Остеопротегерин, його застосування для виготовлення фармацевтичної композиції та отримання харчового продукту та корму для тварин

1. Остеопротегерин, який одержують з жіночого чи коров'ячого молока або молозива і який має профіль глікозилювання, що дає початок поліпептиду з молекулярною масою приблизно 80, 130 і 200 кДа, яку вимірюють способом, що описаний у даному винаході. 2. Харчовий продукт, який містить остеопротегерин за п.1. 3. Харчовий продукт за п. 2, який вибирають із групи, що складається з молока, йогурту, сиру, кисломолочних продуктів, ферментованих продуктів на основі молока, морозива, ферментованих продуктів на основі злаків, порошків на основі молока, дитячих сумішей. 4. Корм для тварин, який містить остеопротегерин за п. 1. (13) 84832 (21) 2003109812 (22) 15.03.2002 (24) 10.12.2008 (86) PCT/EP02/02912, 15.03.2002 (31) 01 108 414.2 (32) 03.04.2001 (33) EP (46) 10.12.2008, Бюл.№ 23, 2008 р. (72) ВІДАЛ КАРІН, ВАН ДЕН БРУК ПЕТЕР, ОФФОРД КЕВІН ЕЛІЗАБЕТ, ДОННЕ-ЮГ АНН (73) СОСЬЄТЕ ДЕ ПРОДЮІ НЕСТЛЕ С.А. (56) EP A1 0816380, 07.01.1998. WO A 9723614, 03.07.1999. Kyoji Yamaguchi, Masahiko Kinosaki., Characterization of structural domains of human osteoclastogenesis inhibitory factor. J Biol Chem. 1998 Feb 27; 273(9): P.5117-5123. WO A1 0116299, 08.03.2001. WO A 0024771, 04.05.2000. EP A2 0786473, 30.07.1997. KONG YY ET AL.: "Osteoprotegerin ligand: a regulator of immune responses and bone physiology" 2 (11) 1 UA (54) ОСТЕОПРОТЕГЕРИН, ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ВИГОТОВЛЕННЯ ФАРМАЦ ЕВТИЧНОЇ КОМПОЗИЦІЇ ТА ОТРИМАННЯ ХАРЧОВОГО ПРОДУКТУ ТА КОРМУ ДЛЯ ТВАРИН C2 ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (19) ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ 3 84832 4 5. Фармацевтична композиція для профілактики або 13. Застосування остеопротегерину за п.1 для лікування розладів, пов'язаних з кістковим ремодеодержання харчового продукту для профілактики люванням, та/або імунних розладів, що містить еферозладів, зв'язаних з кістковим ремоделюванням. ктивну кількість остеопротегерину за п.1 у поєднанні 14. Застосування за п. 13, у якому розлад є остеоз фармацевтично прийнятним носієм. порозом, хворобою Педжета, остеомієлітом, інфе6. Фармацевтична композиція за п. 5, яку вибиракційними ушкодженнями кістки, що ведуть до втрають з групи, що складається з розчинів, сухої пети кісткової тканини, гіперкальціємією, роральної добавки, рідкої пероральної добавки, остеопенією, остеонекрозом, втратою кісткової сухого харчування в тубах чи рідкого харчування в тканини внаслідок остеоартриту чи ревматоїдного тубах. артриту, періодонтальною втратою кістки та/або 7. Застосування остеопротегерину за п.1 для вигоостеолітичним метастазом. товлення харчового продукту за будь-яким з пп. 2 15. Застосування за будь-яким з пп. 12, 13, у якому та 3. розлади зв'язані з передчасними родами та/або 8. Застосування остеопротегерину за п.1 для вигонизькою масою тіла при народженні. товлення корму для тварин за п. 4. 16. Застосування остеопротегерину за п.1 для 9. Застосування остеопротегерину за п.1 для вигоодержання харчового продукту для профілактики товлення фармацевтичної композиції за будьімунних розладів. яким з пп. 5 та 6. 17. Застосування за п. 16, у якому розлад є алергі10. Застосування за п. 9, у якому розлад є остеоєю, автоімунним захворюванням, запальними хвопорозом, хворобою Педжета, остеомієлітом, інферобами кишечнику, системними автоімунними стакційними ушкодженнями кістки, що ведуть до втранами, порушеннями регуляції проліферації й ти кісткової тканини, гіперкальціємією, апоптозу клітин та імунопатологічними станами остеопенією, остеонекрозом, втратою кісткової шкіри, ротової порожнини, шлунково-кишкового і тканини внаслідок остеоартриту чи ревматоїдного сечостатевого тракту чи дихальних шляхів. артриту, періодонтальною втратою кістки та/або 18. Застосування за будь-яким з пп. 16 та 17, у остеолітичним метастазом. якому розлади зв'язані з передчасними родами 11. Застосування за п. 9, у якому розлад є алергіта/або низькою масою тіла при народженні. єю, автоімунним захворюванням, запальними хво19. Застосування остеопротегерину за п.1 для робами кишечнику, системними автоімунними стаодержання харчового продукту для розвитку кістнами, порушеннями регуляції проліферації й кової речовини та/або імунної системи. апоптозу клітин та імунопатологічними станами 20. Застосування остеопротегерину за п.1 для шкіри, ротової порожнини, шлунково-кишкового і одержання фармацевтичної композиції для розвисечостатевого тракту чи дихальних шляхів. тку кісткової речовини та/або імунної системи. 12. Застосування за будь-яким з пп. 9-11, у якому розлади зв'язані з передчасними родами та/або низькою масою тіла при народженні. Даний винахід відноситься до остеопротегерину, який можна одержати з молочних джерел, зокрема, з жіночого і коров'ячого молока. Даний винахід також відноситься до його застосування для одержання препарату, що приймається усередину, та/або фармацевтичної композиції, зокрема, до застосування такого препарату/композиції для попередження чи лікування розладів, зв'язаних з метаболізмом у кістках та імунною функцією. У ссавців кістки забезпечують опору тілу і складаються з мінеральних речовин, матриксу з колагенових та неколагенових білків і клітинного компонента, їхній ріст і підтримання регулюються багатьма різними факторами, включаючи регуляцію і взаємодію клітинних типів, з яких вони складаються, тобто, хондроцитів, що утворюють хрящ, остеобластів, що синтезують і відкладають кістковий матрикс, і остеокластів, відповідальних за резорбцію кісткової речовини. Хондроцити походять від мезенхімних клітин і генерують вихідну хрящову матрицю, необхідну для ендохондрального утворення кістки. Остеобласти, що промотують утворення кісткової тканини, походять від мезенхімних преостеобластів і локалізуються на поверхні кісток, де вони синте зують, транспортують і розміщають білки матриксу. З іншого боку, остеокласти, відповідальні за резорбцію кісток, походять від попередників гранулоцитів-моноцитів, присутніх у гематопоетичному кістковому мозку. Дії остекластів та остеобластів тісно зв'язані, наприклад, під час процесу резорбції, опосередковуваної остеокластами, вироблювані білкові фактори діють як сигнальні молекули для ініціації відновлення кісток остеобластами. Остеобласти, у свою чергу, можуть впливати на функцію остеокластів через експресію розчинних чи мембраннозв'язаних регуляторів. Тому нормальне ремоделювання кісток залежить від визначеного балансу між протилежними функціями утворення кісток та резорбції кісток, здійснюваними кожним з відповідних типів клітин. Фактори росту, такі як фактор росту фібробластів (FGF) і трансформуючий фактор росту b (TGFb), зберігаються в кістковому позаклітинному матриксі ι при секреції стимулюють локальне вивільнення кісткових клітин-попередників. Потім фактори, такі як кісткові морфогенні білки (BMP) і паратиреоїдний гормон (PTH), впливають на розвиток зазначених попередників у клітини, що формують кістки - остеобласти, кінцеві дифференціа 5 84832 6 ція та функція яких регулюються взаємодією клізавдяки якому речовина діє в організмі індивідуутини з білками кісткового матриксу. ма у специфічній тканині-мішені. Під час старіння індивідуум зазнає поступової Відповідно, вищевказана проблема вирішуєтьвтрати кісткової маси - явище, називане роз'єдся за допомогою остеопротегерину, який можна нанням, яке вважають результатом активності одержати з молока. остеокластів, що перевершує таку остеобластів. У Фіг.1 зображує концентрацію остеопротегеривипадках, коли таке роз'єднання зберігається прону в жіночому гр удному молоці під час різних статягом тривалого часу, усе більше та більше кісткодій годування груддю. вої речовини руйнується/розсмоктується, і резульФіг.2 зображує результати аналізу методом татом є стан, називаний остеопорозом. вестерн-блотингу фракцій жіночого молока у відКрім явища, що залежить від віку, втрата кістновних умовах з використанням 10% гелю з домікової тканини також може бути викликана кальцієшкою додецилсульфату натрію (SDS). Смуги OPG вим чи гормональним дефіцитом або станами, виявляють з використанням біотинільованих антирезультатом яких є різні захворювання, такі як OPG поліклональних антитіл BAF805 від R&D остеопороз, гіперкальціємія, хвороба Педжета, Systems і кон'югата стрептавідин-лужна фосфатавтрата кісткової тканини внаслідок остеоартриту, за (SAPP). ревматоїдного артриту чи остеомієліту і т.п. ЗмеФіг.3 зображує рестрикційну карту плазміди, ншена густина кісток, як правило, приводить до інтегрованої до геномної ДНК трансформантів зниженої механічної міцності і підвищеної імовірYarrowia. ності переломів. Фіг.4 зображує результати аналізу методом Сучасні підходи до лікування остеопорозу 3Т-ПЛР (RT-PCR) клітин жіночого грудного молока та/або споріднених порушень у кістках включають та епітеліальних клітин молочної залози людини застосування кальцію, який вводиться пацієнтам, MCF-7; доріжки 1 і 2: b-актин (смуга очікуваного що потребують цього. Останнім часом засоби, що розміру 460п.о.); доріжки 3 і 4: OPG (смуга очікувазалучаються до стимуляції та/або інгібування кістного розміру 603п.о.). 1. Клітини жіночого грудного кових клітин, такі як гормони, кальцитонін, інсулімолока; 2. MCF-7, 3. Клітини жіночого грудного ноподібний фактор росту чи остеопротегерин молока; 4. MCF-7. (OPG), також розглядаються як такі, що можуть Фіг.5 зображує результати експерименту, у застосовуватися при лікуванні вищевказаних хвоякому OPG за даним винаходом інгібує апоптоз робливих станів. Зазначені засоби, як правило, клітин Jurcat, індукований TRAIL. одержують рекомбінантними способами, і їх слід Остеопротегерин (OPG), також відомий як фавводити до складу/го тувати у формі галенових ктор, що пригнічує остеокластогенез (OCIF), і подіпрепаратів, для того, щоб відповідна речовина бна до TNF-рецептора молекула 1 (TR1), є описамогла досягти мішені-кістки в активній формі. ним недавно членом сімейства рецепторів У [WO 00/24771] описуються нуклеїнові кислофактора некрозу пухлини (TNFR). Він пригнічує ти, що кодують остеопротегериноподібні білки, та розвиток остеокластів як in vitro, так і in vi vo, і підїхнє застосування, наприклад, при лікуванні освищує густину кісток (остеопетроз). У здорових теопорозу. Поліпептид синтезують рекомбінантмишачих ембріонах OPG локалізується в хрящоними способами і потім вводять до складу так, вих рудиментах кісток, що розвиваються, а також у щоб він був сумісний з передбачуваним способом тонкому кишечнику. введення. Як такі способи пропонуються внутрішОднак, на відміну від інших членів сімейства ньовенне, інтрадермальне, підшкірне, пероральне TNF-рецепторів, OPG не має трансмембранного (наприклад, шляхом інгаляції), трансдермальне домену. Більш того, можна показати, що OPG та(місцеве), через слизову оболонку і ректальне кож є рецептором для цитотоксичного ліганду введення. TRAIL (споріднений до TNF ліганд, що викликає Взагалі, пошук придатної галенової форми для апоптоз) і є ідентичним рецептору-1, що походить даної речовини є трудомістким і громіздким, тому з фолікулярних дендритних клітин. Як такий, він, що інгредієнти, використовувані з цією метою, пояк передбачається, регулює загибель клітин, а винні бути сумісними з активною речовиною, а також відіграє важливу роль в утворенні лімфоїдтакож повинні забезпечувати достатній захист від них тканин та регуляції імунних реакцій. Дійсно, різних умов в організмі. Однак, оскільки засоби, що показано, що у тварин, позбавлених OPG, виявстимулюють ріст кісток, синтезуються локально ляються недорозвинені лімфощні тканини. у/на кістковій тканині - таку речовину важко вводиУ дослідженнях, що привели до даного винати. Звичайно слід розробляти капсули, що допомаходу, несподівано виявилося, що крім наявності гають речовині пройти через шлунково-кишковий остеопротегерину у, наприклад, кісткових тканитракт без руйнування під впливом несприятливих нах, його також можна знайти в жіночому грудному умов навколишнього середовища, що існують у молоці. В результаті, під час годування груддю ньому. Однак, такий спосіб введення також має мати, очевидно, забезпечує немовля вказаною деякі недоліки, тому що речовина повинна пройти біологічно активною речовиною у формі, здатній печінку і транспортуватися рідинами організму, виживати в шлунково-кишковому тракті. З вказаноперш ніж вона досягне кістки. Крім того, це часто го випливає, що OPG, продукований клітинами приводить до зниженої кількості активної біологічмолочної залози, очевидно, відрізняється від OPG, ної речовини, що досягає тканини-мішені. виділеного з інших джерел, за його стабільністю Отже, метою даного винаходу є створення зата/або стійкістю до розкладу. собу введення активної речовини індивідууму, Без наміру бути зв'язаним якою-небудь теорією, у даний час вважають, що специфічний про 7 84832 8 філь глікозилювання, що надається білку в клітиОтже, харчовий продукт, описаний вище, можнах молочної залози, робить поліпептид більш на з повними підставами використовувати для стійким по відношенню до кислої рідини шлунка попередження появи чи полегшення симптомів та/або лужного навколишнього середовища, що та/або структурних змін у кістках, зв'язаних з осзнаходиться у кишечнику, так що після всмоктутеопеніею чи остеопорозом, відповідно. Слід мати вання в кишечнику і перенесення до кісткової ткана увазі, що активна речовина буде включатися в нини активний домен залишається інтактним та харчовий продукт у кількості, достатній для того, здатним виявляти свою біологічну активність. щоб викликати бажану біологічну відповідь. ОскіOPG за даним винаходом, тобто у формі, яку льки було знайдено, що OPG є сам складовою можна одержати з молочних джерел, має поліпепматеринського молока, продукти на основі молока тидну послідовність, визначену SEQ ID NO.1, і за своєю суттю є дуже придатними для доставки виявляє розміри близько 80, 130 та 200кДа, відпоречовини в організм індивідуума. відно, що відрізняється від розмірів OPG, одержуЗ іншого боку, для лікування важких випадків ваного рекомбінантнимиспособами (55кДа). остеопенії чи остеопорозу, відповідно, кращою OPG за даним винаходом можна включати в лікувальною схемою може бути фармацевтична препарат, що приймають усередину, який може композиція, що містить остеопротегерин за даним бути харчовим продуктом, таким як, наприклад, винаходом у великих кількостях, тобто в кількосмолоко, йогурт, сир, кисломолочні продукти, фертях, достатні х для припинення чи навіть реверсії ментовані продукти на основі молока, морозиво, хворобливого процесу. Такі композиції можуть ферментовані продукти на основі злаків, порошки містити OPG за даним винаходом як єдину активну на основі молока, дитячі суміші, а також корм для речовину. Перевагою є те, що не передбачається тварин. У подібний спосіб, OPG за даним винахожодного серйозного підбору складу для речовини. дом також можна включати в ентеральну чи фарТому у рамках даного винаходу розумно просто мацевтичну композицію, наприклад, обрану з групресувати таблетку, що складається з "порошку пи, що складається з розчинів, сухої пероральної OPG", при необхідності, з додаванням носіїв чи добавки, рідкої пероральної добавки, сухо го харкоригентів. Однак у випадку, коли OPG за даним чування в тубах чи рідкого харчування в туба х. винаходом слід вводити в композицію разом з інДійсно, оскільки OPG за даним винаходом є шими активними речовинами, слід враховува ти стійким, немає необхідності переводити активну природу і схильність до розкладу таких додаткових сполуку в специфічну галенову форму для захисту речовин у шлунково-кишковому тракті. OPG за її від різних та потенційно несприятливих умов, що даним винаходом, включений у дозовані лікарські існують у шлунково-кишковому тракті і рідинах форми, дасть можливість лікарю-куратору точніше організму. контролювати добову чи тижневу дозу активної Відповідно до іншого аспекту, даний винахід сполуки. також відноситься до застосування остеопротегеОстеопротегерин за даним винаходом також рину з молока для одержання препарату, що приможна використовувати для попередження появи ймається усередину, такого як харчовий продукт, та/або лікування хвороби Педжета, остеомієліту, ентеральна композиція або фармацевтична комінфекційних ушкоджень кістки, що приводять до позиція. втрати кісткової тканини, гіперкальціємії, остеонеОстеопротегерин за даним винаходом і описакрозу, втрати кісткової тканини внаслідок остеоарний вище препарат, що приймається усередину, триту чи ревматоїдного артриту, періодонтальної можна використовувати для лікування та/або провтрати кістки та/або остеолітичного метастазу. філактики розладів кісткового ремоделювання. Також виявлено, що OPG є рецептором для Найбільш звичайним кістковим розладом є осліганду, спорідненого з фактором некрозу пухлини теопенія - стан, що відноситься взагалі до будь(TRAIL), який індукує апоптоз після зв'язування з якого зменшення кісткової маси до рівнів нижче його рецепторами, що містять домен смерті. Вванормального. Такий стан може виникнути через жається, що він регулює загибель клітин, а також зниження швидкості синтезу кісток, або збільшенвідіграє важливу роль в утворенні лімфоїдних тканя швидкості деструкції кісток, або того й іншого. нин і регуляції імунних реакцій. Крім того, OPG є Найбільш звичайною формою остеопенії є пернесправжнім рецептором для RANKL (ліганд для винний остеопороз, також називаний постменопаактиватора рецептора NF-kΒ), який описують як узальним та віковим остеопорозом. Така форма продукт активованих Т-клітин. Зв'язування рецепостеопорозу є наслідком загальної втрати маси тора для RANKL на зрілих дендритних клітинах кісткової тканини з віком і, як правило, результазбільшує виживання дендритних клітин. Крім того, том підвищення швидкості резорбції кісток при входження RANKL у контакт із його рецептором нормальній швидкості утворення кісток. Іншими посилює ріст Т-клітин та функцію дендритних кліформами остеопорозу є ендокринний остеопороз тин. (гіпертиреоз, гіперпаратиреоз, синдром Кушинга та Відповідно, даний винахід відноситься до заакромегалія), спадкові та природжені форми осстосування остеопротегерину, який можна одертеопорозу (недосконалий остеогенез, гомоцистижати з жіночого та/або коров'ячого молока, для нурія, синдром Менкеса та синдром Райлі-Дея) і виробництва препарату, що приймається усереостеопороз внаслідок іммобілізації кінцівок. дину, такого як, наприклад, харчова композиція чи Зовсім недавно було визнано, що остеопороз ентеральна композиція, або для виробництва ліу популяції людей також зв'язаний з більш високарського засобу, відповідно, з метою сприяння кою частотою артеріальної кальцифікації - компонормальному розвитку імунних тканин, з метою нента багатьох атеросклеротичних ушкоджень. сприяння нормальній імунній функції і навіть для 9 84832 10 попередження та/або лікування розладів імунної можна одержати, виділяючи його із супернатанта у системи. випадку, коли поліпептид секретується, або збиРозлади імунної системи, розглянуті в даному раючи клітини і виділяючи поліпептид із самих винаході, включають алергію, автоімунні реакції, клітин. У випадку безперервного одержання красепсис, рак, запальні хвороби кишечнику, системні щим буде виділення із супернатанта. автоімунні стани, серцево-судинні захворювання Наведені далі приклади ілюструють винахід, та імунопатологічні стани шкіри, ротової порожнине обмежуючи його ни, шлунково-кишкового і сечостатевого тракту та Приклади дихальних шляхі в. Зразки жіночого молока і людської сироватки Крім того, остеопротегерин за даним винахоЗразки грудного жіночого молока (10-60мл) дом також можна використовувати для регуляції беруть у здорових матерів в період до 17 днів піспроліферації й апоптозу клітин, для стимуляції ля пологів у стерильних умовах шляхом зціджуоральної стерпності, модуляції інфекційних процевання за допомогою молоковідсмоктувача чи, іносів та бактеріальної колонізації новонародженого. ді, ручним зціджуванням. Молоко зціджують у Зокрема, у новонароджених зазначені вище розстерильні 50-мл центрифужні пробірки й оброблялади, загалом, можуть асоціюватися з передчасють протягом 2 годин після узяття. Після центриними родами та/або низькою масою тіла при нафугування (200´g, 10хв.) клітинний осад відразу ж родженні, так що у таких випадках відокремлюють і обробляють для екстрагування остеопротегерин за даним винаходом можна проPHK. Решту молока заморожують при -20°C. Зразсто вводити немовляті через продукти дитячого ки людської сироватки одержують від здорових харчування. донорів і зберігають при -20°С. Слід мати на увазі, що індивідуумом, якого ліФракціонування жіночого грудного молока кують, може бути індивідуум будь-якого віку, хоча Відокремлюють вершки від незбираного моломаленькі діти і старі є основними суб'єктами, яких ка високошвидкісним центрифугуванням Верхній приходиться розглядати через властиву їм потрешар вершків видобувають, промивають водою, і бу в екзогенному остеопротегерині. Деяким індивіводи від промивання вершків заморожують при дуумам, наприклад, новонародженим, остеопроте20°C та зберігають до використання. Розділення герин потрібний для розвитку кісткової речовини сироватки і казеїну досягають обробкою сичужним та/або імунної системи, так що в таких випадках ферментом чи хімічним підкисленням (HCI) знятоможе виявитися доречним введення сполуки го молока, що викликає згортання казеїну. Потім та/або харчового продукту та/або фармацевтичної центрифугуванням обробленого молока відокремкомпозиції за даним винаходом. люють солодку сироватку від нерозчинного сичуж Однак, слід мати на увазі, що даний винахід ного казеїну і кислу сироватку від кислотного казетакож можна застосувати до дорослих людей для їну, відповідно. Нарешті, з використанням попередження появи якого-небудь з вищевказаних ультрацентрифугування одержують розчинні морозладів Також слід мати на увазі, що крім людей, лочні білки (ультрацентрифугована сироватка) і індивідуумами, яких лікують, можуть бути тварини, нерозчинний міцелярний казеїн. Усі фракції казеїнаприклад, домашні тварини, для яких OPG за ну і сироватки заморожують при -20°C та зберігаданим винаходом включають у корм. ють до використання. OPG за даним винаходом можна одержати з Лінія клітин молочної залози людини молочного джерела, одержаного від ссавця, зокКлітинна лінія клітин молочної залози MCF-7 рема, з жіночого чи коров'ячого молока чи молози(American Type Culture Center (ATCC), Manassas, ва OPG жіночого молока має амінокислотну посліVA., НТВ-22), одержана з плеврального випоту довність з 380 ак і виявляє молекулярну масу раку молочної залози, зберігає деякі характерисблизько 80, 130 і 200кДа при порівнянні з білковитики диференційованого епітелію молочної заломи маркерами, використовуваними як еталони зи. Клітини культивують у DMEM (Amimed молекулярної маси (BioRad). Він виявляє 4 сайти Bioconcept, Allschwill, Швейцарія) з доданням 10% для N-глікозилювання і може бути присутнім у мофетальної телячої сироватки (PCS, Amimed номерній формі та димерній формі за рахунок Bioconcept) і культивують при 37°С у вологій атмоутворення зв'язку S-S через Cys 379 . сфері, що містить 5% CO2. Культуральне середоOPG за даним винаходом можна виділити з вище заміняють 2-3 рази на тиждень. По досягмолочних джерел, таких як жіноче чи коров'яче ненні конфлюентності клітини відокремлюють з молоко Однак, слід мати на увазі, що OPG за давикористанням трипсину/ЕДТА (GibcoBRL) при ним винаходом можна одержати рекомбінантними 37°С. Потім клітини готують для екстрагування способами у відповідних клітинах, що дають проPHK. філь глікозилювання, який спостерігають у "OPG з Аналіз методом вестерн-блотингу молока". Кращими клітинами для експресії є клітиЗразки молока розбавляють 1/25 відновним ни молочної залози, тому що можна очікувати, що буфером Леммлі і кип'ятять протягом 5хв. Білки такі клітини дадуть ідентичний чи по суті ідентичрозділяють методом SDS-PAGE (10%) і переноний профіль глікозилювання. сять на нітроцелюлозні мембрани (BioRad). Блоти Придатні клітини для експресії OPG за даним гібридизують з біотинільованими поліклональними винаходом можна одержати шляхом імморталізаантитілами проти людського OPG (BAF805 при ції придатним засобом, таким як вектор SV40 чи 0,2мкг/мл; R&D Systems) і комплексом стрептавіген теломерази, і трансформації експресуючим дин-лужна фосфатаза (Pierce). Імунореактивність вектором, що містить нуклеотидну послідовність, візуалізують за допомогою субстрату лужної фосяка кодує поліпептид OPG. Потрібний поліпептид фатази BCIP/NBT (Zymed Laboratories). Як етало 11 84832 12 ни молекулярної маси використовують попередньо 1,2% агарозні гелі (що містять бромід етидію) у пофарбовані білкові маркери (BioRad). Рекомбінабуфері 1´ TAE і розділяють електрофорезом при нтний людський OPG (R&D Systems), що викорис150В протягом 1 години. Продукти 3Т-ПЛР візуалітовується як позитивний контроль, наносять у кізують в УФ-світлі. Точний розмір смуг визначають лькості 25нг на доріжку. шляхом порівняння з маркерами розмірів ДНК Експресія OPG клітинами жіночого грудного (Boehringer Mannheim). молока й епітеліальними клітинами молочної заELISA-аналіз людського OPG (імуноферментлози людини ний сендвіч-аналіз) Зворотну транскрипцію з наступною ПЛР виКонцентрацію OPG, присутнього у грудному користовують для ампліфікації транскриптів OPG у молоці і різних фракціях молока, вимірюють метопопуляції клітин цільного жіночого грудного молока дом ELISA. З цією метою моноклональні антитіла від однієї матері через 18 днів після пологів і в лінії проти OPG (МАВ805, 1мкг/мл; R&D Systems, UK) епітеліальних клітин молочної залози MCF-7. Понаносять на 96-лункові планшети (Nunc) шляхом вну PHK екстрагують з клітин із використанням інкубації протягом ночі при 4°С. Потім планшети способу з Trizol (GibcoBRL). Коротко, Trizol (1мл на двічі промивають 0,05% розчином твіну-20 у PBS. 5-10´106 клітин) додають до клітинного осаду, суНеспецифічне зв'язування блокують інкубацією міш кілька разів засмоктують у піпетку і видувають планшетів з 2% розчином бичачого сироваткового та переносять до еппендорфівської пробірки. Доальбуміну (BSA) у PBS ще протягом 2 годин при дають хлороформ (0,2мл на 1мл Trizol), і пробірки кімнатній температурі. Зразки чи рекомбінантний інкубують протягом 5хв. перед центрифугуванням OPG у стандартних концентраціях (0,119при 12000хд протягом 15 хв., 4 °С. PHK осаджують 121,5нг/мл; R&D Systems) інкубують у PBS-BSA рівним об'ємом ізопропанолу і центрифугують при протягом 3 годин при кімнатній температурі. Потім планшети чотири рази промивають PBS-твіном 12000´g протягом 10хв. Осад промивають 70% перед додаванням мічених біотином поліклональетанолом і потім ресуспендують у стерильній дених антитіл проти OPG (BAF805, 0,5мкг/мл; R&D іонізованій воді. PHK зберігають при -20°C до заSystems) ще протягом однієї години . при кімнатній стосування. температурі. Після додаткових чотирьох промиЗразки PHK обробляють ДНКазою I, що не мівань додають стрептавідин-пероксидазу (SAAP, стить РНКази, для видалення забруднення геном0,5мкг/мл, Kirkegaard % Perry KPL) і витримують ної ДНК. РНК визначають кількісно за поглинанням протягом 1 години при кімнатній температурі. Попри 260нм і 280нм на спектрофотометрі при відпотім планшети промивають чотири рази, і додають відному розведенні (100-200-кратному). Концентсубстрат пероксидази TMB (KPL). Планшети нарацію PHK (у мкг/мл) обчислюють у такий спосіб: кривають та інкубують у темряві протягом п'яти (поглинання А260) ´ (фактор розведення) ´ хвилин. Ферментативну реакцію зупиняють, дода40мкг/мл. Зразок тотальної PHK, що по суті не ючи 1Н HCI. Визначають поглинання при 450нм за містить білків, повинен мати відношення А260/А280 допомогою зчитувального пристрою для ELISA 1,8-2,2. (Dynex Technologies). Межа чутливості становить PHK піддають зворотній транскрипції зворотприблизно 30пг/мл. ною транскриптазою вірусу мишачого лейкозу МоБіологічна активність OPG з жіночого молока лоні (Perkin-Elmer). Зразки PHK (0,5мкг тотальної OPG є рецептором для ліганду, спорідненого PHK), 0,5 одиниці інгібітору РНКази, 1мМ кожного фактору некрозу пухлини (TR AIL), що індукує апоdNTP, 0,5нмоль/мл специфічного 3'-праймера, птоз після зв'язування з рецепторами DR4 і DR5, 5мМ MgCI2 і 1,25 одиниці зворотної транскриптази що містять домен смерті. Розробляють біологічний інкубують у загальному об'ємі реакційної суміші аналіз, у якому OPG грудного жіночого молока 10мкл, що містить буфер для ферменту, який поможна перевірити на його здатність блокувати стачається виробником. Реакційну суміш інкубують викликуваний TRAIL апоптоз таких клітин. протягом 30хв. при 42°С, а потім нагрівають протяЗ цією метою клітини Jurkat, клон Е6-1 (ATCC), гом 5хв. при 95°С. Потім продукти зворотної культивують у середовищі RPMI 1640 у модифікатранскрипції ампліфікують з Gold-ДНКції постачальника ATCC, що містить 10% FCS полімеразою (Perkin-Elmer) у термоциклері (37°С та 5% СО2). Клітини висівають при щільності (Biolabo, Scientific Instruments, Chatel St. Denis, 5´106 клітин/лунку на 96-лункові планшети (Nunc). Швейцарія). Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) здійснюють у загальному об'ємі 50мкл із У кожну лунку додають різні концентрації розчинного рекомбінантного людського TRAIL (0-20нг/мл) використанням 10мкл продуктів зворотної трансу присутності 2мкг/мл білка-підсилювача - антитіл, рипції в буфері для ПЛР, 2мМ MgCI 2, 5мкМ кожнощо взаємодіють з розчинним рeкомбінантним го dNTP, 0,2нмоль/мл обох OPG-специфічних людським TRAIL і зa рахунок цього підвищують праймерів антисмислового ACTAGTTATAAGCAGCTTATTTTTACTG та смисйого активність (Alexis, Laufelfingen, CH). Деякі лунки також містять 50нг/мл рекомбінантного людлового GGAGGCATTCTTC AGGTTTGCTG і 1,25 ського OPG (R&D Systems), зразки жіночого грудодиниці ДНК-полімерази. Після початкової стадії ного молока (HM; кінцеве розведення 1/80; зібрані денатурації протягом 10хв. при 95°C зразки ампв 1-ий чи 9-ий день після пологів) та/або 20мкг/мл ліфікують у 35 циклах денатурації при 94°С протягом 45с, відпалу при 60°С протягом 1хв. і нарощумоноклональних антитіл проти OPG (МАВ805, R&D Systems). Планшети інкубують при 37°C провання при 72°С протягом 1хв. 30с, з наступною 7тягом 16 годин. Життєздатність клітин визначають, хв. стадією нарощування при 72°С. Усі зразки піддодаючи 3Н-тимідин (1мкКі/лунку) під час останніх дають 3Т-ПЛР, використовуючи b-актин як позити6 годин культивування. вний контроль. Зразки продуктів 3Т-ПЛР вносять в 13 84832 14 У контрольному середовищі інгібування просистеми 3Т-ПЛР TitanÔ One tube відповідна до ліферації клітин, викликане TRAIL, є очевидним протоколу, наданому виробником (Roche при концентраціях понад 5нг/мл. Однак, зразки HM Diagnostics, Rotkreuz). запобігають такому інгібуванню. Цей ефект має З OPG-специфічним антисмисловим праймемісце явно через присутність OPG, тому що монором клональні антитіла проти OPG обертають зазнаCCGGCCTCTTCGGCCGCCAAGCGAGAAACGTTT чений ефект. CCTCCAAAGTACC та смисловим праймером Результати показані на Фігурі 5. ACTAGITATAAGCAGCTTATTTTTACTG з даної Аналіз методом вестерн-блотингу кДНК ампліфікують фрагмент ПЛР у 1174п.о. ПроOPG синтезують у клітинах у виді мономера в дукт ПЛР розщеплюють Sfil-Spel, очищають у гелі, 55кДа, але при позаклітинній секреції він перетвоι одержаний фрагмент у 1156п.о. лігують з розщерюється на зв'язаний дисульфідним зв'язком дипленою Sfil-Xbal і SAP-обробленою plNA1267, мер приблизно в 100кДа. У молоці смуги детектуодержуючи pNFF270. Потім дану плазміду вводять ються в області приблизно 80, 130 і 200кДа. у дріжджі Yarrowia lipolytica шляхом трансформаКонцентрації OPG у жіночому гр удному молоці ції. Фігура 3 зображує рестрикційну карту плазміди, Вміст OPG у зразках грудного молока, взятих у яку інтегрують до геномної ДНК трансформантів 10 матерів-годувальниць в різний час у перші 17 Yarrowia і SEQ ID NO. 1-білок, що кодується такою днів лактації, перевіряють методом ELISA. Концеплазмідою OPG. нтрації досягають максимальних значень у перші Послідовність клону pGEM-T OPG показана на 1-3 дня лактації і потім знижуються. Концентрації у Фігурі 6. Зрілий OPG представлений чорним шримолоці коливаються від 50нг/мл до майже 2мкг/мл фтом і наведений у трансльованому виді В опублі(Фіг.1). кованій послідовності OPG/OCIF амінокислотний Клітинне джерело OPG молока залишок 242 зрілого OPG представлений залишАналіз методом 3Т-ПЛР показує, що OPG за ком AIa (А), у той час як всі аналізовані клони даним винаходом можна знайти в клітинах жіночоpGEM-T OPG у зазначеній позиції кодують залиго гр удного молока та епітеліальних клітинах мошок Asp (D). Sfil-Spel фрагмент OPG даного клону лочної залози. Конститутивна експресія мРНК для переносять у plNA1267, розщеплену Sfil-Xbal. OPG виражена в обох типах необроблених клітин Одержана плазміда має рестрикційну карту, зо(Фігура 4). бражену на Фігурі 3 Одиничну копію такої плазміди Клонування OPG жіночого молока у дріжджах інтегрують до геномної ДНК трансформантів Виділяють клітини з жіночого грудного молока Yarrowia. Білок, кодований такою плазмідою, пока(18 днів після пологів) центрифугуванням (200´g, заний на Фігурі 4. Зрілий OPG показаний жирним 10хв.). З клітинного осаду екстрагують тотальну шрифтом. Плазміду pNFF270 вводять у Yarrowia lipolytica шляхом трансформації. Одержані трансPHK із використанням TrizolÒ (Life Technologies, форманти секретують білок, що перехресно реагує Basel, Швейцарія), обробляють ДНКазою І і потім з OPG-специфічними антитілами, до культуральочищають на центрифужних колонках RNeasy ного середовища, у той час як трансформанти (Qiagen, Basel) згідно з рекомендаціями виробниY.lipolytica, які несуть експресійний вектор, що не ків. Продукт ПЛР, що кодує зрілу форму OPG, аммістить вставки, не секретують такий білок. пліфікують з такої тотальної PHK із використанням 15 84832 16 17 84832 18 19 84832 20 21 84832 22 23 84832 24 25 84832 26 27 84832 28 29 84832 30 31 84832 32 33 84832 34 35 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 84832 Підписне 36 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601