Лікування захворювань хряща

Реферат: Винахід належить до медицини, стосується застосування FGF-18 для лікування хворих, що страждають на захворювання хряща, наприклад остеоартрит, такий як, наприклад, остеоартрит колінного суглоба або вторинний остеоартрит тазостегнового суглоба. UA 99818 C2 (12) UA 99818 C2 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь, до якої належить винахід Цей винахід належить до галузі медицини і має відношення до лікування захворювань хряща, зокрема, остеоартриту. Конкретніше, він має відношення до застосування FGF-18 (фактор росту фібробластів) у схемах лікування і дëÿ виготовлення лікарського засобу для лікування хворих, які страждають на захворювання хряща, наприклад, остеоартрит, такий як, наприклад, остеоартрит колінного суглоба або вторинний остеоартрит тазостегнового суглоба. Пропонується, зокрема, схема лікування, якій віддають перевагу, за якою сполуку FGF-18 вводять один раз на тиждень протягом курсу лікування. Передумови створення винаходу FGF-18 був ідентифікований як член сімейства FGF, що має найбільшу спорідненість з FGF8 та FGF-17. Дія FGF-18 включає стимуляцію клітин мезенхімальної лінії диференціювання, зокрема, серцевих міоцитів, остеобластів та хондроцитів (Патент США № 6,352,971). FGF-18 зв'язує та активізує FGFR-4 та IIIc сплайсинговий варіант FGFR-3 (рецептор фактора росту фібробластів) та FGFR-2. Реконструкція кісткової тканини являє собою динамічний процес, під час якого маса тканини та форма скелету залишаються незмінними. Згаданий процес є балансом між резорбцією та синтезом кісткової тканини, де головними учасниками процесу вважаються клітини двох типів. Цими клітинами є остеобласти та остеокласти. Остеобласти синтезують і відкладають матрицю з перетворенням її на нову кістку. Інтенсивність дії остеобластів та остеокластів регулюється багатьма факторами, як системними, так і місцевими, у тому числі факторами росту. Хрящ являє собою різновид щільної сполучної тканини. Він складається з клітин, які називають хондроцитами, розсіяних у щільній гелеподібній основній речовині, яку називають матрицею. Хрящ є безсудинним (він не містить кровоносних судин), і поживні речовини дифундують через матрицю. Хрящ є присутнім у суглобах, грудній клітці, вусі, носі, у горлі і між міжхребцевими дисками. Існує три головні типи хряща: гіаліновий, еластичний та волоконний хрящ. Головне призначення хряща полягає у забезпеченні каркасу, на якому могло б розпочинатись відкладення кісткової тканини. Іншим важливим призначенням хряща є забезпечення гладеньких поверхонь та механічного захисту для рухання зчленівних кісток. Заміна пошкодженого хряща, зокрема, суглобового хряща, спричинена пошкодженням або захворюванням, є надзвичайно складною проблемою для лікарів. Існуючі способи лікування вважаються такими, що не можуть дати передбачуваних результатів, та є ефективними лише впродовж обмеженого періоду часу. Усі доступні на цей час способи лікування пошкодження хряща фактично зосереджуються на полегшенні болю і мають незначний вплив на регенерацію пошкоджених тканин або не мають жодного впливу на неї. Отже більшість хворих молодшого віку або зовсім не намагається вдаватись до лікування, або цим хворим радять відкласти лікування якомога надовше. У разі виникнення потреби у лікуванні стандартним заходом є повна заміна суглоба або здійснення мікроперелому. Ця процедура передбачає проникнення до субхондральної кістки для стимулювання відкладення хондроцитами волокнистого хряща. Для хворих з остеоартритом нехірургічне лікування полягає у фізіотерапії, зміні способу життя (наприклад, обмеженні активності), іммобілізації, застосуванні опорних пристроїв, застосуванні пероральних та ін'єкційних лікарських засобів (наприклад, нестероїдних протизапальних лікарських засобів) та консервативному лікуванні. Варіанти хірургічного лікування значною мірою залежать від тяжкості остеоартриту та можуть забезпечити загалом лише короткочасне полегшення тяжкості симптомів. Остеотомія (зрізання кістки для урівноваження спрацювання суглоба) великогомілкової або стегнової кістки може полегшити тяжкість симптомів, допомогти у збереженні активного способу життя та відкласти необхідність повної заміни суглоба. Повна заміна суглоба може полегшити тяжкість симптомів задавненого остеоартриту, але, як правило, вимагає зміни способу життя та/або рівня активності хворого. Отже, бажано було б мати спосіб лікування, запобігання або зменшення інтенсивності симптомів захворювання хряща, який би уможливлював регенерацію пошкодженої тканини. На додаток до цього, бажано було б, щоб такий спосіб був якомога безпечним та ефективним. Окрім того, оскільки захворювання хряща можуть бути хронічними захворюваннями, бажано було б, щоб такий спосіб надавав можливість повторного лікування хворого. Короткий виклад суті винаходу Цей винахід пропонує спосіб лікування хворого, який страждає на захворювання хряща, що включає введення сполуки FGF-18, яку вводять щонайменше двічі, причому згадані введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 4 дні, за варіантом, якому віддається перевага, 5 днів, 6 днів, 7 днів, 8 днів, 9 днів або 10 днів. За варіантами здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, захворюванням хряща, яке піддають лікуванню, є остеоартрит, згаданою сполукою FGF-18 є фрагмент FGF-18, позначений у цьому описі як FGF 1 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18(170АА), а доза для внутрішньосуглобової ін'єкції становить від 10 мкг до 30 мкг один раз на тиждень впродовж 3 послідовних тижнів (один курс лікування). За варіантом здійснення, якому віддається перевага, такі курси лікування можуть повторюватись через 4 місяці або 6 місяців. Наприклад, якщо курс лікування повторюють через 6 місяців, у разі, коли перший курс лікування розпочато, наприклад, у січні цього року, тоді другий курс лікування може бути розпочатим у червні згаданого року. Цей винахід додатково пропонує застосування сполуки FGF-18 для виготовлення лікарського засобу для лікування хворого, який страждає на захворювання хряща, причому згадану сполуку FGF-18 вводять щонайменше двічі, та згадані здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 4 дні, за варіантом, якому віддається перевага, 5 днів, 6 днів, 7 днів, 8 днів, 9 днів або 10 днів. Цей винахід також пропонує застосування сполуки FGF-18 для лікування хворого, який страждає на захворювання хряща, причому згадану сполуку FGF-18 вводять щонайменше двічі, та згадані введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 4 дні, за варіантом, якому віддається перевага, 5 днів, 6 днів, 7 днів, 8 днів, 9 днів або 10 днів. Цей винахід пропонує також застосування сполуки FGF-18 для виготовлення лікарського засобу для лікування хворого, який має захворювання хряща, причому згаданий лікарський засіб пристосований для введення щонайменше двічі, причому згадані введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 4 дні, за варіантом, якому віддається перевага, 5 днів, 6 днів, 7 днів, 8 днів, 9 днів або 10 днів. Докладний опис винаходу Цей винахід пропонує прийнятні способи лікування, у тому числі прийнятні схеми приймання лікарського засобу для лікування різних захворювань хряща, зокрема, наприклад, остеоартриту, сполуками FGF-18, такими як, наприклад, фрагмент білка FGF-18(170АА). У контексті цього винаходу несподівано встановлено, що сполуки FGF-18 оптимально впливають на захворювання або полегшення тяжкості симптомів у разі введення за способами та варіантами застосування, розкритими у цьому описі. Було встановлено, що застосування лікарського засобу у дозах, які відповідають дозам, що передбачаються цим винаходом або є порівнянними з ними, але за схемою, яка передбачає приймання лікарського засобу рідше за передбачене цим винаходом, можуть не бути повністю ефективними, у той час як приймання лікарського засобу частіше за передбачене цим винаходом може спричинювати запалення хряща або суглобового середовища та/або мати іншу дію на хрящ або суглобове середовище, яка призводить до протилежних результатів. Відповідно за одним з аспектів цього винаходу пропонується спосіб лікування хворого, що має захворювання хряща, який включає введення сполуки FGF-18, у якому згадану сполуку FGF-18 вводять щонайменше двічі, причому згадані введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 4 дні, за варіантом, якому віддається перевага, 5 днів, 6 днів, 7 днів, 8 днів, 9 днів або 10 днів. Наприклад, коли введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 4 дні, друге введення можна здійснювати через приблизно 96 год. після першого введення; наприклад, коли введення здійснюють у 1-й день, наприклад, вранці, впродовж наступних 3 календарних днів хворому не будуть здійснювати введення (2-й день, 3-й день, 4-й день), і хворий знову одержить введення на 5-й день вранці. За варіантом здійснення, якому віддають особливу перевагу, згадані введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 6 днів, 7 днів або 8 днів. За одним із варіантів здійснення, якому віддається перевага, їх здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 7 днів. За іншим аспектом цього винаходу пропонується застосування сполуки FGF-18 для виготовлення лікарського засобу для лікування хворого, який має захворювання хряща, у якому згадану сполуку FGF-18 вводять щонайменше двічі, причому згадані введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 4 дні, за варіантом, якому віддається перевага, 5 днів, 6 днів, 7 днів, 8 днів, 9 днів або 10 днів. За одним із варіантів здійснення, якому віддають особливу перевагу, згадані введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 6 днів, 7 днів або 8 днів. За одним із варіантів здійснення, якому віддається перевага, їх здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 7 днів. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, кожне зі згаданих введень здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 7 днів. За варіантом, якому віддається перевага, сполуку FGF-18 вводять з регулярними інтервалами один раз на тиждень. За одним із варіантів здійснення цього винаходу пропонується застосування сполуки FGF-18 для виготовлення лікарського засобу для лікування хворого, який має захворювання хряща, де згаданий лікарський засіб призначений для введення щонайменше двічі, причому згадані 2 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 4 дні, за варіантом, якому віддається перевага, 5 днів, 6 днів, 7 днів, 8 днів, 9 днів або 10 днів. За одним із варіантів здійснення, якому віддають особливу перевагу, згадані введення здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 6 днів, 7 днів або 8 днів. За одним із варіантів здійснення, якому віддається перевага, їх здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 7 днів. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, кожне зі згаданих введень здійснюють через проміжок часу, який становить приблизно 7 днів. За варіантом, якому віддається перевага, сполуку FGF-18 вводять із регулярними інтервалами один раз на тиждень. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, сполуку FGF-18 вводять впродовж щонайменше 2 послідовних тижнів, щонайменше 3 послідовних тижнів або щонайменше 4 послідовних тижнів протягом курсу лікування. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, курсом лікування є ряд послідовних тижнів, коли сполуку FGF-18 вводять кожного тижня. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, сполуку FGF-18 вводять впродовж 2 послідовних тижнів, 3 послідовних тижнів або 4 послідовних тижнів протягом курсу лікування, і таке лікування може складатись з 1 курсу лікування, 2 курсів лікування, 3 курсів лікування, 4 курсів лікування, 5 курсів лікування або 6 курсів лікування на рік. За одним із варіантів здійснення, якому віддається перевага, сполуку FGF-18 вводять впродовж 3 послідовних тижнів протягом курсу лікування. За одним із варіантів здійснення, якому віддається перевага, таке лікування складається з 2 курсів лікування на рік. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, лікування включає внутрішньосуглобове введення сполуки FGF-18. За альтернативним варіантом лікування може включати внутрішньовенне введення сполуки FGF-18. За додатковим варіантом здійснення, якому віддається перевага, лікування включає введення у дозі 1-100 мкг, або за варіантом, якому віддається перевага, 1-60 мкг, або за варіантом, якому віддається перевага, 3-50 мкг, або за варіантом, якому віддається перевага, 540 мкг, або за варіантом, якому віддається перевага, 10-30 мкг на одне внутрішньосуглобове введення сполуки FGF-18. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, лікування включає введення у дозі приблизно 3 мкг, 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг, 20 мкг, 25 мкг, 30 мкг, 35 мкг, 40 мкг, 45 мкг, 50 мкг, 55 мкг, 60 мкг на одне внутрішньосуглобове введення сполуки FGF-18. Дози, яким віддають перевагу, становлять 5 мкг, 10 мкг, 15 мкг, 20 мкг, 25 мкг і 30 мкг на одне внутрішньосуглобове введення сполуки FGF-18. За іншим варіантом здійснення, якому віддається перевага, лікування включає введення у дозі 50-200 мкг/кг, за варіантом, якому віддається перевага, 80-120 мкг/кг на одне внутрішньовенне введення сполуки FGF-18. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, лікування включає введення у дозі 80 мкг/кг, 90 мкг/кг, 100 мкг/кг, 110 мкг/кг або 120 мкг/кг на одне внутрішньовенне введення сполуки FGF-18. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, захворюванням хряща, яке піддають лікуванню за будь-яким зі способів за цим винаходом, є остеоартрит, такий як, наприклад, остеоартрит, який за критеріями OARSI (Міжнародне товариство з дослідження остеоартрозу) класифікують як остеоартрит II стадії або остеоартрит III стадії. За прикладом, якому віддається перевага, остеоартритом може бути остеоартрит колінного суглоба або остеоартрит тазостегнового суглоба, наприклад, вторинний остеоартрит тазостегнового суглоба. Для фахівця є повністю зрозумілими класифікації остеоартриту, які вживаються у цій галузі. У цій галузі, зокрема, відома класифікація OARSI. Фахівець може звертатись до довідника "Guidelines for the medical management of osteoarthritis" (Марк К. Хохберг (Marc C. Hochberg), Рой Д. Альтман (Roy D. Altman), Кеннет Д. Брандт (Kenneth D. Brandt), Брюс М. Кларк (Bruce M. Clark), Пол А.Дьєпп (Paul A. Dieppe), Марі Р. Гріффін (Marie R. Griffin), Роланд В. Московіч (Roland W. Moskowitz), Томас Дж. Шніцер (Thomas J. Schnitzer), Arthritis & Rheumatism, том 38, видання 11, 1995, стор. 1535-1546.) Сполуки FGF-18 за цим винаходом, яким віддають перевагу, вибрані з-посеред людського FGF-18 дикого типу або FGF-18(170АА). Сполуки за цим винаходом Нативний FGF-18 або FGF-18 дикого типу являє собою білок, який експресується хондроцитами суглобового хряща. Цей винахід, взагалі, має відношення до застосування сполуки фактора росту фібробластів 18 (FGF-18) для лікування остеоартриту. Сполука FGF-18 за цим винаходом включає, наприклад, нативний FGF-18 або FGF-18 дикого типу, зокрема, людський FGF-18, його біологічно активні варіанти, наприклад, біологічно активні алельні варіанти та біологічно активні скорочені форми FGF-18. Цей винахід може мати відношення до будь-якого варіанта або модифікованої форми FGF-18, яка зберігає бажану біологічну активність FGF-18, як описано у цьому описі, наприклад, зокрема, збільшення осадження 3 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хряща. Біологічні активності FGF-18 охоплюють, зокрема, біологічні активності, опис яких наведено у Прикладах, які наведено нижче, наприклад, зокрема, у in vivo моделях захворювань, опис яких наведено у цьому описі. Опис нуклеотидної послідовності кДНК людського FGF-18 надається Послідовністю № 1, а опис його розшифрованої амінокислотної послідовності надається Послідовністю № 2. Початково FGF-18 мав позначення zFGF-5, і його повний опис наведено у патентах США № 6,352,971, № 5,989,866 та у публікації заявки на патент США № 2005/0043234, усі з яких включено до цього опису шляхом посилання. Аналіз кДНК, що кодує людський поліпептид FGF18 (Послідовність № 1), виявив відкриту рамку зчитування, що кодує 207 амінокислот (Послідовність № 2), яка являє собою зрілий поліпептид довжиною 180 амінокислот (залишок 28-залишок 207 Послідовності № 2). Було встановлено, що послідовність мишачого полінуклеотиду FGF-18, як показано Послідовністю № 3, та відповідна амінокислотна послідовність, як показано Послідовністю № 4, мають високий ступінь гомології з послідовністю людського ортолога. На амінокислотному рівні мишачі і людські поліпептиди є ідентичними приблизно на 98 %, з трьома амінокислотними замінами. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що послідовності, розкриті Послідовністю № 1 або Послідовністю № 3 та Послідовністю № 2 і Послідовністю № 4, являють собою один алель людського і мишачого гена та поліпептиду FGF-18, відповідно, і що можливою є алельна варіація та альтернативне сплайсування. Як вже згадувалось, сполука FGF-18 за цим винаходом охоплює, наприклад, нативний FGF18 або FGF-18 дикого типу, зокрема, людський FGF-18, його біологічно активні варіанти, наприклад, біологічно активні алельні варіанти, та біологічно активні скорочені форми FGF-18. Цей винахід може мати відношення до будь-якого варіанта або модифікованої форми FGF-18, яка зберігає бажану біологічну активність FGF-18, як описано у цьому описі, наприклад, зокрема, збільшення осадження хряща. За одним із варіантів здійснення цього винаходу сполука FGF-18 являє собою скорочену форму людського FGF-18. За конкретним варіантом здійснення, згадана скорочена форма FGF18 містить або складається із залишків 28-175 Послідовності № 2 або функціонального деривату чи варіанта або мутеїну, як визначено у цьому описі. За іншим варіантом здійснення згадана скорочена форма FGF-18 містить або складається із залишків 28-176, 28-177, 28-178, 28-179, 28-180, 28-181, 28-182, 28-183, 28-184, 28-185, 28-186, 28-187, 28-188, 28-189, 28-190, 28-191, 28-192, 28-193, 28-194 або 28-195, 28-196, 28-197, 28-198, 28-199, 28-200, 28-201, 28202, 28-203, 28-204, 28-205, 28-206 або 28-207 Послідовності № 2 або функціонального деривату чи варіанта або мутеїну, як визначено у цьому описі. Ці поліпептиди, функціональні деривати або варіант чи мутеїн можуть містити додатковий N-кінцевий амінокислотний залишок, за варіантом, якому віддається перевага, метіонін. Дійсно, у залежності від експресійної системи та умов, поліпептиди за цим винаходом можуть експресуватись у рекомбінантній клітині-хазяїні з вихідним метіоніном. Варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, є скорочена форма FGF18, що містить 170 амінокислот (АА), яка у цьому описі позначається також як "FGF-18(170АА)”. Згадана форма дикого типу або природна форма складається з 207 амінокислот (АА), перші 27 амінокислот з яких становлять сигнальну послідовність, а останні 11 амінокислот у FGF18(170АА) видалені (що може бути продемонстроване також для природного FGF-18 in vivo). FGF-18(170АА) може експресуватись у E.coli, оскільки сигнальної послідовності немає, амінокислотна послідовність розпочинається метіоніном, за яким розташована амінокислота АА 28, і закінчується амінокислотою АА 196. Молекулярна маса FGF-18(170АА) становить 19,83 кДа, pI10. Додатковий опис FGF-18(170AA) представлено Послідовністю № 5, наведеною нижче. FGF-18(170АА) стимулює проліферацію/диференціацію хондроцитів і відкладення хряща, наслідком чого є репарація та реконструкція цілого ряду хрящових тканин. Члени сімейства FGF характеризуються наявністю гепаринзв'язувальних доменів. Гіпотетичний гепаринзв'язувальний домен для FGF-18 ідентифікували на ділянці від амінокислотного залишку 148 (Gly) до амінокислотного залишку 169 (Gln) Послідовності № 2 та Послідовності № 4. Припускають, що рецепторопосередковане передавання сигналу ініціюється у разі зв'язування ліганду FGF у комплексі з поверхневоклітинними протеогліканами гепаринсульфату. Багато членів сімейства FGF можуть бути віднесені до одного з двох споріднених сімейств, виходячи з їхніх структур та функцій. Кислотний фактор росту фібробластів (аFGF) та основний фактор росту фібробластів (bFGF) складаються з трьох екзонів, відокремлених двома інтронами різної довжини. FGF-18 складається з п'яти екзонів, перші три з яких відповідають першому екзону аFGF та bFGF. Усі відомі члени сімейства FGF сплайсуються з утворенням 4 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 простих поліпептидів. Аналіз ліганд-рецепторного комплексу FGF-18 продемонстрував, що FGF-18 має специфічність до FGFR4 та "IIIc" сплайсингових варіантів FGFR3 та FGFR2. FGFR3-IIIc та FGFR2-IIIc експресуються хондроцитами хрящової тканини, і, зокрема, обидва рецептори були знайдені у людському суглобовому хрящі. FGFR3 та FGFR2 були знайдені у епіфізарній пластинці ссавців, і вони відіграють важливу роль у формуванні ендохондральної кістки та кістки, що розвинулась з мезенхими. FGFR2 експресується спочатку у мезенхимі, що згущується, а експресія FGFR3 розпочинається під час диференціювання та проліферації хондроцитів. У кістках черепа, що розвиваються, FGFR3 знаходять у твердій мозковій оболонці та періості, у той час як FGFR2 експресується у клітинах-попередниках остеоцитів остеогенного фронту, що відокремлює шви. FGFR2 експресується також у губчастій кістці. Раніше було показано, що FGF-18 є проліферативним агентом для хондроцитів та остеобластів, залежним як від стану диференціювання клітин цих типів, так і від способу введення. (Дивись патенти США № 6,352,971 та ¹ 5,989,866; Елсворт (Ellsworth) та інші, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320, 2002; Шімоака (Shimoaka) та інші, J. Bio. Chem., 277 (9) 7493-500, 2002). За варіантом, якому віддається перевага, сполука FGF-18 за цим винаходом збільшує осадження хряща. Таке збільшення може визначатись як in vivo, так і in vitro. Синтезований гіаліновий хрящ, еластичний хрящ та волокнистий хрящ є цінним як терапевтичний засіб, а також як складова біологічних матриць. Сполуки FGF-18, наприклад, FGF-18(170АА), та композиції, які містять сполуки FGF-18 ("композиції FGF-18") будуть придатними для лікування дефектів суглобового хряща синовіальних суглобів, які спричинюються пов'язаною з віком поверхневою фібриляцією, дегенерацією хряща унаслідок остеоартриту, та фокальних хрящових і кістково-хрящових дефектів, спричинених пошкодженням або захворюванням. Сполуки і композиції FGF-18 можуть також бути придатними для лікування захворювань суглобів, які спричинюються розсікальним остеохондритом та дегенеративним захворюванням суглобів. У галузі реконструктивної та пластичної хірургії композиції FGF-18 будуть придатними для розвитку і перенесення автогенного або алогенного хряща для реконструкції широких пошкоджень тканин. Сполуки і композиції FGF-18 можуть також бути придатними для розвитку клітин та стимулювання синтезу еластичного хряща. Розвиток клітин та стимулювання синтезу еластичного хряща будуть придатними для утворення та репарації тканини вуха та носу. Сполуки та композиції FGF-18 можуть також бути застосовані для розвитку популяцій хондроцитів у культурі для трансплантації автогенних або алогенних хондроцитів із подальшим введенням із сумісним лікуванням, яке полягає у введенні композицій FGF-18, або без такого лікування. У цих процедурах, наприклад, хондроцити можуть збиратись за допомогою артроскопа з непошкодженої другорядної ділянки пошкодженого суглоба, яка несе навантаження, і можуть культивуватись у присутності композицій FGF-18 для збільшення кількості клітин перед трансплантацією. Після цього збільшені за об'ємом культури будуть змішуватись із композиціями FGF-18 і розміщуватись у порожнині суглоба або безпосередньо на ділянці дефекту. Композиції FGF-18 можуть застосовуватись у комбінації з періостальними або періхондральними трансплантатами, які містять клітини, які можуть утворювати хрящ та/або допомагати утримувати на місці трансплантовані хондроцити або їхні клітини-попередники. Композиції FGF-18 можуть застосовуватись для репарації пошкодження хряща у поєднанні з промиванням суглоба, стимуляцією кісткового мозку, абразивною артропластикою, свердленням у субхондральній зоні або мікропереломом субхондральної кістки. Крім того, після росту хряща унаслідок введення композиції FGF-18, може виникнути необхідність у додатковому хірургічного лікуванні для надання поверхні новоутвореного хряща відповідної конфігурації. Сполука FGF-18 за цим винаходом може також бути функціональним дериватом, варіантом або мутеїном білка FGF-18 дикого типу. Термін "функціональні деривати", який вживається у цьому описі, означає деривати FGF-18 та його варіанти або мутеїни і гібридні білки, які можуть одержуватись із функціональних груп, які існують як бічні ланцюги на залишках, або N- чи C-кінцевих груп, відомими у цій галузі засобами. Ці функціональні деривати включають до винаходу, доки вони залишаються фармацевтично прийнятними, тобто доки вони не знищують активності білка, яка є по суті подібною до активності FGF-18 або кращою за неї, і не наділяють токсичними властивостями композиції, які їх містять. Ці деривати можуть, наприклад, включати бічні ланцюги поліетиленгліколю, які можуть поліпшувати інші властивості білка, наприклад, стійкість, період напіввиведення, біодоступність, прийнятність для людського тіла, або зменшувати імуногенність. Для досягнення цієї мети FGF 5 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 18 може зв'язуватись, наприклад, із поліетиленгліколем (PEG). Пегілування може здійснюватись відомими способами, як, наприклад, описано у WO 92/13095. Зокрема, PEG-IFN можна одержати відповідно до WO 99/55377. Отже, за варіантом здійснення, якому віддається перевага, функціональний дериват FGF-18 містить щонайменше одну складову, зв'язану з однією або декількома функціональними групами, які існують у вигляді одного або декількох бічних ланцюгів на амінокислотних залишках. Найбільшу перевагу віддають варіанту здійснення, за яким згаданою складовою є поліетиленглікольна (PEG) складова. Відповідно до цього винаходу до FGF-18 можуть також приєднуватись декілька PEG складових. Інші деривати включають модифікований білок FGF-18, наприклад, форму FGF-18 пролонгованої дії. Зокрема, FGF-18 пролонгованої дії може вибиратись з-посеред пегільованого FGF-18, FGF-18-HAS-гібридних білків та FGF-18-Fc-гібридних білків. До числа інших дериватів належать аліфатичні складні ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних груп, які одержують шляхом реакції з аміаком або з первинними чи вторинними амінами, N-ацильні деривати вільних аміногруп амінокислотних залишків, які одержують з ацильними складовими (наприклад, алканоїльними або карбоциклічними ароїльними групами) або О-ацильні деривати вільних гідроксильних груп (наприклад, серильних або треонільних залишків), які одержують з ацильними складовими. Терміни "варіанти" або "мутеїни", які вживаються у рамках цього винаходу, означають аналоги FGF-18, у яких один або декілька амінокислотних залишків природного FGF-18 замінені на різні амінокислотні залишки або видалені, або один або декілька амінокислотних залишків додані до природної послідовності FGF-18 без значного зниження активності одержаного продукту, порівняно з FGF-18 дикого типу. Ці мутеїні одержують за допомогою відомих методів синтезу та/або сайтспрямованого мутагенезу чи за допомогою будь-якого іншого відомого придатного для цього способу. Термін "варіант" або "мутеїн" за цим винаходом означає білки, закодовані нуклеїновою кислотою, наприклад, ДНК або РНК, яка гібридизується з ДНК або РНК, яка кодує FGF-18, за суворих умов, як описано, наприклад, у патенті США № 5,989,866. Термін "суворі умови" означає умови гібридизації та подальшого промивання, які фахівці у цій галузі традиційно визначають як "суворі". Дивись Осбел (Ausubel) та інші, Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, N.Y., § 6.3 та § 6.4 (1987, 1992). До прикладів суворих умов (без обмеження ними) належать умови промивання при температурі на 12-20C нижче обчисленої Tm експериментального гібриду, наприклад, у 2SSC (стандартний цитратний фізіологічний розчин) та 0,5 % SDS (додецилсульфат натрію) впродовж 5 хв, 2SSC та 0,1 % SDS впродовж 15 хв; 0,1SSC та 0,5 % SDS при температурі 37C впродовж 30-60 хв, після чого 0,1SSC та 0,5 % SDS при температурі 68C впродовж 30-60 хв. Фахівцям у цій галузі зрозуміло, що суворі умови залежать також від довжини послідовності ДНК, олігонуклеотидних зондів (наприклад, 1040 основ) або змішаних олігонуклеотидних зондів. У разі застосування змішаних зондів перевагу віддають застосуванню тетраметиламонію хлориду (TMAC) замість SSC. Дивись Осбел (Ausubel), supra. Термін "ідентичність" означає тотожність між двома або декількома поліпептидними послідовностями чи двома або декількома полінуклеотидними послідовностями, що визначається шляхом порівняння послідовностей. Загалом термін "ідентичність" означає повну тотожність (нуклеотид:нуклеотид, амінокислота:амінокислота) двох полінуклеотидних або двох поліпептидних послідовностей, відповідно, по довжині послідовностей, що порівнюються. У разі послідовностей, які не мають повної тотожності, може визначатись "відсоток ідентичності". Як правило, дві порівнювані послідовності впорядковано розміщуються для одержання максимальної кореляції між послідовностями. Цей процес може включати введення "проривів" до будь-якої однієї або обох послідовностей для підвищення ступеня впорядкованого розміщення. Відсоток ідентичності може визначатись по усій довжині кожної з порівнюваних послідовностей (так званий глобальний порівняльний аналіз), що є особливо придатним для послідовностей однакової або дуже подібної довжини, або для коротших відрізків визначеної довжини (так званий локальний порівняльний аналіз), що є більш придатним для послідовностей неоднакової довжини. Методи порівняння ідентичності і гомології та/або подібності двох або декількох послідовностей є добре відомими у цій галузі. Так, наприклад, програми, доступні у пакеті програм Wisconsin Sequence Analysis Package, версія 9.1 (Деверо Дж. (Devereux J.) та інші, 1984), наприклад, програми BESTFIT та GAP, можуть застосовуватись для визначення відсотка ідентичності між двома полінуклеотидами і відсотка ідентичності та відсотка гомології між двома поліпептидними послідовностями. Програма BESTFIT застосовує алгоритм "локальної 6 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 гомології" Сміта (Smith) та Уотермена (Waterman) (1981) і знаходить одну найкращу ділянку подібності між двома послідовностями. У цій галузі також відомі інші програми для визначення ідентичності та/або подібності між послідовностями, наприклад, сімейство програм BLAST (Альтшуль С.Ф. (Altschul S.F.) та інші, 1990, Альтшуль С.Ф. (Altschul S.F.) та інші, 1997, доступне на домашній сторінці NCBI за адресою www.ncbi.nlm.nih.gov) та FASTA (Пірсон В.Р. (Pearson W.R.) 1990). Термін "варіант" або "мутеїн" за цим винаходом означає білки, які мають послідовність амінокислот, яка достатньою мірою повторює послідовність FGF-18, причому настільки, що вони мають активність, яка по суті є подібною до активності FGF-18. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, будь-який з таких варіантів або мутеїнів має щонайменше 40 % ідентичність або гомологію з послідовністю FGF-18. За варіантом, якому віддається більша перевага, будь-який з таких варіантів або мутеїнів має щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 70 %, щонайменше 80 % або за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше 90 % ідентичність або гомологію з послідовністю FGF-18. Мутеїни FGF-18, які можуть застосовуватись за цим винаходом, або нуклеїнова кислота, яка їх кодує, включають кінцевий набір по суті тотожних послідовностей як замісних пептидів або полінуклеотидів, які можуть побіжно одержуватись пересічним фахівцем у цій галузі без зайвого експериментування, грунтуючись на наведених у цьому описі ідеях та порадах. Замінами для мутеїнів за цим винаходом, яким віддають перевагу, є заміни, відомі як "консервативні" заміни. Консервативні амінокислотні заміни поліпептидів FGF-18 можуть включати синонімічні амінокислоти у межах групи, які мають достатньо подібні фізико-хімічні властивості, завдяки чому заміна між членами групи збереже біологічну функцію молекули (Грантем (Grantham, 1974). Зрозуміло, що у вищевизначених послідовностях можуть також здійснюватись інсерції та делеції без зміни їхніх функції, зокрема, у разі, якщо інсерції або делеції охоплюють лише декілька амінокислот, наприклад, менше тридцяти, а за варіантом, якому віддається перевага, менше десяти, і не відбувається видалення або зміщення амінокислот, які є критичними для функціональної конформації, наприклад, залишків цистеїну. Білки та мутеїні, одержані шляхом таких делецій та/або інсерцій, входять до сфери дії цього винаходу. За варіантом, якому віддається перевага, групами синонімічних амінокислот є групи, визначені у Таблиці А. За варіантом, якому віддається більша перевага, групами синонімічних амінокислот є групи, визначені у Таблиці В; і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, групами синонімічних амінокислот є групи, визначені у Таблиці С. 35 Таблиця А Групи синонімічних амінокислот, яким віддають перевагу Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Синонімічна група Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gln, Lys, Glu, His Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu 7 UA 99818 C2 Таблиця А Групи синонімічних амінокислот, яким віддають перевагу АмінокиСинонімічна група слота Met Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp Trp Таблиця В Групи синонімічних амінокислот, яким віддають більшу перевагу Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp Синонімічна група Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Таблиця С Групи синонімічних амінокислот, яким віддають найбільшу перевагу Амінокислота Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Синонімічна група Ser Arg Leu, Ile, Met Pro Thr Ala Val Gly Ile, Met, Leu Phe Tyr Cys, Ser His Gln 8 UA 99818 C2 Таблиця С Групи синонімічних амінокислот, яким віддають найбільшу перевагу Амінокислота Asn Lys Asp Glu Met Trp 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Синонімічна група Asn Lys Asp Glu Met, Ile, Leu Met Приклади здійснення амінокислотних замін у білках, які можуть застосовуватись для одержання мутеїнів FGF-18 для застосування за цим винаходом, включають стадії будь-яких відомих способів, наприклад, описаних у патентах США № 4,959,314, № 4,588,585 та № 4,737,462 (на ім'я Марк (Mark) та інші); № 5,116,943 (на ім'я Котс (Koths) та інші), № 4,965,195 (на ім'я Неймен (Namen) та інші); № 4,879,111 (на ім'я Чонг (Chong) та інші; та № 5,017,691 (на ім'я Лі (Lee) та інші; та білки із заміненим лізином, описані у патенті США № 4,904,584 (Шоу (Shaw) та інші). Одержання і введення сполуки FGF-18 Сполуки FGF-18 можна одержати у вигляді фармацевтичної композиції, тобто разом із фармацевтично прийнятним носієм, наповнювачами тощо. Визначення "фармацевтично прийнятний" охоплює будь-який носій, який не впливає на біологічну активність активного інгредієнта і який не є токсичним для хазяїна, якому він вводиться. Наприклад, для парентерального введення, активному(-им) білка(-ам) може надаватись лікарська форма для ін'єкцій у таких носіях, наприклад, як фізіологічний розчин, розчин декстрози, сироватковий альбумін та розчин Рінгера. Такі композиції сполук FGF-18, які містять щонайменше один додатковий фармацевтично прийнятний носій, наповнювачі тощо, у цьому описі називають також "композиціями FGF-18". Сполуки і композиції FGF-18 можуть застосовуватись шляхом прямого впорскування до синовіальної рідини суглоба або безпосередньо в уражену ділянку суглоба, самостійно або у комплексі з відповідним носієм для пролонгованого виділення білка (наприклад, із відповідними наповнювачами для композицій пролонгованої дії, наприклад, циклодекстрином) або обмеженого локального виділення (такого як, наприклад, доставка за допомогою біосумісних губок, подібних біологічних матриць, капсульованих клітин тощо). Композиції для внутрішньосуглобового (IA) застосування будуть відповідати більшості вимог, які також розповсюджуються на інші ін'єкційні композиції, тобто вони повинні бути стерильними і сумісними із фізіологічними умовами на ділянці застосування (наприклад, у колінному суглобі, у синовіальній рідині). Стерильність композицій-розчинів може забезпечуватись шляхом автоклавування (якщо усі компоненти композиції є достатньо стійкими до термічного напруження) або стерильної фільтрації, у той час як для інших композицій процеси виготовлення, необхідні для забезпечення одержання стерильного продукту, можуть бути більш складними. Стерильна фільтрація, наприклад, є неприйнятною для композицій, які містять частинки (суспензії), напівтвердих або твердих композицій. Для сумісності композиції із фізіологічними умовами на ділянці ін'єкції до уваги слід приймати характеристики синовіальної рідини. Отже, композиції за цим винаходом, яким віддають перевагу, є ізотонічними. рН композицій або наближається до рН синовіальної рідини (тобто рН 7,4), або є дещо нижчим, але за варіантом, якому віддається перевага, не нижчим за рН~5,5 для забезпечення оптимальної стабільності активного інгредієнта з одночасним зведенням до мінімального рівня можливих побічних ефектів нефізіологічних значень рН, наприклад, активації протеолітичних ферментів, наприклад, катепсинів. Наповнювачі, які застосовуються для внутрішньосуглобової ін'єкції, можуть також бути присутніми у інших ін'єкційних композиціях, наприклад, для внутрішньом'язового або підшкірного застосування. За одним із варіантів здійснення цього винаходу спосіб введення сполуки FGF-18, опис якої наведено, вибраний з групи, яка включає: введення до вушної раковини, введення навколо вушної раковини, введення до носа, введення навколо носа, внутрішньопорожнинне введення, внутрішньореберне введення, навколореберне введення, внутрішньогрудинне введення, навкологрудинне введення, епідуральне введення, навколохребетне введення, 9 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 навколосиновіальне введення, інтрасиновіальне введення, внутрішньопорожнинне введення, навколосуглобове введення та внутрішньосуглобове введення. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, сполуку FGF-18, опис якої наведено, вводять навколосуглобово (введення навколо суглоба) або внутрішньосуглобово (введення до суглоба). За одним із варіантів здійснення цього винаходу навколосуглобове або внутрішньосуглобове введення здійснюють навколо або до суглоба, вибраного з-посеред тазостегнового суглоба, коліна, ліктя, зап'ястка, кісточки, хребта, стопи, пальця руки, пальця ноги, руки, плеча, ребер, лопаток, стегон, гомілок, п'яток та вздовж кісткових виступів хребта. За ще одним варіантом здійснення, якому віддається перевага, навколосуглобове або внутрішньосуглобове введення здійснюють навколо або в тазостегновий суглоб або коліно. Захворювання хряща Цей винахід має відношення до способів лікування, запобігання або зменшення інтенсивності симптомів захворювання хряща у ссавців. За варіантом, якому віддається перевага, таке захворювання хряща є наслідком порушень, спричинених травматичним ушкодженням або хондропатією. Зрозуміло, що хворими, які зазнають лікування за цим винаходом, є за варіантом, якому віддається перевага, люди; однак зрозуміло, що за способами за цим винаходом можуть лікуватись інші ссавці, у тому числі (але без обмеження ними) собаки, коні тощо. До прикладів захворювань хряща, які можна лікувати, запобігати або інтенсивність симптомів яких можна зменшувати лікуванням, опис якого наведено, належать (але без обмеження ними): артрит, остеохондрит, реберний хондрит (наприклад, синдром Тітце), остеомієліт, поліхондрит, рецидивний поліхондрит та розсікальний остеохондрит. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є артрит. За варіантом, якому віддається перевага, згадане захворювання вибране з групи, яку складають: анкілозивний спондилоартрит, дифузний ідіопатичний скелетний гіперостоз (DISH), подагра, псевдоподагра, інфекційний артрит, остеоартрит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, реактивний артрит, склеродермія, синдром Шегрена і хвороба Стілла-Шоффара. За варіантом здійснення, якому віддається перевага, захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є ревматоїдний артрит або остеоартрит. За варіантом здійснення, якому віддають особливу перевагу, захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є остеоартрит. Артрит має відношення до пошкодження суглобових структур (суглобів) у тілі і пов'язаних із цим запальних процесів. Артрит, у тому числі остеоартрит, ревматоїдний артрит, артритні суглоби, як результат ушкодження або подібного впливу, являють собою розповсюджені запальні стани, на які могло б благотворно подіяти терапевтичне застосування FGF-18 за цим винаходом. За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є анкілозивний спондилоартрит. Анкілозивний спондилоартрит (AS) являє собою артрит, що уражає хребет. Він спричинює біль і тугорухливість спини, а також викликає зігнуте положення тіла. Це є наслідком тривалого опухання і подразнення суглобів хребта (хребців). У тяжких випадках запалення хребців може зрештою призвести до їх зрощення, наслідком чого є сильно обмежена рухливість. Наслідком запалення сухожиль та зв'язок, які з'єднують і забезпечують підтримку хребців, може бути біль і болісність у ребрах, лопатках, верхній частині стегон, стегнах, гомілках, п'ятках та вздовж кісткових виступів хребта. Анкілозивний спондилоартрит є хронічною запальною формою артриту, що уражає суглоби хребта. Головною відмітною особливістю анкілозивного спондилоартриту є ураження суглобів нижньої частини хребта, де хребет з'єднується з тазом та крижовоклубовими суглобами (SI). Перебіг захворювання є надзвичайно змінним. У той час як у певних осіб трапляються лише тимчасові напади болю у спині, інші майже постійно відчувають тяжкий біль у спині, наслідком чого є розвиток із часом різного ступеня тугорухливості хребта. Майже в усіх випадках захворювання характеризується гострими болісними нападами та ремісіями (періоди, коли симптоми захворювання тимчасово зникають). Впродовж багатьох років анкілозивний спондилоартрит називали по-різному, у тому числі ревматоїдним спондилітом та хворобою Бехтерева-Штрюмпелля-Марі. З початку сімдесятих років, завдяки збільшенню обсягу знань стосовно цього захворювання, майже загальноприйнятим є термін анкілозивний спондилоартрит. Анкілозивний спондилоартрит є членом сімейства захворювань, які уражають хребет. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, 10 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є дифузний ідіопатичний скелетний гіперостоз. Дифузний ідіопатичний скелетний гіперостоз (DISH) характеризується надмірним розростанням кісток по бокам хребців хребта. Це захворювання характеризується також запаленням і розростанням кістки у місці приєднання до неї сухожиль та зв'язок, наприклад, на лікті, коліні та п'ятці стопи. У людей, які страждають на дифузний ідіопатичний скелетний гіперостоз, звичайним явищем є остеофіти. Дифузний ідіопатичний скелетний гіперостоз (який іноді називають хворобою Форестьє) вважають формою дегенеративного артриту, і це захворювання характеризується надмірним розростанням кісток по бокам хребців хребта. Це захворювання пов'язується також із запаленням і кальцифікацією (розростанням кістки) на інших ділянках тіла, де до кістки приєднуються сухожилля та зв'язки, наприклад, на лікті, коліні та п'ятці. Унаслідок цього можуть виникати остеофіти. У людей, що страждають на дифузний ідіопатичний скелетний гіперостоз, звичайним явищем є п'яткові шпори. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є подагра. Подагра являє собою тип артриту, у разі якого вміст сечової кислоти, продукту життєдіяльності, присутність якого є природною у організмі, перевищує нормальні рівні. Замість того, щоб вимиватись нирками і видалятись із сечею, що є природним процесом, сечова кислота утворює кристали і відкладається у суглобах. Ці відкладення викликають запалення суглобів зі спричиненням болю, опухання, почервоніння та болісності цієї ділянки. Найчастіше уражуваним суглобом є суглоб великого пальця ноги, однак подагра може також уражувати кісточку, коліно, стопу, кисть руки, зап'ясток та лікоть. Кристали сечової кислоти можуть також утворювати відкладення на інших ділянках, наприклад, під шкірою або у інших м'яких тканинах та у нирках або сечових шляхах. Подагра, як правило, уражає суглоб у основі великого пальця ноги. Майже у половині випадків усіх початкових нападів цей суглоб є першим уражуваним суглобом. Може бути уражений майже будь-який інший суглоб, але суглоби нижніх кінцівок уражаються частіше, аніж суглоби верхніх кінцівок. Більшість початкових нападів подагри уражає лише один суглоб і, у разі лікування, інтенсивність симптомів зменшується через три-десять днів. Більше ніж у 50 % людей, які мали гострий напад подагри, рецидив відбудеться на протязі року. З часом напади можуть траплятись частіше, тривати довше і часто уражати більшу кількість суглобів. У певних людей напади затягуються, і захворювання стає хронічним. Кристали сечової кислоти, які відклалися усередині суглоба і в навколишніх м'яких тканинах, спричинюють деструктивні зміни у суглобі і викликають постійне запалення. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є псевдоподагра. Псевдоподагра являє собою тип артриту, що спричинюється накопиченням кальцію у тілі. Псевдоподагра є наслідком накопичення кристалів кальцію (кристали дигідрату пірофосфату кальцію) у суглобі. Кальцій утворює кристали, які відкладаються у суглобах між кістками. Це викликає опухання і біль на цій ділянці. Відкладення кальцію і хронічне запалення можуть призвести до того, що частини структури суглоба слабшають і руйнуються. У разі псевдоподагри хрящ починає розтріскуватись, і у ньому з'являються отвори, що спричинює посилення болю і опухання суглоба. З часом хрящ може повністю спрацюватись, і кістки почнуть тертися одна об одну. Біль у разі псевдоподагри найчастіше є наслідком того, що м'язи та інші тканини, які допомагають рухатись суглобу (наприклад, сухожилля та зв'язки), унаслідок пошкодження хряща вимушені працювати іншим чином, аніж той, для якого вони призначені. Сам хрящ не має нервових клітин і тому не може відчувати болю, але біль відчувають м'язи, сухожилля, зв'язки і кістки. Після багатьох років ерозії хряща кістки можуть почати фактично тертись одна об одну. Це тертя кісти об кістку додатково посилює відчуття болю. Кістки можуть також потовщуватись з утворенням наростів, які називають шпорами або остеофітами, які труться між собою. Подібно як і у разі захворювання на подагру, псевдоподагра може виникнути як раптові, рецидивні напади болю і опухання одного суглоба. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є інфекційний артрит. Інфекційний артрит викликає біль і припухлості у суглобах. Запалення спричинюється патогенним мікроорганізмом. Цим патогенним мікроорганізмом може бути бактерія, вірус або гриб. Уражається, як правило, лише один суглоб, хоча іноді інфікуватись можуть два або три суглоби. Це захворювання, у разі раннього початку лікування, є, як правило, нетривалим. Інфекційний артрит уражає, головним чином, великі суглоби (плечові, тазостегнові, колінні), 11 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 але уражатись можуть також і менші суглоби (суглоби пальців, гомілковостопні суглоби). За варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є остеоартрит. Остеоартрит є найпоширенішою формою артриту. Це захворювання може спричинюватись руйнуванням хряща. Шматочки хряща можуть відриватись і викликати біль та припухлості у суглобі між кістками. З часом хрящ може повністю спрацюватись, і кістки почнуть тертися одна об одну. Остеоартрит може уражувати будь-який суглоб, але ураженими, як правило, виявляються руки та суглоби, які несуть навантаження, наприклад, тазостегнові суглоби, колінні суглоби, суглоби стоп та хребта. Захворювання на остеоартрит (ОА) є складним, багатофакторним прогресуючим захворюванням, яке не є запальним за природою і яке характеризується загальною пов'язаною з віком дегенерацією суглобового хряща у суглобах. Остеоартрит також характеризується активацією хондроцитів, наслідком чого є проліферація та апоптоз клітин, експресія протеаз та аномальний синтез матриці. Наслідком відсутності регенерації хряща є втрата позаклітинної матриці, кальцифікація матриці та утворення остеофітів. Унаслідок дегенерації хрящових та позаклітинних матричних структур підвищується тертя між кістками та нервами уражених суглобів. Остеоартрит викликає у хворих біль різного ступеню та прогресуюче ослаблення. Існуючі способи лікування остеоартриту є паліативними або хірургічними. У здорових суглобах хрящ відіграє роль амортизатору, коли суглоб навантажується. Слизька поверхня хряща уможливлює гладке рухання кісток. Коли суглоб уражається остеоартритом, хрящ поступово стає шорстким і тонким, а кістка під хрящем потовщується. Незважаючи на те, що на початковій стадії захворювання припухлості, як правило, немає, у міру розвитку артриту може виникати запалення. Шматочки хряща можуть відриватись і плавати усередині суглоба. Це пошкоджує інші м'які тканини усередині суглоба і може викликати біль і опухання між кістками. З часом, у міру зношення хряща, на кінцях кісток можуть утворюватись опуклості. Ці опуклості називають шпорами. Або ж хрящ може повністю зноситись, і кістки можуть безпосередньо контактувати одна з одною. Унаслідок остеоартриту можуть виникнути інші проблеми, а саме: м'язи, які утримують суглоб на місці, слабшають, оскільки вони не використовуються, суглоб із часом втрачає свою форму і зовсім припиняє функціонувати. Остеоартрит, як правило, уражає суглоби, які несуть навантаження, наприклад, тазостегнові суглоби, колінні суглоби, суглоби стоп і хребта. Однак уражатись можуть також і суглоби, які не несуть навантаження, наприклад, суглоби пальців і суглоб у основі великого пальця руки. Остеоартрит, як правило, не уражає інші суглоби, за виключенням випадків, коли вони були пошкоджені або зазнають незвичного навантаження. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є ревматоїдний артрит. Ревматоїдний артрит (RA) являє собою хронічне системне автоімунне запальне захворювання, яке уражає, головним чином, синовіальну оболонку численних суглобів із подальшим ушкодженням суглобового хряща. Патогенез є Т-лімфоцит-залежним і пов'язується з продукуванням ревматоїдних факторів, автоантитіл, спрямованих проти власного IgG, з утворенням в результаті імунних комплексів, вміст яких досягає високих рівнів у синовіальній рідині та крові. Ці комплекси у суглобі можуть спричинювати явно виражений інфільтрат лімфоцитів і моноцитів до синовіальної оболонки з подальшими явно вираженими її змінами; порожнина суглоба/синовіальна рідина інфільтрується подібними клітинами з доданням численних нейтрофілів. Ураженими тканинами є, головним чином, суглоби, часто за симетричною схемою. Клітини запального інфільтрату виділяють ферменти, які можуть розщеплювати кісткову тканину і хрящ. Як наслідок ревматоїдного артриту запалена вистілка суглоба, синовіальна оболонка, може проникати до кістки та хряща і пошкоджувати їх, що спричинює пошкодження суглоба і, разом з іншими фізіологічними ефектами, викликає тяжкий біль. Уражений суглоб може втратити свою форму і правильне положення, наслідком чого є біль і втрата рухливості. Отже, ревматоїдний артрит може призвести до тяжкої інвалідності та підвищеної смертності. Пошкодження суглоба може відбутись навіть у тих випадках, коли біль не є тяжким. Це може відбутись навіть на ранніх стадіях захворювання. У багатьох людей з ревматоїдним артритом пошкодження було виявлено на рентгенограмах рук та ніг через два роки після започаткування захворювання. Але на той час, коли проблема буде виявлена рентгенографічним шляхом, може бути занадто пізно вдаватись до лікування. 12 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наслідком тяжкого пошкодження може бути постійна деформація суглоба та втрата працездатності. Біль і опухання можуть спричинювати труднощі під час ходіння. У ревматоїдних суглобах відбувається локальне продукування різноманітних цитокінів. Численні дослідження показали, що IL-1 (інтерлейкін) та TNF- (фактор некрозу пухлин), два прототипні прозапальні цитокіни, відіграють важливу роль у механізмах, які мають місце при запаленні синовіальної оболонки, та у прогресуючому руйнуванні суглоба. Дійсно, введення інгібіторів TNF- та IL-1 хворим на ревматоїдний артрит викликало різке поліпшення клінічних та біологічних симптомів запалення та зменшення рентгенологічних ознак ерозії кістки та руйнування хряща. Однак незважаючи на ці обнадійливі результати, значний відсоток хворих не реагує на ці засоби, що дозволяє висунути припущення про те, що до патофізіології артриту мають відношення також інші посередники. Одним із важливих способів відрізнення ревматоїдного артриту від інших форм артриту є схема ураження суглобів. Наприклад, ревматоїдний артрит уражає зап'ясток і багато суглобів кисті руки, але, як правило, не ті з них, що є найвіддаленішими. У разі ревматоїдного артриту спостерігається ураження суглобів за симетричною схемою. Тобто, якщо запаленими є суглоби пальців правої кісті, ймовірно, що запаленими будуть також і суглоби пальців лівої кісті. Іншими суглобами, які, як правило, уражаються ревматоїдним артритом, є ліктьові, плечові суглоби, суглоби шиї, щелепи, стоп, гомілковостопні, колінні та тазостегнові суглоби. Суглоби хребта, окрім шиї, ревматоїдним артритом, як правило, безпосередньо не уражаються. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є псоріатичний артрит. Псоріатичний артрит є станом, який викликає опухання і біль у суглобах та навколо них. Псоріатичний артрит спричинює також виникнення лускатого висипу на шкірі. Псоріатичний артрит може уражати ряд суглобів, у тому числі суглоби пальців рук, зап'ястків, пальців ніг, колін, кісточок, ліктів та плечей, хребта та суглоби у нижній частині спини (які називають крижовоклубовими суглобами). Псоріатичний артрит уражає також тканини, які оточують суглоби, у тому числі сухожилля та зв'язки. Він може спричинити опухання усього пальця руки або ноги, який називають "сосископодібним" пальцем. Спостерігається також запалення шкіри, зокрема, на ліктях, колінах та на волосистій частині шкіри голови. Псоріатичний артрит пов'язаний із псоріазом, захворюванням, унаслідок якого ділянки шкіри запалюються і вкриваються лускою сріблястого або сірого кольору. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є реактивний артрит. Термін "реактивний артрит" застосовують для позначення болю, тугорухливості, почервоніння або опухання суглоба, що є наслідком попередньої інфекції. Реактивний артрит найчастіше спостерігається у суглобах нижніх кінцівок (коліна, кісточки, пальці стопи), але ним можуть уражатись і верхні кінцівки. Проблеми можуть виникати лише у суглобах або ж уражатись можуть і інші системи тіла, наприклад, очі, м'язи шкіри або сухожилля. Коли це захворювання уражає ділянки поза суглобами, у такому разі реактивний артрит називають синдромом Рейтера. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є склеродермія. Склеродермія являє собою стан, у разі якого шкіра стає товстою і твердою. Існує два головні типи склеродермії. Одним із цих типів є локалізована склеродермія, яка уражає головним чином шкіру. Цим захворюванням можуть уражуватись також м'язи та суглоби. Інший тип, генералізована склеродермія, уражає шкіру, а також внутрішні органи, наприклад. серце, легені та нирки. Найхарактернішою ознакою склеродермії є накопичення у шкірі щільної рубцеподібної волокнистої сполучної тканини. Не такими помітними змінами є пошкодження клітин, що вистілають стінки невеликих кровоносних судин. Це, у свою чергу, може спричинювати пошкодження великих органів. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є синдром Шегрена. Синдром Шегрена являє собою хронічне захворювання, яке спричинює пошкодження слинних залоз, наслідком чого є ксеростомія, та слізних залоз, наслідком чого є ксерофтальмія. Це захворювання може також уражати інші частини тіла, у тому числі суглоби, м'язи і нерви, такі органи, наприклад, як легені, нирки, печінку, підшлункову залозу, шлунок і головний мозок, або залози, наприклад, щитоподібну залозу. Синдром Шегрена може спричинити повне знищення будь-якої із цих ділянок. Оскільки синдром Шегрена може впливати на печінку та підшлункову 13 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залозу, існує підвищена ймовірність розвитку раку лімфатичної тканини. Однак це є незвичним і рідким результатом. Синдром Шегрена може виникати двома шляхами. Це "вторинний" синдром Шегрена, коли він виникає у людей, які страждають на ревматичне захворювання або на захворювання сполучної тканини, наприклад, звичайний вовчак, склеродермія або поліміозит. Синдром Шегрена називають "первинним", коли ксерофтальмія та ксеростомія не пов'язані з ревматичним захворюванням. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є хвороба Стілла-Шоффара. Хвороба Стілла-Шоффара є формою артриту, яка характеризується переміжною лихоманкою, оранжево-рожевим висипом та запаленням суглобів. Ця хвороба найбільш поширена серед дітей, у яких її звичайно називають системним ювенільним ідіопатичним артритом. Хвороба Стілла-Шоффара може траплятись також серед дорослих, хоча набагато рідше, аніж у дітей. У цьому разі її називають хворобою Стілла-Шоффара у дорослих або AOSD. Як було розкрито вище, до захворювань хряща, які лікують, запобігають або інтенсивність симптомів яких зменшують, належать: розсікальний остеохондрит, реберний хондрит (наприклад, синдром Тітце), остеомієліт та рецидивний поліхондрит. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є розсікальний остеохондрит. Розсікальний остеохондрит (OCD) є терміном, що означає кістково-хрящовий перелом. Кістково-хрящовий фрагмент може бути присутнім in situ, неповністю відділеним або повністю відділеним. Розсікальний остеохондрит являє собою форму остеохондрозу, яка обмежується епіфізом суглоба. Епіфіз суглоба пошкоджується унаслідок стиснення. Ця патологія ймовірно передбачає як травму, так і ішемію. Травма найімовірніше є первинним пошкодженням, у той час як ішемія є вторинним пошкодженням. Травма може бути спричинена прямим пошкодженням, наприклад, переломом унаслідок удару або повторними мікротравмами, наприклад, надмірним нормальним напруженням стиснення. Колінний суглоб являє собою ділянку, яка уражається найчастіше. Однак можуть також уражатись ліктьовий суглоб, гомілковостопний суглоб, передплюсновий човноподібний суглоб, стегновий суглоб, плечовий суглоб, гленоїдний суглоб, зап'ястковий суглоб. Розсікальний остеохондрит має схильність до виникнення у хворих молодого віку. У разі розсікального остеохондриту ліктьового суглоба вік хворих у середньому становить 23 роки і коливається у межах 4-47 років. У разі розсікального остеохондриту гомілковостопного суглоба вік хворих у середньому становить 20 років і коливається у межах 8-50 років. У разі розсікального остеохондриту стегнового суглоба вік хворих у середньому становить 24 роки і коливається у межах 14-39 років. Хворі, як правило, повідомляють про відчуття болю на межі діапазону руху. Часто спостерігається навколосуглобовий набряк із незначним відчуттям тепла на дотик. У разі ураження нижньої кінцівки хворі часто кульгають. Симптоми, як правило, поліпшуються у разі запобіжної іммобілізації суглоба. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є реберний хондрит. Реберний хондрит являє собою запалення ділянок сполучення верхніх ребер із хрящем, яким вони кріпляться до груднини. Причина, як правило, є невідомою. У разі, коли біль при реберному хондриті супроводжується опуханням, говорять про синдром Тітце. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є остеомієліт. Остеомієліт являє собою гострий або хронічний запальний процес кістки та її структур, який розвивається після інфікування піогенними мікроорганізмами. Інфекція, пов'язана з остеомієлітом, може бути локалізована або може розповсюджуватись через окістя, кортикальний шар, кістковий мозок та губчасту речовину кістки. Бактеріальний патогенний мікроорганізм змінюється у залежності від віку хворого та механізму інфікування. Гематогенний остеомієліт являє собою інфекцію, яка спричинюється дисемінацією бактерій з крові. Гострий гематогенний остеомієліт характеризується гострою інфекцією кістки, яка спричинюється дисемінацією бактерій у межах кістки з віддаленого джерела. Це захворювання трапляється головним чином у дітей. Місцем локалізації найчастіше є метафіз кістки, що росте, який швидко росте і має багато кровоносних судин. Явне уповільнення кровотоку або "сладж"синдром, коли судини дистальної частини метафізу завертають під гострим кутом, сприяє тромбоутворенню у судинах і розвитку локалізованого некрозу та дисемінації бактерій у самій 14 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кістці. Гострий гематогенний остеомієліт, незважаючи на свою назву, може мати повільний клінічний розвиток без явних ознак. Прямий або контактний інокуляційний остеомієліт виникає у разі безпосереднього контакту тканини та бактерій при травмі або під час хірургічного втручання. Прямий інокуляційний (контактно-вогнищевий) остеомієліт являє собою інфекцію кістки, що є наслідком проникнення мікроорганізмів із прямої травми, які поширюються з контактного вогнища інфекції або сепсису після хірургічної процедури. Клінічні прояви прямого інокуляційного остеомієліту є більш локалізованими порівняно з проявами гематогенного остеомієліту, і можуть спричинюватись численними мікроорганізмами. Інші категорії включають хронічний остеомієліт та остеомієліт унаслідок захворювання периферичних кровоносних судин. Хронічний остеомієліт триває або рецидивує незалежно від його початкової причини та/або механізму і незважаючи на інвазивне втручання. Незважаючи на те, що захворювання периферичних кровоносних судин згадується як причина виникнення остеомієліту, фактично згадане захворювання є скоріше сприятливим фактором, аніж дійсною причиною інфекції. До хворобливих станів, які, як відомо, сприяють виникненню у хворих остеомієліту, належать цукровий діабет, дрепаноцитарна анемія, синдром набутого імунодефіциту (СНІД), наркотична залежність (внутрішньовенна), алкоголізм, хронічне застосування стероїдних препаратів, імуносупресія та хронічне захворювання суглобів. Крім того, незалежним фактором ризику є наявність ортопедичного протеза, а також будь-яка недавня ортопедична хірургічна операція або відкритий перелом. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є рецидивний поліхондрит. Рецидивний поліхондрит (RP) є непоширеним та тяжким епізодичним запальним станом, який уражає хрящові структури, головним чином, хрящові структури вуха, носа та ларинготрахеобронхіального дерева. До інших структур, які уражаються, можуть належати очі, серцево-судинна система, периферичні суглоби, середнє та внутрішнє вухо. Етіологія цього захворювання є невідомою, однак патогенез є найімовірніше автоімунним за своєю природою. Свідченням на користь автоімунної етіології є клінічний зв'язок цього захворювання з іншими автоімунними захворюваннями, його зв'язок з HLA-DR4 гаплотипом, патологічні дані стосовно CD4 Т-клітин та комплексів антиген-антитіло, які інфільтруються в уражений хрящ, клітинні та гуморальні реакції проти колагену типу II та інших колагенових антигенів, та спостереження, суть якого полягає у тому, що інтенсивність цього захворювання найчастіше зменшується імуносупресорними схемами лікування. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є пошкодження хряща, що є наслідком травми. Пошкодження хряща можуть бути наслідком травматичного механічного руйнування. Хрящ може бути пошкоджений прямим ударом або іншою травмою. Хрящ не має прямого кровопостачання, тому він має незначну здатність до авторепарації. Способи за цим винаходом поліпшують репарацію хряща. Отже, за одним із варіантів здійснення цього винаходу пошкодження хряща, що є наслідком травми, спричинюється нещасним випадком або хірургічним втручанням. За конкретним варіантом здійснення цього винаходу пошкодження хряща, що є наслідком травми, спричинюється хірургічним втручанням, зокрема, ортопедичним хірургічним втручанням або пластичним хірургічним втручанням. Цим винаходом розглядається також лікування пошкодження, яке пов'язане зі спортом, або спрацювання тканин суглоба, яке пов'язане зі спортом. За одним із варіантів здійснення цього винаходу захворюванням хряща, яке лікують, запобігають або інтенсивність симптомів якого зменшують, є розлад, який спричинює неестетичний зовнішній вигляд. За таким варіантом здійснення спосіб та застосування за цим винаходом можуть застосовуватись у поєднанні з пластичною хірургією. Після завершення повного опису цього винаходу фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що цей винахід може здійснюватись у широкому діапазоні еквівалентних параметрів, концентрацій та умов без відхилення від суті та обсягу винаходу та без зайвого експериментування. Незважаючи на те, що цей винахід описано у зв'язку з конкретними варіантами його здійснення, зрозуміло, що цей винахід може зазнавати додаткових модифікацій. Його застосування призначене для охоплення будь-яких змін, варіантів застосування або адаптацій цього винаходу з дотриманням загалом його принципів та з включенням таких відхилень від наведеного опису, які входять до відомої або традиційної практики у межах галузі, до якої належить цей винахід, і які можуть застосовуватись із врахуванням викладених вище суттєвих ознак, відповідно до обсягу прикладеної формули винаходу. 15 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 Усі посилання, наведені у цьому описі, у тому числі журнальні статті або реферати, опубліковані чи неопубліковані заявки на патенти США або іноземні патенти, патенти США або іноземні патенти чи будь-які інші посилання, у тому числі усі дані, таблиці, фігури і текст, представлені у наведених посиланнях, включені до цього опису у повному обсязі шляхом посилання. Крім того, повний зміст посилань, які згадуються у посиланнях, згаданих у цьому описі, також включено до цього опису у повному обсязі шляхом посилання. Посилання на стадії відомих способів, стадії традиційних способів, відомі способи або традиційні способи жодним чином не є визнанням того, що будь-який аспект, опис або варіант здійснення цього винаходу був розкритий, описаний або запропонований у галузі, якої стосується цей винахід. Наведений вище опис конкретних варіантів здійснення з такою повнотою розкриває загальну природу винаходу, що інші зможуть, із застосуванням знань відповідної галузі (з включенням вмісту посилань, наведених у цьому описі), легко модифікувати та/або адаптувати для різних варіантів застосування ці конкретні варіанти здійснення без надмірного експериментування, без відхилення від загальної концепції цього винаходу. Отже, такі адаптації та модифікації будуть належати до еквівалентів розкритих варіантів здійснення, виходячи з ідеї винаходу та відомостей, наведених у цьому описі. Слід розуміти, що наведена у цьому описі фразеологія або термінологія призначена для опису, а не для обмеження, тому термінологія або фразеологія цього опису повинна інтерпретуватись фахівцем у світлі ідей винаходу та відомостей, наведених у цьому описі, у поєднанні із знанням пересічного фахівця у цій галузі. Приклад 1. Моделювання захворювань на тваринах та тривале застосування фармакологічних препаратів FGF-18(170АА), шляхом внутрішньосуглобового (i.a.) введення, випробували in vivo на різних моделях остеоартриту і пошкодженому хрящі із значною терапевтичною ефективністю. Загалом на різних видах тварин (пацюки, собаки) була продемонстрована терапевтично ефективна доза, що становила 3-40 мкг на тварину на тиждень (внутрішньосуглобово). Нижче узагальнено результати, які були одержані на вищезгаданих тваринних моделях захворювання (остеоартрит, а також дефекти хряща). Таблиця 1 Узагальнення результатів фармакологічних досліджень FGF-18(170АА) Тварина Пацюк Модель Доза (мкг/ін'єкція) захворювання Шлях введення/ Введення Результати 1. Зменшення дегенерації хряща Внутрішньосуглобові 2. Зменшення глибини Остеоартрит, 0,1, 1, 5 (лікарська ін'єкції двічі на пошкоджень хряща індукований форма у тиждень впродовж дозозалежним чином. пошкодженням гіалуронані) 3 тижнів Статистична значущість була досягнута у групі, що одержувала дозу 5 мкг 1. Зменшення показників пошкодження хряща у середній частині верхньої суглобової поверхні великогомілкової кістки (зменшення до 64 % при внутрішньо-суглобовому Модель Внутрішньосуглобові 0,1, 1 або 10 введенні дози 1 мкг) остеоартриту з ін'єкції двічі на (лікарська форма 2. Збільшення товщини відривом тиждень впродовж у гіалуронані) хряща великогомілкової меніска (I) 3 тижнів кістки 3. Новоутворений хрящ, об'єднаний з попередньо існуючим хрящем 4. Збільшення розміру хондрофітів 5. Підвищення резорбції/ 16 UA 99818 C2 Таблиця 1 Узагальнення результатів фармакологічних досліджень FGF-18(170АА) Тварина Модель Доза (мкг/ін'єкція) захворювання Шлях введення/ Введення Результати ремоделювання кістки (зменшення патологічного пошкодження до 42 % при введенні дози 1 мкг) Внутрішньосуглобова ін'єкція (i) одноразова доза, (ii) один раз на тиждень (1/3 сумарної дози на ін'єкцію) впродовж 3 тижнів, або (iii) Модель остео- 0,3, 1, 3 або 10 тричі на тиждень артриту з (лікарська форма впродовж 3 тижнів відривом у фізіологічному (1/9 сумарної дози на a меніска (II) розчині) ін'єкцію). Для періодів лікування тривалістю 3 тижні, також подальше лікарське спостереження впродовж 3 тижнів без лікування. 1. Посилення стимуляції окістя 2. Поліпшення гістопатологічних критеріїв 3. Підвищення показників макроморфоло-гічної репарації 4. Досягнення дозозалежної реакції впродовж періоду лікування з введенням дози один раз на тиждень 5. ED50 при дозі приблизно 1,5 мкг/суглоб один раз на тиждень, значні ефекти при дозі 3 мкг/суглоб один раз на тиждень Таблиця 2 Узагальнення результатів фармакологічних досліджень FGF-18(170АА) (продовження) Тварина Модель Доза (мкг/ін'єкцію) захворювання Шлях введення/ Введення Внутрішньосуглобова ін'єкція (i) одноразова доза, (ii) один раз на тиждень (1/3 3, 10, 30 Остеоартрит з сумарної дози на (лікарська форма Собака меніскектомією ін'єкцію) впродовж у фізіологіч-ному a 3 тижнів, або (iii) розчині) тричі на тиждень впродовж 3 тижнів (1/9 сумарної дози на ін'єкцію) Передня хрестоподібна a зв'язка (ACL) a 5 0, 3, 10, 30 Результати 1. Поліпшення гістопатологічних критеріїв 2. Підвищення показників макроморфологічної репарації 3. Відсутність чітко вираженої дозозалежної реакції унаслідок невеликої кількості тварин. Ефективність демонструється у разі усіх застосованих доз з більш вираженим ефектом у разі внутрішньосуглобового введення дози 10 мкг та 30 мкг/собаку Внутрішньосуглобова ін'єкція один раз на Дивись приклад 1.3 тиждень Докладніше обговорюється нижче Приклад 1.1: Модель остеоартриту з відривом меніска на пацюках Метод Пацюків-самців лінії Lewis (5-10 на групу) піддали хірургічній операції з метою відриву 17 UA 99818 C2 5 10 медіального меніска правого колінного суглоба. Введення препарату внутрішньосуглобовим шляхом розпочали через 19-21 день після хірургічної операції у дозах 0,3 мкг, 1 мкг, 3 мкг або 10 мкг (лікарська форма у фізіологічному розчині) для визначення фармакодинамічних ефектів, пов'язаних із схемою приймання лікарського засобу. Ці сумарні дози вводили таким чином: (i) одноразова доза, (ii) один раз на тиждень (1/3 сумарної дози на ін'єкцію) впродовж 3 тижнів, або (iii) тричі на тиждень впродовж 3 тижнів (1/9 сумарної дози на ін'єкцію). На завершення лікування або через 3 тижні після лікування праві коліна збирали для гістопатологічної оцінки потенційних ефектів. Оцінку уражень здійснювали у 3 різних зонах: регіонарні різниці на середній частині верхньої суглобової поверхні великогомілкової кістки враховували шляхом поділу кожної секції на три зони (1-зовнішня, 2-середня, 3-внутрішня). У разі хірургічної моделі остеоартриту зовнішня (z1) та середня (z2) третини, як правило, є найтяжче ураженими, у той час як на внутрішній третині (z3) спостерігаються незначні зміни. Схема проведення лікування: 15 20 25 30 35 40 45 Планування експерименту Тварин (5-10 на групу), розміщених по 2-3 на клітку, наркотизують ізофлураном, і ділянку правого коліна готують до хірургічної операції. Надріз шкіри роблять по середній лінії коліна, і середню колатеральну зв'язку відшаровують, після чого пересікають. Медіальний меніск прорізають на всю товщину для імітації повного відриву. Розріз шкіри та підшкірного шару закривають шляхом накладання підшкірного шва (вікрил 4-0). Введення дози внутрішньосуглобовим шляхом розпочинають через 19-21 день після хірургічного втручання і припиняють після одноразової дози або продовжують впродовж 3 тижнів шляхом здійснення внутрішньосуглобових ін'єкцій один раз на тиждень або тричі на тиждень. Пацюків після цього умертвляють (g1-16) або залишають до видужання впродовж 3 додаткових тижнів перед умертвінням (g17-32). За чотири години до автопсії усім пацюкам вводять 50 мг/кг BRDU (5бромдезоксіуридин) для мічення клітин, які активно проліферують. Кров збирають для одержання сироватки безпосередньо перед автопсією, і праве коліно піддають синовіальному промиванню. Під час автопсії суглоб правого (оперованого) коліна відділяють від м'язів та сполучної тканини і вміщують у 10 % нейтральний забуферений розчин формаліну. Надколінну чашечку видаляють для уможливлення відповідного фіксування суглобів. Зразки трахеї, груднини та вуха також вміщують у формаліновий розчин. Оцінка результатів через 6 тижнів після хірургічного втручання Контрольні тварини, яких лікуванню не піддавали (оцінка через 6 тижнів після хірургічного втручання) У контрольних тварин із відривом медіального меніска, яких лікуванню не піддавали і яких умертвлювали через 6 тижнів після хірургічного втручання, спостерігалась дегенерація хряща великогомілкової кістки, яка була найбільш тяжкою на зовнішніх 2/3 верхньої суглобової поверхні великогомілкової кістки і менш тяжкою на внутрішній 1/3. Остеофіти були великими (середня величина 468 мкм). Дегенерація хряща стегнової кістки була легшою і більш змінною, аніж дегенерація хряща великогомілкової кістки. Тварини, яким вводили фізіологічний розчин один раз на тиждень, мали значно нижчі сумарні показники дегенерації хряща зони 3 великогомілкової кістки (16 %), значно нижчий показник глибини (16 %) і значно більшу площу життєздатного хряща на латеральній ділянці великогомілкової кістки, порівняно з тваринами, яких лікуванню не піддавали (13 %). Тварини, яким вводили фізіологічний розчин тричі на тиждень, мали значно нижчі показники дегенерації хряща зони 2 великогомілкової кістки (24 %), 18 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 значно нижчий показник глибини (13 %) і значно більшу площу життєздатного хряща як на медіальній, так і на латеральній ділянках великогомілкової кістки (15 % та 14 %). Ці різниці у контрольних групах, ймовірно, є наслідком повторного наркотизування, що впливало на загальну активність тварин, хоча не можна виключити можливості того, що повторні ін'єкції фізіологічного розчину впливали на тяжкість пошкоджень шляхом полегшення видалення медіаторів та залишків органічних речовин. Введення одноразової дози (оцінка через 6 тижнів після хірургічного втручання) У тварин, яким вводили одноразову дозу 10 мкг FGF-18(170АА), спостерігалась значно більша ширина загальної дегенерації хряща (16 %) унаслідок підвищення втрати протеогліканів у зоні 3. У тварин, яким вводили одноразову дозу 10 мкг FGF-18(170АА), показники остеофітів були значно підвищені, а їхні розміри збільшені (19 % та 25 %, відповідно). Площа життєздатної хрящової матриці на медіальній ділянці великогомілкової кістки у тварин, які одержували дозу 10 мкг, була значно збільшена (на 27 %). Імуннезабарвлювання виявило бромдезоксіурудинову (BRDU) імунопозитивність фіброзного кісткового мозку у безпосередній близькості до пошкоджень хряща та у клітинах кісткового мозку, фібробластах та хрящах остеофітів, із подібними схемами забарвлювання суглобів, до яких вводили фізіологічний розчин та FGF18(170АА). Ці результати вказують на те, що одноразова ін'єкція дози 10 мкг FGF-18(170АА) мала визначений анаболічний ефект, що підтверджується підвищеним розміром остеофітів та збільшеною площею медіальної ділянки хряща великогомілкової кістки. Однак ці зміни були недостатніми для поліпшення загальних показників дегенерації хряща. Можливо, що збільшення площі медіальної ділянки хряща є наслідком підвищення товщини хряща на вантажоносній поверхні у безпосередній близькості до остеофіту. Один раз на тиждень впродовж 3 тижнів (оцінка через 6 тижнів після хірургічного втручання) Тварини, яким вводили дозу 3 мкг FGF-18(170АА) один раз на тиждень, мали значно нижчі показники дегенерації хряща порівняно з контрольними тваринами, яким вводили фізіологічний розчин один раз на тиждень, у зоні 2 медіальної ділянки великогомілкової кістки. Тварини, яким вводили дозу 10 мкг FGF-18(170АА), мали значно нижчу ширину дегенерації (37 %), і у тварин, яким вводили дозу 3 мг (28 %) або дозу 1 мкг (15 %), також спостерігалось певне зменшення показників дегенерації. Показники та розміри остеофітів були дозозалежними, і значно збільшувались у разі введення дози 10 мкг (32 % та 53 %) або дози 3 мкг (21 % та 32 %) FGF18(170АА). Ділянка життєздатної хрящової матриці на медіальній ділянці великогомілкової кістки значно збільшувалась унаслідок лікування із застосуванням дози 10 мкг FGF-18(170АА) (27 %). У суглобах тварин, яким вводили дозу 10 мкг або дозу 3 мкг, спостерігався хронічний активний синовіт із фіброзом у межах від незначного до явно вираженого, а тварини, яким вводили дозу 1 мкг, мали мінімальний синовіт. У декількох суглобах, до яких вводили дозу 10 мкг, спостерігалось мінімальне посилення резорбції субхондральної кістки. Тварини, які одержували дозу 3 мкг або дозу 10 мкг FGF-18(170АА), мали підвищене BRDU мічення у фіброзному кістковому мозку, синовіальній оболонці та на ділянках хондрогенезу або остеофітів, порівняно з контрольними тваринами, яким вводили фізіологічний розчин. Ці результати демонструють дозозалежний благотворний вплив на значну ширину дегенерації хряща із застосуванням парадигми лікування з введенням лікарського засобу один раз на тиждень. Цей параметр є найбільш показовим щодо присутності життєздатної матриці певного типу у межах ділянки дефекту і, разом із медіальними ділянками хряща великогомілкової кістки, демонструє анаболічну реакцію. Результати BRDU мічення вказують на продовження проліферативних реакцій після припинення введення лікарського препарату. Тричі на тиждень впродовж 3 тижнів (оцінка через 6 тижнів після хірургічного втручання) Результатом лікування дозами 1 мкг, 3 мкг або 10 мкг FGF-18(170АА), які вводили 3 ін'єкціями впродовж тижня, було значне зменшення сумарних показників дегенерації хряща великогомілкової кістки у зоні 1 (тваринам вводили 10 мкг), зоні 2 (1 мкг або 3 мкг) та зоні 3 (1 мкг або 3 мкг), порівняно з контрольними тваринами, яким вводили фізіологічний розчин тричі на тиждень. Лікування дозою 10 мкг значно збільшило сумарну ширину дегенерації хряща великогомілкової кістки (на 24 %). Лікування дозою 1 мкг або 3 мкг незначно зменшило ширину дегенерації хряща на 24 % та 21 % відповідно, що вказувало на певний благотворний ефект. Тварини, які одержували лікування дозою 1 мкг або 3 мкг FGF-18(170АА), також мали значно нижчі показники глибини (17 % та 18 %, відповідно), порівняно з контрольними тваринами, які одержували фізіологічний розчин. Показник остеофітів медіальної ділянки великогомілкової кістки підвищився після лікування дозою 0,3 мкг, 1 мкг, 3 мкг або 10 мкг FGF-18(170АА) (13 %, 7 %, 13 % та 15 %, відповідно), у той час як усі 4 дози (0,3 мкг, 1 мкг, 3 мкг або 10 мкг FGF18(170АА)) значно підвищили розміри остеофітів (12 %, 18 %, 60 % та 62 %, відповідно). Лікування дозою 10 мкг значно підвищило показник дегенерації хряща стегнової кістки (на 19 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 114 %). Показники кісток значно підвищились унаслідок лікування дозою 3 мкг (60 %) або 10 мкг (88 %) FGF-18(170АА). Сумарний суглобовий показник без стегнової кістки значно зменшився унаслідок лікування дозою 3 мкг FGF-18(170АА) (13 %), але додання стегнової кістки до сумарного суглобового показника ліквідувало це відхилення. Лікування дозою 1 мкг, 3 мкг або 10 мкг FGF-18(170АА) значно збільшило площу життєздатного хряща на медіальній ділянці великогомілкової кістки (13 %, 29 % та 29 %), у той час як лікування дозою 3 мкг або 10 мкг значно збільшило площу на латеральній ділянці великогомілкової кістки (22 % та 13 %). Суглоби, до яких впорскували 3 мкг або 10 мкг, мали синовіт з ознаками від явно виражених до тяжких, із підвищеною резорбцією субхондральної кістки, і подібні зміни у діапазоні від незначних до помірних спостерігались у суглобах, які обробляли дозою 1 мкг. У тварин, які одержали 1 мкг, 30 мкг або 10 мкг FGF-18(170АА), спостерігалось BRDU мічення на численних ділянках, у тому числі у кістковому мозку, остеофітах, меніску, синовіальній оболонці та на ділянках хондрогенезу. Ці результати демонстрували найбільш виражені анаболічні ефекти будь-якого варіанта лікування, але вони супроводжувались тяжким запаленням синовіальної оболонки та підвищеною резорбцією субхондральної кістки. Оцінка результатів через 9 тижнів після хірургічного втручання Контрольні тварини, яких не піддавали лікуванню (оцінка через 9 тижнів після хірургічного втручання) У тварин із відривом медіального меніска, яких не піддавали лікуванню і яких умертвляли на 9 тижні, спостерігалась дегенерація хряща великогомілкової кістки, яка була найбільш тяжкою на зовнішніх 2/3 верхньої суглобової поверхні великогомілкової кістки і менш тяжкою на внутрішній 1/3. Дегенерація хряща стегнової кістки була менш тяжкою і більш змінною. Показники загалом були вищими, аніж у тварин, яких не піддавали лікуванню і умертвляли на 6 тижні. Показники дегенерації хряща у зоні 2 великогомілкової кістки (12 %) контрольних тварин, яким вводили одноразову дозу фізіологічного розчину, були гірші, ніж показники контрольних тварин, яким вводили фізіологічний розчин один раз на тиждень (18 %). Контрольні тварини, які одержали одноразову дозу фізіологічного розчину, також мали значно більшу ширину помірної дегенерації колагену (92 %). Тварини, які одержували фізіологічний розчин один раз на тиждень, мали значно нижчу сумарну тяжку, явно виражену, помірну та незначну дегенерацію колагену (15 %) порівняно з контрольними тваринами, які одержували фізіологічний розчин тричі на тиждень (22 %). Ці різниці були відносно незначними, оскільки у кожній із цих груп було лише по 5 пацюків, і згадані різниці були наслідком змін у розвитку захворювання у окремих тварин. Одноразова доза (оцінка результатів через 9 тижнів після хірургічного втручання, у тому числі через 3 тижні після лікування) У жодної тварини, яка одержувала одноразову дозу FGF-18(170АА) і яку умертвляли через 9 тижнів після хірургічного втручання, не спостерігалось жодного ефекту лікування, хоча певні суглоби, до яких вводили дозу 10 мкг, мали ознаки анаболічної реакції на латеральній ділянці великогомілкової кістки. Один раз на тиждень впродовж 3 тижнів (оцінка результатів через 9 тижнів після хірургічного втручання, у тому числі через 3 тижні після лікування) Після лікування із застосуванням FGF-18(170АА) дозою 10 мкг один раз на тиждень спостерігалось значне зменшення сумарних показників дегенерації хряща у зоні 1 та зоні 3 медіальної ділянки великогомілкової кістки (на 38 % та 31 %). Лікування із застосуванням FGF18(170АА) у дозі 0,3 мкг значно знизило показники у зоні 2 порівняно з контрольними тваринами, що одержували фізіологічний розчин один раз на тиждень. Тварини, яких лікували із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг, мали значно нижчу значущу ширину дегенерації хряща (38 %). Показники глибини значно зменшились унаслідок лікування із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг (22 %). Лікування із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 3 мкг або 10 мкг значно та ідентичним чином підвищило показники остеофітів (25 %), але розміри остеофітів значно збільшились лише у тварин, які одержували 10 мкг (53 %). У тварин, які одержували FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг, спостерігалось значне зменшення (23 %) сумарного суглобового показника стегнової кістки. У тварин, які одержували FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг, площа життєздатного хряща значно збільшилась як на медіальній (40 %), так і латеральній (81 %) ділянках великогомілкової кістки. Лікування із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг значно зменшило ширину ділянки тяжкої та мінімальної дегенерації колагену, а також ширину об'єднаної ділянки тяжкої, явно вираженої та помірної дегенерації і ширину об'єднаної ділянки тяжкої та явно вираженої дегенерації. Запалення синовіальної оболонки було мінімальним у суглобах, до яких вводили дозу 3 мкг або дозу 10 мкг і відсутнім при менших дозах. Анаболічні реакції були очевидними у декількох або усіх суглобах, до яких вводили будь-яку дозу. BRDU 20 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мічення спостерігалось головним чином у кістковому мозку та фібробластах контрольних тварин, які одержували фізіологічний розчин, і підвищене мічення (хрящ та остеофіти) спостерігалось у суглобах, до яких вводили дозу 10 мкг. Ці результати вказують на те, що репарація хряща/анаболічні реакції продовжувались поза межі періоду лікування і що інтенсивність симптомів синовіту зменшувалась, хоча розміри остеофітів були порівнянними через 6 тижнів або 9 тижнів у суглобах, які обробляли цією дозою. Спостерігався дозозалежний благотворний ефект у разі застосування значущого параметра дегенерації хряща, а тяжка втрата матриці, за результатами визначення дегенерації колагену, поліпшилась. Тричі на тиждень впродовж 3 тижнів (оцінка результатів через 9 тижнів після хірургічного втручання, у тому числі через 3 тижні після лікування) Сумарний показник дегенерації хряща зони 3 великогомілкової кістки значно зменшився (на 38 %) у тварин, які одержували FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг у вигляді 3 ін'єкцій на тиждень, порівняно з контрольними тваринами, які тричі на тиждень одержували фізіологічний розчин. Лікування із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг також значно зменшило значущу ширину дегенерації хряща (48 %). Показник глибини значно зменшився (на 27 %) у тварин, яких лікували із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг. У тварин, яких лікували із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 3 мкг або 10 мкг, значно зросли розміри остеофітів (57 % та 103 %, відповідно). Лікування із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 1 мкг, 3 мкг або 10 мкг значно збільшило площу життєздатного хряща на медіальній ділянці великогомілкової кістки (34 %, 37 % та 71 %, відповідно), у той час як лікування із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 0,3 мкг або 10 мкг значно збільшило площі на латеральній ділянці великогомілкової кістки (46 % та 67 %). Незначна ширина дегенерації колагену значно збільшилась у тварин, яких лікували із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 3 мкг або 10 мкг, як і сумарна ширина незначної та мінімальної дегенерації у тварин, які одержували дозу 10 мкг. Незначний синовіт спостерігався в усіх суглобах, до яких вводили дозу 10 мкг (поділена доза); в суглобах, до яких вводили дозу 1 мкг або дозу 3 мкг, спостерігався синовіт у межах від мінімального до незначного. Анаболічні реакції були очевидними, починаючи від дози 1 мкг і більше. BRDU мічення спостерігалось головним чином у кістковому мозку та фібробластах контрольних тварин, яким вводили фізіологічний розчин; підвищене мічення (хрящ та остеофіти) спостерігалось у суглобах, до яких вводили дозу 10 мкг. Ці результати вказують на те, що репарація хряща/анаболічні реакції продовжувались поза межі періоду лікування, і що інтенсивність симптомів синовіту зменшувалась, порівняно з 6-тижневою часовою точкою. Благотворна дія на втрату колагену була менш чіткою, хоча спостерігалась певна тенденція у напрямку менших розмірів для ділянок втрати у межах від явно вираженої до тяжкої. Приклад 1.2. Модель остеоартриту з меніскектомією на собаках Гончакам-самицям (n=3 на групу), ліве коліно яких за один місяць до початку лікування піддали однобічній частковій медіальній меніскектомії, вводили фізіологічний розчин або FGF18(170АА) у дозі 3 мкг, 10 мкг або 30 мкг одноразово, один раз на тиждень або тричі на тиждень (1/3 поділеної дози) впродовж 3 тижнів для визначення благотворної дії на встановлений остеоартрит. Після тритижневого лікування оцінювали стан лівих колін із точки зору дії на макроскопічні (n=3 на групу) та мікроскопічні (n=3 на групу) зміни, індуковані меніскектомією, та ознак анаболічних ефектів. Усі собаки-самиці, за виключенням однієї, демонстрували нормальний апетит і активність впродовж проведення досліджень. Одна собака-самиця (YLI-8) з групи 12 вмерла до закінчення досліджень (день 17) унаслідок аспіраційної пневмонії, пов'язаної з повторним наркотизуванням для здійснення ін'єкцій у суглоб. Типові дегенеративні зміни, які характеризувались присутністю вогнищевих, добре визначених дегенеративних пошкоджень хряща, спостерігались на медіальній ділянці великогомілкових кісток усіх оперованих собаксамиць в усіх групах. Спорадично спостерігались пошкодження стегнових кісток. Усі собаки-самиці мали мінімальне потовщення медіальної ділянки суглобової капсули. Пошкодження меніска (при автопсії відсутні приблизно у 50 % випадків загалом із повною відсутністю ознак або з помірними ознаками репарації) було однаковим в усіх групах. Оцінка за допомогою мікроскопа показала, що коліна, які лікуванню не піддавали, та коліна, в які вводили носій, часто мали гіпертрофію хряща з клонуванням у зоні 1 рівнів 1 та 2. Визначені анаболічні ефекти (підвищене клонування, насиченість клітинами та забарвлення протеогліканів на ділянках пошкодження) спостерігались на колінах, які обробляли FGF18(170АА) у дозі 30 мкг (10 мкг тричі на тиждень), і ці зміни були найбільш значними на виростках стегнової кістки. Менші, але все ж достатньо переконливі, анаболічні ефекти спостерігались на певних колінах, які обробляли тричі на тиждень меншими дозами FGF18(170АА), або на колінах, які обробляли дозою 30 мкг або дозою 10 мкг один раз на тиждень. 21 UA 99818 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Ці індуковані FGF-18(170АА) зміни, у разі присутності, розміщувались, як правило, на ділянці від верхньої 1/3 до 1/2 хряща або у матриці, прилеглій до більш глибоких тріщин. Результати цього дослідження продемонстрували визначені анаболічні ефекти внутрішньосуглобового лікування із застосуванням FGF-18(170АА) у дозі 10 мкг тричі на тиждень (сумарна доза 30 мкг на тиждень) в усіх колінах та менші ефекти у декількох колінах, які лікували меншими дозами тричі на тиждень або у дозах 30 мкг чи 10 мкг один раз на тиждень. Зміни полягали у клонуванні, підвищенні синтезу протеогліканів на ділянці від верхньої 1/3 до 1/2 хряща або у матриці, прилеглій до тріщин. У декількох суглобах спостерігались незначні проліферативні зміни маргінальної зони, але не було надмірних змін, подібних до змін, які спостерігались у пацюків. Анаболічні зміни суглобового хряща в усіх випадках були більшими за анаболічні зміни у маргінальних зонах. Визначення пошкоджень колагену також дозволяли припустити можливість певного захисту цілісності матриці. Приклад 1.3. Собача модель передньої хрестоподібної зв'язки (ACL) З метою дослідження тяжкого прогресуючого остеоартриту для проведення передклінічних фармакологічних досліджень застосовують собачу модель передньої хрестоподібної зв'язки (ACL) з ЯМР-томографічною оцінкою після завершення лікування та під час подальшого лікарського спостереження. Ця модель уможливлює одержання даних щодо ефективності (гістопатологічних та ЯМР-томографічних з перебігом часу та впродовж подальшого лікарського спостереження) спільно з даними щодо функціонування шляхом аналізу ходи. Завдяки неінвазивній ЯМР-томографії вже на кінець лікування можна було продемонструвати зменшення пошкодження хряща порівняно з вихідним здоровим станом (13,3,-7,5,-9,3 та -8,8 для носія, 3 мкг на суглоб, 10 мкг на суглоб та 30 мкг на суглоб, відповідно). Після завершення лікування можна було також продемонструвати функціональне поліпшення, яке визначалось шляхом аналізу ходи на пластині для визначення динамічних характеристик ходи. Аналіз ходи здійснювали із застосуванням показників тиску/сили, які одержали за ® допомогою пластини для визначення динамічних характеристик ходи (Matscan System, компанія Tekscan Inc, Бостон, штат Массачусетс, США). Методика визначення динамічних характеристик ходи ® Matscan System має 4 доріжки, кожна з яких має 2288 датчиків, разміщених на вимірювальній площі 432 мм368 мм, що забезпечує просторове розділення 1,4 вимірів на кв. см. Цей пристрій калібрували на початку дослідження за допомогою заздалегідь визначеної маси, і таку саму калібровку здійснювали для кожного собаки впродовж дослідження. Максимальну вертикальну силу та контактну площу для задньої кінцівки з індукованим остеоартритом визначали при швидкості швидкої ходи у межах від 1,9 м/с до 2,2 м/с. Швидкість підтримували, використовуючи хронометр. Інтервал збирання даних щодо характеристик ходи становив 3 с при частоті, встановленій на 44 Гц, що забезпечувало одержання загалом 132 блоків даних. Для кожного собаки одержали дані перших 5 достовірних випробувань, які у подальшому усереднили для встановлення значення кривої динамічних характеристик собаки у даний момент часу. Максимальну вертикальну силу виражали як відсоток маси тіла (%BW), а 2 контактну площу виражали у квадратних сантиметрах (см ). Щодо максимальної вертикальної сили задньої кінцівки з індукованим остеоартритом, яку визначили під час швидкої ходи, на собачій моделі остеоартриту спостерігали аномальну ходу (4 тиждень), що засвідчувалось значеннями (вихідними), які були одержані перед проведенням оперативного втручання. Максимальна вертикальна сила та контактна площа зменшились через 4 тижні та 8 тижнів після хірургічної операції, оскільки в усіх групах спостерігались негативні зміни (Таблиці 3-4). Однак у собак Групи IV через 8 тижнів після хірургічної операції спостерігалось менш тяжке зменшення порівняно з вихідними даними з інших груп. Таблиця 3 Максимальна вертикальна сила, яку визначали при швидкій ході (динамічне явище) для задньої кінцівки з індукованим остеоартритом a Група I Остеоартрит: контрольні тварини, плацебо Тварини (n) 8 Максимальна вертикальна сила Тиждень 4 Тиждень 8 b b (%BW) (%BW) -37,34±5,68 22 -27,45±3,90 UA 99818 C2 Таблиця 3 Максимальна вертикальна сила, яку визначали при швидкій ході (динамічне явище) для задньої кінцівки з індукованим остеоартритом a Група II FGF-18: 3 мкг/суглоб III FGF-18: 10 мкг/суглоб IV FGF-18: 30 мкг/суглоб Тварини (n) Максимальна вертикальна сила Тиждень 4 Тиждень 8 b b (%BW) (%BW) 8 -34,84±3,65 -22,08±2,87 8 -36,59±3,14 -25,11±3,03 8 -32,28±3,05 -15,71±1,85 a. Представлені значення є середнім значенням середня квадратична помилка середнього. Значення являють собою зміни порівняно з вихідним рівнем. b. Значення виражені у вигляді відсотка маси тіла (%BW). Таблиця 4 Контактна площа, яку визначали при швидкій ході (динамічне явище) для задньої кінцівки з індукованим остеоартритом a Група I Остеоартрит: контрольні тварини, плацебо II FGF-18: 3 мкг/суглоб III FGF-18: 10 мкг/суглоб IV FGF-18: 30 мкг/суглоб Тварини (n) Контактна площа Тиждень 4 Тиждень 8 2 b 2 b (см ) (см ) 8 -11,17±2,61 -7,11±1,55 8 -11,50±1,41 -4,95±0,78 8 -10,45±1,63 -4,92±1,47 8 -10,22±1,52 -3,90±0,93 a. Представлені значення є середнім значенням середня квадратична помилка середнього. Значення являють собою зміни порівняно з вихідним рівнем. 2 b. Значення виражені у квадратних сантиметрах (см ). 5 10 15 Результати in vitro фармакологічних досліджень продемонстрували специфічну активність на хондроцити (проліферація та регенерація хряща/синтез колагену) та відсутність негативних ефектів типу проліферації лейкоцитів або виділення цитокінів клітинами різних типів після піддання дії FGF-18(170АА). Приклад 1.4. Дослідження із застосуванням FGF-18(170АА), міченого радіоактивним ізотопом ([3H]-FGF18) Рівні радіоактивності, визначені у колінному суглобі після внутрішньосуглобового введення [3H]-FGF18, наведені у таблиці 5 (як концентрації сумарної радіоактивності, виражені у вигляді нг еквівалентів/г) та у таблиці 6 (виражені як відсотки введеної дози); у згаданих таблицях наведені рівні радіоактивності, визначені у суглобах, які піддавали лікуванню та аналізуванню як у інтактному стані, так і після збирання синовіальної рідини. Відповідні фармакокінетичні параметри у колінних суглобах (як із синовіальною рідиною, так і без синовіальної рідини) наведені у таблиці 7. 23 UA 99818 C2 Таблиця 5 Концентрації сумарної радіоактивності у колінних суглобах після одноразового 3 внутрішньосуглобового введення [ H]-AS902330 пацюкам-самцям на рівні цільової дози 0,24 мг/кг. Результати виражені у вигляді нг еквівалентів/г. Зразок КОЛІННИЙ СУГЛОБ Час Група 4 Цілий суглоб 15 хв 1 год. 4 год. 24 год. 48 год. 26037 13320 15270 6167,9 3376,3 Група 3 Без синовіальної рідини 11740 9086,7 9664,1 4054,3 1450,8 Відношення Без синовіальної рідини/цілий суглоб 0,45 0,68 0,63 0,66 0,43 Таблиця 6 Виділення сумарної радіоактивності з колінного суглоба після одноразового 3 внутрішньосуглобового введення [ H]-AS902330 пацюкам-самцям на рівні цільової дози 0,24 мг/кг. Результати виражені у вигляді відсоків введеної дози. Зразок КОЛІННИЙ СУГЛОБ Час Група 4 Цілий суглоб 15 хв 1 год. 4 год. 24 год. 48 год. 87,87 78,43 70,94 28,62 21,61 Група 3 Відношення Без синовіальної Без синовіальної рідини рідини/цілий суглоб 66,23 0,75 67,39 0,86 40,92 0,58 14,09 0,49 8,29 0,38 Таблиця 7 Параметри системної експозиції сумарної радіоактивності у колінному суглобі після 3 одноразового внутрішньосуглобового введення [ H]-AS902330 пацюкам-самцям на рівні цільової дози 0,24 мг/кг. Cmax (нгекв/г) Діапазон регресії t1/2,z (год.) AUC (площа під кривою) (0-tlast) (нг еквюгод/г) AUC(0-) (нг еквгод./г) 5 10 15 Група 3 Без синовіальної рідини 11740 4-48 16 Група 4 Цілий суглоб 26037 4-48 20 Відношення Без синовіальної рідини/цілий суглоб 0,45 242116 393063 0,62 275787 492380 0,56 Рівні сумарної радіоактивності у суглобі, який піддавали лікуванню, знижувались двофазно з кінцевим періодом напіввиведення 20 год. Порівнянне значення одержали, приймаючи до уваги цілий суглоб без синовіальної рідини (16 год.). Загалом результати показали, що сумарна радіоактивність розподілилась за межами синовіальної рідини до тканин колінного суглоба. Результати, які одержали після авторадіолюмінографічного аналізу колінних суглобів, які піддавали лікуванню, показали, що більшість радіоактивності локалізувалась у безпосередній близькості до суглоба. Результати повного авторадіолюмінографічного аналізу тіла після внутрішньовенного 3 введення та внутрішньосуглобового введення [ H]-FGF18 наведені у таблиці 8 та у таблиці 9, відповідно. Концентрації сумарної радіоактивності в тканинах і органах виражені у вигляді нг еквівалентів/г (середнє значеннясереднє квадратичне відхилення). 24 UA 99818 C2 Таблиця 8 3 Концентрації сумарної радіактивності після одноразового внутрішньовенного введення [ H]AS902330 пацюкам-самцям (Група 1) на рівні цільової дози 0,24 мг/кг. Результати виражені у вигляді нг еквівалентів/г (середнє значеннясереднє квадратичне відхилення). Тканина Надниркова залоза Кров Кістковий мозок Нирки Печінка Легені Підшлункова залоза Слинні залози Селезінка Яєчка Вилочкова залоза 0,25 год. Mean S.D. 1 год. Mean S.D. 4 год. Mean S.D. 3890 2410 110 48 год. Mean S.D. 50 460 24 год. Mean S.D. 480 20 180 120 790 210 420 90 1170 1210 200 400 260 90 770 560 150 180 110 40 440 310 220 150 210 40 220 60 80 20 220 111 270 50 111 30 690 260 440 90 30 20 260 40 280 50 170 * NQ: Кількісному визначенню не піддається (нижче рівня кількісного визначення) Таблиця 9 3 Концентрації сумарної радіактивності після одноразового внутрішньсуглобового введення [ H]AS902330 пацюкам-самцям (Група 2) на рівні цільової дози 0,24 мг/кг. Результати виражені у вигляді нг еквівалентів/г (середнє значеннясереднє квадратичне відхилення) 0,25 год. Тканина Mean S.D. Надниркова залоза Кістковий мозок Нирки Печінка Підшлункова залоза Слинні залози Селезінка Вилочкова залоза Колінний суглоб 1 год. Mean S.D. 4 год. Mean S.D. 24 год. Mean S.D. 170 48 год. Mean S.D. 20 0.0 107200 57940 90 70 41280 20 10 24480 20 90 70 30 20 90 120 60 190 20 11840 4230 * NQ: Кількісному визначенню не піддається (нижче рівня кількісного визначення) 5 Після внутрішньовенного введення сумарна радіоактивність у крові та сироватці досягла найвищого значення через 4 год. та 24 год. після введення, у сироватці та крові, відповідно. Визначений період напіврозпаду у сироватці становив приблизно 55 год. Після внутрішньосуглобового введення середні значення сумарної радіоактивності підвищились з 25 UA 99818 C2 5 10 15 повільним досягненням найвищої концентрації через 24 год. та 48 год. після введення, у сироватці та крові, відповідно. Системна експозиція становила приблизно 20 % від системної експозиції, яку було визначено після внутрішньовенного введення. Сумарна радіоактивність у сироватці була у середньому більш високою, ніж сумарна радіоактивність у крові, що дозволяє висунути припущення про те, що вихідна сполука та/або її метаболіти мають низьку спорідненість до клітин крові, і циркулююча радіоактивність була розподілена головним чином у сироватці. Рівні сумарної радіоактивності у суглобі, який піддавали лікуванню, знижувались двофазно з кінцевим періодом напіврозпаду 20 год. Загалом результати показали, що сумарна радіоактивність розподілилась за межами синовіальної рідини у тканини колінного суглоба. Загалом, виходячи з неклінічних фармакологічних моделей на пацюках і собаках, встановлено, що особливо прийнятною схемою приймання лікарського засобу є один раз на тиждень впродовж трьох тижнів. Ефективна доза, що спостерігалась, коливається у межах 330 мкг/суглоб. Приклад 2. Приклади сполук FGF-18 за цим винаходом Послідовності сполук FGF-18(170АА) за цим винаходом, яким віддають перевагу, наведені у послідовностях, представлених нижче. 26 UA 99818 C2 ЛІСТИНГ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 27 UA 99818 C2 28