція може бути також зв'язані рецептором дозрівання B-клітин терапевтичною композицією, яка містить (ВСМА) [Gross et al. Nature 404:995 (2000)]. фармацевтично прийнятний носій і злитий білок Нуклеотидна та амінокислотна послідовності ТАСІ-імуноглобулін, і цю фармацевтичну ВСМА позначені як SEQ ID NO:26 і SEQ ID NO: 27, композицію можна вводити суб'єкту, який має відповідно. пухлину. Таким суб'єктом може бути ссавець. Виявлена in vivo активність рецепторів Введення такої фармацевтичної композиції може фактора пухлинного некрозу ілюструє клінічний інгібувати, наприклад, проліферацію В-лімфоцитів потенціал розчинних форм цього рецептора. у ссавця. Даний винахід також пропонує способи Розчинні форми рецептора ТАСІ генерували у інгібування активності ZTNF4 у ссавця, які вигляді злитих білків імуноглобуліну. Первинні передбачають введення ссавцю композиції, що варіанти дали в результаті гетерогенний білок з містить ТАСІ-імуноглобулін. Активність ZTNF4 низькою експресією. Гетерогенність спостерігали може бути пов'язана з різними хворобами та на амінокінці ТАСІ, на Fc-карбоксильному кінці та в порушеннями. Наприклад, фармацевтичну області стебла ТАСІ. Тому існує потреба у композицію, що містить злитий білок ТАСІстворенні фармацевтично корисних композицій імуноглобулін, можна застосовувати для лікування рецептора винахід пропонує поліпшені злиті білки Даний ТАСІ. аутоімунної хвороби, наприклад системного ТАСІ-імуноглобулін, прийнятні як терапевтичні червоного вовчака, міастенії гравіс, розсіяного препарати. склерозу, інсулінозалежного цукрового діабету, Стислий опис графічних матеріалів хвороби Крона, ревматоїдного артриту, Фіг.1 - амінокислотна послідовність ТАСІ багатосуглобного підліткового ревматоїдного людини. Розташування збагачених цистеїном артриту і псоріатичного артриту. Як варіант, фарпсевдо-повторів показано затемненням, мацевтичну композицію, що містить ТАСІтрансмембранний домен обведено рамкою, а імуноглобулін, можна застосовувати для лікування стебло позначено знаками #. таких захворювань, як астма, бронхіт, емфізема та Фіг.2 - схематична діаграма імуноглобуліну ниркова недостатність в кінцевій стадії. підкласу IgGl. CL - константна зона легкого Фармацевтичну композицію, що містить ТАСІланцюга; СН1, CH2, СH3 - константні зони важкого імуноглобулін, можна також використовувати для ланцюга; Vl - варіабельна зона легкого ланцюга; лікування хвороб нирок, наприклад Vh - варіабельна зона важкого ланцюга; СНО гломерулонефриту васкуліту, нефриту, амілоїдозу карбогідрат; N - амінокінець; С - карбоксильний та пієлонефриту, або такого захворювання, як кінець. Фіг.3А, 3В, 3С і 3D показують порівняння Fcнеоплазма, хронічний лімфолейкоз, множинна амінокислотної послідовності людської константної мієлома, лімфома не Ходжкіна, зони g1 дикого типу з варіантами Fc-488, Fc4, Fc5, посттрансплантаційна лімфопроліферація і гамFc6, Fc7 і Fc8. Домен СH1 константної зони g1 мапатія легкого ланцюга. В певних випадках актилюдини не є частиною Fc і тому не показаний. вність ZTNF4 може бути пов'язана з Т-клітинами. Показано розташування шарнірної зони, доменів Фармацевтичну композицію, яка містить ТАСІСH2 і СH3. Позначені також цистеїнові залишки, імуноглобулін, можна також використовувати для нормально включені до дисульфідного зв'язку з лікування хвороб або порушень, пов'язаних з константною зоною легкого ланцюга (LC) і імуносупресією, відторгненням трансплантата, константною зоною важкого ланцюга (НС). Символ реакцією "трансплантат проти хазяїна" та "×" означає ідентичність дикому типу в цій позиції, а запаленням. Наприклад, фармацевтичну символ "***" вказує положення карбоксильних композицію, що містить ТАСІ-імуноглобулін, можна кінців і демонструє відмінність карбоксильного використовувати для зменшення запалення і кінця Fc6 від інших варіантів Fc. Розташування лікування таких захворювань, пропонує способи Даний винахід також як суглобний біль, амінокислот позначені позиціями індексу EU. зниження циркулюючих рівнів ZTNF4 в крові здуття, анемія та септичний шок. Фіг.4 показує конкретний зв'язок 125I-ZTNF4 з ссавця, які передбачають введення ссавцю різними структурними компонентами TACI-Fc. фармацевтичної композиції, що містить Злиті білки TACI-Fc мали частини ТАСІ, в яких не фармацевтично прийнятний носій і злитий білок вистачало перших 29 амінокислотних залишків ТАСІ-імуноглобулін, при цьому введення такої амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2. Один фармацевтичної композиції знижує циркулюючий із злитих білків мав частину ТАСІ з інтактним рівень ZTNF4 в крові ссавця. Наприклад, введення стеблом (TACI(d1-29)-Fc5), тоді як три злиті білки такої фармацевтичної композиції може знизити TACI-Fc мали частини ТАСІ з різними делеціями в циркулюючі рівні ZTNF4 в крові принаймні на 10%, стеблі (TACI(d1-29, d107-154)-Fc5; TACI(d1-29, принаймні на 20%, принаймні на 10-60%, d111-154)-Fc5; TACI(d1-29, d120-154)-Fc5). Деталі принаймні на 20-50% або принаймні на 30-40% експериментів описані в Прикладі 4. 7 82830 8 Ці та інші аспекти даного винаходу стануть порівняно з рівнем ZTNF4 в крові перед уведенням очевидними з наступного детального опису та згаданої фармацевтичної композиції. Фахівці в цій малюнків. Крім того, нижче розкрито ряд термінів. галузі можуть виміряти циркулюючі рівні ZTNF4. В наведеному нижче описі використано ряд Ілюстративні способи описані в Прикладах 4 і 5. термінів. Для полегшення розуміння даного Як описано нижче, ілюстративні злиті білки винаходу наведені наступні визначення. ТАСІ-імуноглобулін включають: Використаний тут термін "нуклеїнова кислота" а) частину рецептора ТАСІ, яка складається з або "молекула нуклеїнової кислоти" відноситься фрагмента поліпептиду, що має амінокислотну до полінуклеотидів, наприклад послідовність амінокислотних залишків 30-154 дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) або послідовності SEQ ID NO:2, причому ця частина рибонуклеїнової кислоти (РНК), олігонуклеотидів, рецептора ТАСІ включає принаймні один з і) фрагментів, генерованих ланцюговою реакцією амінокислотних залишків 34-66 послідовності SEQ полімерази (ЛРП), і фрагментів, генерованих будьID NO:2 та іі) амінокислотних залишків 71-104 якою з дій: зшивання, розщеплення, дія послідовності SEQ ID NO:2, при цьому згадана ендонуклеази та дія екзонуклеази. Молекули частина рецептора ТАСІ зв'язує принаймні один з нуклеїнової кислоти можуть складатися з ZTNF2 або ZTNF4; і мономерів, які є нуклеотидами, що зустрічаються у б) імуноглобулінову частину, яка містить природі (наприклад, ДНК і РНК), або аналогами константну зону імуноглобуліну. Відповідні частини нуклеотидів, що зустрічаються у природі рецептора ТАСІ включають: поліпептиди, які містять амінокислотні залишки 34-66 послідовності (наприклад, a-енантіомерні форми нуклеотидів, SEQ ID NO:2 і амінокислотні залишки 71-104 що зустрічаються у природі), або комбінацією послідовності SEQ ID NO:2; поліпептиди, які обох. Модифіковані нуклеотиди можуть мати зсуви містять амінокислотні залишки 34-104 в цукрових частинах та/або частинах піримідинової послідовності SEQ ID NO:2, поліпептиди, які або пуринової основи. Цукрові модифікації містять амінокислотну послідовність включають, наприклад, заміщення однієї або амінокислотних залишків 30-110 послідовності більше гідроксильних груп галогенами, алкільними SEQ ID NO:2; і поліпептиди з послідовністю, яка групами, амінами та азидогрупами, або цукри складається з амінокислотних залишків 30-110 можна функціоналізувати як прості або складні послідовності SEQ ID NO:2. Імуноглобулінова частина злитого білка ТАСІефіри. Більш того, всю цукрову частину можна імуноглобулін може включати константну зону замінити стерично або електронно подібними важкого ланцюга, наприклад константну зону структурами, наприклад аза-цукрами та важкого ланцюга людини. Константна зона карбоциклічними аналогами цукру. Прикладами важкого ланцюга IgGl - це один приклад придатної модифікацій в частині основи є алкіловані пурини константної зони важкого ланцюга. Показовою та піримідини, ацильовані пурини або піримідини, константною зоною важкого ланцюга IgGl є Fcабо інші добре відомі гетероциклічні замісники. фрагмент IgGl, який включає домени СH2 і СH3 . Мономери нуклеїнової кислоти можуть бути Цей Fc-фрагмент IgGl може бути Fc-фрагментом зв'язані фосфодіефірними зв'язками або IgGl дикого типу або мутованим Fc-фрагментом аналогами таких зв'язків. Аналоги фосфодіефірних IgGl, наприклад Fc-фрагментом, що містить зв'язків включають фосфоротіоат, амінокислотну послідовність SEQ ID NO:33. Одним фосфородитіоат, фосфороселеноат, прикладом злитого білка ТАСІ-імуноглобулін є фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, білок, що має амінокислотну послідовність, якa фосфоранілідат, фосфорамідат тощо. Термін включає амінокислотну послідовність SEQ ID "молекула нуклеїновой кислоти" також включає так NO:54. Описані тут злиті білки ТАСІ-імуноглобулін звані "пептидні нуклеїнові кислоти", які містять ті можуть бути полімерами, наприклад димерами. основи нуклеїнової кислоти, що зустрічаються у Даний винахід також пропонує молекули природі, або модифіковані, які прикріплені до нуклеїнової кислоти, які кодують злитий білок поліамідного "комплемент молекули нуклеїнової Термін скелету. Нуклеїнові кислоти можуть ТАСІ-імуноглобулін. Показову нуклеотидну кислоти" одноланцюговими, молекули нуклеїнової бути або відноситься до або дволанцюговими. послідовність, яка кодує злитий білок ТАСІкислоти, що має комплементарну нуклеотидну імуноглобулін, позначено як SEQ ID NO:53. послідовність і зворотну орієнтацію порівняно з Даний винахід також включає розчинні контрольною нуклеотидною послідовністю. рецептори ТАСІ, які складаються з фрагмента Наприклад, послідовність 5' ATGCACGGG 3' (SEQ поліпептиду, що має амінокислотну послідовність ID NO:57) є комплементарною до 5' CCCGTGCAT амінокислотних залишків 30-154 послідовності 3' (SEQ ID NO:58). SEQ ID NO:2, при цьому розчинний рецептор ТАСІ Термін "контиг" означає молекулу нуклеїнової містить принаймні один з і) амінокислотних кислоти, яка має фрагмент секвенування залишків 34-66 послідовності SEQ ID NO:2 та іі) ідентичної або комплементарної послідовності, амінокислотних залишків 71-104 послідовності суміжний з іншою молекулою нуклеїнової кислоти. SEQ ID NO:2, причому розчинний рецептор ТАСІ Кажуть, що суміжні послідовності "перекривають" зв'язує принаймні один з ZTNF2 або ZTNF4. даний фрагмент секвенування молекули Додаткові розчинні рецептори ТАСІ описуються нуклеїнової кислоти. Термін "вироджена нуклеотидна тут як відповідні частини рецепторів ТАСІ для послідовність" означає послідовність нуклеотидів, злитих білків ТАСІ-імуноглобулін. Більш того, яка включає один або більше вироджених кодонів розчинні рецептори ТАСІ можна використовувати порівняно з контрольною молекулою нуклеїнової в способах, описаних стосовно до злитих білків кислоти, яка кодує поліпептид. Вироджені кодони ТАСІ-імуноглобулін. містять різні триплети нуклеотидів, але кодують 9 82830 10 and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303 A один і той самий амінокислотний залишок (тобто (1994)]. Якщо промотором є індукований триплети GAU і GAC, кожний, кодують Asp). промотор, швидкість транскрипції зростає у Термін "структурний ген" відноситься до відповідь на індукуючий агент. І навпаки, швидкість молекули нуклеїнової кислоти, яка транскрипції не регулюється індукуючим агентом, транскрибується в матричну РНК (мРНК), яка якщо промотор є конститутивним. Відомі також потім транслюється у послідовність амінокислот, промотори, що репресуються. характерну для конкретного поліпептиду. "Кор-промотор" містить незамінні нуклеотидні "Виділена молекула нуклеїнової кислоти" - це послідовності для промоторної функції, в тому молекула нуклеїнової кислоти, неінтегрована в числі ТАТА-блок та ініціацію транскрипції. Згідно з геномній ДНК організму. Наприклад, молекула цим визначенням кор-промотор може мати або не ДНК, що кодує фактор росту, яку було мати виявної активності за відсутності конкретних відокремлено від геномної ДНК клітини, є послідовностей, які можуть підсилювати цю виділеною молекулою ДНК. Інший приклад активність або надавати тканині питомої виділеної молекули нуклеїнової кислоти - хімічно активності. "Регуляторний елемент" - це нуклеотидна синтезована молекула нуклеїнової кислоти, послідовність, яка модулює активність корнеінтегрована в геномі організму. Молекула промотора. Наприклад, регуляторний елемент нуклеїнової кислоти, яку було виділено з може містити нуклеотидну послідовність, яка конкретного виду, є меншою, ніж повна молекула зв'язується з клітинними факторами, надаючи ДНК"Структурний компонент молекули нуклеїнової хромосоми з цього виду. можливість транскрипції відбуватись виключно або кислоти" - це молекула нуклеїнової кислоти, одновибірково в конкретних клітинах, тканинах або або дволанцюгова, яка була модифікована органелах. Ці типи регуляторних елементів, як шляхом втручання людини, щоб вмістити сегменти правило, асоціюються з генами, які експресуються нуклеїнової кислоти, скомбіновані і складені в в "клітинно-специфічній", "тканино-специфічній" порядку, не існуючому у природі. абo "органело-специфічній" манері. "Лінійна ДНК" означає молекули некільцевої "Енхансер" - тип регуляторного елемента, який ДНК, які мають вільні 5'- і 3'-кінці. Лінійну ДНК може підсилювати eфeктивність транскрипції можна сформувати із молекул замкненої кільцевої незалежно від відстані або орієнтації цього ДНК, наприклад плазмід, шляхом енхансера відносно сайту ініціації транскрипції. ферментативного перетравлення або фізичного "Гетерологічна ДНК" відноситься до молекули розриву. "Комплементарна ДНК (кДНК)" - це молекула ДНК або сукупності молекул ДНК, яка природно не одноланцюгової ДНК, яка утворилася із матриці існує всередині заданої клітини-хазяїна. Молекули мРНК в результаті зворотної транскрипції ДНК, гетерологічні до конкретної клітини-хазяїна, ферменту. Як правило, для ініціювання зворотної можуть містити ДНК, отриману з виду згаданої транскрипції використовують праймер, клітини-хазяїна (тобто ендогенну ДНК), поки та комплементарний до ділянок мРНК. Фахівці також ДНК-хазяїн комбінується з ДНК, що не є хазяїном використовують термін "кДНК" для позначення (тобто екзогенною ДНК). Наприклад, молекулу молекули дволанцюгової ДНК, яка складається з ДНК, яка містить сегмент ДНК-нехазяїна, що кодує такої молекули дволанцюгової ДНК і ланцюга її поліпептид, функціонально зв'язаний з сегментом комплементарної ДНК. Термін "кДНК" також ДНК-хазяїна, який включає промотор транскрипції, позначає клон молекули кДНК, синтезований з вважають молекулою гетерологічної ДНК. І матриці РНК. навпаки, молекула гетерологічної ДНК може "Промотор" - це нуклеотидна послідовність, включати ендогенний ген, функціонально яка спрямовує транскрипцію структурного гена. Як зв'язаний з екзогенним промотором. Ще один правило, промотор знаходиться в некодуючій 5'приклад, молекулу ДНК, що містить ген, зоні гена, найближче до сайту ініціації транскрипції отриманий з клітини дикого типу, вважають структурного гена. Елементи послідовності в гетерологічною ДНК, якщо цю молекулу ДНК межах промоторів, які функціонують при ініціації вводять в клітину-мутант, якій не вистачає гена транскрипції, часто характеризуються дикого типу. "Поліпептид" - це полімер амінокислотних узгодженими нуклеотидними послідовностями. залишків, з'єднаних пептидними зв'язками Такі елементи промоторів включають сайти незалежно від того, створені вони природним зв'язування РНК-полімерази, послідовності ТАТА, шляхом чи штучно. Поліпептиди із менш ніж 10 послідовності СААТ, специфічні до амінокислотних залишків зазвичай називають диференціювання елементи [DSEs; McGehee et "пептидами". це макромолекула, що включає один "Білок" al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)], циклічні реагуючі або більше поліпептидних ланцюгів. Білок може на АМФ елементи (CREs), елементи, реагуючі на також включати непептидні компоненти, сироватку [SREs; Treisman, Seminars in Cancer наприклад карбогідратні групи. Карбогідрати та Biol. 7:47 (1990)], елементи, реагуючі на інші непептидні замісники можуть додаватися до глюкокортикоїд (GREs) і сайти зв'язування для білка через клітину, в якій цей білок продукується, і інших факторів транскрипції, наприклад CRE/ATF будуть варіюватися в залежності від типу клітини. [O"Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), В даному описі білки визначено, виходячи з їх AP2 [Ye et al., J. Biol Chem. 269:25728 (1994)], SP1; амінокислотних скелетних структур; замісники, білок, що зв'язує елемент, реагуючий на кАМФ наприклад карбогідратні групи, взагалі не [CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)] і визначені, але тим не менш можуть бути октамерні фактори [див. Watson et al., eds., присутніми. Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987], 11 82830 12 Пептид або поліпептид, кодований молекулою Термін "рецептор" означає клітинноДНК-нехазяїна, є гетерологічним пептидом або асоційований білок, який зв'язується з біоактивною поліпептидом. молекулою, що називається "лігандом". Ця "Інтегрований генетичний елемент" - це взаємодія опосередковує вплив ліганду на клітину. сегмент ДНК, який було включено в хромосому В контексті зв'язування рецептора ТАСІ термін клітини-хазяїна, після чого цей елемент вводять в "специфічно зв'язується" або "специфічне цю клітину шляхом маніпуляції людини. В межах зв'язування" означає здатність ліганду даного винаходу інтегровані генетичні елементи конкурентно зв'язуватись з рецептором. найчастіше є отриманими з переведених в лінійну Наприклад, ZTNF4 специфічно зв'язується з форму плазмід, уведених в ці клітини рецептором ТАСІ, і це можна показати шляхом електропорацією або іншим методом. Інтегровані спостерігання конкуренції для рецептора ТАСІ між генетичні елементи пропускають від первинної виявно міченим ZTNF4 і неміченим ZTNF4. клітини-хазяїна до її нащадка. Рецептори можуть бути мембранозв'язаними, "Клонуючий вектор" - це молекула нуклеїнової цитозольними або нуклеарними; мономерними кислоти, наприклад плазміда, косміда або (наприклад, рецептор гормону, стимулюючого бактеріофаг, здатна до автономної реплікації в щитовидну залозу, бета-адренергічний рецептор) клітині-хазяїні. Клонуючі вектори, як правило, або полімерними (наприклад, рецептор PDGF, містять один сайт розпізнавання рестрикційних рецептор гормону росту, рецептор IL-3, рецептор ендонуклеаз або невелику кількість таких сайтів, GM-CSF, рецептор G-CSF, рецептор які дають можливість вводити молекули еритропоетину та рецептор IL-6). нуклеїнової кислоти методом, що піддається Мембранозв'язані рецептори характеризуються вимірюванню, без втрати незамінної біологічної багатодоменною структурою, яка включає функції цього вектора, а також нуклеотидні позаклітинний домен ефектора, який зазвичай послідовності, що кодують маркерний ген, бере участь в сигнальній трансдукції. В певних придатний для використання при ідентифікації та мембранозв'язаних рецепторах позаклітинний селекції клітин, трансформованих за допомогою домен зв'язування ліганду і внутрішньоклітинний цього клонуючого вектора. Маркерні гени зазвичай домен ефектора знаходяться в окремих включають гени, які забезпечують стійкість до поліпептидах, які включають повний тетрацикліну або стійкість до ампіциліну. функціональний рецептор. ліганду з рецептором Як правило, зв'язування "Вектор експресії" - це молекула нуклеїнової призводить до конформаційної зміни в рецепторі, кислоти, яка кодує ген, експресований в клітиніяка викликає взаємодію між доменом ефектора та хазяїні. Як правило, вектор експресії включає іншою молекулою(молекулами) в клітині, що, в промотор транскрипції, ген і термінатор свою чергу, веде до зміни в метаболізмі клітини. транскрипції. Експресію гена зазвичай віддають Метаболічні акти, які часто пов'язані з взаємодіями під контроль промотора, і про такий ген кажуть, що рецептор-ліганд, включають транскрипцію генів, він "функціонально зв'язаний" з промотором. фосфорилування, дефосфорилування, Аналогічним чином, функціонально зв'язаними є збільшення утворення циклічного АМФ, регуляторний елемент і кор-промотор, якщо цей мобілізацію клітинного кальцію, мобілізацію регуляторний елемент модулює активність кормембранних ліпідів, клітинну адгезію, гідроліз промотора. "Рекомбінантний хазяїн" - це клітина, яка ліпідів інозиту та гідроліз фосфоліпідів. містить молекулу гетерологічної нуклеїнової Термін "секреторна сигнальна послідовність" кислоти, наприклад клонуючий вектор або вектор означає послідовність ДНК, яка кодує пептид експресії. В даному контексті прикладом ("секреторний пептид"), який як компонент рекомбінантного хазяїна є клітина, яка продукує більшого поліпептиду спрямовує цей більший злитий білок ТАСІ-Fc із вектора експресії. поліпептид по секреторному шляху клітини, в якій "Інтегративні трансформанти" це він синтезується. Цей більший поліпептид рекомбінантні клітини-хазяї, в яких гетерологічна зазвичай розщеплюється і виводить згаданий ДНК інтегрувала в геномну ДНК цих клітин. секреторний пептид під час проходження по "Злитий білок" - це гібридний білок, секреторному шляху. поліпептид" - це поліпептид, Термін "виділений експресований молекулою нуклеїнової кислоти, який є, головним чином, вільним від який містить нуклеотидні послідовності принаймні забруднюючих клітинних компонентів, наприклад двох генів. Нариклад, злитий білок ТАСІкарбогідрату, ліпіду або інших білкових домішок, імуноглобулін містить частину рецептора ТАСІ та які по природі асоціюються з поліпептидом. Як імуноглобулінову частину. В даному описі термін правило, препарат виділеного поліпептиду містить "частина рецептора ТАСІ" - це ділянка цей поліпептид у високочистій формі, тобто позаклітинного домену рецептора ТАСІ, яка принаймні з 80%-ною чистотою, принаймні з 90%зв'язує принаймні один з ZTNF2 або ZTNF4. ною чистотою, принаймні з 95%-ною чистотою, Термін "імуноглобулінова частина" відноситься до більш ніж 95%-ною чистотою або більш ніж 99%поліпептиду, який включає константну зону ною чистотою. Один шлях показати, що імуноглобуліну. Наприклад, імуноглобулінова конкретний препарат білка містить виділений частина може включати константну зону важкого поліпептид - по виникненню єдиного диску, який ланцюга. Термін злитий білок "TACI-Fc" позначає з'являється після електрофорезу білкового злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, в якому препарату на поліакриламідному гелі в присутності імуноглобулінова частина включає константні додецилсульфату натрію і витримування цього зони, СH2 і СH3, важкого ланцюга імуноглобуліну. гелю в кумасі бриліантовому зеленому. Однак термін "виділений" не виключає присутності того 13 82830 14 ("scFv-білки"), і мінімальні одиниці розпізнавання, самого поліпептиду в іншій фізичній формі, що складаються з амінокислотних залишків, які наприклад у вигляді димерів або іншим чином удають гіперваріабельну зону. глікозильованих або отриманих шляхом "Химерне антитіло" - це рекомбінантний білок, заміщення форм. який містить варіабельні домени і комплементарні Терміни "амінокінцевий" і "карбоксикінцевий" детермінуючі зони, отримані з антитіла гризуна, використані в даному описі для позначення тоді як решта молекули цього антитіла є положень всередині поліпептидів. Там, де отриманою з антитіла людини. дозволяє контекст, ці терміни використано з "Олюднені антитіла" - це рекомбінантні білки, в посиланням на конкретну послідовність або яких мишині комплементарні детермінуючі зони ділянку поліпептиду для позначення просторової моноклонального антитіла було перенесено з близькості або відносного положення. Наприклад, важкого та легкого варіабельних ланцюгів певна послідовність розташована карбоксикінцево імуноглобуліну миши у варіабельний домен до контрольної послідовності всередині людини. Використаний в даному описі термін поліпептиду, знаходиться найближче до "терапевтичний агент" означає молекулу або атом, карбоксильного кінця контрольної послідовності, який кон'югували з частиною антитіла, щоб але необов'язково на карбоксильному кінці утворити кон'югат, корисний для лікування. повного поліпептиду. відноситься до біосинтезу Термін "експресія" Прикладами терапевтичних агентів є лікарські генного продукту. Нариклад, коли йдеться про препарати, токсини, імуномодулятори, хелати, структурний ген, експресія включає транскрипцію сполуки бору, фотоактивні агенти, або барвники та цього структурного гена в мРНК і трансляцію мРНК ізотопи. "Виявна мітка" - це молекула або атом, який в один або більше поліпептидів. можна кон'югувати з частиною антитіла для Термін "сплайсваріант" використано в даному утворення молекули, корисної для діагнозу. описі для позначення альтернативних форм РНК, Прикладами виявних міток є хелати, фотоактивні транскрибованих з гена. Сплайсваріація зростає агенти, радіоізотопи, флуоресцентні агенти, природно завдяки використанню альтернативних парамагнітні іони та інші маркерні частини. сплайсинг-сайтів всередині молекули Термін "мітка спорідненості" позначає сегмент транскрибованої РНК або, не так часто, між поліпептиду, який можна прикріплювати до другого молекулами окремо транскрибованих РНК і може поліпептиду для забезпечення очищення або дати в результаті декілька мРНК, транскрибованих виявлення цього другого поліпептиду, або з того самого гена. Сплайсваріанти можуть створення сайтів для прикріплення цього другого кодувати поліпептиди, які мають змінену поліпептиду до субстрату. В принципі, будь-який амінокислотну послідовність. Термін пептид або білок, для якого є антитіло або інший "сплайсваріант" також використано тут для специфічний зв'язуючий агент, можна позначення поліпептиду закодованого застосовувати як мітку спорідненості. Мітки сплайсваріантом мРНК, транскрибованої з гена. Використаний в даному описі термін спорідненості включають полігістидинову ділянку, "імуномодулятор" включає цитокіни, фактори Α-білок [Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); росту вихідних клітин, лімфотоксини, коNilsson et al.. Methods Enzymol. 198:3 (1991)), стимулюючі молекули, кровотворні фактори та глютатіон-S-трансферазу [Smith and Johnson, синтетичні аналоги цих молекул. Gene 67:31 (1988)], мітку спорідненості Glu-Glu Термін "пара комплемент-антикомплемент" [Grussenmeyer et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA означає неідентичні частини, які за відповідних 82:7952 (1985)], Р-субстанцію, пептид FLAG [Hopp умов утворюють нековалентно зв'язану стабільну et al., Biotechnology 6:1204 (1988)], пептид, пару. Наприклад, біотин та авідин (або зв'язуючий стрептавідин, або інший антигенний стрептавідин) є прототипними членами пари епітоп або зв'язуючий домен. Див. Ford et al., комплемент-антикомплемент. Іншими прикладами Protein Expression and Purification 2:95 (1991)]. пар комплемент-антикомплемент є пари: Молекули ДНК, які кодують мітки спорідненості, рецептор-ліганд, антитіло-антиген (або гаптен, або можна придбати у комерційних постачальників епітоп), змістовий поліпептид-безглуздий (наприклад, ф. "Pharmacia Biotech", Piscataway, "Голе антитіло" - це все антитіло, на відміну поліпептид тощо. У тих випадках, коли необхідна від фрагмента антитіла, яке не кон'югується з NJ). наступна дисоціація пари комплементтерапевтичним агентом. Голі антитіла включають і антикомплемент, краще щоб вона мала поліклональні, і моноклональні антитіла, а також спорідненість зв'язування менш ніж 109М-1антитіла, "Фрагмент антитіла" - це ділянка . певні рекомбінантні антитіла, наприклад химерні наприклад F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab і т.п. та олюднені антитіла. Незалежно від структури фрагмент антитіла Використаний тут термін "компонент антитіла" зв'язується з тим самим антигеном, який був включає і все антитіло, і фрагмент антитіла. розпізнаний інтактним антитілом. "Імунокон'югат" - це кон'югат компонента Термін "фрагмент антитіла" також включає антитіла з терапевтичним агентом або виявною синтетичний або отриманий шляхом генетичної міткою. "Поліпептид-мішень" або "пептид-мішень" - це інженерії поліпептид, який зв'язується зі амінокислотна послідовність, яка містить специфічним антигеном, наприклад поліпептиди, принаймні один епітоп і яку експресують на клітиніщо складаються з варіабельної зони легкого мішені, наприклад пухлинній клітині, або клітині, ланцюга, "Fv''-фрагменти, що складаються з яка несе антиген інфекційного агента. Т-клітини варіабельних зон важкого та легкого ланцюгів, розпізнають епітопи пептиду, представлені молекули рекомбінантного одноланцюгового молекулою головного комплексу гістосумісності поліпептиду, в яких варіабельні зони легкого і (ГКГС) поліпептиду-мішені або пептиду-мішені і, як важкого ланцюгів з'єднані пептидним лінкером 15 82830 16 псевдо-повторів, характерні для доменів правило, лізують клітину-мішень або набирають зв'язування ліганду фактора пухлинного некрозу; нові інші імуноклітини на сайт клітини-мішені, б) "стебло" із 62 амінокислот, яке знаходиться між таким чином вбиваючи цю клітину-мішень. доменами зв'язування ліганду і трансмембранним "Антигенний пептид" - це пептид, який зв'яже доменом; в) трансмембранний домен із 20 молекулу ГКГС для утворення комплексу ГКГСамінокислот і г) внутрішньоклітинний домен із 120 пептид, який розпізнається Т-клітиною, амінокислот. Ця амінокислотна послідовність не викликаючи в результаті реакцію цитотоксичного містить прогнозованої гідрофобної амінокінцевої лімфоциту після представлення Т-клітині. Таким сигнальної послідовності. чином, антигенні пептиди здатні прив'язуватись до Для створення розчинної форми ТАСІ людини відповідної молекули ГКГС і викликати реакцію на для використання як інгібітора взаємодії нативний цитотоксичні Т-клітини, наприклад лізис клітини ліганд-нативний рецептор генерували злитий білок або специфічний викид цитокіну напроти клітинипозаклітинний домен ТАСІ-імуноглобулін Fc мішені, яка (реакція) зв'язує або експресує людини. Цю доступну послідовність ТАСІ людини антиген. Антигенний пептид може бути зв'язаним в використали як відправну точку для середовищі молекули ГКГС класу І або класу II, на конструювання молекули злитого білка [von Bülow клітині, що представляє антиген, або на клітиніand Bram, Science 278:138 (1997)]. Цей вихідний мішені. еукаріотах РНК-полімераза II каталізує В структурний компонент, позначений "TACI-Fc4", транскрипцію структурного гена для утворення включав амінокислотні залишки 1-154 поліпептиду мРНК. Можна сконструювати так, щоб молекула ТАСІ та модифіковану зону Fc людини, що нуклеїнової кислоти містила матрицю РНКописується нижче. Точку злиття в залишку 154 полімерази II, в якій транскрипт РНК має вибрали, щоб включити якомога більше "стебла" послідовність, яка є комплементарною до ТАСІ, не включаючи при цьому жодної потенційної послідовності конкретної мРНК. Транскрипт РНК ділянки прогнозованого трансмембранного називають "безглуздою РНК", а молекулу домену. Оскільки нативний поліпептид ТАСІ не містить нуклеїнової кислоти, що кодує цю безглузду РНК, амінокінцевої сигнальної послідовності, її додали називають "безглуздим геном". Молекули до ТАСІ, щоб генерувати секретовану форму безглуздої РНК здатні прив'язуватись до молекул злитого білка ТАСІ-Fc. Ця сигнальна послідовність мРНК, в результаті чого інгібується трансляція являла собою пре-про-послідовність, мРНК. Слід розуміти, що через неточність модифіковану з активатора плазміногена тканини стандартних аналітичних методів молекулярні людини. Ці модифікації включили для підсилення маси та довжини полімерів є приблизними розщеплення сигнальної пептидази та величинами. Якщо таку величину виражено у специфічного до фуринової протеази процесингу, і вигляді "приблизно X", то слід розуміти, що з цієї причини цю послідовність назвали точність величини X має похибку ±10%. "оптимізованою tPA (оtРА)-лідерною 3. Продукування молекул нуклеїнової кислоти, послідовністю". Ця otPA-послідовність (SEQ ID які кодують білки ТАСІ- імуноглобулін NO:25) показана нижче; модифіковані На Фіг.1 показана спрогнозована амінокислотні залишки зетемнені. Послідовність, амінокислотна послідовність ТАСІ людини [von яка кодує рекомбінантний злитий білок TACI-Fc, Bülow and Bram, Science 278:138 (1997)]. ввели у вектор експресії, який трансфекували в Поліпептид ТАСІ містить наступні спрогнозовані клітини яєчника китайського хом'яка. елементи: а) дві структури збагачених цистеїном Трансфековані клітини яєчника китайського хом'яка продукували білок TACI-Fc4 на низькому рівні, приблизно 0,3 пг на клітину в день. Вестерн блот-аналіз білка TACI-Fc з антисироватками Fc кози проти людського IgG виявив два диски, один диск був менший за очікуваний розмір приблизно на 48кДа. Аналіз амінокислотних послідовностей очищених білків показав, що цей менший диск відбивав розщеплення злитих білків ТАСІ на різних сайтах в межах стебла ТАСІ. Щодо SEQ ID NO:2, то головні кінці були виявлені на амінокислотних залишках 118 і 123, хоча білки були розщеплені також в амінокислотних позиціях 110, 139 і 141. Додатково до гетерогенності, викликаної розщепленням у стеблі, гетерогенність також спостерігали на аміно- і карбоксильних кінцях. В послідовності SEQ ID NO:2 головні амінокінці 17 82830 18 Первинною функцією ефектора, яка може бути виявили на амінокислотних залишках 1, 10 і 13. найбільш корисною у злитому білку Відмінності в карбоксильному кінці відбивають імуноглобуліну, є здатність антитіла IgG1 природну гетерогенність рекомбінантних опосередковувати залежну від антитіла клітинну імуноглобулінів та злитих білків імуноглобулінів, цитотоксичність. З іншого боку, це може бути і яка включає неповне видалення залишку лізину, небажаною функцією для злитого білка, який діє, в кодованого на карбоксикінці. Інше джерело першу чергу, як антагоніст. В підкласі IgG1 гетерогенності виявили в мінливій природі ідентифіковано декілька специфічних карбогідратної структури, прикріпленої до домену амінокислотних залишків, важливих для Cm імуноглобуліну, кодованого Fc. активності, опосередкованої константною зоною Щоб звернутися до гетерогенності, яку антитіла. Тому включення або виключення цих спостерігали, генерували нові варіанти TACI-Fc. специфічних амінокислот створює можливість Сконструювали структурні компоненти, які включення або виключення специфічної включали принаймні одну з наступних змін в активності, опосередкованої константною зоною частині ТАСІ: 1) ділянки стебла ТАСІ були імуноглобуліну. делетовані; 2) одна ділянка стебла ТАСІ була Для створення злитих білків Fc генерували замінена ділянкою стебла ВСМА; 3) залишок шість варіантів модифікованого Fc IgG1 людини. аргінін в позиції 119 було мутовано дляFc-488 було сконструйовано для зручного виключення потенційного сайту розщеплення фурину; 4) залишок глутамін в позиції 121 було клонування злитого білка, який містить зону g1Fc мутовано для виключення потенційного сайту людини, і його було сконструйовано за допомогою розщеплення фурину; 5) залишок аргінін в позиції константної зони g1 людського імуноглобуліну 122 було мутовано для виключення потенційного дикого типу. Тривога з приводу потенційного сайту розщеплення фурину; 6) амінокислотні шкідливого впливу через непарний цистеїновий залишки в позиціях 123 і 142 було мутовано в залишок привела до рішення замінити цистеїн амінокислотні залишки, виявлені у відповідних (амінокислотний залишок 24 послідовності SEQ ID позиціях ТАСІ миши; 7) сигнальна otPANO:6), який нормально дисульфідно зв'язується з послідовність людини була замінена сигнальною константною зоною легкого ланцюга послідовністю варіабельної зони важкого ланцюга імуноглобуліну, на сериновий залишок. Щоб людини; 8) залишок валін в позиції 29 було ввести сайт розпізнавання рестрикційного мутовано в метонін, і сигнальну otPA-послідовність ферменту Bg l ll для полегшення майбутніх було з'єднано в амінокінцевій позиції з цим маніпуляцій з ДНК, в позицію 218 (амінокислотний залишком, і 9) сигнальну otPA-послідовність було залишок 22 послідовності SEQ ID NO:6) індексу з'єднано на амінокінці також Модифікації із залишком аланін в позиції здійснили в EU, який кодує згаданий колон, було введено імуноглобуліновій частині. У вищих хребетних 30. додаткову зміну. Ці зміни були введені в продукт ідентифіковано п'ять класів імуноглобуліну: IgG, реакції преципітації (РПЦ), кодований на РПСIgA, IgM, IgD та IgE. Білки IgG, IgD та IgE - це праймерах. Через положення сайту Bg l ll і з типово дисульфідно зв'язані гетеротетрамери, які метою закінчення шарнірної зони Fc кодони для складаються з двох ідентичних важких ланцюгів і позицій 216 і 217 індексу EU (амінокислотні двох ідентичних легких ланцюгів. IgM, як правило, залишки 20 і 21 послідовності SEQ ID NO:6) були виявляють у вигляді пентамеру тетрамеру, тоді як введені вFc5 і Fc6 містять мутації для зниження Fc4, послідовності-партнери злитого білка. IgA зустрічається у вигляді димеру тетрамеру. функцій ефектора, опосередкованих Fc, шляхом IgG являє собою головний клас, оскільки він зниження зв'язування з FcgRI і зв'язування нормально існує як другий найбільш поширений комплемента C1q. Fc4 містить такі самі білок, знайдений в плазмі. У людей IgG амінокислотні заміни, які було введено в Fc-488. складається з чотирьох підкласів, позначених Для зниження потенційних функцій ефектора, IgG1, IgG2, IgG3 та IgG4. Як показано на Фіг.2, опосередкованих Fc, були введені додаткові важкий ланцюг кожного імуноглобуліну має амінокислотні заміни. Зокрема, для зменшення константну зону, яка складається з доменів білка зв'язування з FcgRI були введені три амінокислотні константної зони (СH1, шарніра, СH2 і СH3), які є заміни. Це заміни в позиціях індексу EU 234, 235 і інваріантними для даного підкласу. Константні 237 (амінокислотні залишки 38, 39 і 41 зони важкого ланцюга класу IgG позначають послідовності SEQ ID NO:6). Було виявлено, що грецьким символом g. Наприклад, імуноглобуліни заміни в цих позиціях зменшують зв'язування з підкласу IgG містять константну зону важкого FcgRI [Duncan el al., Nature 332:563 (1988)]. Ці ланцюга g1. Fc-фрагмент, або домен Fc, складається з амінокислотні заміни можуть також зменшити дисульфідно зв'язаних шарнірних зон важкого зв'язування з FcgRIIa, а також зв'язування з FcgRIII ланцюга, доменів СH2 і СH3. В злитих білках [Sondermann et al., Nature 406:267 (2000); Wines et імуноглобулінів домени Fc підкласу IgG1 часто al., J. Immunol 164:5313 (2000)]. використовують як імуноглобулінову частину, бо Декілька груп вчених описали релевантність IgG1 має найдовший період напіврозпаду позицій 330 і 331 індексу EU (амінокислотні сироватки будь-якого з сироваткових білків. Надто залишки 134 і 135 послідовності SEQ ID NO:6) в довгий період напіврозпаду сироватки може бути зв'язуванні комплемента Clq і наступній фіксації бажаною характеристикою білка для вивчення комплемента [Canfield and Morrison, J. Exp. Med. тварин і потенційного терапевтичного 173:1483 (1991); Tao et al.,J. Exp. Med. 178:661 застосування для людини. Крім того, підклас IgG1 (1993)]. Амінокислотні заміни в цих позиціях були має найбільшу здатність здійснення функцій введені в Fc4 для зменшення фіксації ефектора, опосередкованих антитілом. 19 82830 20 послідовності SEQ ID NO:6) - це сайт прикріплення комплемента. Домен СH3 Fc4 є ідентичним домену, N-зв'язаного карбогідрату. N-зв'язаний карбогідрат виявленому у відповідному поліпептиді дикого вводить потенційне джерело варіабельності в типу, за винятком термінуючого кодону, який був рекомбінантно експресований білок через змінений з TGA в ТАА для виключення потенційні варіації від групи до групи в структурі потенційного сайту метилування dam, коли карбогідрату. З метою виключити цю потенційну клоновану ДНК вирощують в dam плюс штам Е. варіабельність, щоб запобігти прикріпленню Nсоlі. зв'язаного карбогідрату в позиції того залишку, В Fc5 аргініновий залишок в позиції 218 Asn-297 мутували в глутаміновий залишок. Цей індексу EU мутували назад в лізин, бо в злитих карбогідрат в залишку 297 також бере участь в білках, що містять цей конкретний Fc, не було зв'язуванні Fc6 з FcgRIII (Sondermann et al., Nature застосовано схему клонування Bg l ll. Решта 406:267 (2000)]. Тому, видалення карбогідрату послідовності Fc5 співпадає з наведеним вище зменшило б зв'язування рекомбінантних злитих описом Fc4. Fc6 є ідентичною Fc5, за винятком того, що білків, що містять Fc7, з FcgR взагалі. Як вже карбоксикінцевий лізиновий кодон було описувалось, термінуючий кодон у послідовності виключено. С-кінцевий лізин зрілих Fc7 мутували в ТАА. імуноглобулінів часто видаляють із зрілих Fc8 є ідентичною зоні g1 імуноглобуліну дикого імуноглобулінів пост-трансляційно перед секрецією з B-клітин або видаляють під час типу, показаної в SEQ ID NO:6, з тією різницею, що циркуляції сироватки. Отже, С-кінцевий лізиновий цистеїновий залишок в позиції 220 індексу EU (амінокислотний залишок 24 послідовності SEQ ID залишок, як правило, не знаходять на циркулюючих антитілах. Як і в описаних вище Fc4 і NO:6) замінили сериновим залишком. Ця мутація виключала згаданий цистеїновий залишок, який Fc5, термінуючий кодон у послідовності Fc6 замінили на ТАА. нормально дисульфідно зв'язується з константною Fc7 є ідентичною Fcg1 дикого типу, за зоною легкого ланцюга імуноглобуліну. винятком того, що амінокислотні заміни в позиції В Таблиці 1 показані приклади структурних 297 індексу EU, розміщеній в домені СH2. Позиція компонентів TACI-Fc. Asn-297 індексу EU (амінокислотний залишок 101 21 Білки TACI-Fc продукували за допомогою рекомбінантних клітин яєчника китайського хом'яка, виділяли і аналізували методом вестерн блот-аналізу та аналізу амінокислотної послідовності. Як не дивно, делеція перших 29 амінокислот від N-кінця поліпептиду ТАСІ дала в результаті 10-кратне зменшення в продукуванні злитих білків TACI-Fc при використанні клітин яєчника китайського хом'яка. Ця делеція також зменшила розщеплення повномірного стебла. Крім того, розщеплення всередині стебла ТАСІ пригнічували або відсіканням стебла ТАСІ, або заміною стебла ТАСІ всередині іншої амінокислотної послідовності (наприклад, амінокислотної послідовності стебла ВСМА). Як описано в Прикладі 4, функціональні аналізи структурних компонентів TACI-Fc показують, що злиті білки TACI(d1-29)-Fc5, TACI(d1-29, d107-154)-Fc5, TACI(d1-29, d111-154)Fc5 і TACI(d1-29, d120-154)-Fc5 мають аналогічні спорідненості до зв'язування для ZTNF4. Однак виявилось, що структурні компоненти TACI(d1-29)Fc5, TACI(d1-29, d111-154)-Fc5 і TACI(d1-29, d120154)-Fc5 зв'язують більше ZTNF4 на моль TACI-Fc, ніж структурний компонент TACI(d1-29, d107-154)Fc5. В залежності від передбачуваного застосування (наприклад, терапевтичного, діагностичного або дослідницького) можна використовувати або високу, або низьку ємність злитих білків TACI-Fc. Крім того, поєднання високої ємності та низької ємності злитих білків TACI-Fc дає можливість титрування ZTNF2 або ZTNF4. Даний винахід розглядає злиті білки ТАСІімуноглобулін, які містять частину рецептора ТАСІ, що складається з амінокислотних залишків 30-106 послідовності SEQ ID NO:2, 30-110 послідовності SEQ ID NO:2, 30-119 послідовності SEQ ID NO:2 або 30-154 послідовності SEQ ID NO:2. Даний винахід також включає злиті білки ТАСІімуноглобулін, які містять частину рецептора ТАСІ, що складається з амінокислотних залишків 31-106 послідовності SEQ ID NO:2, 31-110 послідовності SEQ ID NO:2, 31-119 послідовності SEQ ID NO:2 або 31-154 послідовності SEQ ID NO:2. Більш узагальнено, даний винахід включає злиті білки ТАСІ-імуноглобулін, в яких частина рецептора ТАСІ складається з фрагмента амінокислотних залишків 30-154 послідовності SEQ ID NO:2 і в яких частина рецептора ТАСІ зв'язує принаймні один з ZTNF2 або ZTNF4. Такі фрагменти містять зону збагаченого цистеїном 82830 22 псевдо-повтору і, необов'язково, можуть включати принаймні один N-кінцевий сегмент, який знаходиться в амінокінцевій позиції відносно зони збагаченого цистеїном псевдо-повтору, і сегмент стебла, який знаходиться в карбоксикінцевій позиції відносно зони збагаченого цистеїном псевдо-повтору. Відповідні зони збагачених цистеїном псевдо-повторів включають поліпептиди, які: а) містять принаймні один з амінокислотних залишків 34-66 послідовності SEQ ID NO:2 і амінокислотних залишків 71-104 послідовності SEQ ID NO:2; б) містять і амінокислотні залишки 34-66 послідовності SEQ ID NO:2, і амінокислотні залишки 71-104 послідовності SEQ ID NO:2, або в) містять амінокислотні залишки 34-104 послідовності SEQ ID NO:2. Відповідні N-кінцеві сегменти включають наступні залишки послідовності SEQ ID NO:2: амінокислотний залишок 33, амінокислотні залишки 32-33, амінокислотні залишки 31-33 і амінокислотні залишки 30-33. Відповідні сегменти стебла включають одну або більше амінокислот амінокислотних залишків 105-154 послідовності SEQ ID NO:2. Наприклад, сегмент стебла може складатися з наступних амінокислотних залишків послідовності SEQ ID NO:2: амінокислотного залишку 105, амінокислотних залишків 105-106, амінокислотних залишків 105-107, амінокислотних залишків 105-108, амінокислотних залишків 105109, амінокислотних залишків 105-110, амінокислотних залишків 105-111, амінокислотних залишків 105-112, амінокислотних залишків 105113, амінокислотних залишків 105-114, амінокислотних залишків 105-115, амінокислотних залишків 105-116, амінокислотних залишків 105117, амінокислотних залишків 105-118, амінокислотних залишків 105-119, амінокислотних залишків 105-120, амінокислотних залишків 105121, амінокислотних залишків 105-122, амінокислотних залишків 105-123, амінокислотних залишків 105-124, амінокислотних залишків 105125, амінокислотних залишків 105-126, амінокислотних залишків 105-127, амінокислотних залишків 105-128, амінокислотних залишків 105129, амінокислотних залишків 105-130, амінокислотних залишків 105-131, амінокислотних залишків 105-132, амінокислотних залишків 105133, амінокислотних залишків 105-134, амінокислотних залишків 105-135, амінокислотних залишків 105-136, амінокислотних залишків 105 23 82830 24 137, амінокислотних залишків 105-138, Більш узагальнено, сегмент стебла може амінокислотних залишків 105-139, амінокислотних складатися з 2-50 амінокислотних залишків. залишків 105-140, амінокислотних залишків 105Імуноглобулінова частина злитого білка, що 141, амінокислотних залишків 105-142, тут описується, містить принаймні одну константну амінокислотних залишків 105-143, амінокислотних зону імуноглобуліну. У кращому варіанті залишків 105-144, амінокислотних залишків 105імуноглобулінова частина являє собою сегмент 145, амінокислотних залишків 105-146, імуноглобуліну людини. Послідовність амінокислотних залишків 105-147, амінокислотних імуноглобуліну людини може бути амінокислотною залишків 105-148, амінокислотних залишків 105послідовністю дикого типу або модифікованою 149, амінокислотних залишків 105-150, амінокислотною послідовністю дикого типу, яка амінокислотних залишків 105-151, амінокислотних має принаймні одну з обговорених вище залишків 105-152, амінокислотних залишків 105амінокислотних мутацій. Амінокислотна послідовність імуноглобуліну 153 та амінокислотних залишків 105-154. людини може також відрізнятися від дикого типу Додаткові відповідні сегменти стебла тим, що має одну або більше мутацій, характерних включають одну або більше амінокислот стебла для відомої алотипічної детермінанти. В Таблиці 2 ВСМА (наприклад, амінокислотні залишки 42-54 показані алотипічні детермінанти константної зони послідовності SEQ ID NO:27). Наприклад, сегмент IgGyl людини [Putman, The Plasma Proteins, Vol.V, стебла може складатися з наступних pages 49-140 (Academic Press, Inc. 1987)]. Позиції амінокислотних залишків послідовності SEQ ID 214, 356, 358 і 431 індексу EU визначають відомі NO:27: амінокислотного залишку 42, алотипи IgGg1. Позиція 214 знаходиться в домені амінокислотних залишків 42-43, амінокислотних СH1 константної зони IgGg1 і тому не знаходиться в залишків 42-44, амінокислотних залишків 42-45, межах послідовності Fc. Послідовність Fc амінокислотних залишків 42-46, амінокислотних послідовності SEQ ID NO:6 дикого типу включає залишків 42-47, амінокислотних залишків 42-48, алотипи Glm(1) і Glm(2-). Однак Fc-частину білка амінокислотних залишків 42-49, амінокислотних TACI-Fc можна модифікувати для відображення залишків 42-50, амінокислотних залишків 42-51, будь-якої комбінації цих алотипів. амінокислотних залишків 42-52, амінокислотних залишків 42-53 та амінокислотних залишків 42-54. Описані тут приклади білків TACI-Fc містять константні зони IgGl людини. Однак придатні імуноглобулінові частини включають також поліпептиди, що містять принаймні одну константну зону, наприклад константну зону важкого ланцюга з будь-якого з наступних імуноглобулінів: IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, IgA2, IgD, IgE та IgM. Вигідним є те, що імуноглобулінові частини, отримані з IgG2 дикого типу або IgG4 дикого типу, пропонують знижену функцію ефектора порівняно з IgGl дикого типу або IgG3 дикого типу. Даний винахід також розглядає злиті білки, які містять частину рецептора ТАСІ, описану вище, і будь-який альбумін або b2-макроглобулін. Іншим типом рецепторного злитого білка, який зв'язує ZTNF2 або ZTNF4, є злитий білок ВСМАімуноглобулін. Були проведені дослідження із злитим білком BCMA-Fc4, в якому частина ВСМА складається з амінокислотних залишків 1-48 послідовності SEQ ID NO:27. Як не дивно, фармакокінетичні дослідження на мишах показали, що злитий білок BCMA-Fc4 мав період напіврозпаду приблизно 101 годину, тоді як білок TACI-Fc мав період напіврозпаду 25 годин. Таким чином, при певних клінічних установках перевагу можуть віддавати введенню злитого білка ВСМАімуноглобулін. Більш того, для лікування певних станів вигідною може бути комбінація злитих білків ТАСІ-імуноглобулін і ВСМА-імуноглобулін. Цієї комбінаційної терапії можна досягти введенням злитих білків ТАСІ-імуноглобулін і ВСМАімуноглобулін або введенням гетеродимерів злитих білків ТАСІ-імуноглобулін і ВСМАімуноглобулін. 25 82830 26 Wu et al. Methods in Gene Biotechnology, pages 33Іншим типом рецепторно злитого білка, який 41 (CRC Press, Inc. 1997) ("Wu (1997)"); Ausubel зв'язує ZTNF4, є злитий білок імуноглобуліну, що (1995) at pages 5-1 - 5-6; Wu (1997) at pages 307містить позаклітинний домен рецептора, 327)]. позначеного "Ztnfr12". Амінокислотна і Як варіант, молекули для конструювання нуклеотидна послідовності рецептора Ztnfr12 злитих білків імуноглобуліну можна отримати, представлені як SEQ ID NO:59 і SEQ ID NO:60, синтезуючи молекули нуклеїнової кислоти, відповідно. Відповідні частини рецептора Ztnfr12 використовуючи довгі олігонуклеотиди і описані включають поліпептиди, що містять амінокислотні вище нуклеотидні послідовності, які служать залишки 1-69 послідовності SEQ ID NO:60 або взаємним праймером [див., наприклад, Ausubel амінокислотні залишки 19-35 послідовності SEQ ID (1995) at pages 8-8 - 8-9]. Адаптований метод NO:60. Запропоновані даним винаходом злиті білки використання ланцюгової реакції полімерази дає можуть мати форму одноланцюгових поліпептидів, можливість синтезувати молекули ДНК довжиною димерів, тримерів або множин димерів або принаймні дві тисячі гетероциклічних основ тримерів. Димери можуть бути гомодимерами або нуклеїнової кислоти [Adang et al.. Plant Molec. Вiol гетеродимерами, а тримери можуть бути 27:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and гомотримерами або гетеротримерами. Applications 2:266 (1993), Dillon et al., "Use of the Прикладами гетеродимерів можуть служити Polymerase Chain Reaction for the Rapid поліпептид ТАСІ-імуноглобулін з поліпептидом Construction of Synthetic Genes", in Methods in ВСМА-імуноглобулін, поліпептид ТАСІMolecular Biology, Vol. 15:PCR Protocols: Current імуноглобулін з поліпептидом Ztnfr12Methods and Applications, White (ed.), pages 263iмyнoглoбyлiн і поліпептид ВСМА-імуноглобулін з 268, (Humana Press, Inc. 1993), and Holowachuk et поліпептидом Ztnfr12-імуноглобулін. Приклади ai, PCR Methods Appl 4:299 (1995)]. гетеротримерів включають поліпептид ТАСІЗапропоновані даним винаходом молекули імуноглобулін з двома поліпептидами ВСМАнуклеїнової кислоти також можна синтезувати, імуноглобулін, поліпептид ТАСІ-імуноглобулін з застосовуючи протоколи використання двома полпептидами Ztnfr12-імуноглобулін, "синтезатора полінуклеотидів" , наприклад методу поліпептид ВСМА-імуноглобулін з двома фосфорамідиту. Якщо, наприклад, для синтезу поліпептидами Ztnfr12-імуноглобулін, два гена або фрагмента гена необхідна хімічно поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін з поліпептидом синтезована дволанцюгова ДНК, тоді кожний ВСМА-імуноглобулін, два поліпептиди ТАСІкомплементарний ланцюг створюють окремо. імуноглобулін з поліпептидом Ztnfr12Продукування коротких генів (60-80 пар азотистих імуноглобулін, два поліпептиди ВСМАоснов) є технічно простим і його можна імуноглобулін з поліпептидом Ztnfr12здійснювати шляхом синтезу комплементарних імуноглобулін, а також тример з поліпептиду ТАСІланцюгів і наступної їх гібридизації. Однак для імуноглобулін, поліпептиду ВСМА-імуноглобулін та продукування довгих генів (>300 пар азотистих поліпептидузлитих білках частина рецептора ТАСІ В таких Ztnfr12-імуноглобулін. основ) можуть знадобитися спеціальні стратегії, може містити принаймні одну з наступних оскільки ефективність спряження кожного циклу амінокислотних послідовностей послідовності SEQ під час хімічного синтезу ДНК рідко буває 100%ID NO:2: амінокислотні залишки 30-154, ною. Для подолання цієї проблеми синтетичні гени амінокислотні залишки 34-66, амінокислотні (дволанцюгові) збирають у модулярну форму із залишки 71-104, амінокислотні залишки 47-62, одноланцюгових фрагментів довжиною 20-100 амінокислотні залишки 86-100. Частина рецептора нуклеотидів. Про синтез нуклеотидів [див., ВСМА може містити принаймні одну з наступних наприклад, Glick and Pasternak, Molecular амінокислотних послідовностей послідовності SEQ Biotechnology, Principles and Applications of ID NO:27: амінокислотні залишки 1-48, Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al, амінокислотні залишки 8-41 і амінокислотні Anmi. Rev. Biochem. 53:323 (1984), and Climie etai, залишки 21-37. Частина рецептора Ztnfr12 може Proc. Nat'l Продукування 87:633 (1990)]. 4. Acad. Sci. USA поліпептидів ТАСІмістити принаймні одну з наступних імуноглобулін амінокислотних послідовностей послідовності SEQ Запропоновані даним винаходом поліпептиди ID NO:60: амінокислотні залишки 1-69 та можна продукувати в рекомбінантних клітинахамінокислотні залишки 19-35. Злиті білки можна продукувати, хазяях відомими методами. Для експресії використовуючи методи реакції преципітації послідовності, що кодує ТАСІ-імуноглобулін, (РПЦ), застосовані для конструювання можна молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує ілюстративних молекул TACI-Fc, які описані в цей поліпептид, функціонально зв'язати з прикладах. Однак фахівці в цій галузі можуть регуляторними послідовностями, які контролюють використовувати інші стандартні методи. транскрипційну експресію у векторі експресії, а Наприклад, молекули нуклеїнової кислоти, що потім увести в клітину-хазяїн. Крім кодують ТАСІ, ВСМА, Ztnfr12, або поліпептиди транскрипційних регуляторних послідовностей, імуноглобуліну можна отримати, ретельно наприклад промоторів та енхансерів, вектори перевіряючи бібліотеки кДНК людини або геномні експресії можуть включати трансляційні бібліотеки, використовуючи полінуклеотидні зонди, регуляторні послідовності та маркерний ген, що базуються на описаних тут послідовностях. Ці придатний для селекції клітин, які несуть цей методи є стандартними і добре адаптованими вектор експресії. Вектори експресії, придатні для продукування [див., наприклад, Ausubel et al., (eds.), Short стороннього білка в еукаріотних клітинах, як Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, pages 4-1 правило, містять: 1) прокаріотні елементи ДНК для -4-6 [John Wiley & Sons 1995) ("Ausubel (1995)"]; 27 82830 28 (1980)] і промотор онкогенного вірусу молочної кодування бактеріального реплікатора і маркер залози миши [див., Etcheverry, "Expression of стійкості до антибіотика для забезпечення росту і Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", in селекції вектора експресії в бактеріальному Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland хазяїні, 2) еукаріотні елементи ДНК, що et al., (eds.), pages 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. контролюють ініціацію транскрипції, наприклад 1996)]. Прикладом корисної комбінації промотра та промотор, і 3) елементи ДНК, що контролюють енхансера є комбінація промотора вірусу процесонг транскриптів, наприклад послідовність мієлопроліферативної саркоми та енхансера термі нації транскрипції/поліаденилування. цитомегаловірусу людини. Вектори експресії можуть також включати Як варіант, для контролювання продукування нуклеотидні послідовності, які кодують секреторну білків ТАСІ-імуноглобулін в клітинах ссавців можна послідовність, що спрямовує гетерологічний використати прокаріотний промотор, наприклад поліпептид в секреторний шлях клітини-хазяїна. промотор Т3 РНК-полімерази, якщо цей Вектор експресії може, наприклад, містити прокаріотний промотор регулюється еукаріотним нуклеотидну послідовність, яка кодує ТАСІпромотором [Zhou et al, Mol. Cell. Biol 70:4529 імуноглобулін, і секреторну послідовність, (1990) and Kaufman et al., Nucl, Acids Res. 19:4485 отриману з будь-якого секретованого гена. Як (1991)]. Вектор експресії можна вводити в клітиниобговорювалось вище, однією придатною хазяї кількома стандартними методами, в тому сигнальною послідовністю є сигнальна tPAчислі трансфекцією фосфату кальцію, послідовність. Прикладом сигнальної tPAтрансфекцією, опосередкованою ліпосомами, послідовності є SEQ ID NO:25. Іншою придатною методом введення за допомогою налітаючих сигнальною послідовністю є сигнальна мікрочастинок, електропорацією тощо. послідовність 26-10 VH миши. Мишине антитіло 26Трансфековані клітини можна селектувати і 10 описується, наприклад, у Near et al., Mol. розмножити для створення рекомбінантних клітинImmunol. 27:901 (1990). Описувані амінокислотна хазяїв, які містять вектор експресії, стабільно та нуклеотидна послідовності сигнальної інтегрований в геном клітини-хазяїна. Методи послідовності 26-10 VH миши представлені введення векторів в еукаріотні клітини і методи послідовностями SEQ ID NО:61 і SEQ ID NО:65, селектування таких стійких трансформантів з відповідно. SEQ ID NО:62 показує амінокислотну використанням домінантного селектованого послідовність злитого білка TACI-Fc5, який містить маркера описуються, наприклад, в роботі Ausubel сигнальну послідовність 26-10 VH миши. Запропоновані даним винаходом білки ТАСІ(1995) та Murray (ed.), Gene Transfer and імуноглобулін можна експресувати в клітинах Expression Protocols (Humana Press 1991). ссавців. Прикладами придатних клітин-хазяїв Одним придатним селектованим маркером є, ссавців є клітини нирки африканської зеленої наприклад, ген, який забезпечує стійкість до мавпи [Vero; ATCC CRL 1587], клітини нирки антибіотичного неоміцину. В цьому випадку ембріону людини (293-НЕК; ATCC CRL 1573), селекцію проводять у присутності лікарського клітини нирки маляти хом'яка (ВНК-21, ВНК-570; засобу типу неоміцину, наприклад G-418 або йому АТСС CRL 8544, ATCC CRL 10314), клітини нирки подібного. Селекційні системи можна також псових (MDCK; АТСС CCL 34), клітини яєчника використовувати для підвищення рівня експресії китайського хом'яка [СНО-К1; АТСС CCL 61; СНО гена, що становить інтерес, і процес цей DG44 (Chasin ei al., Som. Cell Molec. Genet. 12:555, називають "ампліфікацією". Ампліфікацію (1986)], клітини гіпофізу щура (GH1; АТСС CCL здійснюють шляхом культивування трансфектантів 82), клітини HeLa S3 (АТСС CCL 2.2), клітини у присутності невеликої кількості селективного гепатоми щура (Н-4-ІІ-Е; АТСС CRL 1548), агента і наступного збільшення кількості трансформовані клітини SV-40 нирки мавпи (COSселективного агента для селектування клітин, які 1; АТСС CRL 1650) і клітини ембріону миши (NIHпродукують високі рівні продуктів уведених генів. 3T3;Для АТСС CRL 1658). хазяїна-ссавця транскрипційні та Придатним ампліфікованим селектованим трансляційні регуляторні сигнали можна отримати маркером є дигідрофолатредуктаза, яка надає з вірусного джерела, наприклад аденовірусу, стійкості до метотрексату. Можна також вірусу папіломи великої рогатої худоби, мавп'ячого застосовувати й інші гени, що надають стійкості до вірусу тощо, в яких регуляторні сигнали лікарського засобу (наприклад, пуроміцинасоційовані з конкретним геном, що має високий ацетилтрансферазу, що надає стійкості до рівень експресії. Відповідні транскрипційні та гігроміцину і до багатьох лікарських засобів). З трансляційні регуляторні послідовності також іншого боку, маркери, які вводять змінений можна отримати з генів ссавців, наприклад генів фенотин, наприклад зелений флуоресцентний актину, колагену, міозину та металотіонеїну. білок або білки поверхонь клітин, наприклад CD4, Транскрипційні регуляторні послідовності CD8, Class І МНС, плацентарна лужна фосфатаза, включають зону промотора, достатню для можна використовувати для сортування спрямування ініціації синтезу РНК. Відповідні трансфекованих клітин від нетрансфекованих еукаріотні промотори включають промотор гена клітин, наприклад, за допомогою клітинного металотіонеїн І миши [Hamer et al, J. Molec. Appl. сортера із збудженням флуоресценції або Genet/ 7:273 (1982)], ТК-промотор вірусу гкрпксу методом розділення за допомогою магнітних [McKnight, Cell 37:355 (1982)], ранній промотор SV гранул. Поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін можна 40 [Benoist et al., Nature 290:304 (1981)], промотор також продукувати за допомогою культивованих вірусу саркоми Рауса [Gorman et al, Proc. Nat'l клітин, використовуючи вірусну систему Acad Sci. USA 70:6777 (1982)], промотор транспортування. Прикоадами вірусів для цієї цитомегаловірусу [Foecking et al., Gene 45:101 29 82830 30 UTR можна отримати з гена 26-10 VH мишей. мети є аденовірус, вірус герпесу, вірус коров'ячої Послідовність SEQ ID NО:63 показує нуклеотидну віспи та аденоасоційований вірус (AAV). послідовність корисної нативної 5'-UTR 26-10 VH Аденовірус, вірус з дволанцюговою ДНК. На мишей, а послідовність SEQ ID NО:64 показує сьогодні є найбільш дослідженим вектором нуклеотидну послідовність 5'-UTR 26-10 VH мишей, переносу гена для транспортування гетерологічної яку було оптимізовано на 3'-кінці. нуклеїнової кислоти [див., Becker et al., Meth. Cell Наприклад, SEQ ID NО:67 являє собою Вiol. 43:161 (1994), and Douglas and Curiel, Science нуклеотидну послідовність, яка включає такі & Medicine 4:44 (1997)]. Перевагами аденовірусної елементи: нативну 5'-UTR 26-10 VH мишей системи є пристосування відносно великих (нуклеотиди 1-51), сигнальну послідовність 26-10 вставок ДНК, здатність рости до високого титру, VH мишей (нуклеотиди 52-97 і 182-192), інтрон 26здатність інфекувати широкий розмах типів клітин 10 VH мишей (нуклеотиди 98-181), нуклеотидну ссавців і гнучкість, що дає можливість послідовність, яка кодує ТАСІ-частину (нуклеотиди використання з великою кількістю доступних 193-435) і нуклеотидну послідовність, яка кодує векторів, які містять різні промотори. Fс5-частину (нуклеотиди 436-1131). В результаті делеції ділянок аденовірусного Нуклеотидна послідовність SEQ ID NO:68 генома можна пристосовувати більші вставки (до 7 відрізняється від SEQ ID NO:67 завдяки заміні тисяч пар нуклеотидів) гетерологічної ДНК. Ці оптимізованої 5'-UTR 26-10 VH мишей (нуклeотиди вставки можна включати у вірусну ДНК прямим 1-51) на нативну послідовність. зшиванням або гомологічною рекомбінацією з коБілки ТАСІ-імуноглобулін можна також трансфекованою плазмідою. Як варіант можна експресувати в інших вищих еукаріотних клітинах, делетувати незамінний ген El з вірусного вектора, наприклад клітинах птахів, грибів, комах, дріжджів що веде до нездатності відтворювання, поки або рослин. Бакуловірусна система забезпечує клітина-хазяїн не дасть цей ген El. Інфіковані ефективний засіб введення клонованих генів в аденовірусним вектором людські клітини 293 клітини комах. Відповідні вектори експресії [АТСС №№ CRL-1573, 45504, 45505], наприклад, базуються на вірусі множинного ядерного можна виростити як прирослі клітини або в поліедрозу Autographa californica (AcMNPV) і суспензійній культурі при відносно високій містять добре відомі промотори, наприклад щільності клітин для продукування значних промотор хітшокового білка (хтб) Drosophila 70, кількостей білка [див., Garniere et. al., Cytotechnol. промотор предраннього гена вірусу ядерного 15:145(1994)].в цій галузі можуть розробити Фахівці поліедрозу Autographa californica (іе-1) і відповідні вектори експресії для продукування сповільнений ранній 39К-промотор, описаних тут злитих білків за допомогою клітин бакуловірусний р10-промотор і промотор ссавців. Ознаки одного вектора експресії описані в Drosophila metallothionein. Другий спосіб створення Прикладі 4. Як інший приклад, вектор експресії рекомбінантного бакуловірусу використовує може містити двоцистронну касету експресії, яка систему, що базується на транспозоні, описану в включає ділянку енхансера цитомегаловірусу роботі Luckow [Luckow et al., J. Virol, 67:4566 людини, промотор вірусу мієлопроліферативної (1993)]. Ця система, яка використовує вектори саркоми, нуклеотидну послідовність, що кодує переносу, продається в комплекті BAC-to-BAC [Life злитий білок, поліовірусні внутрішні рибосомні Technologies, Rockville, MD]. В цій системі сайти входження, нуклеотидну послідовність, що застосований вектор переносу PEASTBAC (Life кодує дигідрофолатредуктазу мишей, за якою йде Technologies), що містить транспозон Тn7 для додаткова послідовність SV40-полі А. переміщення ДНК, яка кодує поліпептид ТАСІНуклеотидна послідовність SEQ ID NО:69 показує імуноглобулін у бакуловірусний геном, що структурний компонент "енхансер зберігається в Е. соlі як велика плазміда під цитомегаловірусу-промотор LTR вірусу назвою "бакміда". Див. Hill-Perkins and Possee, J. мієлопроліферативної саркоми", в якому енхансер Gen. Virol. 77:971 (1990), Bonning et. al., J. Gen. цитомегаловірусу тягнеться від нуклеотиду 1 до Virol. 75:1551 (1994), and Chazenbalk, and нуклеотиду 407. Промотор LTR вірусу Rapoport, J. Biol. Chem. 279:1543 (1995)]. Крім того, мієлопроліферативної саркоми, який не має зони вектори переносу можуть включати негативної регуляції, тягнеться від нуклеотиду 408 внутрішньоскелетне злиття з ДНК, яка кодує мітку до нуклеотиду 884 послідовності SEQ ID NО:69. епітопа на С- або N-кінці експресованого Нуклеотидна послідовність промотора LTR вірусу поліпептиду ТАСІ-імуноглобулін, наприклад мітку мієлопроліферативної саркоми без зони Glu-Glu епітопу [Grussenmeyer et al., Proc. Nat’l негативної регуляції знаходиться в послідовності Acad. Sci. 82:7952 (1985)]. Використовуючи SEQ ID NO.70. 1 описано вектор експресії, який У Прикладі відомий в цій галузі метод, вектор переносу, що містить промотор цитомегаловірусу для містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок спрямування експресії трансгена рекомбінантного ТАСІ-імуноглобулін, трансформують в Е. соlі та білка, інтрон імуноглобуліну, сигнальну перевіряють на виявлення бакмід, які містять послідовність активатора плазміногена тканини. перерваний ген lacZ, що є ознакою Прикладом придатного інтрону імуноглобуліну є рекомбінантного бакуловірусу. Бакмідну ДНК, яка інтрон 26-10VH мишей. Послідовність SEQ ID містить геном рекомбінантногоPEASTBAC можна Ілюстративний вектор бакуловірусу, потім NО:66 ілюструє нуклеотидну послідовність інтрону значною застосовуючи відомий метод. виділяють, мірою модифікувати. Наприклад, 26-10 VH мишей. Вектор експресії може також промотор поліедрин можна видалити і замінити включати нетрансльовану 5'-область (UTR), промотором головного білка бакуловірусу (також розміщену вище від нуклеотидної послідовності, відомим як Рсоr, р6.9 або МР-промотор), який яка кодує білок ТАСі-імуноглобулін. Відповідну 5' 31 82830 32 придбати. Можна сконструювати вектор для експресують раніше при зараженні бакуловірусом і генерації структурних компонентів, який показав себе кращим для експресії використовуючи необхідні елементи для секретованих білків [див., наприклад, Hill-Perkins здійснення гомологічної рекомбінації в дріжджах and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning et [див., наприклад, Raymond et al., BioTechniques al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) and Chazrnbalk and 26:134 (1999)]. Такий вектор експресії, наприклад, Rapoport, J. Biol. Chem. 270L543 (1995)]. В таких може включати послідовності URA3 та CEN-ARS структурних компонентах вектора переносу можна (автономно реплікуюча послідовність), необхідні використовувати короткий або довгий варіант для селекції та реплікації в S. cerevisiae. Інші промотора головного білка. Більш того, можна придатні вектори включають вектори на основі YIp, побудувати вектори переносу, використовуючи наприклад Yip5; вектори на основі Yrp, наприклад секреторні сигнальні послідовності, отримані з Yrp17; вектори на основі Yep, наприклад Yep 13, і білків комах. Як такі структурні компоненти можна вектори на основі Ycp, наприклад Yep 19. Методи використати, наприклад, секреторну сигнальну трансформування клітин S. cerevisiae за послідовність з екдистероїд-глюкозилтрансферази допомогою екзогенної ДНК і продукування (EGT), мелітину медоносної бджоли [Invitrogen рекомбінантних поліпептидів із цих клітин Corporation; Carlsbad, СА] або бакуловірусу gp67 описуються, наприклад, Kawasaki [пат. США [PharMingen; San Diego, CA]. №4599311], Kawasaki et al, пат. США №4931373, Цей рекомбінантний вірус або бакміду Brake, пат. США №4870008, Welch et al, пат. США використовують для трансфекування клітин№5037743 та Murray et al, пат. США №4845075. хазяїв. Відповідні клітини-хазяї включають клітинні Трансформовані клітини селектують за лінії, отримані з lPLB-Sf-21, пупальну яєчникову фенотипом, визначеним селектованим маркером, клітинну лінію, наприклад Sf9 (АТСС CRL 1711), зазвичай стійкістю до лікарського препарату або SJ21AE та Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, здатністю рости за відсутності конкретної поживної CA), а також клітини Шнайдера-2 Drosophila і речовини (наприклад, лейцину). Придатною клітинну лінію HIGH FIVEO (Invitrjgen), отриману з векторною системою для використання в Trichoplusia пі [Пат. США №5300435]. Для Saccharomyces cerevisiae є векторна система вирощування і зберігання цих клітин можна РОТІ, описана Kawasaki et al. [пат. США використати комерційно доступні безсироваткові №4931373], яка дає можливість трансформувати середовища. Придатними середовищами для клітини, які слід селектувати, шляхом клітин Sf9 є Sf900 II™ (Life Technologies) або ESF вирощування в середовищах, що містять глюкозу. 921™ (Expression Systems); для клітин Т. пі Додаткові придатні промотори і термінатори для середовища ExcellO405™ (JRH Biosciences, використання в дріжджах включають промотори і Lenexa, KS) або Express FiveO™ (Life термінатори з генів гліколітичних ферментів [див., Technologies). При використанні рекомбінантного наприклад, Kawasaki, пат. США №4599311, вірусу клітини, як правило, вирощують від Kingman et al., пат. США №4615974 та Bitter, пат. щільності інокуляції приблизно 2-5x105 клітин до США №4977092] та генів алкогольдегідрогенази. щільності 1-2x106 клітин і в цей час додають Див. також патенти США №№: 4990446, 5063154, рекомбінантний вірусний штам при множинності 5139936 та 4661454. Відомі також трансформаційні системи для зараження 0,1-10, частіше приблизнопродукування Відомі адаптовані методи 3. інших дріжджів, в тому числі Hansenula рекомбінантних білків в бакуловірусних системах polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, описані авторами: Bailey et ah, "Manipulation of Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Baculovirus Vectors" in Methods in Molecular Biology, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Pichia guillermondii та Candida maltosa. Див., Murray (ed.), pages 147-168 (The Humana Press, наприклад, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. Inc. 1991); Patel et al., "The baculovirus expression 132:3459 (1986) and Cregg, US Patent No. 4882279. system", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Можна використовувати клітини Aspergilhis згідно з Edition, Glover et ah, (eds.), pages 205-244 (Oxford методами McKnight et al., US Patent No. 4935349. University Press 1995); Ausubel (1995) at pages 16Методи трансформування Acremonium 37 to 16-57; Richardson (ed.), Baculovirus chrysogenum описані Sumino et al [US Patent No. Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), 5162228]. Методи трансформування Neurospora and Luckow, "Insect Cell Expression Technology", in описані Lambowitz в пат. США №4486533. Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland Використання Pichia methanolica як хазяїна et al., (eds.), pages 183-218 [John Wiley & Sons, Inc. для продукування рекомбінантних білків описано в 1996]. [патентах США №№5716808 і 5736383 (Raymond), Для експресування описаних тут генів можна Raymond et al, Yeast 14:11-23 (1998) та в використовувати грибкові клітини, в тому числі міжнародних заявках №№WO 97/17450, WO дріжджові клітини. Дріжджі, які становлять 97/17451, WO 98/02536 та WO 98/02565]. особливий інтерес, включають Saccharomyces Молекули ДНК для використання в cerevisiae, Pichia pastoris та Pichia methanolica. трансформуванні Р. methanolica можна звичайно Придатними промоторами для експресування в отримати у вигляді дволанцюгових кільцевих дріжджах є промотори з GALI (галактози), PGK плазмід, які у кращому варіанті лінеаризують (фосфогліцераткінази), ADH перед трансформацією. При продукуванні (алкогольдегідрогенази), АОХ1 поліпептиду в Р.methanolica промотор і термінатор (алкогольоксидази), HISH в цій плазміді можуть бути промотором і (гістидинолдегідрогенази) тощо. Сконструйовано термінатором гена P.methanolica, наприклад багато векторів, клонуючих дріжджі, які легко 33 82830 34 DH1, DH41, DH5, DH51, DH51F’, DH51MCR, алкоголь використовуючого гена Р.methanolica DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, (AUG1 або AUG2). Інші придатні промотори JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, включають промотори генів CSH18, ER1451 та ER1647 [див., наприклад, дигідроксиац5етонсинтази (DHAS), Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic форміатдегідрогенази (FMD) та каталази (CAT). Press 1991)]. Придатними штамами Bacillus Для полегшення інтеграції ДНК в хромосомуsubtilus є: BR151, YB886, MI119, MI120 та В170 хазяїн краще мати повний сегмент експресії [див., наприклад, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", плазміди, фланкованої з обох кінців in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) послідовностями ДНК-хазяїна. Для використання в (IRL Press 1985)]. Pichai methanolica кращим селектованим При експресуванні білка ТАСІ-імуноглобулін в маркером є ген P.methanolica ADE2, який кодує бактерії, наприклад Е.coli, поліпептид можна фосфорибозил-5-аміноімідазолкарбоксилазу утримувати в цитоплазмі, як правило, у вигляді (AIRC; EC 4.1.1.21) і який дає можливість клітинамнерозчинних гранул, або можна спрямовувати у хазяям ade2 рости за відсутності аденіну. Для періплазматичний простір за допомогою великомасштабних промислових процесів, де бактеріальної секреторної послідовності. У необхідно мінімізувати використання метанолу, першому випадку клітини лізують, і гранули можна застосовувати клітини-хазяї, в яких видаляють і денатурують, використовуючи, делетовано обидва гени, що використовують наприклад, ізотіоціанат гуанідину або сечовину. метанол (AUG1 та AUG2). Для продукування Денатурований поліпептид можна потім повторно секретованих білків клітини-хазяї можна розбавити скласти та димеризувати шляхом розбавлення в генах вакуолярної протеази (PEP4 та PRB1). Для денатуранту, наприклад шляхом діалізу поруч з полегшення інтродукції в клітини P.methanolica розчином сечовини та комбінацією відновленого плазміди, що містить ДНК, яка кодує поліпептид, та окисленого глутаніону та наступного діалізу що становить інтерес, застосовують поруч з буферним сольовим розчином. У другому електропорацію. Клітини P.methanolica можна випадку поліпептид можна видалити з трансформувати електропорацією, періплазматичного простору в розчинній та використовуючи експоненціально згасаюче функціональній формі шляхом розривання клітин імпульсне електричне поле з напруженістю 2,5(наприклад, в результаті обробки ультразвуком 4,5кB/см, краще приблизно 3,75кB/см, та сталою або осмотичного шоку), щоб вивільнити вміст часу (t) 1-40 мілісекунд, краще приблизно 20 періплазматичного простору та видалити білок, мілісекунд. виключаючи таким чином необхідність денатурації Вектори експресії можна також вводити в та повторного складання. Методи експресування білків у прокаріотних протопласти рослин, інтактну рослинну тканину клітинах добре відомі фахівцям [див., наприклад, або виділені рослинні клітини. Методи введення Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. векторів експресії в рослинну тканину включають coli using plasmid vectors and purification of specific пряме зараження рослинної тканини бактерією polyclonal antibodies", in DNA Cloning 2: Expression Agrobaclehum tumefaciens або ко-культивацію Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds), page 15 рослинної тканини разом із згаданими бактеріями; (Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic метод введення за допомогою налітаючих Manipulation and Expression of Antibodies", in мікрочастинок, ін'єкцію ДНК, електропорацію тощо. Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Див., наприклад, Horsch et al., Science 227:1229 page 137 [Wiley-Liss, Inc. 1995) and Georgiou, (1985), Klein et al., Biotechnology 70:268 (1992) and "Expression of Proteins in Bacteria", in Protein Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., into Plants", in Methods in Plant Molecular Biology (eds.), page 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)]. and Biotechnology, Glick et al., (eds.), pages 67-88 Стандартні методи введення векторів (CRC Press, 1993). експресії в бактеріальні, дріжджові клітини та Як варіант, білки ТАСІ-імуноглобулін можна клітини комах і рослин можна знайти, наприклад, у продукувати в прокаріотних клітинах-хазяях. Ausubel (1995). Відповідні промотори, які можна застосовувати Загальні методи експресування та вилучення для продукування поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін стороннього білка, продукованого за допомогою в прокаріотному хазяїні, добре відомі фахівцям і клітинної системи ссавців описані, наприклад, включають промотори, здатні розпізнавати [Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in полімерази Т4, Т3, Sp6 та Т7, PR- та PL-промотори Mammalian Cell Culture", in Protein Engineering: бактеріофага лямбда, промотори trр, rесА, Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), page хітшокові промотори, lacUV5-, tас-, Ipp-lacSpr-, 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)]. Стандартні методи phoA- та lacZ-промотори Ε.coli, промотори вилучення білка, продукованого за допомогою В.sublilis, промотори бактеріофагів Bacillus, бактеріальної системи, описані, наприклад, промотори Streptomyces, int-промотор [Grisshammer et al., "Purification of over-produced бактеріофага лямбда, blа-промотор pBR322 та proteins from E. coli cells", in DNA Cloning 2: САТ-промотор гена Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), хлорамфеніколацетилтрансферази. Прокаріотні pages 59-92 (Oxford University Press 1995)]. промотори описано в роботах [Glick, J. Ind. Адаптовані методи виділення рекомбінантних Microbiol. 7:277 (1987), Watson et al., Molecular білків з бакуловірусної системи описані Richardson Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin єCummins Придатними прокаріотними хазяями Е.coli та (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Bacillus subtilus. Придатними штамами E.coli є: 1987) and Ausubel et al. (1995)]. Press Inc. 1995). BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, 35 82830 36 хвороби, наприклад штамах MRL-lpr/lpr або F1 Як варіант, запропоновані даним винаходом НЗЧxНЗБ мишей, які належать одному роду, які поліпептиди можна синтезувати ексклюзивним служать моделлю системного червоного вовчака твердофазним синтезом, методом часткової (СЧВ). Такі тваринні моделі відомі [див., твердої фази, конденсацією фрагментів або наприклад, Cohen and Miller (Eds.), Autoimmune класичним синтезом в рідкій фазі. Ці способи Disease Models: A Guidebook (Academic Press, Inc. синтезу добре відомі [див., наприклад, Merrifield, J. 1994)]. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Нащадки схрещування між новозеландською Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce чорною (НЗЧ) та новозеландською білою (НЗБ) Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp. Chem. Pept. мишами розвивають спонтанну форму СЧВ, яка Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide дуже нагадує СЧВ у людей. Миші-нащадки, відомі Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), як НЗЧБ, починають розвивати аутоантитіла IgM Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide проти Т-клітин на одному місяці життя, і к 5-7 Synthesis", Methods in Enzymology Volume 289 місяцям аутоантитіла проти ДНК є домінантним (Academic Press 1997) and Lloyd-Williams et al., імуноглобуліном. Гіперактивність поліклональних Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides B-клітин веде до надсинтезу аутоантитіл. and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Стандартними Відкладення цих аутоантитіл, особливо тих, що також є варіації в загальній стратегії хімічного спрямовані проти одноланцюгової ДНК, синтезу, наприклад "нативне хімічне зшивання" та асоціюється з розвитком гломерулонефриту, який "зшивання експресованого білка" [див., наприклад, проявляється клінічно як протеінурія, азотемія і Dawson et al, Science 266:776 (1994), Hackeng et al, смерть від ниркової недостатності. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Ниркова недостатність - головна причина Methods Enzymol. 287:34 (1997), Muir et al., Proc. смерті мишей, уражених спонтанним СЧВ, і в Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998) and Severinov штамі НЗЧБ цей процес є хронічним і and Muir, J. Biol Chem. 273:16205(1998)]. облітеруючим. Ця хвороба протікає скоріше і 5. Аналіз злитих білків ТАСІ-імуноглобулін важкіше у самиць, ніж у самців, із середньою Функцію злитих білків ТАСІ-імуноглобулін для тривалістю життя тільки 245 днів порівняно з 406 оцінки їхньої здатності зв'язувати ZTNF4 або днями у самців. Хоча багато з мишей-самиць ZTNF2 можна досліджувати багатьма методами. будуть симптоматичними (протеінурія) к семиДля наочності в Прикладі 4 описуються способи дев'яти місяцям життя, деякі можуть бути значно вимірювання спорідненості до зв'язування ZTNF4 молодшими або старшими, коли в них розвинуться та зв'язуючої здатності ZTNF4. симптоми. Смертельний імунонефрит, який З іншого боку, злиті білки ТАСІ-імуноглобулін спостерігають у НЗЧБ мишей, дуже схожий на можна ідентифікувати за здатністю інгібувати гломерулонефрит, який спостерігають при СЧВ стимуляцію B-клітин людини за допомогою людини, що робить цю спонтанну мишину модель розчинного ZTNF4, як описується в міжнародній дуже привабливою для тестування терапії заявці №WO 00/40716 (Gross et al.). Стисло, Bпотенційного СЧВ [Putterman and Naparstek, клітини людини виділяють з периферійних "Murine Models of Spontaneous Lupus кров'яних мононуклеарних клітин, використовуючи Erythematosus", in Autoimmune Disease Models: A магнітні гранули CD 19 і систему магнітної Guidebook, pages 217-234 [Academic Press, Inc. сепарації VarioMacs (Miltenyi Biotech Auburn, СА) 1994]; Mohan et al., J. Immunol. 154:1470 (1995); за інструкціями виробника. Очищені B-клітини and Як описують Gross et al. в міжнародній заявці Daikh et al., J. Immunol, 159:3104(1997)]. змішують з розчинним ZTNF4 (25нг/мл) і №WO 00/40716, білки ТАСІ-імуноглобулін можна рекомбінантним IL-4 людини (10нг/мл Pharmingen), вводити НЗЧБ мишам для перевірки його і ці клітини висівають на круглодонні 96-ямкові пригнічуючого ефекта на B-клітини упродовж 5планшети по 1x105 клітин на ямку. тижневого періоду, коли, в середньому, як Розчинні білки ТАСІ-імуноглобулін можна вважають, продукування B-клітинних аутоантитіл розбавляти від приблизно 5мкг/мл до приблизно знаходиться на високих рівнях у НЗЧБ мишей. 6нг/мл та інкубувати разом з B-клітинами протягом Стисло, 100 8-тижневого віку мишей-самиць 5 днів, на четвертий день піддаючи вібрації всю (НЗЧxНЗБ) F1 можна поділити на 6 груп по 15 ніч, використовуючи 1mCi 3Н-тимідину на ямку. Для мишей. Перед лікуванням у цих мишей контрою білок ТАСІ-імуноглобулін можна також перевіряють один місяць білок сечовини, беруть інкубувати з B-клітинами та ll-4 без ZTNF4. Клітини кров на клінічний аналіз і заготовку сироватки. з планшетів збирають за допомогою харвестера Сироватку можна перевірити на наявність Пакарда і рахують за допомогою планшет-ридера аутоантитіл. Оскільки протеінурія - це ознакаПакарда. критерій гломерулонефриту, рівні білка сечовини Цей загальний метод використовували для перевіряють за допомогою показника рівня через дослідження трьох злитих білків ТАСІ-Fc. Хоча всі регулярні інтервали впродовж усього курсу злиті білки інгібували проліферацію B-клітин, дослідження. Лікування мишей можна розпочинати структурні компоненти ТАСІ (d1-29, d111-154)-Fc5 приблизно у 5-місячному віці. Миші приймають та TACI(d1-29, d120-154)-Fc5 були сильнішими, ніж інтраперитонеальні ін'єкції тільки наповнювача TACI(d1-29, d107-154)-Fc5. (фізіологічний розчин з фосфатним буфером) або Існують добре адаптовані тваринні моделі для ТАСІ-імуноглобуліну (контрольний білок), або тестування in vivo ефективності білків ТАСІбілка ТАСІ-імуноглобулін (наприклад, 20-100мкг імуноглобулін при певних станах хвороби. контрольного білка на дозу) три рази на тиждень Наприклад, білки ТАСІ-імуноглобулін можна упродовж 5 тижнів. тестувати на ряді тваринних моделей аутоімунної 37 82830 38 перевагою використання моделі АВК є те, що Кров беруть двічі під час лікування, і візьмуть механізми патогенезу відомі. Ідентифіковано принаймні двічі після лікування. Величини епітопи Т- і B-клітин на колагені II типу, визначено показника рівня сечовини для протеінурії і масу різні імунологічні показники (гіперчутливість тіла визначають кожні два тижні після початку сповільненого типу і антитіло проти колагену) і лікування. Беруть кров, знімають величину показники запалення (цитокіни, хемокіни і показника рівня сечовини і визначають масу тіла матрицеруйнуючі ферменти), які відносяться до під час еутаназії. Селезінку і тимус розділяють для імунопатологічного артриту, і їх можна сортинг-аналізу збуджених флуоресцентних клітин використовувати для оцінки ефективності та гістології. Для гістології також беруть композицій в цих моделях [Wooley, Curr. Оріn. піднижньощелепні слинні залози, ланцюг Rheum. 3:407 (1999); Williams et al., Immunol. мезентериального лімфовузла, долку печінки з 89:9184 (1992); Myers et al., Life Sci. 61:1861 жовчним міхурем, сліпу і товсту кишки шлунок, (1997); and Wang et al., Immunol. 92:8955 (1995)]. тонку кишку, підшлункову залозу, праву нирку, У міжнародній [заявці № WO 00/40716 Gross et надниркову залозу, язик з трахеєю і стравоходом, al.] описують спосіб оцінювання ефективності серце і легені. моделі для експериментального Мишині злитих білків ТАСІ-імуноглобулін в зменшенні алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ) використали інтенсивності симптомів, асоційованих з АВК. як інструмент для дослідження і механізму Стисло, самці мишей DBA/1J (Jackson Labs) 8імунопатологічної хвороби і методів потенційного тижневого віку ділять на групи по 5 мишей і терапевтичного втручання. Модель нагадує роблять дві підшкірні ін'єкції дозою 50-100мкл множинний склероз людини і викликає колагену концентрації 1мг/мл (курчачого або демієлінізацію як результат активації Т-клітин до бичачого походження) з інтервалами 3 тижні. нейробілків, наприклад мієлінового головного Одній контрольній групі ін'єкцій колагену не білка або протеоліпідного білка. Інокуляція з роблять. Першу ін'єкцію готують в повному антигеном веде до індукції CD4+, Т-клітин (Тh1), ад'юванті Фрейнда, а другу - в неповному рестриктованих ГКГ (головним комплексом ад'юванті Фрейнда. Білок ТАСІ-імуноглобулін гістосумісності) II класу. Зміни в протоколі ЕАЕ вводять профілактично з другою ін'єкцією або можуть викликати гострий, хронічнорецидивний перед нею, або після того, як тварина розвине або пасивно-перехідний варіанти моделі [Weinberg клінічний індекс 2 або більше, який триває et al., J. Immunol. 162:1818 (1999); Mijaba et al., принаймні 24 години. Тварини починають Cell. Immunol, 186:94 (1999); and Glabinski, Meth. виявляти симптоми артриту після другої ін'єкції Enzym. 288:182 (1997)]. №WO 00/40716 Gross et В міжнародній заявці колагену, як правило, в межах 2-3 тижнів. al. описують один метод оцінювання ефективності Наприклад, контрольний білок TACI-Fc IgFc білків ТАСІ-імуноглобулін в зменшенні людини або фізіологічний розчин з фосфатним інтенсивності симптомів, асоційованих з ЕАЕ. буфером (наповнювач) можна вводити Стисло, 25 самицям мишей PLxSJL F1 (12профілактично, починаючи за 7 днів до другої тижневого віку) роблять підшкірну ін'єкцію ін'єкції (день -7). Білки можна вводити по 100мкг 125мкг/мишу антигена (мієліновий протеоліпідний три рази на тиждень у вигляді білок (ПЛБ), залишки 139-151), приготованого в інтраперитонеальної ступінь хвороби оцінюють в В моделі АВК ін'єкції об'ємом 200мкл, і повному ад'юванті Фрейнда. Мишей ділять на кожній лапі, використовуючи штангенциркуль для продовжують це робити чотири тижні. п'ять груп по 5 мишей. Інтраперитонеальні ін'єкції виміряння товщини лапи, і встановлюють клінічний токсину коклюшу (400нг) роблять на день 0 і день індекс для кожної лапи. Наприклад, клінічний 2. Групам вводять 1х, 10х або 100х дозу білка індекс "0" означає нормальну мишу, індекс "1" ТАСІ-імуноглобулін, одна група буде приймати означає, що один або більше пальців стопи тільки наповнювач, і одна група не буде приймати запалені, індекс "2" означає легке запалення лапи, лікування. Профілактичну терапію починають з індекс "3" означає помірне запалення лапи, і дня 0, втручальну терапію починають на день 7 індекс "4" означає сильне запалення лапи. Тварин або при появі клінічних ознак. Ознаки хвороби, безболісно умертвляють після того, як хворобу втрата ваги і параліч, проявляються приблизно було встановлено за певний період часу, як через 10-14 днів і тривають приблизно один правило, це 7 днів. Лапи забирають на гістологію тиждень. Тварин щоденно оцінюють шляхом або аналіз мРНК, а сироватку беруть на аналіз збирання крові і визначення клінічного індексу, імуноглобуліну та цитокіну. щоб співвіднести зі ступенем їхніх симптомів. Міастенія гравіс (МГ) - ще одна хвороба, для Клінічні ознаки ЕАЕ з'являються в межах 10-14 якої підходять моделі мишей. МГ -це розлад днів інокуляції і зберігаються приблизно один нервово-м'язової передачі, в якому бере участь тиждень. Наприкінці дослідження всіх тварин продукування аутоантитіл, спрямованих проти безболісно умертвляють наддозою газу і роблять нікотинного ацетилхолінового рецептора. Ця розтин. Мозок і хребет беруть на гістологію або хвороба набуває клінічних ознак або наслідує заморожують для аналізу мРНК. По даним про клінічні ознаки, в тому числі ненормальну масу тіла і клінічному індексу будують криві по слабкість і втому при напруженні. кожній особині і по групах. викликаного колагеном В моделі артриту, Мишину модель міастенії гравіс встановлено (АВК), миші розвивають хронічний запальний [Christadoss et al., "Establishment of a Mouse Model артрит, який дуже нагадує ревматоїдний артрит of Myasthenia gravis which Mimics Human (РА) людини. Оскільки АВК має аналогічні з РА Myasthenia gravis Pathogenesis for Immune імунологічні та патологічні ознаки, це робить цю Intervention", in Inmnmobiology of Proteins and модель ідеальною для перевірки потенційних Peptides VIII, Atassi and Bixler (eds.), pages 195-199 протизапальних композицій для людини. Іншою 39 82830 40 ТАСІ-імуноглобуліну на протікання клінічної (1995)]. Експериментальна аутоімунна міастенія міастенії гравіс, рівень антитіл проти гравіс - це опосередкована антитілами хвороба, ацетилхолінового рецептора та ізотопів і втрату яка характеризується наявністю антитіл до м'язового ацетилхолінового рецептора. ацетилхолінового рецептора. Ці антитіла руйнують На день 0 і день 30 можна імунізувати згаданий рецептор, призводячи до дефективних приблизно 100 мишей за допомогою 20мкг нервово-м'язових електричних імпульсів, і в ацетилхолінового рецептора, приготованого в результаті - до м'язової слабкості. В моделі повному ад'юванті Фрейнда. Мишей з клінічною експериментальної аутоімунної міастенії гравіс міастенією гравіс ділять на чотири групи. Групі А мишей імунізують за допомогою нікотинного вводять інтраперитонеально 100мкг контрольного ацетилхолінового рецептора. Клінічні ознаки Fc, групі В-20мкг контрольного Fc, групі С -100мкг міастенії гравіс стають явними через тижні після TACI-Fc і групі D-20мкг TACI-Fc три рази на другої імунізації. Експериментальну аутоімунну тиждень упродовж чотирьох тижнів. Мишей міастенію гравіс оцінюють кількома методами, в зважують і беруть кров для сироватки на день 15 і тому числі вимірюванням рівнів антитіл день 30 після початку лікування. Сироватку ацетилхолінового рецептора в сироватці шляхом перевіряють на антитіла проти ацетилхолінового радіоімунного аналізу [Christadoss and Dauphinee, рецептора та ізотопи, як описувалось вище. J. Immunol. 136:2437 (1986); Lindstrom et al., Можна також виміряти втрату м'язового Methods Enzymol. 74:432 (1981)), вимірюванням ацетилхоліновогогалузі можуть застосовувати інші Фахівці в цій рецептора. ацетилхолінового рецептора м'язів або придатні методи аналізу злитих білків ТАСІелектроміографією (Coligan et al. (Eds.), Protocols імуноглобулін. in Immunology. Vol. 3, page 15.8.1 (John Wiley & 6. Продукування кон'югатів ТАСІ-імуноглобулін Sons, 1977)]. Даний винахід включає хімічно модифіковані Вплив ТАСІ-імуноглобуліну на композиції ТАСІ-імуноглобулін, в яких поліпептид експериментальну аутоімунну міастенію гравіс ТАСІ-імуноглобулін зв'язаний з полімером. Як можна визначати шляхом введення злитих білків правило, цей полімер є водорозчинним, так що упродовж протікання клінічної міастенії гравіс у кон'югат ТАСІ-імуноглобулін не осаджується у мишей BG. Наприклад, 100 мишей BG імунізують водному середовищі, наприклад фізіологічному за допомогою 20мкг ацетилхолінового рецептора в середовищі. Прикладом придатного полімеру є повному ад'юванті Фрейнда на день 0 і 30. полімер, модифікований так, щоб мати одну Приблизно 40-60% мишей розвинуть помірну реакційну групу, наприклад активний складний (ступінь 2) - важку, (ступінь 3) клінічну міастенію ефір для ацилювання або альдегід для гравіс після повторної імунізації ацетилхоліновим алкілування. Таким шляхом можна контролювати рецептором. Мишей з клінічною хворобою ступінь полімеризації. Прикладом реактивного ступеней 2 і 3 ділять на три групи (з однаковими альдегіду є поліетилен глікольпропіональдегід або ступенями слабкості), зважують (миші зі слабкістю його моно-(С1-С10)алкокси- або арилоксидеривати також втрачають вагу, оскільки мають утруднення [див., наприклад, Harris et al., US Patent No. із споживанням їжі та води) і беруть кров для 5252714]. Цей полімер може бути розгалуженим сироватки (для попереднього введення антитіл або нерозгалуженим. Більш того, для проти ацетилхолінового рецептора та ізотопів). продукування кон'югатів ТАСІ-імуноглобулін Групі А вводять інтраперитонеально фізіологічний можна застосовувати суміш полімерів. розчин з фосфатним буфером, групі В вводять Кон'югати ТАСІ-імуноглобулін, застосовувані інтраперитонеально IgG-Fc людини як для лікування, можуть містити частини контрольний білок (100мкг), і групі С вводять фармацевтично прийнятних водорозчинних 100мкг TACI-Fc три рази на тиждень упродовж полімерів. Придатними водорозчинними чотирьох тижнів. Мишей перевіряють на клінічну полімерами є поліетиленгліколь (ПЕГ), м'язову слабкість двічі на тиждень, зважують і монометокси-ПЕГ, моно-(С1-С10)алкокси-ПЕГ, беруть кров для сироватки на день 15 і день 30 арилокси-ПЕГ, полі-(N-вінилпіролідон)ПЕГ, після початку лікування. Всю кров збирають на тресилмонометокси-ПЕГ, пропіональдегід-ПЕГ, день 15 для визначення співвідношення Т-клітин і bis-сукцинімідилкарбонат-ПЕГ, гомополімери B-клітин методом аналізу за допомогою клітинного поліетиленгліколю, співполімер сортера з активацією флуоресценції, поліпропіленоксиду і етиленоксиду, використовуючи маркери В220 і CD5. Мишей, які поліоксиетильовані поліоли (наприклад, гліцерин), вижили, вбивають через 30-45 днів після початку полівініловий спирт, декстран, целюлоза або інші лікування, і їхні тушки заморожують для наступної полімери на основі карбогідрату. Придатний ПЕГ екстракції м'язового ацетилхолінового рецептора і має молекулярну масу приблизно 600-60000, в визначення втрати м'язового ацетилхолінового тому числі, наприклад, 5000, 12000, 20000 і 25000. рецептора, головну патологію при міастенії гравіс Кон'югат ТАСІ-імуноглобулін може також містити [див., наприклад, Coligan et al. (Eds.), Protocols in суміш таких водорозчинних полімерів. Один приклад кон'югату ТАСІ-імуноглобулін Immunology, Vol.3, page 15.8.1 (John Wiley & Sons, містить ТАСІ-імуноглобулінову частину і 1997)]. Сироваткові антитіла проти м'язового поліалкілоксидну частину, прикріплену до N-кінця ацетилхолінового рецептора можна визначити ТАСІ-імуноглобуліну. ПЕГ є одним таким традиційним радіоімунним аналізом, а ізотопи придатним поліалкілоксидом. Наприклад, ТАСІ(IgM, IgG1, IgG2b та IgG2c) антитіл проти імуноглобулін можна модифікувати за допомогою ацетилхолінового рецептора виміряють, ПЕГ, цей процес відомий як використовуючи ферментний імуносорбентний "поліетиленгліколізація". Поліетиленгліколізацію тест (ELISA). Ці методи відомі. Визначають вплив 41 82830 42 pH, який дає можливість скористатися різницями в ТАСІ-імуноглобуліну можна здійснювати будьступенях кислотності між ε-аміногрупами лізинових якою з відомих реакцій поліетиленгліколізації [див., наприклад, ЕР 0154316, Delgado et al., залишків та a-аміногрупою N-кінцевого залишку Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems білка. Шляхом такої вибіркової реакції заміщення 9:249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. керують прикріпленням водорозчинного полімеру, Pharmacokwet. 27:290 (1994), and Francis el al., hit. що містить реакційну групу, наприклад альдегід, J Hematol 68:1 (1998)]. Наприклад, до білка. Кон'югація з полімером відбувається, поліетиленгліколізацію можна здійснювати головним чином, на N-кінці білка без значної реакцією ацилювання або алкілування за модифікації інших реакційних груп, наприклад допомогою реакційної молекули аміногруп бічного ланцюга лізину. Даний винахід поліетиленгліколю. В іншому методі кон'югат ТАСІпропонує, головним чином, однорідну композицію імуноглобулін формують, конденсуючи монополїмерних кон'югатів ТАСІ-імуноглобулін. активований ПЕГ, в якому кінцеву гідрокси- або Відновлювальне алкілування для аміногрупу ПЕГ було замінено активованим продукування, головним чином, однорідної лінкером [див., наприклад, Korasiewicz et al., US сукупності молекул монополімерного кон'югату Patent No. 5382657]. ТАСІ-імуноглобулін може включати етапи: а) Поліетиленгліколізація шляхом ацилювання, взаємодію поліпептиду ТАСІ-імуноглобулін з як правило, потребує взаємодії активного реакційним ПЕГ за умов відновлювального складного ефіру, деривату ПЕГ, з поліпептидом алкілування при pH, придатному для здійснення ТАСІ-імуноглобулін. Прикладом ефіру селективної модифікації a-аміногруп на амінокінці активованого ПЕГ є ПЕГ, естерифікований до NТАСІ-імуноглобуліну, і б) отримання продукту гідроксисукциніміду. Використаний тут термін (продуктів) реакції. Відновник, застосовуваний для "ацилювання" включає наступні типи зв'язків між відновлювального алкілування, повинен бути ТАСІ-імуноглобуліном і водорозчинним полімером: стабільним у водному розчині і здатним амід, карбамат, уретан тощо. Методи отримання відновлювати тільки шифову основу, утворену поліетиленгліколізованого ТАСІ-імуноглобуліну напочатку відновлювального алкілування. шляхом ацилювання, як правило, передбачають Прикладами відновників є борогідрид натрію, етапи: а) взаємодію поліпептиду ТАСІціаноборогідрид натрію, боран диметиламіну, імуноглобулін з ПЕГ (наприклад, реакційним боран триметиламіну іголовним чином, сукупності Для однорідної, боран піридину. ефіром альдегіду, похідного ПЕГ) за умов, за яких монополімерних кон'югатів ТАСІ-імуноглобулін одна або більше груп ПЕГ прикріплюються до реакційні умови для відновлювального ТАСІ-імуноглобуліну, і б) отримання продукту алкілування є такими, що дають можливість (продуктів) реакції. Взагалі ж, оптимальні реакційні селективного прикріплення частини умови для реакцій ацилювання визначатимуть на водорозчинного полімеру до N-кінця ТАСІоснові відомих параметрів і заданих результатів. імуноглобуліну. Ці реакційні умови, як правило, Наприклад, чим більше співвідношення ПЕГ:ТАСІпередбачають різницю між ступенями кислотності імуноглобулін, тим більше процентний вміст лізинових аміногруп і α-аміногруп на N-кінці. pH продукту поліетиленгліколізований ТАСІтакож впливає на співвідношення полімер-білок, імуноглобулін. Продуктом поліетиленгліколізації шляхом яке необхідно застосувати. Як правило, якщо pH ацилювання є, як правило, продукт нижче, то для досягнення оптимальних умов буде поліетиленгліколізований ТАСІ-імуноглобулін, в необхідний більший надлишок полімеру відносно якому лізинові ε-аміногрупи білка, тому що чим менш реакційною є N-кінцева поліетиленгліколізують через ацильну зв'язуючу α-аміногрупа, тим більше необхідно полімеру. групу. Прикладом з'єднувального зв'язку є амід. Як Якщо pH вище, співвідношення полімер-ТАСІправило, отриманий в результаті ТАСІімуноглобулін може не бути таким великим, бо імуноглобулін буде принаймні на 95% моно-, диреакційні групи доступні. Зазвичай pH знаходиться або триполіетиленгліколізованим, хоча можна в межах 3-9 або 3-6. Іншим фактором є молекулярна маса формувати деякі види з більшими ступенями водорозчинного полімеру. Як правило, чим вище поліетиленгліколізації в залежності від реакційних молекулярна маса полімеру, тим менше кількість умов. Поліетиленгліколізовані види можна полімеру, яку можна прикріплювати до білка. Для відокремлювати від некон'югованих полі пептидів реакцій поліетиленгліколізації типовою ТАСІ-імуноглобулін, застосовуючи стандартні молекулярною масою є приблизно 2-100кДа, методи очищення, наприклад діаліз, приблизно 5-50кДа або приблизно 12-25кДа. ультрафільтрування, іонообмінну хроматографію, Молярне відношення водорозчинного полімеру до афінну хроматографію тощо. Поліетиленгліколізація шляхом алкілування, як ТАСІ-імуноглобуліну знаходиться, як правило, в правило, включає в себе взаємодію кінцевого межах 1:1-100:1. Типово, молярне відношення альдегіду, похідного ПЕГ, з ТАСІ-імуноглобуліном водорозчинного полімеру до ТАСІ-імуноглобуліну у присутності відновника. Групи поліетиленгліколю становитиме 1:1-20:1 для можна прикріплювати до поліпептида через групу поліполіетиленгліколізації і 1:1-5:1 для СН2-NH. монополіетиленгліколізації. Загальні методи продукування кон'югатів, що Отримання шляхом заміщення через містять частини поліпептиду і водорозчинного відновлювальне алкілування для створення полімеру, в галузі відомі. Див., наприклад, монополіетиленгліколізованого продукту [Karasiewicz et al., US Patent No. 5382657, використовує різну реакційну здатність різних типів Greenwald et al., US Patent No. 5738846, Nieforth et первинних аміногруп, доступних для реакції al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh заміщення. Як правило, реакцію здійснюють при et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997)]. 43 82830 44 Affinity Chromatography: Principles & Methods Даний винахід розглядає композиції, що (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) and Doonan, містять описаний тут пептид або поліпептид. Такі Protein Purification Protocols (The Humana Press композиції можуть додатково містити носій. Носієм 1996). може бути традиційний органічний або Фахівці в цій галузі можуть розробити неорганічний носій, наприклад вода, буферний додаткові варіанти виділення і очищення ТАСІрозчин, спирт, пропіленгліколь, макроголь, імуноглобуліну. Наприклад, для виділення великих кунжутна олія, кукурудзяна олія тощо. кількостей білка шляхом імуноафінного очищення 7. Виділення поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін можна застосувати антитіла проти ТАСІ або проти Запропоновані даним винаходом поліпептиди Fc. можна очистити до чистоти принаймні 80%, Запропоновані даним винаходом поліпептиди принаймні 90%. Принаймні 95% або більше можна також виділяти, використовуючи конкретні стосовно до забруднюючих макромолекул, властивості. Наприклад, для очищення білків з зокрема інших білків та нуклеїнових кислот, та високим вмістом гістидину, в тому числі білків, що звільнити від інфекційних та пірогенних агентів. містять полігістидинові мітки, можна застосувати Запропоновані поліпептиди можна також очистити адсорбційну хроматографію імобілізованих іонів до фармацевтично чистого стану, тобто більш ніж металу. Стисло, спочатку заряджають гель іонами до 99,9% чистоти. В деяких композиціях очищений двовалентного металу, щоб утворити хелат поліпептид здебільшого не містить інших [Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)]. Білки з поліпептидів, зокрема інших поліпептидів високим вмістом гістидину будуть адсорбуватись в тваринногоотримання композицій синтетичних Для походження. цю матрицю з різними ступенями спорідненості в поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін та залежності від використаного іону металу, і будуть рекомбінантних поліпептидів ТАСІ-імуноглобулін, вимиватися в результаті конкурентної елюції, очищених від рекомбінантних клітин-хазяїв, можна знижуючи pH, або використання сильних використовувати методи фракціонування та/або хелатоутворюючих агентів. Інші способи очищення звичайного очищення. Для фракціонування включають очищення глікозильованих білків зразків, як правило, можна використовувати афінною хроматографією лектину, преципітацію сульфату амонію та кислотне або хроматографією білка А та іонообмінною хаотропне екстрагування. Наприклад, етапи хроматографією [M.Deutscher, (ed.),Meth. Enzymol. очищення можуть включати гідроксиапатит, 182:559 (1990)]. Поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін або їх розмірну ексклюзію, рідинну хроматографію фрагменти можна також утворити хімічним високого розділення та рідинну хроматографію синтезом, як вже описувалось. Поліпептиди ТАСІвисокого розділення з оберненою фазою. імуноглобулін можуть бути мономерами або Відповідні хроматографічні середовища полімерами; глікозильованими або включають отримані шляхом заміщення неглікозильованими, поліетиленглікозильованими декстрани, агарозу, целюлозу, поліакриламід, або неполіетиленглікозильованими, і можуть спеціалізовані оксиди кремнію тощо. Придатними включати залишок початкової метіонінової є похідні поліетиленгліколю (ПЕГ), амінокислоти або не включати його. Злитий білок діетиламіноетилу (ДЕАЕ), глутамінаміноетилу ТАСІ-імуноглобулін може бути неглікозильованим, (ГАЕ) та глутаміну (Г). Прикладами глікозильованим або глікозильованим лише в хроматографічних середовищ є середовища, частині ТАСІ або в імуноглобуліновій частині. отримані за допомогою фенілових, бутилових або Імуноглобулінову частину можна отримати з октилових груп, наприклад феніл-сефароза FF антитіла людини, химерного антитіла або (Pharmacia), тойопербутил 650 (Toso Haas, олюдненого антитіла. застосування поліпептидів 8. Терапевтичне Montgomeryville, PA), октил-сефароза (Pharmacia) ТАСІ-імуноглобулін тощо; або поліакрилатні смоли, наприклад Білки ТАСІ-імуноглобулін можна амберхром CG 71 (Toso Haas) тощо. Відповідні використовувати для модуляції імунної системи тверді носії включають скляні гранули, смоли на шляхом зв'язування ZTNF4 або ZTNF2, і, таким основі оксиду кремнію, целюлозні смоли, гранули чином, запобігаючи зв'язуванню цих лігандів з агарози, гранули зшитої агарози, гранули ендогенними рецепторами ТАСІ або ВСМА. В полістиролу, смоли зшитого поліакриламіду тощо, зв'язку з цим даний винахід включає застосування які є нерозчинними в умовах, в яких їх слід білків ТАСІ-імуноглобулін до суб'єкту, якому не використовувати. Ці носії можна модифікувати вистачає адекватної кількості рецепторів ТАСІ або реакційними групами, які роблять можливим ВСМА, або який виробляє надлишок ZTNF4 або прикріплення білків аміногрупами, карбоксильними ZTNF2. Ці молекули можна вводити будь-якому групами групами, Прикладамисульфгідрильними хімічних технологій спряження є суб'єкту, що потребує лікування, і даний винахід гідроксильними бромціану,та/абоактивація активація групами карбогідратними Nрозглядає і ветеринарне терапевтичне частинами. гідроксисукциніміду, активація епоксисполуки, застосування, і терапевтичне застосування для сульфгідрильна активація, активація гідразиду, та людини. Суб'єкти включають суб'єктів-ссавців, карбоксильні та амінопохідні для хімічних наприклад сільськогосподарських тварин, технологій спряження карбодиіміду. Ці та інші домашніх тварин і пацієнтів-людей. тверді середовища добре відомі, широко Поліпептиди ТАСІ-імуноглобулін можна застосовуються в цій галузі і їх можна придбати у використовувати для лікування аутоімунних фірм-постачальників. Вибір конкретного методу хвороб, видів раку B-клітин, імуномодуляції, виділення поліпептиду та очищення - справа хвороб, що розповсюджуються комахами, та будьзвичайного плану досліду і визначається частково яких патологій, пов'язаних з антитілами властивостями вибраного носія. Див., наприклад, 45 82830 46 мінімальними змінами. Ці способи могли б також (наприклад, непрямої Т-клітинної патології, служити терапевтичними аплікаціями для міастенії гравіс тощо), ниркових хвороб, непрямої лікування вторинного гломерулонефриту або Т-клітинної імунної реакції, відторгнення васкуліту, пов'язаному з такими хворобами, як трансплантата і реакції "трансплантат проти звичайний вовчак, поліартеріїт, хвороба Генохахазяїна". Запропоновані даним винаходом Шенлейна, склеродермія, ВІЛ-пов'язані хвороби, поліпептиди можуть бути мішенями, зокрема для амілоідоз або гемолітикоуремічний синдром. регулювання гуморальних імунних реакцій під час Запропоновані даним винаходом способи були б імунної реакції. Крім того, запропоновані також корисними як частина терапевтичної поліпептиди можна використовувати для модуляції аплікації для лікування інтерстиціального нефриту розвитку В-клітин, розвитку інших клітин, або пієлонефриту, пов'язаному з хронічним продукування антитіл і цитокінів. Запропоновані пієлонефритом, зловживання аналгетиками, поліпептиди можуть також модулювати нефрокальциноз, нефропатія, викликана іншими комунікацію Т- і B-клітин шляхом нейтралізації агентами, нирковокам'яна хвороба або хронічний проліферативних ефектів ZTNF4. чи гострий інтерстиціальний нефрит. Запропоновані поліпептиди ТАСІЗапропоновані способи можуть також імуноглобулін можуть бути корисними для включати використання білків ТАСІ-імуноглобулін нейтралізації ефектів ZTNF4 при лікуванні пре-Вв лікуванні гіпертонічної хвороби або хвороби або B-клітинних лейкозів, наприклад крупних судин, в тому числі стеноз або плазмоцитарного лейкозу, хронічного або гострого закупорювання ниркової артерії та холестеринові лімфолейкозу, мієлом, наприклад множинної емболи або ниркові емболи. мієломи, дифузної ендотеліоми кісток та Даний винахід також пропонує способи гігінтоклітинної остеобластоми, та лімфом, лікування ниркових або урологічних пухлин, наприклад лімфоми не Ходжкіна, з якою пов'язане множинних мієлом, лімфом, нейропатії легкого збільшення поліпептидів ZTNP4. клітинах CD8+, ZTNF4 експресується в ланцюга або амігоідозу. моноцитах, дендритних клітинах, активованих Винахід також пропонує способи блокування моноцитах, що означає, що при певних або інгібування активованих В-клітин за аутоімунних розладах цитотоксичні Т-клітини допомогою білків ТАСІ-імуноглобулін для могли стимулювати продукування B-клітин через лікування астми або інших хронічних хвороб надлишкове продукування ZTNF4. Білки дихальних шляхів, наприклад бронхіту та імунодепресантів, які селективно блокують дію Bемфіземи. Описані тут білки ТАСІ-імуноглобулін лімфоцитів, стали б у пригоді для лікування також можна використати для лікування синдрому хвороби. Продукування аутоантитіл є загальним Шегрена. Винахід також пропонує способи інгібування для кількох аутоімунних захворювань і сприяє або нейтралізації Т-клітинної імунної реакції пошкодженню тканини та загостренню хвороби. ефектора за допомогою білків ТАСІ-імуноглобулін, Аутоантитіла можуть також привести до для використання в імуносупресії, зокрема для виникнення ускладнень у вигляді відкладення лікування реакції "трансплантат проти хазяїна" та імунних комплексів і привести до багатьох відторгнення трансплантата. Більш того, білки симптомів системного червоного вовчака, в тому ТАСІ-імуноглобулін були б корисними для числі ниркової недостатності, невралгічних лікування таких аутоімунних хвороб, як симптомів і смерті. В багатьох станах хвороби інсулінозалежний цукровий діабет або хвороба також було б вигідним модулювання продукування Крона. Запропоновані способи мали б додаткову антитіл незалежно від клітинної реакції. Виявили терапевтичну цінність при лікуванні хронічних також, що B-клітини відіграють роль в секреції запальних хвороб, зокрема для зменшення болю в артритогенних імуноглобулінів при ревматоїдному суглобах, припухлості, анемії та інших артриті. Як таке, інгібування продукування антитіл асоційованих симптомів, а також для лікування ZTNF4 було б корисним в лікуванні аутоімунних септичного шоку. Існують адаптовані тваринні моделі для хвороб, таких як міастенія гравіс, ревматоїдний тестування in vivo ефективності запропонованих артрит, багатосуглобна хвороба Стила та білків ТАСІ-імунолобулін при певних станах псоріатичний артрит. Для таких цілей корисним хвороби. Зокрема, білки ТАСІ-імуноглобулін можна було б лікування імунодепресантами, наприклад тестувати in vivo в ряді тваринних моделей білками ТАСІ-імуноглобулін, які селективно аутоімунної хвороби, наприклад лініях MRL-lpr/lpr блокують або нейтралізують способи застосування Даний винахід пропонує дію В-лімфоцитів. мишей або лініях НЗЧхНЗБ F1 конгенних мишей, білків ТАСІ-імуноглобулін для селективного які служать моделлю системного червоного блокування або нейтралізації дій B-клітин на вовчака (СЧВ). Такі тваринні моделі відомі. кінцевій стадії ниркових хвороб, які можуть бути Нащадки схрещування між новозеландськими пов'язані або непов'язані з аутоімунними чорними (НЗЧ) і новозеландськими білими (НЗБ) хворобами. Ці способи також були б корисними мишами розвивають спонтанну форму СЧВ, яка для лікування імунологічних ниркових хвороб. Ці дуже нагадує СЧВ у людей. Миші-нащадки, відомі способи також були б корисними для лікування як НЗЧБ, починають розвивати аутоантитіла класів гломерулонефритів, пов'язаних з такими IgM проти Т-клітин в одномісячному віці і к 5-7 хворобами, як мембранна нефропатія, місяцям аутоантитіла Ig проти ДНК є домінантним нефропатія, пов'язана з IgA, або хвороба Бергера, імуноглобуліном. Поліклональна гіперактивність Bнефропатія, пов'язана з IgM, хвороба Гудпасчера, клітин призводить до перевиробництва постінфекційний гломерулонефрит, аутоантитіл. Відкладення цих аутоантитіл, зокрема мезангіопроліферативна хвороба, хронічний тих, що спрямовані проти одноланцюгової ДНК, лімфолейкоз, нефротичний синдром з 47 82830 48 вимірюванням рівнів антитіл АХР в сироватці асоціюються з розвитком гломерулонефриту, який шляхом радіоімунного аналізу, вимірюванням АХР клінічно проявляється як протеінурія, азотемія і м'язів або електроміографією. смерть через ниркову недостатність. Ниркова Взагалі, доза білка ТАСІ-імуноглобулін, яку недостатність - головна причина смерті мишей, вводять, буде мінятися в залежності від таких уражених спонтанним СЧВ, і в лінії НЗЧБ цей факторів, як вік суб'єкту, вага, зріст, стать, процес є хронічним і облітеративним. Хвороба загальний медичний стан і попередня історія протікає швидше і важкіше у самиць, ніж у самців, хвороби. Як правило, необхідно ввести пацієнту з середньою тривалістю життя лише 245 днів у дозу білка ТАСІ-імуноглобулін, яка знаходиться самиць порівняно з 406 днями у самців. Хоча вмежах 1пг/кг-10мг/кг (кількість агента на масу багато з мишей-самиць будуть симптоматичними суб'єкту), хоча в залежності від обставин можна (протеінурія) к 7-9 місяцям життя, деякі можуть також вводити меншу або більшу дозу. бути значно молодшими або старшими, коли в них Введення білка ТАСІ-імуноглобулін суб'єкту розвинуться симптоми. Смертельний може бути внутрішньовенним, імунонефрит, який спостерігають у НЗЧБ мишей, внутрішньоартеріальним, інтраперитонеальним, дуже схожий на гломерулонефрит, який внутрішньом'язовим, підшкірним, спостерігають при СЧВ людини, що робить цю інтраплевральним, внутрішньооболонковим, спонтанну мишину модель дуже привабливою для шляхом перфузії через катетер або шляхом ін'єкції тестування потенційної терапії СЧВ. прямо всередину ураження. Введення Мишині моделі для експериментального терапевтичних білків шляхом ін'єкції може бути у алергічного енцефаломієліту (ЕАЕ) використали вигляді безперервного вливання або одноразового як інструмент для дослідження і механізмів чи багаторазовихшляхи Додаткові болюсів. введення включають імунопатологічної хвороби, і методів потенційного пероральний, в мембрану слизової оболонки, терапевтичного втручання. Модель нагадує легеневий та черезшкірний. Пероральне введення множинний склероз людини і викликає підходить для поліефірних мікросфер, зеінових демієлінізацію як результат активації Т-клітин до мікросфер, протеіноідних мікросфер, нейробілків, наприклад мієлінового головного поліціаноакрилатних мікросфер і систем на основі білка або протеоліпідного білка. Інокуляція з ліпідів [див., наприклад, DiBase and Morrel, "Oral антигеном веде до індукції CD4+ ГКГ(головним Delivery of Microencapsulated Proteins", in Protein комплексом гістосумісності)-рестриктованих ТDelivery: Physical Systems, Sanders and Hendren клітин (Тh1). Зміни в протоколі ЕАЕ можуть (eds.), pages 255-288 (Plenum Press 1997)]. викликати гострий, хронічно-рецидивний або Прикладом внутрішньоносового введення може пасивно-перехідний варіанти моделі. служити введення інсуліну [див., наприклад, В моделі артриту, викликаного колагеном Hinchcliffe and IlIum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (АВК), миші розвивають хронічний запальний (1999)].Сухі або рідкі частинки, що містять ТАСІартрит, який дуже нагадує ревматоїдний артрит імуноглобулін, можна готувати та вдихати у (РА) людини. Оскільки АВК має аналогічні з РА вигляді дисперсій сухого порошку, за допомогою імунологічні та патологічні ознаки, це робить цю рідких аерозольних генераторів або розпилювачів модель ідеальною для перевірки потенційних [наприклад, Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 протизапальних композицій для людини. Іншою (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 перевагою використання моделі АВК є те, що (1999)]. Прикладом цього методу є система AERX механізми патогенезу відомі. Ідентифіковані для лікування діабету, яка являє собою епітопи Т- і B-клітин на колагені II типу, визначені електронний інгалятор, що утримується рукою і різні імунологічні показники (гіперчутливість транспортує інсулін у формі аерозолю в легені. сповільненого типу та антитіло проти колагену) і Дослідження показали, що білки розміром показники запалення (цитокіни, хемокіни і 48000кДа транспортуються крізь шкіру в матрицеруйнуючі ферменти), які відносяться до терапевтичних концентраціях за допомогою імунопатологічного артриту, і їх можна низькочастотного ультразвуку, що ілюструє використовувати для оцінки ефективності можливість черезшкірного введення [Mitragotri et композицій в цих моделях. - ще одна аутоімунна Міастенія гравіс (МГ) al., Science 269:850 (1995)]. Трансдермальне хвороба, для якої підходять моделі мишей. МГ транспортування з використанням електропорації розлад нервово-м'язової передачі, в якій бере забезпечує інший метод введення білка ТАСІучасть продукування аутоантитіл, спрямованих імуноглобулін [Potts et al., Pharm. Biotechnol. роти нікотинного ацетилхолінового рецептора 70:213 (1997)]. Фармацевтичну композицію, що містить білок (АХР). МГ набуває клінічних ознак або наслідує ТАСІ-імуноглобулін, можна приготувати за клінічні ознаки, в тому числі слабкість і втому при відповідними методами приготування напруженні. Мишину модель МГ установлено. фармацевтично корисних композицій, згідно з Експериментальна аутоімунна міастенія гравіс якими терапевтичні білки поєднують у вигляді (ЕАМГ) - це опосередкована антитілами хвороба, суміші з фармацевтично прийнятним носієм. яка характеризується наявністю антитіл до АХР. Ці Композицію називають "фармацевтично антитіла руйнують згаданий рецептор, призводячи прийнятним носієм", якщо її введення до дефективних нервово-м'язових електричних переноситься пацієнтом-реципієнтом. Одним імпульсів, і в результаті до м'язової слабкості. В прикладом фармацевтично прийнятного носія є моделі ЕАМГ мишей імунізують за допомогою стерильний фізіологічний розчин з фосфатним нікотинного АХР. Клінічні ознаки МГ стають буфером. Фахівцям в цій галузі відомі й інші явними через тижні після другої імунізації. ЕАМГ придатні носії. Див., наприклад, [Gennaro (ed.), оцінюють кількома методами, в тому числі 49 82830 50 способу приготування ліпосоми можуть бути Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition одноламелярними або багатоламелярними, (Mack Publishing Company 1995)]. можуть бути різними за розміром, з діаметрами З лікувальними цілями білки ТАСІ0,02мкм ->10мкм. В ліпосоми можна імуноглобулін вводять пацієнту в терапевтично інкапсюлювати різноманітні агенти: розділення ефективній кількості. Кажуть, що білок ТАСІгідрофобних агентів у бішарах і розділення імуноглобулін і фармацевтично прийнятний носій гідрофільних агентів всередині внутрішнього вводять у "терапевтично ефективній кількості", водного простору (просторів) [див., наприклад, якщо кількість, яку вводять, є фізіологічно Machy et al, Liposomes In Cell Biology And значущою. Агент є фізіологічно значущим, якщо Pharmacology (John Libbey 1987), and Ostro et al., його присутність дає в результаті виявну зміну у American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)]. Більш фізіології пацієнта-реципієнта. Наприклад, того, можна регулювати терапевтичну доступність застосований для лікування запалення агент є інкапсульованого агента, змінюючи розмір фізіологічно значущим, якщо його присутність ліпосом, кількість бішарів, ліпідний склад, а також зменшує запальну реакцію. Ще один приклад: наповнення та поверхневі властивості ліпосом. агент, застосований для інгібування росту Ліпосоми можуть адсорбуватись фактично в пухлинних клітин, є фізіологічно значущим, якщо будь-який тип клітин і потім повільно вивільняти введення цього агента веде до зменшення інкапсульований агент. З іншого боку, кількості пухлинних коітин, зменшення метастазу, абсорбована ліпосома може бути ендоцитозована зменшення розміру твердої пухлини або клітинами, які є фагоцитарними. За ендоцитозом збільшення некрозу пухлини. Далі, агент, відбувається внутрішньолізосомна деградація використаний для лікування системного червоного ліпосомних ліпідів і вивільнення інкапсульованих вовчака, є фізіологічно значущим, якщо введення агентів [Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. цього агента веде до зменшення циркулюючих 446:368 (1985)]. Після внутрішньовенного антитіл проти дволанцюгової ДНК або до введення маленькі ліпосоми (0,1-1,0мкм), як зменшення принаймні одного з наступних правило, захоплюються клітинами симптомів: лихоманки, болю в суглобах, ретикулоендотеліальної системи, які знаходяться, патологічних змін еритематозної шкіри або інших головним чином, в печінці та селезінці, тоді як ознак системного червоного вовчака. Прикладом ліпосоми розміром більш ніж 3,0мкм загального показника того, що білок ТАСІвідкладаються в легені. Це вибіркове захоплення імуноглобулін введено у терапевтично ефективній менших ліпосом клітинами кількості є те, що після введення суб'єкту ретикулоендотеліальної системи було спостерігають зменшення циркулюючих рівнів Фармацевтичну композицію, що містить білок використане для транспортування ТАСІ-імуноглобулін, можна приготувати в рідкій ZTNF4 (BlyS). хемотерапевтичних агентів в систему Ретикулоендотеліальну макрофаги і в можна формі, у вигляді аерозолю або в твердій формі. перехитрувати кількома способами, в тому числі пухлини печінки. Рідкі форми являють собою впорскувані розчини і насиченням великими дозами ліпосомних суспензії для перорального введення. Тверді частинок або селективною інактивацією форми включають капсули, таблетки і форми з макрофагів фармакологічними засобами [Claassen контрольованим вивільненням. Прикладом et al., Biochim. Biophys. Ada 802:428 (1984)]. Крім останньої форми є мініосмотичні насоси та того, включення фосфоліпідів, похідних від імплантати [Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 гліколіпідів або поліетиленгліколю, в мембрани (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", in Drug ліпосом показало, що в результаті це значно Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), зменшує захоплення ретикулоендотеліальною pages 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., системою [Allen et al., Biochim. Biophys. Acta "Protein Delivery with Infusion Pumps", in Protein 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys Ada Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren 1150:9 (1993)]. Можна приготувати ліпосоми так, щоб вони (eds.), pages 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey націлювались на конкретні клітини або органи, et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release шляхом замінення фосфоліпідного складу або Injectable Implant", in Protein Delivery: Physical вставляння рецепторів або лігандів в ліпосоми. Systems, Sanders and Hendren (eds.), pages 93-117 Наприклад, ліпосоми, приготовані з високим (Plenum Press 1997)]. вмістом неіонного сурфактанта, застосували, щоб Одним з засобів введення суб'єкту поцілити в печінку [Hayakawa et al., Japanese терапевтичних поліпептидів, внутрішньовенно, Patent 04-244018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. інтраперитонеально, внутрішньооболонково, J6:960 (1993)]. Ці композиції готували, змішуючи внутрішньом'язово, перорально, вдиханням або інтраназально, є ліпосоми. Ліпосоми - це фосфатидилхолін сої, a-токоферол та мікроскопічні бульбашки, які складаються з одного етоксильовану гідрогенізовану касторову олію або більше ліпідних бішарів, що оточують водні (НСО-60) в метанолі, концентруючи цю суміш у компартменти [див., Bakker-Woudenberg et al, Eur. вакуумі, а потім відновлюючи цю суміш водою. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 Ліпосомна композиція (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), and Ranade, "Siteдипалмітойлфосфатидилхолін (ДПФХ) із сумішшю Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", стерилглюкозиду, отриманого з сої, і холестерину in Drug Delively Systems, Ranade and Hollinger також була націлена на печінку [Shimizu et al., Bio., (eds.), pages 3-24 (CRC Press 1995)]. Ліпосоми Pharm. Bull. 20:881 (1997)]. З іншого боку, до поверхні ліпосоми можуть схожі за складом на клітинні мембрани, в прив'язуватись різні ліганди, які можна результаті чого їх можна безпечно вводити, і є націлювати, наприклад антитіла, фрагменти такими, що біодеградують. В залежності від антитіл, карбогідрати, вітаміни і транспортні білки. 51 82830 52 Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Наприклад, ліпосоми можна модифікувати за Hendren (eds.), pages 45-92 (Plenum Press 1997); допомогою галактозилліпідних похідних Bartus et al., Science 257:1161 (1998); Putney and розгалуженого типу, щоб націлити на рецептори Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, азіалоглікопротеїну (галактози), які експресуються Curr: Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)]. Наносфери з виключно на поверхні клітин печінки [Kato and поліетиленгліколевим (ПЕГ) покриттям можуть Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 також служити носіями для внутрішньовенного (1997); Murahashi et al., Biol Pharm. Bull. 20:259 введення терапевтичних білків [див., наприклад, (1997)]. Аналогічним чином Wu et al., Hepatology Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)]. 27:772 (1998) виявили, що мічення ліпосом Даний винахід також розглядає хімічно азіалофетуіном призвело до скорочення періоду модифіковані білки.ТАСІ-імуноглобулін, в яких напівжиття плазми ліпосоми і дуже посилило поліпептид є зв'язаним з полімером, обговореним захоплення ліпосоми, поміченої азіалофетуіном, вище. Фахівці в цій галузі можуть розробити інші гепатоцитами. З іншого боку, печінкову акумуляцію лікарські форми, як описані, наприклад, Ansel and ліпосом, які містять галактозилліпідні похідні Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug розгалуженого типу, можна інгібувати попереднім Delivery Systems, 5th Edition (Lea & Febiger 1990), упорскуванням азіалофетуіну [Murahashi et al., Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Biol. Phar. Bull. 20:259 (1997)]. Іншим засобом Sciences, 19 th Edition (Mack Publishing Company націлювання ліпосом на печінкові коітини є 1995), and Ranade and Hollinger, Drug Delivery поліаконітильовані ліпосоми сироваткового Systems (CRC Press 1996). альбуміну людини [Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Наприклад, фармацевтичні композиції можуть Sci. USA 94:11681 (1997)]. Більш того, [Geho et al. бути представлені у вигляді комплекту, який в патенті США №4603044] описують систему включає ємкість, що містить білок ТАСІтранспортування бульбашок ліпосом, спрямованих імуноглобулін. Терапевтичні поліпептиди можуть на гепатоцити, яка має специфічність до мати форму упорскуваного розчину для однієї гепатобіліарних рецепторів, пов'язаних із дози або багатьох доз, або у вигляді стерильного спеціалізованими метаболічними клітинами порошку, який потрібно буде відновити перед печінки. ін'єкцією. Як варіант, такий комплект може У найбільш загальному методі націлювання на включати диспергатор сухого порошку, генератор тканину клітини-мішені попередньо мітять рідкого аерозолю або розпилювач для введення біотинильованими антитілами, специфічними до терапевтичного поліпептиду. Такий комплект може ліганду, що експресується клітиною-мішенню додатково містити письмову інформацію щодо [Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)]. показань та застосування фармацевтичної Після елімінації плазми вільного антитіла вводять композиції. Більш того, ця інформація може ліпосоми, кон'юговані зі стрептавідином. В іншому включати попередження про те, що дана методі антитіла проти клітини-мішені композиція білка ТАСІ-імуноглобулін прикріплюють безпосередньо до ліпосом [Harasym протипоказана хворим з відомою гіперчутливістю et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)]. або до частини рецептора ТАСІ, або до Білки ТАСІ-імуноглобулін можна імуноглобулінової частини. 9. Терапевтичне використання нуклеотидних інкапсулювати всередині ліпосом, використовуючи послідовностей ТАСІ-імуноглобуліну стандартні методи мікрокапсулювання білків [див., Даний винахід включає використання молекул наприклад, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 нуклеїнової кислоти, які кодують злиті білки ТАСІ(1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990) імуноглобулін, для введення останніх пацієнту, and Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 який потребує лікування. При ветеринарному (1991), Alving et al., "Preparation and Use of терапевтичному використанні або при лікуванні Liposomes in Immunological Studies", in Liposome людини ці молекули нуклїнової кислоти можна Technology, 2nd Edition, Vol. Ill, Gregoriadis (ed.), вводити суб'єкту з розладом або хворобою, page 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. описаними вище. Наприклад, молекули Enzymol. 149:124 (1987)]. Як зазначалось вище, нуклуїнової кислоти, що кодують злитий білок терапевтично корисні ліпосоми можуть містити ряд ТАСІ-імуноглобулін, можна використовувати для компонентів. Наприклад, ліпосоми можуть містити довготривалого лікування системного червоного ліпідні похідні (полі(етиленгліколю) (Allen et al., вовчака. багато методів уведення гена ТАСІІснує Biochim. Biophys. Acta 1150:9(1993)]. імуноглобуліну суб'єкту, в тому числі використання Були розроблені здатні розкладатися клітин-хазяїв, які експресують ТАСІ-імуноглобулін, полімерні мікросфери для підтримання високих введення голої нуклеїнової кислоти, яка кодує системних рівнів терапевтичних білків. ТАСІ-імуноглобулін, використання катіонного Мікросфери готують із здатних розкладатися ліпідного носія з молекулою нуклеїнової кислоти, полімерів, наприклад полі(лактид-ко-гліколід) яка кодує ТАСІ-імуноглобулін, та використання (ПЛГ), поліангідриди, полі(орто складні ефіри), не вірусів, які експресують ТАСІ-імуноглобулін, здатні біорозкладатися полімери етил наприклад рекомбінантних ретровірусів, вінілацетату, в яких білки є захопленими в рекомбінантних аденоасоційованих вірусів, полімері [Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. рекомбінантних аденовірусів та рекомбінантних 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug вірусів простого герпесу [див., наприклад, Mulligan, Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Science 260:296 (1993), Rosenberg et al., Science Hollinger (eds.), pages 51-93 (CRC Press 1995); 242:1575 (1988), LaSalle et al., Science 259:988 Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled (1993), Wolff et al., Science 247:1465 (1990), Release Systems Useful for Protein Delivery", in 53 82830 54 транфекованою плазмідою. Наприклад, незмінний Breakfield and Deluca, The New Biologist 3:203 ген E1 делетують з вірусного вектора, і цей вірус (1991)]. При методі ex vivo, наприклад, клітини не буде реплікуватися, якщо тільки клітина-хазяїн виділяють із суб'єкта, трансфекують вектором, не дасть ген E1. При внутрішньовенному введенні який експресує ген ТАСІ-імуноглобуліну, і потім інтактній тварині аденовірус, головним чином, пересаджують тому самому суб'єкту. націлюється на печінку. Хоча аденовірусна Щоб здійснити експресію гена ТАСІсистема доставки з делецією гена E1 не може імуноглобуліну, конструюють вектор експресії, в реплікуватися в клітинах-хазяях, тканина клітини якому нуклеотидна послідовність, яка кодує ген буде експресувати і обробляти закодований ТАСІ-імуноглобуліну, функціонально зв'язана з гетерологічний білок. Клітини-хазяї будуть також кор-промотором і, необов'язково, з регуляторним секретувати гетерологічний білок, якщо елементом для контролювання транскрипції гена. відповідний ген включає секреторну сигнальну Загальні вимоги щодо вектора експресії послідовність. Секретовані білки увійдуть в описувались вище. кровообіг з тканини, яка експресує цей Як варіант, ген ТАСІ-імуноглобуліну можна гетерологічний ген (наприклад, дуже вводити, використовуючи вірусні вектори, втому васкуляризованої печінки). числі, наприклад, аденовірусні вектори [Kass-Eisler Більш того, аденовірусні вектори, що містять et al., Proc. Nat'lAcad Sci. USA 90:11498 (1993), різні делеції вірусних генів, можна застосовувати Kolls et al., Proc. Νat’l Acad. Sci. USA 91:215 (1994), для зменшення або виключення імунних реакцій Li et al., Hum. Gene Ther. - 4:403 (1993), Vincent et на цей вектор. Такі аденовіруси є Ε1 al., Nat, Genet. 5:130 (1993), and Zabner et al., Cell делетованими і, крім того, містять делеції Е2А або 75:207 (1993)], аденовірусасоційованих вірусних Е4 [Lusky et al., J. Virol. 72:2022 (1998); Raper et al., векторів [Flott et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90; Human Gene Therapy 9:671 (1998)]. Як стало 10613 (1993)], такі альфавіруси, як вірус Semliki відомо, зменшує імунні реакції і делеція E2b Forest і вірус Sindbis (Hertz and Huang, J. Vir. [Amalfitano et al., J. Virol. 72:926 (1998)]. В 66:857 (1992), Raju and Huang, J. Vir. 65:2501 результаті делеції всього аденовірусного геному (1991), and Xiong el al., Science 243:1188 (1989)], можна акомодувати дуже великі вставки вірусні вектори герпесу [наприклад, пат. США гетерологічної ДНК. Особливо вигідним для №№: 4769331, 4859587, 5288641 та 5328688], вставляння великих вставок гетерологічної ДНК є вектори парвовірусу [Koering et al., Hum. Gege генерування так званих "безкишкових" Therap. 5:457 (1994), вектори покевірусу [Ozaki et аденовірусів, в яких всі вірусні гени делетовані al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 193:653 (1993), [Yeh and Perricaudet, FASEBJ. 11:615 (1997)]. Panicali and Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA Високотитрові штами рекомбінантних вірусів, 79:4927 (1982)], покcвіруси, наприклад покcвірус здатних експресувати терапевтичний ген, можна канарейки або вірус коров'ячої віспи [Fisher-Hoch отримати з клітин заражених ссавців, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:317 (1989) and використовуючи стандартні методи. Наприклад, Flexner et al., Ami N.Y. Acad. Sci. 569:86 (1989)], та рекомбінантний вірус простого герпесу можна ретровіруси [Baba et al., J. Neurosurg 79:729 приготувати в клітинах Vero, як описано Brandt et (1993), Ram et al., Cancer Res. 53:83 (1993), al, J. Gen. Virol. 72:2043 (1991), Herold et al., J. Gen. Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 35:493 (1992), Vile Virol. 75:1211 (1994), Visalli and Brandt, Virology and Hart, Cancer Res. 53:962 (1993), Vile and Hart, 185:419 (1991), Grau et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Cancer Res. 55:3860 (1993), and Anderson et al., US Sci. 30:2474 (1989), Brandt et al, J. Virol. Meth. Patent No. 5399346]. В межах різних варіантів або 36:209 (1992), and Brown and MacLean (eds.), HSV сам по собі вірусний вектор або вірусна частинка, Virus Protocols (Humana Press 1997). яка містить такий вірусний вектор, може бути Як варіант, вектор експресії, який містить ген використаний в способах і композиціях, описаних ТАСІ-імуиоглобуліну, можна вводити суб'єкту нижче. шляхом ліпофекції in vivo з використанням Як приклад однієї системи, аденовірус, вірус ліпосом. Для приготування ліпосом для дволанцюгової ДНК, є добре охарактеризованим трансфекції in vivo гена, кодуючого маркер, можна вектором переносу гена для введення молекули застосовувати синтетичні катіонні ліпіди [Felgner et гетерологічної нуклеїнової кислоти [Becker et al., al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987); Meth. Cell Biol. 43:161 (1994); Douglas and Curiel, Mackey et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:8027 Science & Medicine 4:44 (1997)]. Ця аденовірусна (1988)]. Застосування ліпофекції для введення система має декілька переваг, в тому числі: і) екзогенних генів в конкретні органи /// vivo має здатність акомодувати відносно великі вставки певні практичні переваги. Ліпосоми можна ДНК, іі) здатність вирощуватись до високого титру, використовувати для спрямування трансфекції в ііі) здатність заражати широке коло типів клітин конкретні типи клітин, що є особливо вигідним в ссавців, і IV) здатність застосовуватись з багатьма тканині з клітинною гетерогенністю, наприклад в різними промоторами, в тому числі убіквітарним, підшлунковій залозі, печінці, нирці і мозку. Ліпіди тканиноспецифічним та регулятабельним можна хімічно з'єднувати з іншими молекулами з промоторами. Крім того, аденовіруси можна метою націлювання. Націлені пептиди (наприклад, вводити внутрішньовенно, оскільки ці віруси є гормони або нейропередавачі), білки (наприклад, стабільними у кров'яному руслі. антитіла або непептидні молекули) можна При використанні аденовірусних векторів, в з'єднувати з ліпосомами хімічно. Іншим альтернативним методом уведення є яких ділянки аденовірусного геному делетовані, електропорація. Використання in vivo вставки включають у вірусну ДНК прямим електропорації для переносу гена в м'яз описане, зшиванням або гомологічною рекомбінацією з ко 55 82830 56 З метою надекспресії послідовностей наприклад в [роботі Aihara та Miyazaki (Nature нуклеїнової кислоти, які кодують злиті білки ТАСІBiotechnology 16:867 (1998)]. імуноглобулін у всіх тканинах або під контролем Взагалі дозування композиції, що містить тканиноспецифічного регуляторного елемента, терапевтичний вектор, який має послідовність або регуляторного елемента, що віддає перевагу нуклеїнової кислоти ТАСІ-імуиоглобуліну, тканинам, можна створити трансгенних мишей. наприклад рекомбінантний вірус, буде мінятися в Цих надпродуцентів злитих білків можна залежності від таких факторів, як вік суб'єкта, вага, використовувати для ідентифікації фенотипу, який зріст, стать, загальний медичний стан та є результатом надекспресії, і трансгенні тварини попередня історія хвороби. Придатними шляхами можуть служити моделями хвороби людини, введення терапевтичних векторів ε викликаної надлишком білка рецептора ТАСІ. внутрішньовенна, внутрішньоартеріальна, Трансгенні миші, які надмірно експресують злиті інтраперитонеальна, внутрішньом'язова, білки ТАСІ-імуноглобулін, також утворюють внутрішньопухлинна ін'єкції та ін'єкція в модель біореакторів для продукування злитих порожнину, що містить пухлину. Наприклад, білків ТАСІ-імуноглобулін в молоці або крові [Horton et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 96:1553 більших тварин. Методи створення трансгенних (1999)], показали, що внутрішньом'язова ін'єкція мишей добре відомі в цій галузі [див., наприклад, плазмідної ДНК, кодуючої інтерферон-a, створює Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in сильні протипухлинні ефекти на первинні та Transgenic Mice", in Overexpression and Knockout in метастатичні пухлини в мишинІй моделі. Запропоновану даним винаходом композицію, Cyrokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), pages що містить вірусні вектори, невірусні вектори або 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky комбінацію вірусних і невірусних векторів, можна and Robl (eds.), Strategies in Transgetic Animal приготувати за відомими методами приготування Science (ASM Press 1995) and Abbud and Nilson, фармацевтично корисних композицій, за якими "Recombinant Protein Expression in Transgenic вектори або віруси об'єднують в суміші з Mice", in Gene Expression Systems: Using Nature for фармацевтично прийнятним носієм. Як the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), зазначалось вище, кажуть, що композиція, pages 367-397 (Academic Press, Inc. 1999)]. наприклад фізіологічний розчин з фосфатним Спосіб створення трансгенної миши, яка буфером, є "фармацевтично прийнятним носієм", експресує послідовність нуклеїнової кислоти, що якщо суб'єкт-реципієнт може переносити її кодує злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, можна, введення. В галузі добре відомі й інші придатні наприклад, розпочати з дорослих, здатних до носії [див., наприклад, Remington's Pharmaceutical зачаття самців (В6С3f1, 2-8-місячного віку (Taconic Sciences, 19 th Ed. (Mack Publishing Co., 1995) and Farms, Germantown, NY)), вазектомованих самців Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, 7 th (B6D2f1, 2-8-місячного віку (Taconic Farms)), Ed. (MacMillan Publishing Co., 1985)]. препубертатних здатних до зачаття самиць В лікувальних цілях вектор експресії (донорів) (B6C3f1, 4-5-місячного віку (Taconic терапевтичного гена або рекомбінантний вірус, що Farms)) та дорослих здатних до зачаття самиць містить такий вектор, і фармацевтично прийнятний (реципієнтів) (B6D2f1, 2-4-місячного віку (Taconic носій вводять суб'єкту в терапевтично ефективній Farms)). Донорів аклімують упродовж одного кількості. Кажуть, що комбінація вектора експресії тижня, а потім упорскують приблизно 8 (або вірусу) і фармацевтично прийнятного носія імунізуючих одиниць (IU) на мишу гонадотропіну введена в терапевтично ефективній кількості, сироватки вагітної кобили [Sigma Chemical якщо введена кількість є фізіологічно значущою. Company; St. Louis, MO] I.P., і через 46-47 годин 8 Агент є фізіологічно значущим, якщо його IU на мишу хоріонгонадотропіну людини (hCG присутність дає в результаті виявну зміну у (Sigma)) I.P., щоб індукувати суперовуляцію. Після фізіології суб'єкта-реципієнта. Наприклад, агент, впорскування гормонів донорів спаровують зі використаний для лікування запалення, є здатними до зачаття самцями. Овуляція, як фізіологічно значущим, якщо його присутність правило, відбувається в межах 13 годин після зменшує запальну реакцію. Інший приклад, агент, впорскування hCG. Копуляцію підтверджують використаний для інгібування росту пухлинних наявністю вагінальної пробки наступного ранку клітин, є фізіологічно значущим, якщо введення після спаровування. Запліднені яйцеклітини збирають за цього агента зменшує в результаті кількість допомогою хірургічної ложки. Яйцеводи збирають пухлинних клітин, зменшує метастаз і розмір та яйцеклітини випускають на предметні скельця з твердої пухлини або збільшує некроз пухлини. ямками для аналізу сечі, які містять гіалуронідазу Якщо суб'єктом, якого лікують вектором (Sigma). Яйцеклітини промивають один раз в експресії терапевтичного гена або рекомбінантним гаулуронідазі і двічі в середовищі Уітена (Whitten) вірусом, є людина, тоді перевагу слід віддати W640 (описаному, наприклад, Menino and O'Claray, лікуванню генами соматичних клітин. Тобто таке Biol. Reprod. 77:159 (1986) and Dienhart and D лікування людини вектором експресії owns, Zygote 4:129 (1996)], яке інкубували 5%-ним терапевтичного гена або рекомбінантним вірусом СО2, 5%-ним О2 і 90%-ним N2 при 37°С. не передбачає введення в клітини молекули Яйцеклітини потім зберігають в термостаті з 5%нуклеїнової кислоти, яка може утворити частину ним СО2 і температурою 37°С перед лінії патогенних мікроорганізмів людини і мікроін'єкуванням. 10-20мкм плазмідної ДНК, що Для мікроін'єкції передатися наступним поколінням (тобто терапія містить послідовність, кодуючу злитий білок ТАСІгеном лінії патогенних мікроорганізмів людини). імуноглобулін, лінеаризують, очищують гелем і 10. Створення трансгенних мишей ресуспендують в 10мМ Tris-HCl (pH 7,4), 0,25мМ 57 82830 58 окремих клітинах і чистими ножицями відрізають етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТК) (pH 8,0) 0,5см хвоста для біопсії (для визначення при кінцевій концентрації 5-10 нанограмів на генотипу). мікролітр. Наприклад, послідовності, що кодують З відрізків хвостів готують геномну ДНК, злитий білок ТАСІ-імуноглобулін, можуть кодувати використовуючи, наприклад, комплект QIAGEN поліпептид ТАСІ делецією амінокислотних DNEASY, додержуючись інструкцій виробника. залишків 1-29 та 111-154 послідовності SEQ ID Геномну ДНК аналізують шляхом реакції NO:2 і частиною імуноглобуліну Fc5. преципітації (РПЦ), застосовуючи праймери, Плазмідну ДНК вводять шляхом мікроін'єкції в призначені для посилення послідовності зібрані яйцеклітини, які містяться в краплині нуклеїнової кислоти, яка кодує злитий білок ТАСІсередовища W640, покритого теплим СО2імуноглобулін, або селектований маркерний ген, збалансованим мінеральним маслом. ДНК який було введено в ту саму плазміду. Після втягують в ін'єкційну голку (втягуали з 0,75 підтвердження, що тварини є трансгенними, їх міліметрового капіляра із боросилікатного скла із зворотньо схрещують в інбредну лінію, зовнішнім діаметром 1мм), і впорскують в окремі розміщуючи трансгенну самицю з самцем дикого яйцеклітини. В кожну яйцеклітину проникають типу або трансгенного самця з однією або двома ін'єкційною голкою, в один чи обидва гаплоїдні самицями дикого типу, Після народження і пронуклеуси. В ці пронуклеуси впорскують піколітри ДНК, і відлучення від матері мишенят розділяють за ін'єкційну голку витягують, не контактуючи з статтю, і їхні хвости відрізають для визначення ядерцями. Процедуру повторюють, доки всі генотипу. перевірки експресії трансгена в живій Для яйцеклітини не будуть ін'єковані. Успішно тварині здійснюють часткову гепатектомію. ін'єковані яйцеклітини переносять в чашку для Здійснюють хірургічне препарування верхнього культивування з тканиною органу з попередньо відділу черевної порожнини прямо під зипофідним наповненим газоподібним середовищем W640 для відростком. Використовуючи стерильний зберігання всю ніч в термостаті з 5%-ним СО2 і інструмент, під грудниною роблять маленький, 1,5температурою 37°С. 2см, розріз і виймають на поверхню тіла ліву бічну Наступного дня двоклітинні зародки частку печінки. Використовуючи шовк 4-0, навколо переносять в псевдовагітних реципієнтів. нижньої частки роблять петлю, закріплюючи її Реципієнтів ідентифікують за наявністю зовні порожнини на тілі. Для утримання петлі копуляційних пробок після спаровування з застосовують атравматичний затискач, поки поруч вазектомованими самцями. Реципієнтів з першою петлею розміщують другу петлю із анестезують, голять з заднього лівого боку і абсорбованого дексону (американський ціанамід; переносять під хірургічний мікроскоп. Роблять Wayne, N.J.). Від дексонової петлі роблять маленький розріз в шкірі через стінку м'яза дистальний розріз, і приблизно 100мг вирізаної всередину черевинної області, оточеної реберною печінкової тканини поміщають в стерильну чашку кліткою, сідлоподібною частиною, задньою лапою, Петрі. Зріз вирізаної печінки переносять в 14посередині між коліном і селезінкою. міліметрову поліпропіленову круглодонну Репродуктивні органи тимчасово виводять на пробірку, миттєво заморожують в рідкому азоті і поверхню тіла на маленьку хірургічну серветку. потім зберігають на сухому льоді. Хірургічну Жирову тканину розтягують по хірургічній серветці, ділянку закривають за допомогою швів і затискачів до жирової тканини прикріплюють дитячий для ран, і після операції клітку тварини поміщають судинний затискач (Roboz, Rockville, MD) і звішують зліва поверх спинки миши, щоб не дати на грілку-подушку з температурою 37°С на 24 органам зісковзнутималенької переносної піпетки, За допомогою назад всередину. години. Після операції тварину перевіряють щодня яка містить мінеральне масло, за яким йдуть і через 7-10 днів після операції знімають затискачі почергово W640 і повітряні бульбашки, в для ран. Рівень експресії мРНК злитого білка реципієнта переносять 12-17 здорових ТАСІ-імуноглобулін досліджують по кожній двоклітинних зародків з ін'єкції попереднього дня. трансгенній миши, використовуючи метод Набухлу ампулу розміщують і, утримуючи яйцевід гібридизації розчину РНК або ланцюгову реакцію між ампулою і бурсою, в яйцеводі роблять насічку полімерази. При використанні вищеописаних загальних за допомогою 28-грамової голки біля бурси, методів були створені трансгенні миші, які переконуючись, що не розірвали ампулу або експресували значні рівні злитого білка ТАСІбурсу. Піпетку переносять в згадану насічку в імуноглобулін в молоці. В цьому конкретному яйцеводі, і зародки вдувають, дозволивши першій випадку послідовність, кодуюча злитий білок ТАСІповітряній бульбашці вийти з піпетки. Жирову імуноглобулін, закодувала поліпептид ТАСІ за тканину обережно вштовхують в очеревину і допомогою делеції амінокислотних залишків 1-29 дають можливість репродуктивним органам та 111-154 послідовності SEQ ID NO:2 і частини зісковзнути всередину. Одним хірургічним швом імуноглобуліну Fc5. закривають перитонеальну стінку, а рану на шкірі Даний винахід, описаний таким чином взагалі, закривають скобкою. Миші відновлюють сили на стане більш зрозумілим при розгляданні наступних підігрівальному столику з температурою 37°С прикладів, які є лише ілюстраціями і не обмежують упродовж як мінімум чотирьох годин. даного винаходу. Реципієнтів повертають в клітини парами і Приклад 1 чекають, поки 19-21 день триває вагітність. Після Конструювання молекул нуклеїнової кислоти, народження дають 19-21 день після пологів перед що кодують білки TACI-Fc відлученням від матері. Сисунків, віднятих від Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують матері, розділяють за статтю, розміщують в ТАСІ людини, отримували під час експресійного 59 82830 60 доводили до 94°С упродовж 1 хвилини. Додавали клонування рецепторів до ZTNF4, як описують Pfu-полімеразу (2,5 одиниць, Stratagene), після Gross et al., Nature 404:995 (2000). Кодуючі чого здійснювали 25 циклів при 94°С упродовж послідовності, які містилися в експресійних 30сек., 55°С упродовж 30сек., 72°С упродовж 1 структурних компонентах TACI-Fc, генерували хвилини, а потім ще 7 хвилин при 72°С. Продукт шляхом реакції преципітації (РПЦ) з накладанням реакції фракціонували методом електрофорезу і фракцій, використовуючи стандартні методи (див., виявили диск, що відповідав передбаченому наприклад, Horton et al., Gem 77:61 (1989)). Як розміру, приблизно 676 пар основ (п.о.). Цей диск первинні матриці для ампліфікацій РПЦ ексцизували з гелю і екстрагували, застосовуючи використовували кДНК ТАСІ і кДНК Fc людини. комплект реагентів QIAGEN QIAquickTM для Праймери РПЦ були призначені дати в результаті екстракції гелю (Qiagen), додержуючись інструкцій 5' і 3' кінці заданої кодуючої послідовності і ввести виробника. сайти розпізнавання рестрикційних ферментів для РПЦ також використали для введення мутації полегшення вставляння цих кодуючих Ala-Ser (амінокислотний залишок 134 послідовностей у вектори експресії. Кодуючі послідовності SEQ ID NO:6, який відповідає позиції послідовності TACI-Fc вставляли у вектори 330 індексу EU) і Pro-Ser (амінокислотний залишок експресії, які включали мишиний функціонуючий 135 послідовності SEQ ID NO:6, який відповідає ген дигідрофолатредуктази. Один вектор експресії позиції 331 індексу EU), щоб зменшити зв'язування також містив промотор цитомегаловірусу для комплементу Clq або фіксацію комплементу спрямування експресії трансгена рекомбінантного [Duncan and Winter, Nature 332:788 (1988)]. Дві білка, інтрон імуноглобуліну, сигнальну перші циклічні реакції проводили, використовуючи послідовність активатора плазміногена тканини, як матрицю послідовність IgFc з мутованим сайтом внутрішню послідовність входження рибосоми, делетований цистрон CD8 для поверхневої зв'язування FcgRI. До 50мкл кінцевого об'єму селекції трансфекованих клітин та елементи додавали 1мкл матриці IgFc з мутованим сайтом експресії дріжджів для вирощування плазміди в зв'язування FcgRI, 5мкл реакційного буфера клітинах дріжджів. 10хPfu (Stratagene), 8мкл 1,25мМ dNTP, 31мкл Один з прийомів, застосованих для дистильованої води, 2мкл 20мМ 5' GGTGGCGGCT продукування злитих білків TACI-Fc, CCCAGATGGG TCCTGTCCGA GCCCAGATCT проілюстровано методом, використаним для TCAGACAAAA СТСАС 3' (SEQ ID NO.11), 5'конструювання TACI-Fc4. Інші злиті білки TACI-Fc праймера, що починається на нуклеотиді 36 продукували, вставляючи нуклеотидні послідовності SEQ ID NO:5, і 2мкл 20мМ 5' послідовності, які кодують злитий білок TACI-Fc, у TGGGAGGGCT TTGTTGGA 3' (SEQ ID NO.12), 3'вектор експресії ссавців і вводячи цей вектор праймера, що починається на комплементі експресії в клітини ссавців. А. Конструювання фрагмента Igg1Fc4 нуклеотиду 405 послідовності SEQ ID NO:5. Друга Для отримання злитого білка TACI-Fc4 зону Fc реакція містила 2мкл кожної з 20мМ сумішей людського IgG1 (шарнірна зона і домени С Н2 і СН3) олігонуклеотидних праймерів 5' TCCAACAAAG СССТСССАТС CTCCATCGAG ААААССАТСТ СС модифікували для виключення рецептора Fcg1 3' (SEQ ID NO:13), 5'-праймера, що починається на (FcgRI) і функцій зв'язування комплементу (C1q). нуклеотиді 388 послідовності SEQ ID NO:5 та 5' Цей модифікований варіант людського IgG1Fc GGATGGATCC ATGAAGCACC TGTGGTTCTT позначили "Fc4". CCTCCTGCTG GTGGCGGCTC CCAGATG 3' (SEQ Зону Fc виділяли з бібліотеки печінки зародка ID NO:14), 3'-праймера для введення мутації Alaлюдини (Clontech) за допомогою РПЦ, Ser, сайту рестрикції Xbal і термінуючого кодону. використовуючи олігопраймери 5' ATCAGCGGAA Додавали рівний об'єм мінерального масла і TTCAGATCTT CAGACAAAAC TCACACATGC температуру реакції доводили до 94°С упродовж 1 ССАС У (SEQ ID NО:7) та 5' GGCAGTCTCT хвилини. Додавали Pfu-полімеразу (2,5 одиниць, AGATCATTTA CCCGGAGACA GGGAG З' (SEQ Ш Stratagene), потім проводили 25 циклів при 94°С NО:8). Для зменшення зв'язування FcyRI за упродовж 30сек., 55°С упродовж 30сек., 72°С допомогою РПЦ в межі зони Fc були введені упродовж 2 хвилин, а потім ще 7 хвилин при 72°С. мутації. Сайт зв'язування FcgRI (Leu-Leu-GIy-GIy; Продукт реакції фракціонували методом амінокислотні залишки 38-41 послідовності SEQ ID електрофорезу і виявили диски, які відповідали NО:6, які відповідають позиціям 234-237 індексу передбаченим розмірам, приблизно 370 п.о. і EU) мутували в Ala-Glu-Gly-Ala, щоб зменшити приблизно 395 п.о., відповідно. Ці диски зв'язування FcgR1 [див., наприклад, Duncan et al., ексцизували з гелю і екстрагували, застосовуючи Nature 332:563 (1988); Baum ei al., EMBO J. комплект реагентів QIAGEN QIAquickTM для 13:3992 (1994)]. Для введення цієї мутації екстракції гелю (Qiagen) згідно з інструкціями використовували олігонуклеотидні праймери 5' виробника. Здійснювали другу циклічну реакцію для CCGTGCCCAG CACCTGAAGC CGAGGGGGCA з'єднання вищезгаданих фрагментів і додавали CCGTCAGTCT ТССТСТТССС С 3' (SEQ ID NO:9) сайт рестрикції 5’ ВатHI і сигнальну послідовність та 5' GGATTCTAGA ТТАТТТАССС GGAGACAGGG із варіабельної зони важкого ланцюга JBL 2'CL А 3' (SEQ ID NO:10). До 50мкл кінцевого об'єму імуноглобуліну людини [Cogne et al., Eur. J. додавали 570нг матриці IgFc, 5мкл 10х Immunol 18:1485 (1988)]. До 50мкл кінцевого реакційного буфера Pfu (Stratagene), 8мкл 1,25мМ об'єму додавали 30мкл дистильованої води, 8мкл дезоксинуклеозидтрифосфатів (dNTP), 31мкл 1,25мМ dNTP, 5мкл реакційного буфера 10х Pfuдистильованої води, 2мкл 20мМ полімерази (Stratagene) і 1мкл кожного з двох олігонуклеотидних праймерів. Додавали рівний перших продуктів двох РПЦ. Додавали рівний об'єм мінерального масла і температуру реакції
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюTaci-immunoglobulin fused protein
Автори англійськоюRixon Mark U., GROSS JANE A
Назва патенту російськоюСлитый белок таци-иммуноглобулин
Автори російськоюРиксон Марк У., Гросс Джейн А.
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/395, C07K 16/00, A61P 35/00, A61K 48/00, C07K 14/715, C07K 14/705, C07K 19/00, C12N 15/09, A61K 38/00
Мітки: злитий, білок, таці-імуноглобулін
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/49-82830-zlitijj-bilok-taci-imunoglobulin.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Злитий білок таці-імуноглобулін</a>
Дезоксирибонуклеїнова кислота, яка кодує білок глутатіон-s-трансферазу, білок
Номер патенту: 51642
Опубліковано: 16.12.2002
Автори: Бізелер Барбара, Манн Карльхайнц, Райнемер Петер, Райф Ханс-Йорг, Хайн Рюдігер, Томцік Юрген
МПК: C12N 15/54, C12N 15/82, A01H 5/00, C12N 9/10, C12N 1/21
Мітки: яка, кодує, кислота, глутатіон-s-трансферазу, білок, дезоксирибонуклеїнова
Формула / Реферат:
1. ДНК (дезоксирибонуклеїнова кислота), яка кодує білок глутатіон-S-трансферазу IIIс (GSTIIIc) з послідовністю:.2. ДНК згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що має послідовність3. ДНК згідно з п. 1, яка відрізняється тим, що має послідовність ДНК GSTIIIc, яка міститься у векторній плазміді рЕТЗа- GSTIIIc.4. ДНК згідно з будь яким з пп. 1-3, яка відрізняється тим, що існує у формі дволанцюгової...
Злитий білок, який складається з мишачого або олюдненого моноклонального антитіла мав425 або його фрагменту, який спрямовано проти пухлинної клітини, спосіб його отримання, фармацевтична композиція
Номер патенту: 41888
Опубліковано: 15.10.2001
Автори: Штадльмюллер Йорг, Штріттматтер Вольфганг, Йегле Карлота-Сільва, Матцку Зігфрід, Хофманн Уве, Фон Хьогєн Ілка
МПК: A61P 35/04, C12N 15/79, C07K 14/525, A61P 35/00, A61K 39/44, C12N 15/55, C07K 19/00, C07K 14/54, C07K 16/00, C12N 15/62, A61K 38/16, C07K 16/30, C12R 1/19, A61K 47/48, A61K 38/20, A61K 38/19, C12N 15/64, C12P 21/02, C07K 16/28, A61K 39/00, A61K 39/395, C12N 15/19, C12N 15/09, C12P 21/08, C12N 15/13, C07K 14/52, C12N 15/72, C07K 16/46, A61K 38/18, C12R 1/91, C07K 16/42, A61K 38/00
Мітки: композиція, мав425, антитіла, олюдненого, отримання, пухлинної, складається, фрагменту, мишачого, спосіб, білок, клітині, моноклонального, фармацевтична, злитий, спрямовано
Формула / Реферат:
Слитый белок, состоящий из мышиного или очеловеченного моноклонального антитела Mab425 или его фрагмента, направленного против опухолевой клетки, несущей антигенную детерминанту рецептора эпидермального фактора роста (EGF-R), и биологически активного цитокина, слитого с указанным антителом или фрагментом антитела, и обладающего цитотоксической способностью к специфическому лизису опухолевой клетки.2. Слитый белок по п. 1, отличающийся...
Рекомбінантний, очищений, модифікований генноінженерно білок, продукований бактеріями е.coli, імітуючий коровий білок вірусу імунодефіциту людини першого типу ( gag віл-1)
Номер патенту: 14847
Опубліковано: 18.02.1997
Автори: Мартиненко Дмитро Леонідович, Чумак Ростислав Максимович, Міхайлова Татьяна Гавріловна, Чєрєпанов Пьотр Алєксєєвіч
МПК: C07K 14/155, C12N 15/49
Мітки: модифікований, очищений, коровий, імітуючий, білок, e.coli, імунодефіциту, типу, рекомбінантний, генноінженерно, першого, віл-1, людини, вірусу, бактеріями, продукований
Формула / Реферат:
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями Е.соlі, імітуючий коровий білок вірусу імунодефіциту людини першого типу (GAG ВІЛ-1), який має основні імунодомінантігі епітопи, притаманні нативним білкам gpl7, gp24 і gpl5 BІЛ-1, злитний, має молекулярну масу 70376 Д, містить в собі 623 амінокислотних залишка, ізоелектричну точку 8,54 і відповідає загальній формулі N-бета-Gal-pl7-p24-pl5-COOH.
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продуктований бактеріями e.coli, імітуючий білок оболонки trepanema pallidum
Номер патенту: 14746
Опубліковано: 04.02.1997
Автори: Мартиненко Дмитро Леонідович, Міхайлова Татьяна Гавріловна, Чєрєпанов Пьотр Алєксєєвіч, Чумак Ростислав Максимович
МПК: C12N 15/31, C07K 14/20
Мітки: оболонки, білок, рекомбінантний, генно-інженерно, модифікований, бактеріями, trepanema, очищений, імітуючий, pallidum, e.coli, продуктований
Формула / Реферат:
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями Е.соlі, імітуючий білок оболонки Trepanema pallidum, який має основні імунодомінантні епітопи, притаманні нативному білку, має молекулярну масу 106 кД, містить в собі 883 амінокислотних залишків і відповідає загальній формулі N-бетa-Gal-pTr-COOH.
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інжерно білок, продукований бактеріями е.coli, імітуючий білок оболонки вірусу імунодефіциту людини другого типу ( env віл-2)
Номер патенту: 14842
Опубліковано: 18.02.1997
Автори: Чумак Ростислав Максимович, Чєрєпанов Пьотр Алєксєєвіч, Міхайлова Татьяна Гавріловна, Мартиненко Дмитро Леонідович
МПК: C12N 15/49, C07K 14/155, G01N 33/531
Мітки: продукований, білок, людини, імітуючий, рекомбінантний, вірусу, e.coli, віл-2, другого, бактеріями, оболонки, генно-інжерно, типу, модифікований, імунодефіциту, очищений
Формула / Реферат:
Рекомбінантний, очищений, модифікований генно-інженерно білок, продукований бактеріями Е.соlі, імітуючий білок оболонки вірусу імунодефіциту людини другого типу (Env ВІЛ-2), який має основні імунодомінантні епітопи, притаманні нативним білкам gp 110, gp38 ВІЛ-2, злитний, має молекулярну масу 67750 Д, містить в собі 1382 амінокислотних залишка і відповідає загальній формулі N-бета-GаІ-рІ 10-р38-СООН.
Попередній патент: Рідка гербіцидна композиція та спосіб боротьби з небажаною вегетацією
Наступний патент: Сполуки для лікування розладів обміну речовин
Випадковий патент: Спосіб одержання бактеріального препарату прямого внесення "квм-п" для кисловершкового масла