Композиції корму для тварин із ферментами, що знижують імунний стрес

1. Композиція корму для тварин, придатна для перорального введення тварині, яка включає кількість принаймні одного ферменту, що знижує імунний стрес, ефективну для зниження рівня позитивного білка гострої фази в зазначеної тварини, підвищення рівня негативного білка гострої фази в зазначеної тварини та/або поліпшення показників росту тварин у прийнятному для перорального застосування носії, причому (і) зазначена кількість ферменту становить щонайменше 20 МО ферменту/кг корму; (іі) за умови присутності одного ферменту, він відрізняється від геміцелюлази типу β-мананази або фосфоліпази; (ііі) зазначений фермент вибраний з групи, що складається з 1,3-β-глюканази, β-глюкозидази, ксилоглюканази, РНКази L, dsPHK-специфічної аденозиндезамінази, ЦГ-специфічної рестрикційної ендонуклеази, N-гліканаз, α-1,2-фукозидази, α1,3-1,4-фукозидази, α-1,6-манозидази, α-1,2манозидази, α-1,3-манозидази, β-1,4галактозидази, ендо-β-N-ацетилглюкозамінідази F (ендо F), пептид-N-(N-ацетил-βглюкозамініл)аспарагінамідази F (PNGази F), 2 (19) 1 3 N-галактозидази, ендо-α-Nацетилгалактозоамінідази, ендо-α-1,6-D-мананази, арабіногалактанази, α-мананази, α-манозидази, сфінгомієлінази, хітинази, хітиндезацетилази, вуглеводдезацетилази, N-ацетилглюкозамінідази, фосфатидилсериндекарбоксилази, сульфатази, βгалактозидази, арабінанази, гіалуронідази, αарабінофуранозидази, хондроїтинази, глюкоцереброзидази, метилестерази, естерази ферулової кислоти, фурулоїлестерази, ацетилестерази, вуглеводдезацетилази, фосфорилхолінгідролази, лужної фосфатази, кислотної фосфатази, фосфорилхолінестерази та фосфорилхолінфосфатази; та (iv) якщо зазначений фермент включає 1,3-βглюканазу, композиція включає щонайменше 155000 МО 1,3-β-глюканази/л. 3. Тверда композиція, придатна для перорального введення тварині, яка включає принаймні один фермент, що знижує імунний стрес, у прийнятному для перорального застосування носії, причому (і) зазначена композиція містить щонайменше 40000 МО ферменту/кг; (іі) за умови присутності одного ферменту, він відрізняється від геміцелюлази типу β-мананази або фocфoлiпaзи; (ііі) зазначений фермент вибраний з групи, що складається з 1,3-β-глюканази, β-глюкозидази, ксилоглюканази, РНКази L, dsPНK-специфічної аденозиндезамінази, ЦГ-специфічної рестрикційної ендонуклеази, N-гліканаз, α-1,2-фукозидази, α1,3-1,4-фукозидази, α-1,6-манозидази, α-1,2манозидази, α-1,3-манозидази, β-1,4галактозидази, ендо-β-N-ацетилглюкозамінідази F (ендо F), пептид-N-(N-ацетил-βглюкозамініл)аспарагінамідази F (РNGази F), РNGази А, ендо-β-N-ацетилглюкозамінідази Н (ендо Н). ендо D, ендо С, α-Nацетилгалактозоамідази, β-1,3-галактозидази, ендо-N-ацилнейрамінідази (ендо N), α-2,3нейрамінідази, α-2,6-нейрамінідази, α-2,8нейрамінідази, β-N-ацетилгексозамінідази, eндo-βN-гaлaктoзидaзи, ендо-α-Nацетилгалактозоамінідази, ендо-α-1,6-D-мананази, арабіногалактанази, α-мананази, α-манозидази, сфінгомієлінази, хітинази, хітиндезацетилази, вуглеводдезацетилази, N-ацетилглюкозамінідази, фосфатидилсериндекарбоксилази, сульфатази, βгалактозидази, арабінанази, гіалуронідази, αарабінофуранозидази, хондроїтинази, глюкоцереброзидази, метилестерази, естерази ферулової кислоти, фурулоїлестерази, ацетилестерази, вуглеводдезацетилази, фосфорилхолінгідролази, лужної фосфатази, кислотної фосфатази, фосфорилхолінестерази та фосфорилхолінфосфатази; та (iv) якщо зазначений фермент включає 1,3-βглюканазу, композиція включає щонайменше 300000 МО 1,3-β-глюканази/кг. 4. Композиція за п. 1, де композиція являє собою корм для тварин, що включає інгредієнт, який викликає імунну відповідь у тварини, та при цьому фермент містить фермент, що розкладає зазначений інгредієнт. 95266 4 5. Композиція за п. 4, у якій зазначений інгредієнт являє собою антиген, що представляється патогенним мікроорганізмом. 6. Композиція за п. 3, у якій щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, присутній у кількості щонайменше 80000 МО ферменту/кг. 7. Композиція за п. 3, у якій щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, присутній у кількості щонайменше 160000 МО ферменту/кг. 8. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, у якій фермент включає 1,3-β-глюканазу. 9. Композиція за п. 1, яка включає принаймні 30 МО 1,3-β-глюканази/кг корму. 10. Композиція за п. 2, яка включає принаймні 230000 МО 1,3-β-глюканази/л. 11. Композиція за п. 3, яка включає принаймні 450000 МО 1,3-β-глюканази/кг. 12. Композиція корму для тварин за п. 1, яка включає два або більше ферментів, що знижують імунний стрес, вибраних з групи, що складається з 1,4β-мананази, 1,3-β-глюканази, β-глюкозидази, ксилоглюканази, РНКази L, dsPHK-специфічної аденозиндезамінази, ЦГ-специфічної рестрикційної ендонуклеази, N-гліканаз, α-1,2-фукозидази, α-1,31,4-фукозидази, α-1,6-манозидази, α-1,2манозидази, α-1,3-манозидази, β-1,4галактозидази, eндo-β-N-aцeтилглюкoзaмiнiдaзи F (ендо F), пептид-N-(N-ацетил-βглюкозамініл)аспарагінамідази F (PNGaзи F), PNGaзи А, ендо-β-N-ацетилглюкозамінідази Н (ендо Н), ендо D, ендо С, α-Nацетилгалактозоамідази, β-1,3-галактозидази, ендо-N-ацил-нейрамінідази (ендо N), α-2,3нейрамінідази, α-2,6-нейрамінідази, α-2,8нейрамінідази, β-N-ацетилгексозамінідази, ендо-βN-галактозидази, ендо-α-Nацетилгалактозоамінідази, ендо-α-1,6-D-мананази, арабіногалактанази, α-мананази, α-манозидази, сфінгомієлінази, хітинази, хітиндезацетилази, вуглеводдезацетилази, N-ацетилглюкозамінідази, фосфатидилсериндекарбоксилази, сульфатази, βгалактозидази, арабінанази, гіалуронідази, αарабінофуранозидази, хондроїтинази, глюкоцереброзидази, метилестерази, естерази ферулової кислоти, фурулоїлестерази, ацетилестерази, вуглеводдезацетилази, фосфорилхолінгідролази, лужної фосфатази, кислотної фосфатази, фосфорилхолінестерази та фосфорилхолінфосфатази, за умови, що, якщо композиція включає 1,4-βмананазу і 1,3-β-глюканазу, вона включає принаймні 20 МО 1,3-β-глюканази/кг корму. 13. Рідка композиція за п. 2, яка включає два або більше ферментів, що знижують імунний стрес, вибраних з групи, що складається з 1,4-βмананази, 1,3-β-глюканази, β-глюкозидази, ксилоглюканази, РНКази L, dsPHK-специфічної аденозиндезамінази, ЦГ-специфічної рестрикційної ендонуклеази, N-гліканаз, α-1,2-фукозидази, α-1,31,4-фукозидази, α-1,6-манозидази, α-1,2манозидази, α-1,3-манозидази, β-1,4галактозидази, ендо-β-N-ацетилглюкозамінідази F (ендо F), пептид-N-(N-ацетил-βглюкозамініл)аспарагінамідази F (PNGази F), PNGази A, ендо-β-N-ацетилглюкозамінідази Н (ендо Н), ендо D, ендо С, α-N 5 95266 6 ацетилгалактозоамідази, β-1,3-галактозидази, ендо-N-ацилнейрамінідази (ендо N), α-2,3нейрамінідази, α-2,6-нейрамінідази, α-2,8нейрамінідази, β-N-ацетилгексозамінідази, ендо-βN-галактозидази, ендо-α-Nацетилгалактозоамінідази, ендо-α-1,6-D-мананази, арабіногалактанази, α-мананази, α-манозидази, сфінгомієлінази, хітинази, хітиндезацетилази, вуглеводдезацетилази, N-ацетилглюкозамінідази, фосфатидилсериндекарбоксилази, сульфатази, βгалактозидази, арабінанази, гіалуронідази, αарабінофуранозидази, хондроїтинази, глюкоцереброзидази, метилестерази, естерази ферулової кислоти, фурулоїлестерази, ацетилестерази, вуглеводдезацетилази, фосфорилхолінгідролази, лужної фосфатази, кислотної фосфатази, фосфорилхолінестерази та фосфорилхолінфосфатази, за умови, що, якщо композиція включає 1,4-βмананазу і 1,3-β-глюканазу, вона включає принаймні 155000 МО 1,3-β-глюкaнaзи/л. 14. Тверда композиція за п. 3, яка включає два або більше ферментів, що знижують імунний стрес, вибраних з групи, що складається з 1,4-βмананази, 1,3-β-глюканази, β-глюкозидази, ксилоглюканази, РНКази L, dsPНK-специфічної аденозиндезамінази, ЦГ-специфічної рестрикційної ендонуклеази, N-гліканаз, α-1,2-фукозидази, α-1,31,4-фукозидази, α-1,6-манозидази, α-1,2манозидази, α-1,3-манозидази, β-1,4галактозидази, ендо-β-N-ацетилглюкозамінідази F (ендо F), пептид-N-(N-ацетил-βглюкозамініл)аспарагінамідази F (РNGази F), РNGази А, ендо-β-N-ацетилглюкозамінідази Н (ендо Н), ендо D, ендо С, α-Nацетилгалактозоамідази, β-1,3-галактозидази, ендо-N-ацилнейрамінідази (ендо N), α-2,3нейрамінідази, α-2,6-нейрамінідази, α-2,8нейрамінідази, β-N-ацетилгексозамінідази, eндo-βN-гaлaктoзидaзи, ендо-α-Nацетилгалактозоамінідази, ендо-α-1,6-D-мананази, арабіногалактанази, α-мананази, α-манозидази, сфінгомієлінази, хітинази, хітиндезацетилази, вуглеводдезацетилази, N-ацетилглюкозамінідази, фосфатидилсериндекарбоксилази, сульфатази, βгалактозидази, арабінанази, гіалуронідази, αарабінофуранозидази, хондроїтинази, глюкоцереброзидази, метилестерази, естерази ферулової кислоти, фурулоїлестерази, ацетилестерази, вуглеводдезацетилази, фосфорилхолінгідролази, лужної фосфатази, кислотної фосфатази, фосфорилхолінестерази та фосфорилхолінфосфатази, за умови, що, якщо композиція включає 1,4-βмананазу і 1,3-β-глюканазу, вона включає принаймні 300000 МО 1,3-β-глюканази/кг. 15. Композиція за будь-яким з пп. 12-14, яка включає принаймні один з 1,4-β-мананази та 1,3-βглюканази. 16. Композиція за будь-яким з пп. 12-14, яка вибрана з групи, що включає (і) композицію, що включає 1,4-β-мананазу та хітаназу, (іі) композицію, що включає 1,4-β-мананазу та ксилоглюканазу, (ііі) композицію, що включає 1,4-β-мананазу та арабінаназу, (iv) композицію, що включає 1,3-β-глюканазу та хітаназу, (v) композицію, що включає 1,3-β-глюканазу та ксилоглюканазу, (vi) композицію, що включає 1,3-β-глюканазу та арабінаназу, (vii) композицію, що включає 1,4-β-мананазу, 1,3-βглюканазу та арабінаназу. 17. Композиція за п. 12, яка включає 1,4-βмананазу та 1,3-β-глюканазу. 18. Композиція за п. 17, яка включає принаймні 30 МО 1,3-β-глюканази/кг корму. 19. Композиція за п. 13, яка включає 1,4-βмананазу та 1,3-β-глюканазу. 20. Композиція за п. 19, яка включає принаймні 230000 МО 1,3-β-глюканази/л. 21. Композиція за п. 14, яка включає 1,4-βмананазу та 1,3-β-глюканазу. 22. Композиція за п. 21, яка включає принаймні 450000 МО 1,3-β-глюканази/кг. 23. Композиція за будь-яким з пп. 17-22, яка додатково включає один або більше додаткових ферментів, що знижують імунний стрес. 24. Композиція за будь-яким з пп. 1-23 для застосування при зниженні імунного стресу у тварини. 25. Композиція за п. 24, при застосуванні якої тварині вводять інгредієнт, що викликає імунну відповідь у тварини, і де зазначена композиція включає щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, який розкладає зазначений інгредієнт. 26. Композиція за п. 25, у якій зазначений інгредієнт та зазначений фермент присутні в одній і тій же композиції. Галузь винаходу Даний винахід представляє композиції та способи зниження імунологічного стресу та поліпшення характеристик росту тварини. Зокрема, винахід представляє композиції, що містять ферменти, які ефективні в плані зниження імунологічного стресу, або ті, які ефективні в плані лікування або попередження інфекції, або ті, які ефективні для цілей поліпшення показників росту тварини. Винахід також представляє способи застосування композицій. Попередній рівень техніки Тварина може зазнавати імунологічного стресу через ряд причин, включаючи вплив антигену, що розпізнається імунною системою тварини. Антиген може ініціювати імунну відповідь, що являє собою адаптивну імунну відповідь або який являє собою вроджену імунну відповідь. Коли імунна відповідь є ініційованою, тварина зазнає імуноло 7 гічного стресу, оскільки її імунна система відповідає на сприйману небезпеку. Часто імунологічний стрес погіршує показники росту тварини. Білки гострої фази (АРР) являють собою білки крові, концентрація яких у крові змінюється, коли тварина зазнає стресу, такого як інфекція, запалення, хірургічна травма або інші внутрішні або зовнішні стимули. Див., наприклад, статтю Murata et al., Vet. J. 168:28 (2004). АРР, як вважають, відіграє роль у вродженій імунній відповіді тварини. Наприклад, АРР можуть брати участь у відновленні гомеостазу та обмеженні росту мікробів аж до розвинення набутого імунітету. АРР включають "негативні" білки, концентрація яких знижується при стресі, і "позитивні" білки, концентрація яких зростає при стресі. Див., наприклад, статтю Murata et al., вище. Негативні АРР включають альбумін та трансферин. Позитивні АРР включають білки, що синтезуються гепатоцитами при стимуляції протизапальними цитокінами та вивільнюються в кровоток, наприклад, гаптоглобін, С-реактивний білок, сироватковий амілоїд А, церулоплазмін, фібриноген та -1-кислий глікопротеїн (AGP). Позапечінкове вироблення АРР описане також для більшості видів ссавців. Див. там само. Вважають, що прозапальні цитокіни, такі як інтерлейкін-6 (ІЛ-6) та фактор некрозу пухлини  (ΦΗΠ-), є основними посередниками синтезу АРР у печінці. Запалення, інфекція або ушкодження тканини ініціює вивільнення цитокінів клітинами, орієнтованими на захист, викликаючи тим самим синтез АРР. Індукція позитивних АРР пов'язана також зі зниженням рівня синтезу негативних АРР. Див. там само. Розроблено способи кількісної оцінки АРР, та концентрація циркулюючих у кровотоці АРР (наприклад, сироваткові рівні АРР) корелює з тяжкістю стану тварини. Див. там само. Так, концентрацію АРР можна використовувати як індикатор рівня імунного стресу тварини. Імунна система тварин може розпізнати антигени, які не є реальною загрозою для здоров'я тварини, такі як інгредієнти рослинної та тваринної природи, у композиціях корму для тварин. Дані антигени можуть ініціювати імунну відповідь, таку як вроджена імунна відповідь, приводячи тим самим до того, що тварина зазнає імунологічного стресу. Дану відповідь на стрес можна виявити та контролювати за сироватковою концентрацією АРР. Навіть коли ініціюючий імунітет антиген не представляє реальної загрози для здоров'я тварини, відповідь на стрес може мати несприятливий ефект. Це можна спостерігати, наприклад, як зниження ефективності корму, зменшення швидкості набору маси тіла, підвищення чутливості до інфекції або підвищення температури тіла. Описано застосування антитіл, таких як антитіла до фосфоліпази А2, для зменшення шлунково-кишкового запалення у тварин. Див., наприклад, Патент США № 6383485. Описано композиції кормів, які містять геміцелюлазу, здатну до розкладання -манан-вмісної геміцелюлози (наприклад, геміцелюлазу типу -мананази), таку як ендо-1,4--мананаза, або фосфоліпазу, таку як 95266 8 фосфоліпаза А2, для підвищення ефективності кормів. Див., наприклад, WO 97/41739, патент США № 6162473 та патент США № 6183739. Аналогічним чином описані композиції, що включають фермент, такий як PI-PLC, що розщеплює зв'язок, впливаючи в такий спосіб на вивільнення білку або вуглеводу клітинної поверхні, призначені для лікування або попередження інфекції травного тракту. Див., наприклад, WO 01/41785. У статті Walsh et al., J. Anim. Sci. 73: 1074 (1995) обговорюють композиції кормів, що включають ферменти глюканази, які розщеплюють змішаний глюкановий субстрат, такі як 1,4--глюканаза, що розщеплює змішані -1,3-, -1,4-субстрати. Однак у проведених авторами тестах ні PI-PLC, ні 1,4-глюканаза не проявляють активності зниження імунного стресу. Раніше не було опису композиції корму, що включає фермент, який відрізняється від геміцелюлази типу -мананази або фосфоліпази, та який присутній у кількості, ефективній для зниження імунологічного стресу. Відповідно існує потреба у композиції та способі зниження імунологічного стресу у тварин. Розкриття винаходу Один варіант здійснення представляє композицію, що підходить для перорального введення тварині, що включає фермент, що знижує імунний стрес, у перорально прийнятному носії. Композицію вибирають з групи, що включає: (і) корм для тварин, що містить кількість ферменту, ефективну у плані зниження рівня позитивного білку гострої фази у тварини, підвищення рівня негативного білку гострої фази у тварини та/або поліпшення показників росту тварини, (іі) рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає щонайменше 40000 МО (міжнародних одиниць) ферменту/л, та (ііі) тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає щонайменше 40000 МО (міжнародних одиниць) ферменту/кг. Фермент відрізняється від геміцелюлази типу -мананази або фосфоліпази, та, якщо фермент містить 1,3--глюканазу, композицію вибирають з групи, що включає (і) корм для тварин, що містить щонайменше 20 МО 1,3--глюканази/кг корму; (іі) рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає щонайменше 155000 МО 1,3-глюканази/л, та (ііі) тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, що містить щонайменше 300000 МО 1,3--глюканази/кг. В одному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою корм для тварин, що включає щонайменше 20 МО ферменту/кг корму. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція являє собою тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає щонайменше 80000 МО ферменту/кг або щонайменше 160000 МО ферменту/кг. В одному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою корм для тварин, що включає інгредієнт, що викликає імунну відповідь у тварини, та фермент містить фермент, що розкладає даний інгредієнт. В одному варіанті здійснення винаходу інгредієнт являє собою антиген, що представляється патогенним мікроорганізмом. 9 В одному варіанті здійснення винаходу фермент містить 1,3--глюканазу. В одному варіанті здійснення винаходу фермент містить 1,3-глюканазу, та композицію вибирають з групи, що включає (і) корм для тварин, що містить щонайменше 30 МО 1,3--глюканази/кг корму; (іі) рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, що містить щонайменше 230000 МО 1,3-глюканази/л, та (ііі) тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає щонайменше 450000 МО 1,3--глюканази/кг. Інший варіант здійснення винаходу представляє композицію, що підходить для перорального введення тварині, яка містить два або більше ферментів, що знижують імунний стрес, причому композиція включає щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, що відрізняється від 1,4-мананази та 1,3--глюканази. Композицію вибирають з групи, що включає: (і) корм для тварин, що містить кількість зазначених ферментів, які знижують імунний стрес, ефективну для зниження рівня позитивного білку гострої фази у зазначеної тварини, підвищення рівня негативного білку гострої фази у зазначеної тварини та/або поліпшення показників росту тварини; (іі) рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, що містить щонайменше один фермент, який знижує імунний стрес, у кількості щонайменше 40000 МО ферменту/л, та (ііі) тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, яка включає щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, у кількості щонайменше 40000 МО ферменту/кг. В одному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою корм для тварин, що містить щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, у кількості щонайменше 20 МО ферменту/кг корму. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція являє собою тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, яка включає щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, у кількості щонайменше 80000 МО ферменту/кг або щонайменше 160000 МО ферменту/кг. У спеціальних варіантах здійснення винаходу композицію вибирають з групи, що включає (і) композицію, яка містить 1,4--мананазу та хітиназу; (іі) композицію, яка містить 1,4--мананазу та ксилоглюканазу, (ііі) композицію, яка містить 1,4-мананазу та арабінаназу, (iv) композицію, яка містить 1,3--глюканазу та хітиназу, (ν) композицію, яка містить 1,3--глюканазу та ксилоглюканазу, (vi) композицію, яка містить 1,3--глюканазу та арабінаназу, та (vii) композицію, яка містить 1,4-мананазу, 1,3--глюканазу та арабінаназу. Інший варіант здійснення винаходу представляє композицію, що підходить для перорального введення тварині, що містить 1,4--мананазу та 1,3--глюканазу. Композицію вибирають з групи, що включає (і) корм для тварин, який включає 1,4-мананазу та щонайменше 20 МО 1,3-глюканази/кг корму, (іі) рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає 1,4-мананазу та щонайменше 155000 МО 1,3-глюканази/л та (ііі) тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає 1,4- 95266 10 мананазу та щонайменше 300000 МО 1,3-глюканази/кг. В одному варіанті здійснення винаходу композицію вибирають з групи, що включає (і) корм для тварин, що включає 1,4--мананазу та щонайменше 30 МО 1,3--глюканази/кг корму; (іі) рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає 1,4--мананазу та щонайменше 230000 МО 1,3--глюканази/л, та (ііі) тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає 1,4--мананазу та щонайменше 450000 МО 1,3--глюканази/кг. В одному варіанті здійснення винаходу композиція, крім того, включає один або більше додаткових ферментів, що знижують імунний стрес. Інший варіант здійснення представляє спосіб поліпшення показників росту тварини та/або зниження імунного стресу у тварини, що полягає у введенні тварині кожної з описаних вище композицій. В одному варіанті здійснення тварині вводять інгредієнт, що викликає імунну відповідь у тварини, та композиція містить щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, що розкладає інгредієнт. В одному варіанті здійснення інгредієнт та фермент вводять у ту саму композицію. В одному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою корм для тварин. В одному варіанті здійснення інгредієнт являє собою антиген, що представляється патогенним мікроорганізмом. Інший варіант здійснення представляє спосіб попередження або лікування інфекції, пов'язаної в патогенним мікроорганізмом, що представляє антиген, який полягає в пероральному введенні тварині, яка цього потребує, кожної з описаних вище композицій, причому композиція включає щонайменше один фермент, що знижує імунний стрес, який розкладає антиген. Короткий опис креслень На Фігурі 1 представлено оптимальну побудовану по крапках криву (та поліноміальне рівняння, що лежить в основі) для розрахунку концентрації курячого -1-кислотного глікопротеїну (AGP) у зразках плазми курей, що тестують, з використанням даних, отриманих у Прикладі 1. На Фігурі 2 представлено графік Бокса та Уіскера, що графічно показує рівні AGP у курячій сироватці, отриманій від курей, що тестують, як описано в Прикладі 2. Інтервал даних представлений вертикальними лініями. Прямокутник представляє інтервал, у якому лежать дані, з одним стандартним відхиленням від середнього. Горизонтальна лінія показує середнє дане. На Фігурі 3 показані рівні AGP сироватки, отриманої від курей, що одержують один з декількох різних кормів, включаючи корми, що відповідають винаходу, та корми, що відповідають попередньому рівню техніки, як описано в Прикладі 3. На Фігурі 4 представляють оптимальну побудовану по крапках криву (та поліноміальне рівняння, що лежить в основі) для розрахунку концентрації AGP у зразках плазми індичок, що тестують, з використанням даних, отриманих у Прикладі 8. Детальний опис 11 Як використовують у наступному описі, слід мати на увазі, що термін "будь-який" охоплює один або більше, поки не визначають інакше. Як використовують у даному контексті, термін "тварина" відноситься до будь-якої тварини, включаючи людину та інших тварин, таких як тварини, відмінні від людини, у тому числі тваринкомпаньйонів, таких як собаки та кішки, худоба, наприклад, корови та інші жуйні тварини, буйвіл, коні, свині, вівці, домашня птиця (наприклад, кури, качки, індички та гусаки) та тварини, що вирощують у аквакультурі (наприклад, риба та креветки та вугри). У даному описі вираз "фермент, що розкладає антиген" та "фермент, що розкладає інгредієнт" означають, що фермент перетворює антиген або інгредієнт у форму, що не розпізнається імунною системою тварини. Здатність ферменту розкладати антиген або інгредієнт можна визначити вимірюванням концентрації сироваткового АРР тварини, причому зниження сироваткової концентрації позитивного АРР або зниження сироваткової концентрації негативного АРР показує, що фермент розклав антиген або інгредієнт. Як відзначено вище, термін "АРР" включає "негативні" білки, концентрація яких знижується при стресі, та "позитивні" білки, концентрація яких підвищується при стресі. Винахід включає композиції та способи, які підвищують концентрацію негативних білків гострої фази, концентрація яких, як правило, знижується при стресі, а також композиції та способи, які знижують концентрацію позитивних білків гострої фази, концентрація яких, як правило, підвищується при стресі. Для зручності в наступному обговоренні винахід ілюструють із посиланням на ефект композицій та способів на позитивні білки гострої фази. Таким чином, термін "АРР" у наступному обговоренні, як правило, відноситься до будь-якого одного або більше позитивного білку гострої фази, пов'язаного з відповіддю тварини на стрес. Слід мати на увазі, що композиції та способи, описані в даному контексті, як знижуючі концентрацію "АРР" (відносно позитивних білків гострої фази), використовують також для підвищення концентрації негативних білків гострої фази. Один аспект винаходу відноситься до композиції, що містить фермент, що є ефективним у плані зниження імунологічного стресу, що зазнається твариною. Для зручності дані ферменти позначають у даному контексті як ферменти "знижуючі імунний стрес". Як використовують у даному контексті, термін "фермент, що знижує імунний стрес", означає будь-який фермент, що розкладає антиген або молекулярну структуру, що розпізнається імунною системою людини, наприклад, антиген або молекулярну структуру, що ініціює імунну відповідь, приводячи тим самим до того, що тварина зазнає імунологічного стресу. Термін "молекулярна структура", як використовують у даному контексті, включає загальні молекулярні структури, які зв'язуються рецепторами в контексті вродженої імунної системи, такі як молекулярні структури, які звичайно пов'язані з патогенами. Відповідно до одного варіанту здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, не є 95266 12 геміцелюлазою типу -мананази. Відповідно до одного аспекту даного варіанта здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, не є ендо-1,4--D-мананазою. Відповідно до іншого варіанту здійснення винаходу фермент не є фосфоліпазою. Відповідно до іншого варіанту здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, не є 1,4--D-глюканазою. Відповідно до іншого варіанту здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, не є PI- PLC. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, не є геміцелюлазою типу мананази або фосфоліпазою. Відповідно до ще одного варіанту здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, не є геміцелюлазою типу мананази, не є 1,4--глюканазою та не є фосфоліпазою. У відповідності з наступним варіантом здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, не є геміцелюлазою типу -мананази, не є 1,4--глюканазою, не є фосфоліпазою та не є PIPLC. Відповідно до одного аспекту кожного з вищеописаних варіантів здійснення фермент не є 1,3--глюканазою. Не бажаючи бути зв'язаними якою-небудь теорією, автори даного винаходу вважають, що розкладання антигену або молекулярної структури ферментом, що знижує імунний стрес, інгібує або знижує рівень імунної відповіді, що ініціюється антигеном або молекулярною структурою, знижуючи в такий спосіб імунологічний стрес у тварини. Зниження рівня імунологічного стресу можна ідентифікувати та контролювати вимірюванням сироваткової концентрації АРР у тварини, використовуючи відомі в галузі техніки способи кількісного визначення АРР. Приклади даних способів згадуються в статті Murata, et al., див. вище, та описані та згадуються в статтях Hulten et al., Vet. Microbiol. 95: 75 (2003) та Holt et al., див. вище, а також у Прикладі 1, див. нижче. У зв'язаному варіанті здійснення винахід представляє способи зниження імунологічного стресу у тварини, які полягають у введенні тварині композиції, що містить кількість ферменту, що знижує імунний стрес, ефективну в плані зниження рівня АРР у тварини. Ідентифіковано ряд різних позитивних білків гострої фази, включаючи -1-кислий глікопротеїн (AGP), церулоплазмін (Ср), білки сімейства колектину (наприклад, легеневі поверхнево-активні білки, конглютинін та манан-зв'язуючий лектин), фібриноген (Fb), C-реактивний білок (CRP), гаптоглобін, інгібітори протеази (наприклад, -1антитрипсин, -1-антихімотрипсин та -2макроглобулін) та сироватковий амілоїд-A (SAA). Інші потенційні АРР включають ліпополісахаридзв'язуючий білок (LPB), фосфоліпід-зв'язуючі білки, такі як анексини, та головний білок гострої фази (МАР). Див. статтю Murata, et al., вище. Сироваткові концентрації кожного з даних або інших АРР можуть бути використані для ідентифікації, оцінки та контролювання активності ферментів відповідно до винаходу. Різні АРР можуть грати більш істотні ролі у відповідях на стрес різних тварин. Наприклад, AGP, 13 як відомо, клінічно важливий у великої рогатої худоби та пов'язаний з інфекцією у свиней, собак, кішок та курей (включаючи несучок). Ср, як показано, є показником інфекції у великої рогатої худоби, коней та курей. CRP виявлений у жуйних тварин, коней, свиней, собак та кішок, хоча не було продемонстровано, що CRP являє собою АРР у великої рогатої худоби. Показано, що CRP пов'язано з інфекцією у коней та свиней. Fb являє собою надійний показник запалення, бактеріальної інфекції або хірургічної травми у великої рогатої худоби та овець та пов'язаний з інфекцією у коней. Нр являє собою АРР у ряду продуктивних тварин та тварин-компаньйонів, включаючи жуйних тварин, наприклад, велику рогату худобу, овець, свиней, коней та собак. SAA пов'язаний із запаленням та інфекцією у великої рогатої худоби та з інфекцією у коней, свиней, тварин-компаньйонів, таких як собаки, та курей. Підвищення рівнів SAA у молоці виявлено у корів та овець із маститом. Сироватковий LBP пов'язаний з інфекцією у великої рогатої худоби, так само як місцеві рівні анексинів (на поверхнях секреторного епітелію в легенів зараженої великої рогатої худоби). Показано, що МАР є показником інфекції у свиней. Крім того, хоча трансферин звичайно вважають негативним білком гострої фази, він, очевидно, відіграє роль позитивного білку гострої фази у курей. Див. статті Murata, et al., вище; Holt et al., Poultry Sci. 81:1295-1300 (2002). Інші автори також показали, що SAA та Нр, а також CRP та МАР, пов'язані з інфекцією у свиней. Див. статтю Hulten et al., вище. У деяких варіантах здійснення композиції, що відповідають винаходу, включають кількість ферменту, що знижує імунний стрес, що ефективно в плані зниження сироваткової концентрації АРР у тварини. Кількість може варіюватися залежно від тварини та ферменту, що знижує імунний стрес, та легко може бути визначена компетентним фахівцем в галузі техніки при використанні способів, відомих у даній галузі техніки. Наприклад, рівні сироваткового АРР тварини можна вимірювати до та після введення ферменту або можна зрівняти рівні сироваткового АРР еквівалентних лікованих та контрольних тварин. (У цьому плані може бути корисним зрівняти лікованих та контрольних тварин одного віку, оскільки рівні АРР можуть змінюватися з віком. Наприклад, автори виявили, що рівні сироваткового AGP у курей підвищуються з віком). Зниження концентрації сироваткового АРР, пов'язане із введенням ферменту, показує, що введено ефективну кількість ферменту. У інших варіантах здійснення композиції, що відповідають винаходу, включають кількість ферменту, що знижує імунний стрес, що ефективно в плані поліпшення показників росту тварини (що називають також "продуктивність по живій масі", зокрема, в галузі птахівництва). Як використовують у даному контексті, вираз "показники росту тварини" включає будь-який параметр, що відбиває ріст тварини, включаючи перетворення кормів, всмоктування води, вміст води у фекаліях, однорідність маси тіла в зграї або групі тварин, життєздатність та смертність. Не бажаючи зв'язувати себе якою-небудь теорією, вважають, що в деяких 95266 14 умовах ефект ферменту, що знижує імунний стрес, на концентрацію АРР маскується такими факторами, як фактори, що викликають імунний стрес, наприклад, присутність інфекції на низькому рівні в групі тварин або стресові умови життя. У даних умовах фермент, що знижує імунний стрес, проте може бути ефективним у плані поліпшення показників росту тварини. У такий спосіб показники росту тварини являють собою альтернативну міру ефективності композицій та способів, що відповідають даному винаходу. Композиція може являти собою будь-яку композицію, що підходить для введення тварині. В одному варіанті здійснення винаходу композиція підходить для перорального введення. В одному спеціальному варіанті здійснення винаходу композицію, що підходить для перорального введення, як правило, визнають безпечною для перорального введення тварині. В іншому спеціальному варіанті здійснення винаходу композиція, що підходить для перорального введення, містить тільки інгредієнти та кількості зазначених інгредієнтів, які, як правило, визнають безпечними для перорального введення тварині. В іншому спеціальному варіанті здійснення винаходу композиція, що підходить для перорального введення, не містить ніяких інгредієнтів або кількостей зазначених інгредієнтів, які, як правило, не визнаються, як безпечні для перорального введення тварині. В іншому спеціальному варіанті здійснення винаходу композиція, що підходить для перорального введення, містить тільки інгредієнти та кількості зазначених інгредієнтів, які дозволені або які не заборонені для перорального введення тварині. В іншому спеціальному варіанті здійснення винаходу композиція, що підходить для перорального введення, не містить ніяких інгредієнтів або кількостей зазначених інгредієнтів, які дозволені або які не заборонені для перорального введення тварині. У деяких варіантах здійснення винаходу композиція включає перорально прийнятний носій для ферменту. Як використають у даному контексті, вираз "перорально прийнятний носій" включає будь-який фізіологічно прийнятний носій, що підходить для перорального введення. Перорально прийнятні носії включають без обмеження перерахованим композиції кормів для тварин, водні композиції, та рідкі та тверді композиції, що підходять для застосування в кормових продуктах для тварин та/або для перорального введення тварині. Підходящі носії відомі в галузі техніки та включають описані в патенті США 6780628. У ряді варіантів здійснення композиція являє собою корм для тварин. Як використовують у даному контексті, термін "корм для тварин" має значення, прийняте в галузі тваринництва. Наприклад, корм для тварин включає їстівні матеріали, які споживаються домашньою худобою внаслідок їхньої живильної цінності. Корм для тварин включає харчові раціони, наприклад, композиції, які відповідають харчовим вимогам тварини, та, крім того, включає композиції, які не відповідають харчовим вимогам тварин. У спеціальних прикладах даного варіанту здійснення кількість ферменту становить щонайменше 15 приблизно 50000 міжнародних одиниць (МО)/тонну США (907,3 кг) корму, щонайменше приблизно 60000 МО/тонну корму, щонайменше приблизно 70000 МО/тонну корму, щонайменше приблизно 80000 МО/тонну корму, щонайменше приблизно 90000 МО/тонну корму, щонайменше приблизно 100000 МО/тонну корму, щонайменше приблизно 200000 МО/тонну корму або щонайменше приблизно 500000 МО/тонну корму або більше. В інших спеціальних прикладах винахід представляє корм для тварин, що включає кількість ферменту, що знижує імунний стрес, щонайменше приблизно 20 МО/кг корму, наприклад, щонайменше 20 МО/кг корму, щонайменше 25 МО/кг корму, щонайменше 30 МО/кг корму, щонайменше 35 МО/кг корму, щонайменше 40 МО/кг корму, щонайменше 45 МО/кг корму, щонайменше 50 МО/кг корму або більше. Не бажаючи зв'язувати себе якою-небудь теорією, вважають, що корм для тварин, що включає кількість ферменту, що знижує імунний стрес, щонайменше приблизно 20 МО/кг корму, буде ефективним у плані зниження рівня позитивного білку гострої фази у зазначеної тварини, підвищення рівня негативного білку гострої фази у зазначеної тварини та/або поліпшення показників росту тварини. Таким чином, у деяких варіантах здійснення винахід представляє корм для тварин, що містить кількість ферменту, що знижує імунний стрес, ефективну для зниження рівня позитивного білку гострої фази у тварини, підвищення рівня негативного білку гострої фази у тварини та/або поліпшення показників росту тварини. Композицію корму можна одержати способами, відомими в рівні техніки. Наприклад, фермент, що знижує імунний стрес, можна додати до інших інгредієнтів корму на будь-якій стадії в процесі виробництва, яку вважають підходящою компетентні фахівці в галузі техніки. В одному варіанті здійснення фермент представлений у вигляді розчину, такого як рідкий концентрат ферменту, що додають до інших інгредієнтів корму в процесі виробництва. Альтернативно фермент-вмісний розчин розпорошують на практично кінцеву форму корму для тварин. В іншому варіанті здійснення винаходу фермент представлений у вигляді твердої композиції (такої як порошок), наприклад, тверда композиція, яку додають до інших інгредієнтів корму в процесі виробництва. Приклади способів виготовлення фермент-вмісного корму описані в заявці WO 97/41739. У ряді варіантів здійснення винаходу композиція відрізняється від корму для тварин. Наприклад, композиція може являти собою рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, або тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин. Дані композиції можуть підходити для безпосереднього введення тварині або можуть бути використані у вигляді добавок у корм (наприклад, що вводять у корм перед годівлею) або кормових добавок (включаючи добавки, які розводять іншими компонентами корму перед годівлею, та добавки, які пропонують тварині у вигляді вільного вибору на роздільній основі). Приклади рідкої композиції, що відрізняється від корму для тварин, 95266 16 включають рідкі концентрати ферментів, у тому числі рідкі концентрати ферментів, які, як правило, розводять або змішують із іншими інгредієнтами перед пероральним введенням тварині. У варіантах здійснення винаходу, де композиція являє собою рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, таку як розчин ферменту, рідка композиція або розчин може містити щонайменше приблизно 40000 міжнародних одиниць (МО)/л розчину, наприклад, щонайменше 40000 МО/л, щонайменше 50000 МО/л, щонайменше 60000 МО/л, щонайменше 70000 МО/л, щонайменше 80000 МО/л, щонайменше 90000 МО/л, щонайменше 100000 МО/л, щонайменше приблизно 500000 МО/л, щонайменше приблизно 600000 МО/л, щонайменше приблизно 700000 МО/л, щонайменше приблизно 800000 МО/л, щонайменше приблизно 900000 МО/л, щонайменше приблизно 1000000 МО/л, щонайменше приблизно 2000000 МО/л, або щонайменше приблизно 5000000 МО/л. У деяких варіантах здійснення кількість рідкої композиції, що відрізняється від корму для тварин, наприклад, приблизно 500 мл розчину наносять або перемішують із кількістю корму, таким як тонна корму, щоб одержати склади кормів з вищеописаними рівнями ферментів. В інших варіантах здійснення кількість рідкої композиції, що відрізняється від корму для тварин, наносять або змішують із кількістю корму для готування корму для тварин з кількістю ферменту, ефективною у плані зниження рівня позитивного білку гострої фази у тварини, підвищення рівня негативного білку гострої фази у тварини та/або поліпшення показників росту тварини. Вважають, що наявні в цей час композиції рідких концентратів ферментів (відмінних від обговорюваних нижче композицій 1,3--глюканази), які підходять для перорального введення, містять значно менше, ніж щонайменше приблизно 40000 МО/л ферменту, що знижує імунний стрес, якщо взагалі його містять, та не є ефективними в плані зниження рівня позитивного білку гострої фази, підвищення рівня негативного білку гострої фази та/або поліпшення показників росту тварини при використанні у відповідності зі своїми інструкціями. У варіантах здійснення винаходу, де композиція являє собою тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, композиція може включати щонайменше приблизно 40000 МО//кг, наприклад, щонайменше 40000 МО/кг, щонайменше 50000 МО/кг, щонайменше 60000 МО/кг, щонайменше 70000 МО/кг, щонайменше 80000 МО/кг, щонайменше 90000 МО/кг, щонайменше 100000 МО/кг, щонайменше 120000 МО/кг, щонайменше 140000 МО/кг, щонайменше 160000 МО/кг, щонайменше 180000 МО/кг, щонайменше 200000 МО/кг або більше. У ряді варіантів здійснення кількість твердої композиції, що відрізняється від корму для тварин, наносять або змішують із кількістю корму, щоб одержати склади кормів з вищеописаними рівнями ферментів. В інших варіантах здійснення кількість твердої композиції, що відрізняється від корму для тварин, змішують із кількістю корму для одержання корму для тварин з кількістю ферменту, ефек 17 тивною у плані зниження рівня позитивного білку гострої фази у тварини, підвищення рівня негативного білку гострої фази у тварини та/або поліпшення показників росту тварини. Вважають, що наявні в цей час композиції твердих порошкових композицій ферментів, які підходять для перорального введення, містять значно менше, ніж щонайменше приблизно 40000 МО/л ферменту, що знижує імунний стрес, якщо взагалі його містять, та не є ефективними в плані зниження рівня позитивного білку гострої фази, підвищення рівня негативного білку гострої фази та/або поліпшення показників росту тварини при використанні у відповідності зі своїми інструкціями. Як прийнято в галузі техніки, термін "МО" або "міжнародна одиниця" відноситься до кількості ферменту, що буде каталізувати перетворення мікромолю субстрату у хвилину в умовах, які оптимальні для ферменту. Еквіваленти мас щодо міжнародних одиниць ферментів, що знижують імунний стрес, відомі в галузі техніки та можуть бути визначені при використанні стандартних аналізів. Приклади стандартних аналізів для репрезентативних ферментів, що знижують імунний стрес, наведені нижче. В одному варіанті здійснення фермент експресується рослиною, що використовують у кормі для тварин. Наприклад, кукурудза може бути піддана генній інженерії, щоб одержати експресію ферменту, що знижує імунний стрес, та отриманий у результаті продукт генетично модифікованої кукурудзи може бути використаний у кормі. На продукцію можна також впливати іншими генетично модифікованими або класичним чином модифікованими системами, таким як бактерії, наприклад, Е. coli, Bacillus sp., Lactobacillus; дріжджі, наприклад, Pichia, Yarrow, Saccharomyces, Schizosaccharomyces (наприклад, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula, Kluyveromyces, Candida) та інші гриби, такі як Aspergillus, Rhizopus, Tricoderma, Penicillium та Humicola. Відповідно до іншого варіанту здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, являє собою капсулу або таблетку для перорального прийому. Винахід також охоплює варіанти здійснення, у яких фермент вводять іншими шляхами, наприклад, внутрівенно, внутрішньочеревинно або підшкірно у вигляді компоненту композиції, приготовленої для даного застосування відповідно до відомої фармакологічної практики. Імунна система тварини може розпізнавати як антиген або молекулярну структуру деякі інгредієнти композиції корму, які не представляють реальної загрози для здоров'я тварини. Проте, інгредієнт ініціює імунну відповідь, що приводить до того, що тварина зазнає імунологічного стресу, і який можна виявити та контролювати за підвищенням сироваткової концентрації одного або більше АРР. Не бажаючи бути зв'язаними якою-небудь теорією, автори даного винаходу вважають, що дана імунна відповідь, яка "непотрібна та дає зворотний результат", може включати рецептори розпізнавання типу (PRR), такі як беруть участь у вродженій імунній системі. 95266 18 Вроджена імунна система дає імунну відповідь, що не залежить від розпізнавання специфічного антигену. Див., наприклад, статтю Tosi, J. Allergy Clin. Immunol. 116: 241 (2005). Один аспект вродженої імунної системи включає PRR, які розпізнають та зв'язують пов'язані з патогеном молекулярні структури, трансдуцируючи сигнали імунної відповіді. Див. наприклад, Fabrick et al., J. Biol. Chem. 279: 26605 (2004). Приклади PRR включають Toll-подібні рецептори (TLR), які розпізнають ряд молекулярних структур та генерують внутрішньоклітинні сигнали для активації ряду відповідей хазяїна. Див., наприклад, статті Tosi, supra; BlachOlszewska, Arch. Immunol. Ther. Exp. 53: 245 (2005). Ідентифіковані PRR/TLR, які розпізнають манозу (див., наприклад, статтю Blach-Olszewska, вище), 1,3--глюкан (див., наприклад, статтю Rice et al., J. Leukoc. Biol. 72:140 (2002)), ліпополісахарид та фосфорилхолін (див., наприклад, статтю Baumgarth et al., Semin. Immunopathol. 26: 347 (2005)), ліпотейхоєву кислоту, розчинний у фенолі модулін, мурамілдипептид та пептидоглікан (див., наприклад, статтю Fournier et al., Clin. Microbiol. Rev. 18: 521 (2005). Описані імуномодулюючі рецептори для манану (див., наприклад, статтю Klabunde et al., Parasitol. Res. 88: 113 (2002) (манан-зв'язуючий лектин)) та N-ацетил-Dглюкозаміну та N-ацетил-D-манозаміну (див., наприклад, статтю Hansen et al., J. Immunol. 169: 5726 (2002)). Ідентифіковані також TLR для дволанцюгової РНК (див., наприклад, статтю Bell et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 102: 10976 (2005)) та ДНК із типами метилювання, які відрізняються від ендогенної ДНК (див., наприклад, статті Huang et al., J. Immunol 175: 3964 (2005); Nonnemacher et al., Infect. Immun. 71: 850 (2003)). Хоча дані молекулярні структури пов'язані з патогенними мікроорганізмами (наприклад, бактеріями, вірусами, грибами та найпростішими), вони також презентуються деякими непатогенними молекулами, такими як інгредієнти корму для тварин. Вроджена імунна відповідь на непатогенні молекули, що презентуються даними молекулярними структурами, зайво піддає тварину імунологічному стресу та може впливати на ефективність корму для тварини, сповільнювати швидкість набору маси тіла тварини або приводити до втрати маси тіла, робити тварину більше чутливою до інфекції, підвищувати температуру тіла тварини або іншим способом впливати на здоров'я тварини або ефективність використання енергії їжі (калорій). Вроджена імунна відповідь, обумовлена функцією MBL (маноза-зв'язуючий лектин), наприклад, індукує сильні відповіді. Показано, що мутація одного з генів білку, що зв'язує манозу, у мишей парадоксальним чином забезпечує виживання після звичайно летального штучно викликаного гострого септичного перитоніту (див. статтю Takahashi, K. et al., Microbes Infect. 4 (8): 773-784, 2002). У цьому випадку імунний стрес внаслідок агресивної вродженої імунної відповіді є більш летальним, ніж інфекція. -манан являє собою компонент соєвих продуктів та кормів для тварин на соєвій основі. Високомолекулярні форми -манану, присутні в кормі 19 для тварини, можуть ініціювати імунну відповідь, яка "непотрібна та дає зворотний результат", тим самим піддаючи тварину імунологічному стресу. Автори даного винаходу виявили, що даний імунологічний стрес можна зменшити або попередити, використовуючи геміцелюлазу типу -мананази, ендо-1,4--D-мананазу, фермент, що розкладає манани (наприклад -галактоманан, глюкоманан), тим самим зменшуючи або запобігаючи імунній відповіді на -манан. Як показано в Прикладах нижче, зниження рівня імунологічного стресу відбивається на зниженні сироваткової концентрації АРР. -мананазу, що розкладає -манан, використовують як фермент, що зменшує імунний стрес, відповідно до винаходу, -манан не вважають геміцелюлозою, оскільки він не має загальних характерних властивостей геміцелюлоз. В галузі промислових ферментів термін "геміцелюлаза" використовують як торговельну назву -мананази. Аналогічним чином у патентах та публікаціях, співавторами яких є автори даної заявки, термін "геміцелюлаза" використовують для позначення -мананази, у тому числі ендо-1,4--Dмананази. Див., наприклад, патент США No. 6162473. В інших контекстах термін "геміцелюлаза" може бути ширше, охоплюючи глюканази ти ксиланази на додаток до мананази, як пояснюють нижче. Термін "геміцелюлоза" створений для опису вуглеводного рослинного матеріалу, отриманого екстракцією розведеним лужним розчином, що гідролізується легше, ніж целюлоза. Див., наприклад, статті Schulze, Ε., Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaf, 24: 2277 (1891); Schulze, Ε., Ζ. Physiol Chem. 16: 387 (1892). Відтоді термін "геміцелюлоза" став визначати нерозчинні у воді рослинні полісахариди, пов'язані із целюлозою, відмінні від пектину та крохмалів, та полісахариди в соку рослин, які розчинні в розведених лужних розчинах. Див., наприклад, розділ, написаний Whisler et al., "Hemicelluloses" (Геміцелюлози) у монографії IV POLYSACCHARIDE CHEMISTRY (Хімія полісахаридів) 112 (Academic Press, 1953). Як правило, вважають, що ксилан, -манани та Антигени -манан -манани -1,3-глюкани Дволанцюгова РНК мРНК без кепа 3рРНК ДНК 95266 20 галактани являють собою геміцелюлози, хоча деякі -манани, такі як галактоманани камеді плодів ріжкового дерева та гуарової камеді добре розчинні. Хвойні дерева містять багато -мананів, асоційованих із целюлозою, та листяні дерева містять багато ксиланів. На противагу геміцелюлозам -манан пов'язаний із клітинними стінками грибів, таких як Saccharomyces, не є структурним компонентом деревини та постійно виявляється в еукаріотичних глікопротеїнах, які, як правило, розчинні у воді. У такий спосіб не вважають, що -манан являє собою геміцелюлозу, та -мананаза не є геміцелюлазою. -мананазу використовують як фермент, що знижує імунний стрес, відповідно до даного винаходу, оскільки вона розкладає -манани, які розпізнаються імунною системою тварини, але не пов'язані з патогеном. Вроджена імунна система чутлива до манану, оскільки полімери, що містять маннозу, виявлені на поверхні багатьох патогенів. Інші інгредієнти корму, які може розпізнавати імунна система тварини, включають -1,3-глюкан (звичайний структурний компонент рослинних матеріалів), N-зв'язані глікопротеїновї комплекси (виявлені, наприклад, у соєвих продуктах), дволанцюгові РНК, виділені з рослин, тварин або мікробів, рослини або тварини із чужорідним (неендогенним) типом мієлірування. Так, відповідно до одного варіанту здійснення винахід представляє композиції, що містять один або більше ферментів, що знижують імунні стреси, які розкладають один або більше даних або інших інгредієнтів корму. У пов'язаному варіанті здійснення винахід представляє способи зменшення імунологічного стресу у тварини, які полягають у введенні тварині композиції, що містить ефективну кількість даного ферменту або ферментів. Специфічні приклади ферментів, що знижують імунний стрес та антигенів, які вони розкладають, наведені в наступній таблиці. Винахід охоплює композиції, які включають інші ферменти, що знижують імунний стрес, які розкладають ті ж самі або інші антигени, а також застосування даних інших ферментів для зниження імунологічного стресу. Ферменти -мананаза -манозидаза -мананаза геміцелюлаза (типу -мананази) 1,4--мананаза ендо-1,4--D-мананаза 1,3--глюканаза ендо-1,3--глюканаза (ЄС 3.2.1.39) -глюкозидаза Неспецифічна нуклеаза РНКаза L Аденозиндезаміназа, специфічна у відношенні dsPHK ДНКаза Неспецифічна нуклеаза ЦГ-специфічна рестрикційна ендонуклеаза 21 95266 22 Карбогідрази N-зв'язані глікопротеїни (наприклад, асиалогліко- N-гліканази протеїн) Ендоферменти PNGasn Фосфохолін у сфінгомієліні Сфінгомієліназа хітиназа (ЄС 93.2.2.14) N-ацетилглюкозамин-вмісний полімер (напри- Хітиндезацетилаза клад, хітин) Вуглеводдезацетилаза N-ацетилглюкозамінідаза Фосфатидилсеріндекарбоксилаза Фосфатидилсерін Фосфоліпаза С Фосфоліпаза D Сульфатований галактозид-сахарид Сульфатаза -галактозид -галактозидаза Ксилоглюканаза Ксилоглюкан (ЄС 3.2.1.15) Ліпоарабіноманан (LAM) Арабінаназа Арабіногалактан (AG) Гіалуронідаза Гіалуронан (гіалуронова кислота) (ЄС 3.2.1.35) Арабіногалактан та інші -арабінофуранозидаза Арабіно-модифіковані вуглеводні Хондроітинсульфат Хондроітиназа Глюкоцереброзиди Глюкоцереброзидаза Складні метилові ефіри вуглеводнів Метилестераза Естераза ферулової кислоти Вуглеводи, естерифіковані феруловою кислотою Фурулоїлестераза Ацетилестераза Ацетильований вуглеводневий полімер Вуглеводдезацетилаза Відповідно до деяких варіантів здійснення винахід представляє композицію, що містить два або більше ферменти, що знижують імунний стрес. В одному варіанті здійснення щонайменше один із двох або більше ферментів не є 1,4--мананазою або 1,3--глюканазою. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція включає 1,4--мананазу та 1,3--глюканазу. В одному спеціальному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою корм для тварин, що містить 1,4--мананазу та щонайменше приблизно 20 МО 1,3--глюканази/кг корму, наприклад, щонайменше 20 МО/кг корму, щонайменше 25 МО/кг корму, щонайменше 30 МО/кг корму, щонайменше 35 МО/кг корму, щонайменше 40 МО/кг корму, щонайменше 45 МО/кг корму, щонайменше 50 МО/кг корму або більше 1,3--глюканази. В іншому спеціальному варіанті здійснення винаходу, композиція являє собою рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає 1,4--мананазу та щонайменше приблизно 155000 МО 1,3--глюканази/л, наприклад, щонайменше 155000 МО/л, щонайменше 230000 МО/л, щонайменше 300000 МО/л, щонайменше 380000 МО/л або більше 1,3--глюканази. В іншому спеціальному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає 1,4--мананазу та щонайменше приблизно 300000 МО 1,3--глюканази/кг, наприклад, щонайменше 300000 МО/кг, щонайменше 450000 МО/кг, щонайменше 600000 МО/кг, щонайменше 750000 МО/кг, щонайменше 900000 МО/кг або більше 1,3--глюканази. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція включає 1,4--мананазу та ксилоглюканазу. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція включає 1,3--глюканазу та ксилоглюканазу. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція включає 1,4--мананазу та хітиназу. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція включає 1,3--глюканазу та хітиназу. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція включає 1,4-мананазу та арабінаназу. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція включає 1,3-глюканазу та арабінаназу. В іншому варіанті здійснення винаходу композиція включає 1,4-мананазу, 1,3--глюканазу та арабінаназу. Слід мати на увазі, що дані комбінації є тільки ілюстративними, та винахід включає композиції, що містять інші комбінації ферментів, що зменшують імунний стрес. Наприклад, винахід включає композиції, що містять один або більше ферментів, що знижують імунний стрес, перерахованих вище та/або обговорюваних нижче та 1,4-мананазу. Імунний стрес, що викликається інгредієнтом корму, може не завжди являти собою відповідь вродженої імунної системи. Добре відомо, що в деякого невеликого відсотку дітей, яких годують замінником жіночого молока на основі соєвого білку, розвивається сильна несприятлива кишкова реакція на імунологічній базі (див. звіт Комітету з харчуванню Американської академії педіатрії, 23 Pediatrics 101 (1): стор. 148, (1998)). N-зв'язані глікопротеїни сої, наприклад, -конгліцинін, що іноді називають 7S глобуліном (див. статті Ogawa Τ, et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 59(5): 831-833, 1995; Burks AW, et al., J Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 8(2): 195-203, 1989), можуть являти собою сильні антигени, та визнають, що вони мають антиживильні властивості, -конгліцинін навмисно видаляють із препаратів ізолятів соєвого білку, використовуваних для харчових добавок, незважаючи на його внесок у загальний білок. Гідроліз руйнує антигенність. Крім того, автори виявили, що збагачена 7S фракція соєвого глікопротеїну при використанні для годівлі самців птахів, переварювалася гірше, ніж інша менш глікозильована фракція соєвого білку. Приклади придатних ферментів для розкладання вуглеводів в N-зв'язаних глікопротеїнах, включають -фукозидази, такі як -1,2-фукозидаза та -1,3-1,4-фукозидаза, -манозидази, такі як 1,6-манозидаза, -1,2-манозидаза, та -1,3манозидаза, -1,4-гaлaктoзидaзa, ендо--Нацетилглюкозамінідаза F (ендо F), пептид-N-(Nацетил--глюкозамініл)аспарагінамідаза F (PNGaзa F), PNGaзa А, ендо--Nацетилглюкозамінідаза Η (ендо Н), ендо D, ендоС, -Ν-ацетилгалактозамідаза, -1,3-гaлaктoзидaзa, ендо-N-ацил-нейрамінідаза (ендо Ν), -2,3нейрамінідаза, -2,6-нейрамінідаза, -2,8нейрамінідаза, -N-ацетилгексозамінідаза, ендо-N-галактозидаза, ендо--Nацетилгалатозамінидаза, ендо--1,6-D-мананаза, арабіногалактаназа, -галактозидаза, галактозидаза. Дані ферменти відомі у рівні техніки та деякі доступні з комерційних джерел. Альтернативно ферменти, що знижують імунний стрес, можна одержати з мікроорганізмів, які продукують ферменти, таких як бактерії, гриби та дріжджі. Крім того, ферменти можна одержати при використанні методів рекомбінантної технології, відомих в галузі техніки, шляхом, наприклад, генетичної інженерії клітини-хазяїна з метою одержання продукції ферменту, наприклад, викликаючи транскрипцію та трансляції гену, що кодує фермент. Послідовності амінокислот ряду наведених вище ферментів відомі в галузі техніки. Використовуючи дані послідовності або відомі нуклеотидні послідовності, що кодують дані послідовності, компетентні фахівці в галузі техніки можуть сконструювати підходящі гени для рекомбінантної експресії ферментів. Крім того або альтернативно, нуклеотидну послідовність, що кодує відомий фермент, що знижує імунний стрес, можна використовувати для зондування бібліотеки ДНК із метою ідентифікації інших нуклеотидних послідовностей, що кодують ферменти, що знижують імунний стрес. Як відомо в галузі техніки, дану бібліотеку ДНК можна виділити з певного організму або популяції організмів або можна одержати із природних джерел і, таким чином, представити ДНК із мікроорганізмів, які важко культивувати. У варіантах здійснення винаходу, де композиція включає комбінацію ферментів, фермент мож 95266 24 на одержати в індивідуальній формі шляхом розділення організмів, або два або більше ферменти можуть продукуватися одним організмом. Наприклад, один організм можна сконструювати рекомбінантно з метою одержання двох або більше ферментів способами, відомими в галузі техніки. Як обговорюється вище, імунна система тварини розпізнає ряд молекулярних структур, що продукуються патогенними мікроорганізмами, включаючи ліпополісахарид (наприклад, асоційований із грам-негативними бактеріями), бактеріальні жгутики, що містять консервативний білок флагелін, пептидоглікан (наприклад, асоційований із грам-позитивними бактеріями), ліпотейхоєву кислоту (наприклад, асоційовану із грампозитивними бактеріями), зв'язану лектином Lфіколіном С-типу (див. статтю Lynch, N. J., et al., J. Immunology 172: 1198-1202, 2004), фосфорилхолін (наприклад, асоційований із грам-позитивними та грам-негативними бактеріями), ДНК (таку як бактеріальна ДНК із неметильованими фрагментами Ср, див. статтю Van Uden та Raz, J Allergy Clin Immunol. 104(5):902-10, 1999.) та дволанцюгову РНК та 3рРНК (див. статтю Horaung, et. al.,. Science 314: 994-997, 2006). Імунна відповідь на дані молекули включає підвищення рівня сироваткового АРР. Інші патогенні молекулярні структури включають молекули, що містять N-ацетилглюкозамін та молекули, що містять N-ацетилманозамін. Точна специфічність зв'язування всіх колектинів може бути невідомою (маноза-зв'язуючий лектин являє собою колектин або лектин С-типу), але зв'язування з рядом різних бактеріальних патогенів спостерігають наприклад, у Н-фіколіну, пов'язаного з поверхнево-активною речовиною білку A (SP-A) та конглютиніну. Сполуки, подібні Nацетилглюкозаміну та N-ацетилманозаміну можуть інгібувати зв'язування і, таким чином, як припускають, є частиною специфічності зв'язування розпізнаваної структури (див. статтю Haurum, J.S., et al., Biochemical J. 293 (3): 873-878, 1993). Приклади інших антигенів та молекулярних структур, які можуть являти собою мішень для розкладання ферментом відповідно до винаходу, включають бактеріальні ліпопротеїни (див. статтю Hacker, Η. et al., J. Exper. Med. 192 (4): 595-600, 2000); -1,3-глюкан, що зв'язується колектином дектином-1 (Adachi, Y., et al., Infection and Immunity 72 (7): 4159-4171, 2004); флагелін (який зв'язує TLF5) (див. статтю Honko, A.N., і Mizel, S.B., Immunol. Res. 33 (1): 83-101, 2005); глікокон'югати фукозилу, -Gal-церамід, фібриноген, гепаринсульфат, сульфатований gal-сахарид, хітозан Nацетилглюкозамін; асиалолікопротеїн та галактозиди. Клас рецепторів, що називають фагоцитарними рецепторами (SR), структурно близький ряду рецепторів вродженої імунної відповіді та може привести до імунного стресу. Вважають, що SR включено в повторний цикл та очищення в апоптозних або в іншим способом ушкоджених клітинах. Фагоцитарні рецептори (SR), що експресуються макрофагами та дендритними клітинами, також являють собою рецептори для вродженої імунної 25 системи. Більше того, деякі SR розпізнають патогени, та показано, що ряд вроджених імунних рецепторів важливі при апоптозі. Так, відповідно до одного варіанта здійснення винаходу молекулярні структури, що є мішенями зв'язування SR, направлені на розкладання ферментом. Одна з даних мішеней зв'язування молекулярних структур являє собою окислений ліпопротеїн низкою густини (ЛНГ). Рецептори, що називають LOX-I (див. статтю Peiser, L., et al., Current Opinion in Immunology 14:123-128, 2002) SR-PS OX/CXCL16 (див. статтю Fukumoto, Ν., et al., J. Immunol. 173(3): 1620-1627, 2004) та CD36 (див. статтю Bruni, F., et al., Clin. Appl. Thromb. Hemost. 119(4): 417-28, 2005) зв'язують окислений ЛНГ, що може бути присутнім у ряді кормів, зокрема, кормів, що містять борошно із субпродуктів тварин, таке як кров'яне борошно. Інша молекулярна структура, що є мішенню зв'язування SR являє собою фосфатидилсерін (PS) та лізофосфатидилсерін (лізо PS). SR для PS включає SR-PSOX/CXCL-16 та інші рецептори PS (див. статтю Schlegel, R.A. і Williamson, P., Cell Death Differ. 8 (6): 545-548, 2001). Вплив фосфатидилсерінових фосфоліпідів може привести до запальних реакцій, та вважають, що фосфатидилсерінові фосфоліпіди присутні на деякому рівні в більшості кормів. Гіалуронан переважає в позаклітинних рідинах тварин, але також розпізнається механізмами вродженої імунної/фагоцитарної системи, наприклад, при загоєнні ран. Див., наприклад, статтю Jameson, et al., J. Expt. Medicine 210 (8): 12691279, 2005. Курячі гребінці є комерційним джерелом гіалуронану, що звичайно використовують у формі очищеної гіалуронової кислоти. Так, корм для птаха, зроблений із субпродуктів обробки м'яса, може містити гіалуронан, часто у великих кількостях. Гіалуронідазу (EC 3.2.1.35), що розкладає гіалуронан та гіалуронову кислоту, використовують як фермент, що знижує імунний стрес, відповідно до винаходу, особливо в контексті тварин, які одержують корм із птаха. Наприклад, гіалуронідазу використовують для зниження імунного стресу, асоційованого з годівлею їжею із птаха. Ферменти, які розкладають кожну з даних молекулярних структур, тим самим інгібують або знижують рівень імунної відповіді, у такий спосіб знижуючи імунологічний стрес у тварини. Наприклад, відомі ДНКази та неспецифічні нуклеази, які розкладають дволанцюгову РНК та бактеріальну ДНК. Відомі ферменти рестрікційні ендонуклеази, специфічні у відношенні метильованих фрагментів ЦГ у ДНК нессавців. Ферменти, які розкладають фосфорилхолін, включають фосфорилхолінгідроліазу, лужну фосфатазу, кислу фосфатазу, фосфорилхолінестеразу та фосфорилхолінфосфатазу. Дане зниження стресу можна виявити та контролювати вимірюванням рівня сироваткового АРР, як описано вище, причому знижені концентрації сироваткового АРР відбивають знижений імунологічний стрес. Як відзначено вище, композиція включає кількість ферменту, що знижує імунний стрес, яка 95266 26 ефективна в плані зниження рівня білку гострої фази у тварини. Дана кількість може варіюватися від тварини до тварини та від ферменту до ферменту, але може бути легко встановлена компетентними фахівцями в галузі техніки, наприклад, вимірюванням рівнів АРР, як описано вище. Наприклад, рівні сироваткового АРР тварини можна вимірювати до та після введення ферменту або можна зрівняти рівні сироваткового АΡΡ лікований та контрольних тварин. У варіантах здійснення, де ефективну кількість оцінюють вимірюванням рівнів сироваткового АРР до та після введення ферменту, наступне вимірювання можна зробити через щонайменше приблизно один день до щонайменше приблизно декількох днів або більше після вихідного введення ферменту. Зниження концентрації сироваткового АРР, пов'язане із введенням ферменту, показує, що вводять ефективну кількість ферменту. Однак слід мати на увазі, що рівні АРР, як правило, знижуються в міру того, як адаптивна імунна відповідь тварини дає ефект. Відповідно до деяких варіантів здійснення даний винахід представляє композицію, що включає 1,3--глюканазу в кількості, ефективній для ефективного зниження рівня позитивного білку гострої фази в зазначеної тварини, підвищення рівня негативного білку гострої фази в зазначеної тварини та/або поліпшення показників росту тварини. В одному специфічному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою корм для тварин, що включає щонайменше приблизно 20 МО 1,3-глюканази/кг корму, наприклад, щонайменше 20 МО/кг корму, щонайменше 25 МО/кг корму, щонайменше 30 МО/кг корму, щонайменше 35 МО/кг корму, щонайменше 40 МО/кг корму, щонайменше 45 МО/кг корму, щонайменше 50 МО/кг корму, або більше 1,3--глюканази. В іншому спеціальному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає щонайменше приблизно 155000 МО 1,3--глюканази/л, наприклад, щонайменше 155000 МО/л, щонайменше 230000 МО/л, щонайменше 300000 МО/л, щонайменше 380000 МО/л, або більше 1,3--глюканази. В іншому спеціальному варіанті здійснення винаходу композиція являє собою тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин, що включає щонайменше приблизно 300000 МО 1,3-глюканази/кг, наприклад, щонайменше 300000 МО/кг, щонайменше 450000 МО/кг, щонайменше 600000 МО/кг, щонайменше 750000 МО/кг, щонайменше 900000 МО/кг або більше 1,3-глюканази. У деяких варіантах здійснення корму для тварин, де фермент містить 1,3--глюканазу, фермент може бути присутнім у кількості, що становить щонайменше приблизно 100000 МО на тонну корму. Дані кількості значно вище, ніж вміст 1,3-глюканази в комерційних ферментних добавках для кормів та комерційно доступних кормах, які були проаналізовані авторами даного винаходу, та було показано, що вони містять максимум від приблизно 10000 МО/тонну корму, приблизно 72500 МО/л некормової рідкої композиції або приблизно 150000 МО/кг некормової твердої композиції. Ав 27 тори даного винаходу вважають, що 10000 МО/тонну корму 1,3--глюканази не було б ефективним для зниження рівня АРР, та експериментально підтверджують дану думку. Крім того, автори даного винаходу експериментально встановили, що комерційні продукти, такі як Avizyme (Danisco A/S, Langebrogade 1, Dk-1001, Copenhagen, Denmark) та Rovobio (Adisseo France SAS, 42, Avenue Aristide Briand, BP1OO, 92164 Antony Cedex,) та комерційні корми, що містять стандартні кількості -1,3-1,4-глюканази (Brewzyme BG plus, Dyadic International, 140 Intracoastal Pointe Drive, Suite 404, Jupiter, Florida 33477-5094), ксиланази (Multifect XL, Genencor International, Inc., 925 Page Mill Road, Palo Alto, CA), PI- PLC (ChemGen Corp., 211 Perry Parkway, Gaithersburg, MD) та амілази (Амілаза FRED, Genencor International, Inc., 925 Page Mill Road, Palo Alto, CA) не знижують рівень АРР. Див. Приклад 3 нижче та Фігуру 3. У випадках, коли є активність 1,3-глюканази, вона знаходиться у вищевказаних низьких межах та неефективна в плані зниження рівня AGP. В іншому варіанті здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, представлений як компонент композиції, що включає також сполуки, що містять антиген або молекулярну структуру, які розкладаються ферментом. Наприклад, винахід включає корм для тварин, що містить -1,3-глюкан та 1,3--глюканазу, корм для тварин, що містить ДНК або дволанцюгову РНК та ДНКазу та/або неспецифічні нуклеази, корм для тварин, що містить N-зв'язаний глікопротеїн, та ендо- або екзокарбогідразу, N-гліканазу або PNGaзy або будьякий з інших вищенаведених ферментів. Інші придатні комбінації антигенів та ферментів, що знижують імунний стрес, будуть очевидні для компетентних фахівців в галузі техніки та охоплюються винаходом. У даному варіанті здійснення винаходу очікують, що рівні сироваткового АРР будуть залишатися підвищеними так довго, як будуть вводити композицію. Таким чином, якщо ефективну кількість ферменту, що знижує імунний стрес, оцінюють вимірюванням рівнів сироваткового АРР до та після введення ферменту, наступне вимірювання можна робити через кілька днів або тижнів після вихідного введення ферменту. Як відзначено вище, винахід включає способи зниження імунного стресу у тварини, що включають введення тварині композиції, що містить фермент, що знижує імунний стрес, у кількості, ефективній для зниження рівня білку гострої фази у тварини. Композиція може являти собою кожну з вищеописаних композицій, включаючи пероральну композицію, таку як корм для тварин, рідка композиція, відмінна від корму для тварин, або тверда композиція, відмінна від корму для тварин. Тварина може являти собою будь-яку тварину, включаючи людину, та може бути здоровою твариною або твариною, що страждає від інфекції або іншого захворювання або стану. Винахід включає також способи поліпшення показників росту тварини, що полягають у введенні тварині композиції, що містить фермент, що 95266 28 знижує імунний стрес. У ряді варіантів здійснення винаходу композиція включає кількість ферменту, що знижує імунний стрес, ефективну в плані поліпшенняпоказників росту тварини. Композиція може являти собою кожну з вищеописаних композицій, включаючи пероральну композицію, корм для тварин, рідку композицію, що відрізняється від корму для тварин, або тверду композицію, що відрізняється від корму для тварин. Тварина може являти собою будь-яку тварину, включаючи людину, і може бути здоровою твариною або твариною, що страждає від інфекції або іншого захворювання або стану. В одному варіанті здійснення фермент експресується рослиною, що використовують у кормі для тварини. Наприклад, кукурудзу можна піддати генетичній інженерії, щоб вона експресувала фермент, що знижує імунний стрес, та отриманий у результаті продукт генетично модифікованої кукурудзи можна використовувати в кормі. В одному варіанті здійснення винаходу тварині вводять фермент, що знижує імунний стрес, та, крім того, вводять антиген (наприклад, молекулу, що містить структуру, що розкладається ферментом). Фермент та антиген можна вводити окремо або одночасно у вигляді частини однієї й тієї ж або різних композицій. В одному варіанті здійснення тварині винаходу вводять корм, що містить антиген або вміщуючу структуру молекулу та окремо вводять композицію, що містить фермент, що знижує імунний стрес. В іншому варіанті здійснення тварині вводять корм, що містить антиген або вміщуючу структуру молекулу та кормову добавку, що містить фермент. В іншому варіанті здійснення тварині вводять корм, що містить як антиген, так і фермент. Інший аспект винаходу представляє композиції та способи зниження імунологічного стресу шляхом попередження та лікування інфекції, що викликається патогенними мікроорганізмами. Іноді тварини споживають композиції, такі як вода або корм для тварин, які містять патогенні мікроорганізми (наприклад, бактерії, віруси, гриби та найпростіші), або іншим способом піддаються впливу даних патогенів. Даний винахід представляє композиції, що містять фермент, що розкладає ключові компоненти патогенних мікроорганізмів (тобто, "патогенний компонент"), у кількості, ефективній для зниження рівня інфекції, та, внаслідок цього, рівня АРР, що експресується твариною, що відповідає на інфекцію. Композицію використовують для зниження імунологічного стресу шляхом попередження або зведення до мінімуму інфекції, тим самим знижуючи імунологічний стрес, що викликається безпосередньо патогеном. В одному конкретному аспекті даного варіанту здійснення винахід представляє спосіб попередження та лікування інфекції травного тракту. Ферменти можуть також лікувати або попереджати інфекцію за допомогою розкладання компонентів патогену. Це обумовлено тим, що при розкладанні патогенного компоненту патоген може втрачати свою здатність інфікувати хазяїна. Дане зниження даної інфекції привело б у результаті до зниженого імунного стресу та зниження рівня си 29 роваткового АРР за допомогою іншого механізму, ніж описаний вище, але практично невідрізнимого в плані спостережуваного зниження рівня АРР. Є щонайменше три варіанти, при яких лікування ферментами могло б привести до позитивного результату. Якщо молекулярна структура патогену, що розкладається ферментом, бере участь у зв'язуванні патогену із клітинами-хазяями, першої стадії, що вимагається для інфекції, або в будьякій іншій стадії, необхідній для успішної інфекції, то лікування ферментами могло б допомогти. Альтернативно можна модифікувати зв'язуючу структуру на клітині-хазяїні. Наприклад, показано, що ряд бактеріальних та протозойних патогенів взаємодіє із протеогліканами на поверхні еукаріотичної клітини-хазяїна, особливо із сульфотованими протеогліканами (див. статтю Flekenstein, J.M. et al., Infection and Immunity 70 (3): 1530-1537, 2002). Застосування ферментів, таких як гепариназа та N-ацетилглюкозамін-4-сульфатаза або арилсульфатази, могло б знизити рівень взаємодії та інфекції. У другому варіанті молекулярна структура патогену, що розкладають, могла б являти собою токсин, що порушує метаболічні функції клітинимішені. У третьому варіанті патогенний компонент, що розкладається ферментом, міг би брати участь у механізмі патогену, спрямованому на запобігання імунної відповіді хазяїна. У патогенів виявлені численні механізми запобігання імунної відповіді, починаючи від імітації зовнішньої поверхні клітинхазяїв для інгібування імунної відповіді, наприклад, реакцій комплементу та апоптозу. Зниження або попередження інфекції можна також оцінити вимірюванням сироваткового АРР, причому більш високі рівні АРР асоціюються із інфекцією. Ферменти, які розкладають патогенні компоненти, такі як описані вище, відомі в галузі техніки. Наприклад, показано, що ендосіалідаза, виділена з бактеріофага, попереджає летальність при системній інфекції Е. coli K1 у щурів шляхом розкладання капсули PSA (полісіалової кислоти) на поверхні бактерій. Хоча розкладання капсульного вуглеводню не робить впливу на життєздатність Е. coli in vitro, втрата капсули in vivo дозволяє імунній системі хазяїна розпізнавати та боротися з інфекцією, крім летального результату (див. статтю Mushtaq, N., et al. Antimicrobial Agents and ChemoTherapy 48(5): 1503-1508, 2004). Капсула PSA дає можливість поверхні Е. соlі виглядати подібно клітині-хазяїнові, у такий спосіб уникаючи вроджених імунних відповідей хазяїна. Іншим відомим ферментом, використовуваним у даному винаході, є гепариназа І (Нейтралаза, Ibex Technologies, Canada). Багато ферментів є в комерційних джерелах або можуть бути отримані з мікроорганізмів, які продукують ферменти, таких як бактерії та гриби, у тому числі дріжджі, або можуть бути отримані рекомбінантним шляхом, як обговорюється вище. Необхідні ферменти можна одержати технологіями рекомбінантної ДНК, коли відомий ген, що кодує фермент. Розвиток методів швидкого секвенування ДНК привело в результаті до створення більших загальнодоступних баз даних послідовно 95266 30 стей білків та їхніх кодуючих генів, таких як NCBI Genbank. Використовуючи метод швидкого секвенування, наприклад, з 454 Life Sciences (454 Life Sciences, 20 Commercial Street, Branford, CT 06405), можна секвенувати типовий бактеріальний геном протягом чотирьох годин. Раніше невідомий ген нового необхідного ферменту з геному можна одержати зондуванням геному з використанням, наприклад, раніше ідентифікованих кодуючих послідовностей ферментів того ж самого типу або подібних типів, описаних з комерційних або загальнодоступних базах даних, використовуючи легкодоступні комп'ютерні програми, такі як Blast. Компетентні фахівці в галузі техніки можуть ідентифікувати в геномі ДНК, що має граничний рівень гомології з відомою послідовністю та інші властивості ділянки, що кодує ген, та потім виділити та ампліфікувати ген, використовуючи, наприклад, спосіб полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Потім ген можна експресувати у хазяїні, та можна підтвердити його ферментні властивості необхідного білку. Якщо необхідна активність ферменту заздалегідь невідома, її можна визначити, використовуючи стандартні мікробіологічні способи збагачення, засновані на підборі за ростом на субстраті. Мікроби, що використовують субстрат як єдине джерело вуглецю або азоту, повинні експресувати ферменти, здатні розкладати сполуку-мішень. Для розробки економічного одержання існує можливість вибору підвищення вироблення даного ферменту з використанням класичних мутаційних/селекційних методів та методів збагачення стосовно до мікроорганізму-продуцента або за допомогою методів експресії рекомбінантної ДНК, добре відомих в галузі техніки. Композиція, що включає фермент, який знижує імунний стрес, що розкладає патогенний мікроорганізм, може являти собою будь-яку композицію, що підходить для введення тварині, включаючи композиції, що підходять для перорального введення тварині, як описано вище. Як відзначено вище, композиція може включати кількість ферменту, що ефективна в плані зниження рівня позитивного білку гострої фази (або підвищення рівня негативного білку гострої фази) у тварини та/або поліпшення показників росту тварини. Дана кількість може варіюватися від тварини до тварини та від ферменту до ферменту, але може бути легко встановлена компетентними фахівцями в галузі техніки, наприклад, вимірюванням рівнів АРР та/або контролюванням показників росту тварини, як описано вище та як відомо в галузі техніки. В одному варіанті здійснення фермент, що знижує імунний стрес, що спрямований на патогенний антиген, представлений як компонент корму для тварин. В одному прикладі даного варіанту здійснення винаходу кількість ферменту становить щонайменше приблизно 100000 МО/тонну корму. В іншому варіанті здійснення винаходу фермент, що знижує імунний стрес, що спрямований на патогенний антиген, представлений як компонент композиції, що також включає патогенний антиген. Наприклад, винахід включає корм для тварин, що містить (А) патогенний мікроорганізм, 31 95266 що представляє антиген, такий як ліпополісахарид, пептидоглікан, ліпотейхоєва кислота, фосфорилхолін, дволанцюгова РНК та ДНК, та (В) та фермент, що розкладає антиген. Патогенні організми можуть проникнути в корм внаслідок самої природи антисанітарних умов, обумовлених високою щільністю вирощування тварин в умовах їх виробництва. Як відзначено вище, винахід включає способи зниження імунного стресу у тварини та/або поліпшення показників росту тварини, що полягають у введенні тварині композиції, що містить фермент, що знижує імунний стрес. В одному варіанті здійснення тварині вводять фермент, що знижує імунний стрес, що розкладає патогенний антиген, та, крім того, вводять патогенний антиген. Фермент та антиген можна вводити окремо або одночасно у вигляді частини однієї й тієї ж або різних композицій. В одному варіанті здійснення винаходу тварині вводять корм, що містить антиген, та окремо вводять композицію, що містить фермент. В іншому варіанті здійснення тварині вводять корм, що містить антиген та кормову добавку, що містить фермент. В іншому варіанті здійснення тварині вводять корм, що містить як антиген, так і фермент. Наступні приклади далі ілюструють винахід, але винахід не обмежений спеціальними прикладами варіантів здійснення. Приклад 1 Корм для тварин, що містить геміцелюлазу (ендо-1,4--мананазу) одержують та вводять курям та вимірюють рівні AGP, як більш детально описано нижче. У цілому 4000 однодобових курчат Cobb X Cobb чоловічої статі розподіляють випадковим чином на 8 експериментальних груп лікування, та кожен варіант лікування здійснюють в 10 повторах: 32 План експерименту 8 груп лікування Загальна кількість загонів 80 Загальна кількість груп лікування 8 Кількість птахів/загін 50 Кількість загонів/групу лікування 10 Кількість птахів/групу лікування 500 Дві з восьми груп лікування включають ферменти, що знижують стрес, відповідно до винаходу: Група лікування 3 (мананаза у формі упареного бульйону із цільних клітин, отриманого при ферментації В. lentus, внесеного в концентрації приблизно 100 MU/тонну в основні дієти) та група лікування 6 (мананаза у формі безклітинного центрифугованого супернатанту бульйону, отриманого при ферментації В. lentus, внесеного в концентрації приблизно 30 MU/тонну в основні варіанти харчування). Група лікування 8 є контрольною без доданого ферменту. (1 MU = 4000 МО). Партії основного корму у вигляді борошна ділять порівну на вісім частин і на кожну розприскують відповідну кількість тест-матеріалів. Корми для початкової стадії вирощування та стадії росту птаха містять 90 г/т Cobon (антикокцидіальний лікарський препарат іонофорного типу) та 50 г/т BMD (антибіотик). Корми для завершальної стадії вирощування не містять лікарських препаратів. Харчування для початкової стадії дають всім птахам у віці від одного до 21 дня, харчування для росту від 22 до 35 днів та харчування для завершальної стадії від 36 до 42 днів. Харчування та воду дають без обмеження. Харчування пропонують птахові у вигляді крихт/гранул протягом всіх періодів годівлі. Водопровідну воду використовують як питну та подають через внутрішню водопровідну систему. Склад та аналізи базового експериментального харчування Інгредієнти Кукурудза Соєве борошно (48,5% СР) Жир, суміш AV Дикальційфосфат Вапняне борошно Хлорид натрію L-lys,HCl DL Метіонін Холін хлорид Вітамінний премікс Мінеральний премікс Coban, г/т BMD, г/т 2 Розраховані аналізи МЕn птаха (ккал/кг) Суха речовина, % Необроблений білок, % Необроблене волокно, % Жир, % Кальцій, % Загальний фосфор, % Доступний фосфор, % Натрій, % Початкова стадія 60,3851 34,5066 1,0516 1,761 1,3192 0,3299 0,008 0,2135 0,05 0,25 0,075 90 50 Стадія росту 67,6864 27,8363 0,9915 1,2682 1,383 0,3304 0,0793 0,05 0,25 0,075 90 50 Завершальна стадія 72,1098 23,3785 1,1389 1,3021 1,26 0,3305 0,0552 0,05 0,25 0,075 3080,0 88,9169 22,0 2,8813 3,6777 1,0 0,7088 0,45 0,18 3150,0 88,9236 19,3 2,8176 3,8291 0,9 0,5967 0,35 0,18 3200,0 88,9054 17,5 2,7632 4,0981 0,85 0,5877 0,35 0,18 33 Лізин, % Метіонін+Цистеїн, % Треонін, % Триптофан, % 95266 1,2 0,92 0,8821 0,2938 По двох птахів з кожного з десяти загонів у групах лікування 3, 6 та 8 випадковим чином вибирають після зважування для аналізу крові через 42 дні, у цілому 20 птахів з 500/групу лікування. Зразки збирають на льоді в пробірки для збору крові, що містять агент гепарин проти згортання крові, та одержують плазму центрифугуванням. Зразки плазми крові аналізують на курячий 1-кислий глікопротеїн з використанням набору для аналізу на основі імунодифузії фірми Cardiotech Services, Inc. (Louisville, KY). Зразки сироватки, взяті у двох птахів/загін додають у тест-планшети (5 мкл/лунку) та в деякі лунки додають стандартний чистий AGP у концентрації, що доходить до мкг/мл. Преципітинові кільця вимірюють, викорис 34 1,0152 0,72 0,7657 0,2489 0,8948 0,65 0,6932 0,2185 товуючи шкалу для вимірювання преципітинових кілець для найближчого діаметру 0,1 мм. Для побудови оптимальної кривої, що відповідає даним, і одержання можливості швидкого розрахунку концентрації AGP у зразках плазми використовують поліноміальне рівняння, як показано на Фігурі 1. Вимірювання діаметрів преципітинових кілець для всіх виділених зразків курячої сироватки та розрахована концентрація AGP для кожного птаха показані в таблиці нижче. Птахи, які одержують мананазу, у середньому мають дуже статистично достовірне зниження середньої концентрації AGP у порівнянні з контрольними птахами. День 42 Зразки крові (у = AGP мкг/мл, x = результат вимірювання кільця в мм) Група лікування 3 (мананаза) X Υ 5,3 225,0 5,3 225,0 4,9 178,6 5,2 212,9 5,8 289,7 5,4 237,4 5,4 237,4 5,9 303,6 5,6 262,9 5,9 303,6 5,2 212,9 5,4 237,4 5,3 225,0 5,1 201,2 5,3 225,0 5,3 225,0 5,7 276,2 5,3 225,0 5,7 276,2 5 189,7 Група лікування 8 (контроль) X Υ 6 317,7 6 317,7 6,1 332,1 5,2 212,9 7,4 546,9 5,4 237,4 6,2 346,9 5,9 303,6 6 317,7 6,2 346,9 6,1 332,1 5,6 262,9 5,9 303,6 6,3 361,9 6,2 346,9 7,5 565,5 7,4 546,9 7,5 565,5 7,5 565,5 6,1 332,1 Група лікування 3 (мананаза) AVE 238,5 SD 35,8 CV 14,99 t-критерій p відносно 82,94Е-05 Група лікування 6 (мананаза) X Υ 5,3 225,0 5,7 276,2 5,8 289,7 5,1 201,2 5,4 237,4 5,7 276,2 5,5 250,0 6,1 332,1 5,4 237,4 5,2 212,9 5 189,7 6,1 332,1 5,5 250,0 5,5 250,0 6 317,7 5,4 237,4 5,6 262,9 4,4 127,2 Група лікування 8 (контроль) Група лікування 6 (мананаза) 373,1 250,3 115,6 51,3 30,97 20,50 t-критерій p відносно 8 0,000193 Приклад 2 Проводять інший експеримент із використанням геміцелюлази (ендо-1,4--мананази). У даному експерименті групи курей (10 загонів кожна, по 50 птахів/загін) годують одним із чотирьох варіантів харчування: Група лікування 1 (контроль): Корм, що містить антибіотик BMD, покроплений після гранулювання контрольним складом, та 35% сорбітом з коричневим харчовим барвником, внесеним у кількості 100 мл/тонну корму. Група лікування 2 (контроль): Корм без BMD, покроплений після гранулювання контрольним складом, та 35% сорбітом з коричневим харчовим барвником, внесеним у кількості 100 мл/тонну корму. Група лікування 3: Корм, покроплений після гранулювання складом, що містить геміцелюлазу (ендо-1,4--мананазу), виділену з В. lentus, внесену в кількості 100 мл/тонну корму. Група лікування 4: Корм, приготовлений з порошковою композицією (доданою в змішувач пе 35 95266 ред гранулюванням), що містить геміцелюлазу (ендо-1,4--мананазу), виділену з В. lentus, причому додають 454 г композиції/тонну корму, щоб одержати 100 MU/т корму. (1 MU = 4000 МО). 36 На початку експерименту використовують курчат у віці 1 день. Харчування дають без обмежень. Корми для початкової стадії (дні 0-21), стадії росту (дні 21-35) і завершальної стадії (дні 35-42) з наступними складами використовують як базові корми: Очікувані кількості Аналіз живильних речовин ME* птаха, ккал Необроблений білок Жир, % Кальцій, % Загальний фосфат Доступний фосфор Натрій Лізин, % Метіонін Met+Cys Початкова стадія 2960,0 22,0 3,1439 0,9 0,7032 0,45 0,18 1,205 0,5446 0,92 Стадія росту 3030,0 19,4 3,0647 0,8 0,6315 0,39 0,18 1,0302 0,3838 0,72 Стадія завершення 3080,0 17,5 3,4503 0,8 0,515 0,35 0,18 0,9014 0,3435 0,65 * Енергія метаболізму Додані інгредієнти Інгредієнт Вапно Сіль D-L метіонін Холін хлорид 70% Дикальційфосфат Жир Кукурудза Соєве борошно Борошно із пташиних субпродуктів Вітаміни Мінерали Саліноміцин Початкова стадія 0,8291 0,2696 0,1963 0,0500 1,6869 0,6517 59,3480 33,5934 3,0 0,25 0,075 0,05 У день 21 приблизно 3 мл крові збирають в 3 птахів/загін (30/групу). Кров поміщають у гепаринізовану пробірку та злегка перемішують. Пробірки повільно центрифугують та потім видаляють сироватку. Зразки сироватки поміщають у пробірки та позначають номерами загонів. Сироватку заморожують для наступного аналізу AGP, як описано вище в Прикладі 1. Кільця імунодифузії, що використовують для кількісної оцінки курячого 1 кислого глікопротеїну, просто вимірюються, мають високу відтворюваність та показують коефіцієнт варіації 4% або менше. Група лікування AGP Т-критерій Т-критерій Т-критерій Середній SD* CV** Ρ Відносно Ρ Відносно Ρ відносно 1 214,35 62,16 29,00 Стадія росту 0,7674 0,2698 0,0682 0,0500 1,4088 0,4751 67,4725 27,1132 3,0 0,25 0,075 0,05 Стадія завершення 0,9012 0,2702 0,0532 0,0500 1,2295 0,8162 70,9038 22,4010 3,0 0,25 0,075 0,05 Середні результати для дня 21 по 30 птахам/варіант лікування показані в таблиці нижче та графічно на Фігурі 2. Можна бачити, що вилучення антибіотику (BMD) з харчування приводить до сильного та істотного підвищення рівня AGP у плазмі (порівн. Групу лікування 1 та Групу лікування 2). Додавання будь-якого препарату геміцелюлази (ендо-1,4--мананази) у харчування без BMD (Групи лікування 3 та 4) відновлюють AGP до рівня, що спостерігається при використанні антибіотику, вказуючи на істотне зниження імунологічного стресу. 2 267,99 82,42 30,76 0,003055 Гр. лік. 1 3 220,28 68,58 31,13 0,008952 Гр. лік. 2 0,363305 Гр. лік. 1 4 233,09 67,73 29,06 0,03919 Гр. лік. 3 0,234892 Гр. лік. 3 0,134383 Гр. лік. 1 37 95266 38 * Стандартне відхилення ** Коефіцієнт мінливості Проводять також оцінку показників росту курей, результати якої підсумують у таблиці нижче. Показники росту День 21 1 FCR Гр. 1 Гр. 2 Гр. 3 Гр. 4 День 42 Гр. 1 Гр. 2 Гр. 3 Гр. 4 Знач. Ρ 1,394 1,412 1,404 1,407 0,150 1,776 1,813 1,770 1,761 0,006 0,605 0,740 0,001 0,0001 Набір маси 0,693 0,657 0,673 0,670 2,102 2,073 2,131 2,060 Ρ вел. 0,016 0,197 0,459 0,189 0,088 0,572 Перетворення корму з 2 поправкою на масу 1,379 1,424 1,404 1,410 1,772 1,820 1,756 1,772 3 Ρ вел. CVID Знач. Ρ 0,017 13,81 14,77 14,03 14,40 0,33 11,23 10,42 9,97 10,38 0,19 0,248 0,551 0,007 0,005 0,003 0,46 0,69 0,49 0,95 1 - Перетворення корму - Перетворення корму з поправкою на масу тіла 3 - Коефіцієнт варіації в індивідуальних масах тіла 2 У такий спосіб як перетворення корму, так і перетворення корму з поправкою на масу тіла поліпшуються до дня 21 зі статистичною значимістю у курей, що одержують -мананазу. Це показує, що зниження рівня сироваткового AGP може мати реальну значимість відносно показників тварини. Приклад 3 Здатність інших ферментів, звичайно використовуваних у кормі для тварин, оцінюють у плані позитивної дії на AGP. Раціони для курей початкової стадії вирощування комерційного типу (з низькою енергією метаболізму) складають із кормовими продуктами, звичайно використовуваними в США. Дані раціони (у формі м'якої маси або гранул) дають без обмеження із часу прибуття курчати до дня 21 дослідження. Експериментальні лікувальні корми одержують із даного базового корму для початкової стадії вирощування. Лікувальні корми змішують, щоб забезпечити рівномірний розподіл відповідного тест-продукту. Склад та аналізи базового експериментального харчування Інгредієнти Кукурудза Соєве борошно (48,5% СР) Жир, суміш AV 59,398 33,5934 0,6517 Дикальційфосфат Вапняне борошно Хлорид натрію DL Метіонін Борошно із пташиних субпродуктів Холін хлорид 70% Вітамінний премікс Мінеральний премікс 1,6869 0,8291 0,2696 0,1963 3,0 0,05 0,25 0,075 Інгредієнти МЕn птаха (ккал/кг) Необроблений білок, % Необроблене волокно, % Жир, % Кальцій, % Загальний фосфор, % Доступний фосфор, % Натрій, % Лізин, % Метіонін+Цистеїн, % Треонін, % LO ME* 2960 22,0 2,8899 3,1439 0,9 0,7032 0,45 0,18 1,205 0,92 0,8266 * низька метаболічна енергія BMD 50 г/т та саліноміцин 60 г/т додають в усі корми. 39 95266 40 Ферментні препарати Зразок 3 6 7 8 9 10 11 12 17 Фермент Дані аналізу Вихідний Розріджувач Зауваження об'єм + харчовий 20 барвник HB* Adessio, Rovabio Excel LC Danisco, Avizyme (1500 гранульов.) PI-PLC Genecor Амілаза FRED Genecor Multifect XL Dyadic Brewzyme BG Hemicell Rovabio, комерційний 10 продукт Avizyme, комерційний Твердий продукт продукт 106 Од. /мл 50 20мл/100кг 10 20мл/100кг 100 г/100 кг 1,0 мл/кг 20мл/100кг 20мл/100кг 20мл/100кг 1092 MU/л 13 НВ Рівень застосування 20мл/100кг 12 20 + харчовий барвник 20 мл/100 кг * - не визначають (І MU - 4000 МО) Ферментні препарати. Додаткова інформація Зразок Основна активність 3 Мінорна активність ендо-1,3--глюканази* Ендо-1,4--ксиланаза Од./мл 350 Рівень застосування АХС 63350 АХС Ед./т 6 Ендо-1,4--глюканаза Од./мл 7 8 9 10 11 12 17 Ендо-1,4--ксиланаза 350 АХС 500 9139 МО/т AGL Ендо--1,4--глюканаза 90500 AGL Од./т Амілаза Ксиланаза протеаза PI-PLC 106000 МО/л Амілаза 4700 MU/л Ендо-1,4--ксиланаза 4500 MU/л Ендо-1,4--1,3-глюканаза 1586 MU/л Ендо-1,4--мананаза 1092 MU/л 1,0 кг/т 96188 МО/т або 24 MU/т 6 1,88x10 МО/т або 470 MU/т 900000 МО/т або 225 MU/t 634400 МО/т або 159MU/T 1040 МО/т 400000 МО/т або 100MU/T 580 МО/т ChemGen MU = 4000 МО; АХС - одиниці ксиланази за визначенням Adisseo; AGL - одиниці глюканази за визначенням Adisseo; * - приблизний рівень, вимірюваний ChemGen Corp. за допомогою аналізу редукуючих цукрів. Корм та вода доступні без обмеження протягом випробування. У день 15 птахів із груп лікування 17, 18, 19, 20 та 21 перорально інокулюють змішаним інокулюмом, що містить приблизно 30000 ооцист Е. Acervulina/птаха, 2500 ооцист Е. Maxima/птаха та 25000 ооцист Е. Tenella/птаха. Способи інокуляції ооцистами кокцидій описані в SPR SOP: IN1.002. Визначають середні значення набирання маси тіла при клітинному вмісті, споживання корму та перетворення корму. Результати приводять нижче. Інфікують тільки тварин, що одержують зразок 17. 41 Зразок Відн. групи лікування 3 t-тест Р= 3 6 7 8 9 10 11 12 0,2076 0,2770 0,1263 0,3962 0,3783 0,2647 0,0178 17 0,0043 95266 Лікування 42 Дані по росту на день 21 Середн. наСередн. Рівень ферменту/метрич. бир. живої Перетворення AGP тонну маси 170,52 0,624 1,438 Немає 186,55 0,626 1,395 100 мл 160,44 0,633 1,426 1,0 кг 196,35 0,650 1,406 106000 МО 164,05 0,622 1,434 175,89 0,593 1,444 182,00 0,629 1,396 138,22 0,645 1,421 102 MU контроль Rovabio Avizyme PI-PLC Амілаза Ксиланаза Глюканаза Hemicell Контроль 252,04 інфіковані Виявлено, що комерційні корми, що містять стандартні кількості амілази, 1,3-глюканази, 1,4глюканази, ксиланази та PI-PLC, не знижують рівні AGP. У дійсності тільки геміцелюлаза (ендо-1,4-мананаза) показує істотний ефект на рівні AGP. Крім того, порівняння груп лікування 1 та 17 ясно показує, що AGP є високочутливим до АРР у курей, оскільки інфекція підвищує рівень AGP до 82 мкг/мл. Див. також Фігуру 3. Приклад 4 Корм для тварин, який тестують, що містить 1,3--глюкан, складають таким чином, щоб він включав 1,3--глюканазу в концентрації 400000 МО (100 ChemGen MU)/т корму. Корм для тварин, який тестують, вводять тест-курям, тоді як контрольні кури одержують той же корм для тварин (що містить 1,3--глюкан) без 1,3--глюканази. Через 21 та 42 дня ведення даної схеми оцінюють рівні сироваткового AGP у крові, як описано вище. Кури, що одержують корм для тварин, до складу якого входить фермент, мають істотно більш низькі рівні AGP ніж контрольні тварини. Крім того, тест-кури демонструють більш високу ефективність корму та підвищений набір маси в порівнянні з контрольними курми. Приклад 5 Корм для тварин, який тестують, що містить джерело бактеріальної ДНК (наприклад Biolys  Lysine або інший продукт ферментації, що містить клітинні продукти), складають таким чином, щоб він включав неспецифічну нуклеазу, виділену з Cyanobacterium Anabaena sp. 7120 (Nuc), одну з найбільш активних відомих неспецифічних нуклеаз (див. статтю Meiss, G. et al., Eur. J. Biochem. 251(3): 924-934, 1998). Фермент додають у конце7 нтрації 1X10 одиниць Кунітца ферменту/кг корму або приблизно 1 мг (на основі чистого ферменту) на кг корми. Корм для тварин, який тестують вводять тест-курям, тоді як контрольні кури одержують той же корм для тварин (що містить бактеріальну ДНК) без неспецифічної нуклеази. Через 21 день або 42 дня ведення даної схеми оцінюють рівні сироваткового AGP у крові, як описано вище. Кури, що одержують корм для тварин, до складу якого входить фермент, мають істотно більш низькі рівні AGP ніж контрольні тварини. Приклад 6 0,564 1,507 Немає Корм для тварин, який тестують, що містить м'ясо-кісткове борошно, кров'яне борошно або інший субпродукт тваринного походження, складають таким чином, щоб він включав фосфатидилсеріндекарбоксилазу в концентрації 400000 МО/т корму. Корм для тварин, який тестують, вводять тест-курям, тоді як контрольні кури одержують той же корм для тварин без фосфатидилсеріндекарбоксилази. Через 21 день або 42 дня ведення даної схеми оцінюють рівні сироваткового AGP у крові, як описано вище. Кури, що одержують корм для тварин, до складу якого входить фермент, мають істотно більш низькі рівні AGP ніж контрольні тварини. Приклад 7 Корм для тварин, який тестують, що містить соєве борошно або борошно, отримане з іншої рослини, складають таким чином, щоб він включав ферменти -мананазу та/або 1,3--глюканазу, виділені з В. lentus, кожний у концентрації 400000 МО/т корму. Корм для тварин, який тестують, вводять тест-курям, тоді як контрольні кури одержують той же корм для тварин без -мананази або 1,3--глюканази. Через 21 день або 42 дня ведення даної схеми оцінюють рівні сироваткового AGP у крові, як описано вище. Кури, що одержують корм для тварин, до складу якого входить фермент, мають істотно більш низькі рівні AGP ніж контрольні тварини. Приклад 8 У даному прикладі показано, що мананаза Hemicell, додана в корм (традиційне кукурудзяносоєве харчування), знижує рівень 1 кислого глікопротеїну (AGP) у сироватці індичок, при цьому поліпшуючи також показники росту. Експеримент складається з 48 загонів по 11 індичат (вихідне розміщення). Шість груп лікування повторюють в 8 блоках, рандомізованих у блоках із шести загонів кожний: Кількість Птахів/Групу лікування Число повторів/Групу лікування Загальна кількість груп лікування Загальна кількість загонів Загальна кількість птахів 88 8 6 48 528 43 95266 Одну групу лікування, що включає ферменти, що знижують стрес, відповідно до винаходу, Групу лікування 1 (комерційний Hemicell у концентрації 100 MU/т корму), аналізують на AGP. (1 MU = 4000 МО) Група лікування 2 одержує контрольний корм без доданого ферменту. Корм перемішують, щоб забезпечити рівномірний розподіл базових кормів серед груп лікування. Всі ферменти перемішують (розбризкують), щоб забезпечити рівномірний розподіл тестферментів і забезпечити близькі умови харчування в групах лікування. Щоразу, коли готовлять лікувальний корм, зразок з верхньої частини, середини та нижньої частини кожної партії лікувального корму змішують для одержання змішаного зразку. Один зразок беруть із кожного змішаного зразка для кожного варіанту лікування та для перевірки рівня ферменту. Харчування для індичок, яким годують у даному дослідженні групи лікування 1 та 2, детально 44 описано нижче в наступних таблицях. У Таблицях показують склади компонентів, розраховані рівні живильних речовин та, нарешті, деякі вимірювані значення живильних речовин з урахуванням повернення кормів. Харчування є репрезентативним у тому плані, що його можна було б використовувати при комерційному вирощуванні індичок та, внаслідок цього, харчування кілька разів підбирають протягом 20-тижневого періоду. Композиції харчування змінюють на тижні 6, 9, 12, 15 та 18. Композиції харчування для кожного періоду небагато розрізняються для груп лікування 1 та 2. Добре відомо, що мананаза Hemicell має ефект підвищувати ефективний енергетичний вміст кормів (див. патент США 6162473). По даній причині харчування Групи лікування 1 складено з меншим вмістом калорій ніж харчування для Групи лікування 2, щоб звести до мінімуму різницю в рості між групами лікування 1 та 2 з метою даного дослідження. Композиція інгредієнтів та розраховані рівні живильних речовин, 0-9 тижнів Період Інгредієнт, % Кукурудза Соєве борошно Борошно із птаха Пташиний жир Вапно Дикальційфосфат 18,5 Сіль DL Метіонін L-Лізин-НСІ Премікс вітамінів Мікроелементи Холін СІ 60% Сульфат міді Coban 60 г/фунт (130 г/кг) BMD 50 г/фунт (110 г/кг) Hemicell Необроблений білок (%) МО (Ккал/фунт) Кальцій (%) Доступний фосфор (%) Лізин (%) Met+Cys (%) 0-6 тижнів 6-9 тижнів Група лікування 1 Група лікування 1 Група лікування 2 Група лікування 2 з Hemicell з Hemicell 46,77 45,39 53,14 51,79 37,15 37,40 29,30 29,50 9,00 9,00 9,00 9,00 1,50 2,65 3,50 4,65 1,20 1,20 1,25 1,25 2,70 2,70 2,35 2,35 0,325 0,325 0,315 0,32 0,315 0,315 0,245 0,25 0,41 0,405 0,335 0,34 0,25 0,25 0,25 0,25 0,075 0,075 0,075 0,075 0,135 0,135 0,085 0,085 0,05 0,05 0,05 0,05 0,055 0,055 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,0125 0,0 0,0125 0,0 28,00 28,00 24,5 24,5 1323 1323 1408 1407 1,484 1,484 1,462 1,462 0,797 0,797 0,764 0,763 1,794 1,793 1,502 1,501 1,179 1,177 1,018 1,021 45 95266 46 Композиція інгредієнтів та розраховані рівні живильних речовин, 9-15 тижнів Період Інгредіент, % Кукурудза Соєве борошно Борошно із птаха Пташиний жир Вапно Дикальційфосфат 18,5 Сіль DL Метіонін L-Лізин-НСІ Премікс вітамінів Мікроелементи Холін СІ 60% Сульфат міді Coban 60 г/фунт (130 г/кг) BMD 50 г/фунт (110 г/кг) Hemicell Необроблений білок (%) МО (Ккал/фунт) Кальцій (%) Доступний фосфор (%) Лізин (%) Met+Cys (%) 9-12 тижнів 12-15 тижнів Група лікування 1 Група лікування 1 Група лікування 2 Група лікування 2 з Hemicell з Hemicell 56,88 55,55 62,45 61,05 24,55 24,75 21,15 21,40 9,00 9,00 7,00 7,00 5,00 6,22 5,00 6,15 1,20 1,20 1,15 1,15 1,95 1,95 1,75 1,75 0,32 0,32 0,32 0,32 0,22 0,22 0,30 0,30 0,315 0,315 0,42 0,42 0,25 0,25 0,25 0,25 0,075 0,075 0,075 0,075 0,085 0,085 0,015 0,015 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,00 0,00 0,05 0,05 0,05 0,05 0,0125 0,0 0,0125 0,0 22,5 22,5 20,0 20,0 1469 1469 1490 1490 1,35 1,35 1Д9 1,19 0,681 0,681 0,59 0,59 1,350 1,350 1,298 1,298 0,940 0,940 0,95 0,95 Композиція інгредієнтів та розраховані рівні живильних речовин, 15-20 тижнів Період Інгредієнт, % Кукурудза Соєве борошно Борошно із птаха Пташиний жир Вапно Дикальційфосфат 18,5 Сіль DL Метіонін L-Лізин-НСІ Премікс вітамінів Мікроелементи Холін СІ 60% Сульфат міді Coban 60 г/фунт (130 г/кг) BMD 50 г/фунт (110 г/кг) Hemicell Необроблений білок (%) МО (Ккал/фунт) Кальцій (%) Доступний фосфор(%) Лізин (%) Met+Cys (%) 15-18 тижнів 18-20 тижнів Група лікування 1 Група лікування 1 Група лікування 2 Група лікування 2 з Hemicell з Hemicell 67,25 65,85 70,60 69,15 17,90 18,15 15,60 15,85 5,00 5,00 4,00 4,00 6,00 7,15 6,50 7,70 1,00 1,00 0,85 0,85 1,50 1,50 1,23 1,23 0,33 0,33 0,34 0,34 0,205 0,205 0,193 0,193 0,340 0,340 0,235 0,235 0,25 0,25 0,25 0,25 0,075 0,075 0,075 0,075 0,02 0,02 0,02 0,02 0,05 0,05 0,05 0,05 0,00 0,00 0,00 0,00 0,05 0,05 0,05 0,05 0,0125 0,0 0,0125 0,0 17,5 17,5 16,0 16,0 1539 1539 1570 1570 0,982 0,982 0,82 0,82 0,490 0,490 0,41 0,41 1,10 1,10 0,93 0,93 0,791 0,791 0,74 0,74 47 95266 48 Аналіз харчування з поверненням кормів, 0-12 тижнів Живильна речовина Білок Жир Кальцій Загальний фосфор Hemicell одиниць Білок Жир Кальцій Загальний фосфор Hemicell одиниць Білок Жир Кальцій Загальний фосфор Hemicell одиниць Білок Жир Кальцій Загальний фосфор Hemicell одиниць Група лікування 1 з Hemicell Розраховане Отримане при аналізі 0-3 тижня 28 27,46 4,2 4,03 1,48 1,38 1,02 0,96 100 70,1 3-6 тижнів 28 25,90 4,2 4,01 1,48 1,63 1,02 1,15 100 99,3 6-9 тижнів 24,5 23,42 6,3 6,33 1,46 1,69 0,96 1,09 100 138,6 9-12 тижнів 22,5 22,61 7,9/8,0 7,91 1,35 1,37 0,86 0,93 100 83,9 Група лікування 2 Розраховане Отримане при аналізі 28 5,3 1,48 1,02 0 27,57 4,99 1,45 1,08 8,9 28 5,3 1,48 1,02 0 27,17 5,16 1,52 1,12 8,9 24,5 7,4 1,46 0,96 0 24,17 7,00 1,65 1,06 14,4 22,5 9,0 1,35 0,86 0 23,61 9,02 1,32 0,90 12,0 Аналіз харчування з поверненням кормів, 12-80 тижнів Живильна речовина Білок Жир Кальцій Загальний фосфор Hemicell одиниць Білок Жир Кальцій Загальний фосфор Hemicell одиниць Білок Жир Кальцій Загальний фосфор Hemicell одиниць Група лікування 1 з Hemicell Розраховане Отримане при аналізі 12-15 тижнів 20 20,49 7,79 8,25 1,19 1,16 0,76 0,78 100 90,5 15-18 тижнів 17,5 17,20 8,68 8,00 0,98 0,96 0,65 0,68 100 98,6 18-20 тижнів 16,0 15,95 9,14 8,93 0,82 0,79 0,57 0,61 100 113,4 Вимірювання глікопротеїну: Кров одержують наприкінці випробування від чотирьох птахів/загін, вибраних випадковим чином із груп лікування 1, 2 та 5. Кров збирають у пробірки, що містять агент проти згортання ЕДТА (етилендіамінтетраоцтову кислоту), змішують, потім центрифугують для осадження цілих клітин. Планшети для тестування AGP індичок одержують в Cardiotech Services (Louisville, KY). Тест Група лікування 2 Розраховане Отримане при аналізі 20 8,89 1,19 0 0 21,09 9,03 1,09 0,77 13,6 17,5 9,78 0,98 0,65 0 16,24 9,21 0,94 0,70 5,6 16,0 19,29 0,82 0,57 0 15,14 10,39 0,87 0,65 13,6 на AGP являє собою тест на основі імунодифузії. Рівні об'єми тест-зразків або зразків сироватки додають у лунки планшета для імунодифузії, як рекомендує виробник, потім через два дні інкубування при кімнатній температурі вимірюють діаметр отриманих у результаті кілець імунопреципітації.Зразок стандарту очищеного AGP індички, що представлений в наборі, тестують у різних 49 95266 концентраціях, щоб накреслити стандартну криву, як показано на Фігурі 4. Поліноміальне рівняння підбору кривої, отримане зі стандартом, 50 використовують для розрахунку рівня AGP у плазмі індичок у тест-зразках. Розрахунок рівнів AGP та статистичний аналіз із використанням t-критерію Ст'юдента Hemicell мананаза (Група лікування 1) мм AGP Викиди 5,2 231,5 4,8 181,6 5 205,7 5 205,7 5 205,7 5,1 218,4 5,3 245,1 6,1 372,3 5,8 320,6 4,7 170,2 4,9 193,4 5 205,7 5,2 231,5 5,5 273,8 5,7 304,5 5,1 218,4 4,7 170,2 5 205,7 4,5 148,5 5,3 245,1 5,2 231,5 4,4 138,3 4,3 128,4 6,35 419,3 4,9 193,4 5,65 296,6 5,2 231,5 5 205,7 4,8 181,6 5,2 231,5 7,5 687,1 5 205,7 Середнє 226,4 Станд. відхилення 63,4 CV 28,0 t-критерій, значення Ρ мм 5,7 5,1 5,6 5,3 5,1 5,1 5,9 5 6,3 7,5 6,45 5,4 5,1 5,3 5,1 5,6 5,6 6,05 5,6 5,4 5 5 5,2 5,4 4,8 5 5,2 5,4 4,9 5,1 4,2 6,5 Контроль (Група лікування 2) AGP викиди 304,5 218,4 288,9 245,1 218,4 218,4 337,3 205,7 409,6 687,1 439,1 259,2 218,4 245,1 218,4 288,9 288,9 363,3 288,9 259,2 205,7 205,7 231,5 231,5 181,6 205,7 231,5 259,2 193,4 218,4 118,9 449,3 260,5 74,6 28,6 0,0284 Викиди >2 ст. відхилень від середнього відкидають Середнє AGP плазми для групи, що лікували ферментом, істотно менше, ніж для контрольної групи, яку не лікували. Для даного аналізу один викид видаляють із аналізу з кожної групи. Можна виявити птахів, які зазнають незвичайну кількість стресу внаслідок ушкодження або інфекції. Зни жений рівень AGP, що викликається годівлею ферментом, корелює зі статистично значимими поліпшеними життєвими показниками птахів, як показано нижче в Групі лікування 1 (мананаза) відносно Групи лікування 2. 51 95266 52 Результати росту День 140 Загін Маса 3 7 14 21 29 36 37 47 Середнє 200,25 193,3 143,95 164,1 185,8 161,1 182,1 182,55 Hemicell Смертність, Маса при Споживання Перетворення кількість загибелі корму корму 0 0 487,35 2,434 0 0 479,55 2,481 3 10,817 389,05 2,514 2 24,205 448,70 2,383 1 0,975 448,90 2,403 2 16,49 419,90 2,364 1 7,611 443,70 2,339 1 13,115 449,05 2,295 445,78 2,402 5 12 13 23 28 35 42 48 144,1 196,1 178,7 141,95 190,2 194,5 159,25 176,65 Середнє 2 0 1 3 0 0 2 1 13,085 0 14,65 21,912 0 0 10,814 9,05 Контроль 389,00 486,70 466,25 389,40 482,10 486,25 409,40 459,10 446,03 Птахи, що одержують корм із мананазою, мають більше середнє набирання маси на 3,7%, знижений рівень перетворення корму на 2,3% та зменшення CV (коефіцієнта варіації = відхилення по Ст'юденту/середнє значення) однаковості маси тіла. Зниження імунного стресу, як показано за допомогою знижених сироваткових рівнів AGP, корелює з деякими вимірюваннями поліпшення росту. Приклад 9 У даному прикладі 1,4--мананазу з В. lentus, 1,3--глюканазу з В. lentus та комбінацію даних двох ферментів додають у корм (прийняте кукурудзяно-соєве харчування). Кожен варіант лікування ферментом поліпшує показники росту живого птаха у 700 6-тижневих самок індички породи Nicholas, причому результати, досягнуті за допомогою комбінації неочікувано перевищують результати, досягнуті при лікуванні тільки одним з ферментів. В експерименті використовують 80 загонів по 40 самок індички. Лікування повторюють у десятьох (10) блоках з використанням восьми варіантів лікування (сім варіантів лікування ферментами та один негативний контроль), рандомізованих у кожному блоці. У групі лікування 3 використовують композицію, що містить фермент, що знижує імунний стрес, відповідно до винаходу, 1,4--мананазу в концентрації 100 MU/т корму. У групі лікування 6 також використовують композицію, що містить CV при масі на 140 день 5,766 7,426 6,857 4,411 6,092 8,352 5,944 3,405 6,032 0,05 t-критерій, від. значення Ρ Групи лік. 2 Набирання живої маси 18,147 17,512 17,934 18,172 18,521 17,839 18,150 18,195 18,059 0,01 0,05 2,475 2,482 2,411 2,376 2,535 2,500 2,407 2,472 2,457 15,950 17,766 17,810 17,684 17,231 17,622 17,635 17,605 17,413 14,518 5,288 9,717 8,012 9,331 9,722 5,054 4,772 8,302 фермент, що знижує імунний стрес, відповідно до винаходу, 1,3--глюканазу в концентрації 60 MU/т корму. У групі лікування 8 використовують комбіновану композицію, що відповідає винаходу, що включає 1,4--мананазу в концентрації 100 MU/т корму та 1,3--глюканазу в концентрації 60 MU/т корму. Група лікування 1 одержує контрольне харчування без доданого ферменту. (1 MU = 4000 МО). Корм перемішують, щоб забезпечити рівномірний розподіл базових кормів серед груп лікування. Всі ферменти перемішують (розприскують), щоб забезпечити рівномірний розподіл тест-ферментів та забезпечити близькі умови харчування в групах лікування. Щоразу, коли готовлять лікувальний корм, зразок з верхньої частини, середини та нижньої частини кожної партії лікувального корму змішують для одержання змішаного зразку. Один зразок беруть із кожного змішаного зразка для кожного варіанту лікування та для перевірки рівня ферменту. Харчування для індичок, яким годують у даному дослідженні, являє собою типові комерційні корми для індичок. Харчування є репрезентативним у тому плані, що його можна було б використовувати при комерційному вирощуванні індичок та, внаслідок цього, харчування коректують через 3 тижні. Результати росту для груп лікування 1, 3, 6 та 8 показані в таблиці нижче. 53 Варіант лікування Γp. 1 Гр. 3 Γp. 6 Γp. 8 Контроль 1,4--мананаза (100 MU/т) U--глюканаза (60 MU/т) 1,4--мананаза (100 MU/т) 1,3--глюканаза (60 MU/т) 95266 54 Параметри росту на 6 тижнів Смертність Середня жива Перетворення Маса з поправкою на 1 2 (%) маса (фунти) корму перетворення корму А А А А 1,75 5,406 1,500 1,520 А АВС АВ АВ 1,50 5,484 1,495 1,502 А C C C 1,50 5,540 1,467 1,465 3,25 А 5,718 D 1,420 D 1,389 D (1 MU = 4000 МО) Зауваження 1: Перетворення корму дане з поправкою на смертність. Зауваження 2: Масу з поправкою на перетворення корму для кожного варіанту лікування розраховують у такий спосіб: (а) Середню живу масу всього тесту віднімають із середньої живої маси, призначеної для лікування, одержуючи кількість Quantity A; (b) кількість А ділять на 6, одержуючи в результаті кількість В; (с) кількість В віднімають із перетворення корму, що дає в результаті масу з поправкою на перетворення корму, призначену для лікування. Статистичні дані представлені для LSD-тесту; Р