Імунокон’югати анти-мезотеліну, їх застосування та одержання

Реферат: Даний винахід забезпечує імунокон'югати, які складаються з антитіл, що зв'язуються з мезотеліном, які є кон'югованими з цитотоксичними агентами, наприклад, майтансином, і є корисними для лікування та/або діагностики, та/або моніторингу раку, наприклад солідних пухлин. UA 106492 C2 (12) UA 106492 C2 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід забезпечує імунокон'югати, які включають антитіло або його фрагмент, що має специфічність для білка мезотеліну, та терапевтичний агент. Композиції таких імунокон'югатів можуть використовуватися у лікуванні, запобіганні або діагностиці розладів, пов'язаних із мезотеліном, наприклад, раку. Передумови створення винаходу Виникнення раку найбільш часто асоціюється зі старінням, у відповідності із цим 65 % усіх нових випадків раку реєструється для пацієнтів у віці 65 років та більше. Рак являє собою другу головну причину смертей у Сполучених Штатах після серцевого захворювання. Так, за оцінками Американського товариства по боротьбі з раком, 1 з 4 людей буде хворіти раком у США, це дає змогу передбачити, що на сьогоднішній день показник смертності залишається статичним. Тільки у США 1437180 нових випадків та 565650 смертей від раку очікується у 2008 році. Терапія на основі антитіл була схвалена як дуже ефективна у лікуванні різноманітних видів раку, включаючи солідні пухлини. Наприклад, ГЕРЦЕПТИН® успішно використовувався для лікування раку молочної залози. Основним для розробки успішної терапії на основі антитіл є ізоляція антитіл проти білків поверхні клітин, що, як було встановлено, переважно експресуються на пухлинних клітинах. Поліпептид, що є попередником мезотеліну, являє собою глікофосфатидилінозитол(GPI)-закріплений, глікозильований білок поверхні клітин, що протеолітично розщеплюється до 30 кДа N-термінального секретованого поліпептиду та 40 кДа C-термінального поліпептиду, який переважно утворюється у зв'язаній з мембраною, GPIзакріпленій формі (Chang, K. та I. Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, (1996) 93(1):136), та який в даній заявці називається мезотеліном. Мезотелін переважно експресується деякими пухлинними клітинами, зокрема, клітинами мезотеліоми, клітинами раку підшлункової залози та клітинами карциноми яєчника, у той час, як його експресія є обмеженою у нормальній тканині, що робить його привабливою мішенню для розробки терапії пухлин (Argani, P. та ін., Clin. Cancer Res. (2001) 7(12): 3862; Hassan, R., та ін., Clin. Cancer Res. (2004) 10 (12 Pt 1):3937). Функція мезотеліну є невідомою та чітко невідтворюваною, гематологічні або анатомічні патології спостерігали у мишей, дефектних за експресією гена мезотеліну (Bera, T.K. та I. Pastan, Mol. Cell. Biol. (2000) 20(8):2902). Націлювальна терапія, що базується на антитілах проти експресуючих мезотелін ракових клітин, була запропонована для лікування раку легень, яєчника та підшлункової залози. Mab K1 було першим антитілом до зв'язаного з мембраною поліпептиду мезотеліну, яке було описане (Chang, K., та ін., Int. J. Рак, (1992) 50(3):373). Mab K1 одержували шляхом імунізації мишей. Завдяки низькій афінності та зниженим швидкостям інтерналізації антитіла, імунотоксин, що складається з Mab K1, зв'язаного з хімічно модифікованою вкороченою формою екзотоксину A Pseudomonas, не розглядався як прийнятний для клінічної розробки (Hassan, R., та ін., J. Immunother. (2000) 23(4):473; Hassan, R., та ін., Clin.Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1): 3937). Пізніше були розроблені одноланцюгові антитіла з більш високими афінностями, включаючи SS1-(dsFv)-PE38, яке продемонструвало активність знищення пухлинних клітин in vitro (Hassan, R., та ін., Clin. Cancer Res. (2002) 8(11): 3520), а також ефективність у мишачій моделі людських пухлин, що експресують мезотелін (Fan, D., та ін., Mol. Cancer Ther. (2002) 1(8): 595). Ці дані підтвердили, що мезотелін являє собою привабливу модель для розробки iмунотерапії для лікування багатьох форм раку. SS1-(dsFv)-PE38 був продемонстрований як такий, що має швидке виведення з крові, були також описані спроби підвищити його молекулярну масу шляхом пегилювання гібридного білка (Filpula, D., та ін., Bioconjugate Chem. (2007) 18(3): 773). MS-1, MS-2 та MS-3 являють собою антитіла, що зв'язують мезотелін, які виявляють імунну ефекторну активність на поверхні клітин завдяки своєму людському IgG1 ізотипу та інтерналізуються у клітинах, що експресують мезотелін (WO 2006/099141 A2). Одне з цих антитіл, некон'юговане, химерне (миша/людина) IgG1 анти-мезотелін антитіло MORAb 009 на сьогоднішній день досліджується у клінічних експериментах на терапевтичні ефекти при лікуванні раку підшлункової залози. Постульований механізм дії MORAb 009 полягає у запуску імунних ефекторних функцій, таких як ADCC та функції блокування. Нові терапевтичні способи лікування з поліпшеною ефективністю щодо боротьби з агресивними видами раку, такими, як рак яєчника, підшлункової залози та легень, є дуже бажаними та будуть представляти прогрес у галузі техніки. Як такий даний винахід розкриває нові імунокон'югатні композиції, що є корисними у лікуванні, запобіганні та/або діагностиці розладів, пов'язаних із мезотеліном, наприклад, раку. Короткий виклад суті винаходу Даний винахід відноситься до імунокон'югатів, що включають антитіла, наприклад, моноклональні антитіла, або їх фрагменти, що зв'язуються з мезотеліном, які є кон'югованими з цитотоксичними агентами, наприклад, майтансиноїдами або їх похідними, та/або сумісно 1 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вводяться або рецептуються з одним або більше додатковими протираковими агентами. Імунокон'югати згідно з винаходом можуть використовуватися для лікування та/або діагностики та/або моніторингу розладів, пов'язаних із мезотеліном, наприклад, раку. Об'єктом даного винаходу є забезпечення імунокон'югатів, що включають антитіла або антигензв'язувальні фрагменти антитіл, або їх варіанти, що є високо селективними для Cтермінальної позаклітинної частини поліпептиду 40 кДа, що є попередником мезотеліну, та зв'язують мезотелін у присутності ракового антигену 125 (CA125; MUC16), та ефекторний залишок. Особливі властивості мезотелінових антитіл були описані у PCT/EP2008/009756, в одному аспекті винаходу поєднання їх особливої здатності до специфічної імунологічної реакції з мезотеліном у присутності CA125 у комбінації з цитотоксичним агентом, наприклад, майтансиноїдом, шляхом кон'югації забезпечує поліпшену ефективність у порівнянні із функцією блокуючого антитіла, яке конкурує з CA125 за зв'язування з мезотеліном. В одному аспекті антитіла або їх фрагменти згідно з винаходом являють собою IgG антитіла або фрагменти IgG. Антитіла або фрагменти можуть також являти собою IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgD, IgE, IgA або IgM антитіла, Fab фрагменти, F(ab')2 фрагменти, scFv фрагменти, Fv фрагменти, діатіла, лінійні антитіла, одноланцюгові антитіла, біспецифічні антитіла, мультиспецифічні антитіла або химерні антитіла (наприклад, включаючи каркас людського антитіла, прищеплений на зв'язувальну ділянку людського або не-людського антитіла, або каркас не-людського антитіла, прищеплений на зв'язувальну ділянку людського або нелюдського антитіла). Химерні антитіла можуть включати, наприклад, каркасні ділянки антитіла з не-людських джерел, таких як, наприклад, корова, миша, лама, верблюд або кролик. Додаткова інформація щодо конструювання антитіл може бути знайдена у літературі, наприклад, Holliger та Hudson, Nature Biotechnology, (Sep, 2005) 23: 1126-1136, що є введеним у дану заявку як посилання. Згадані вище фрагменти можуть бути одержані з імуноглобуліну або синтезовані, наприклад, за допомогою рекомбінантної експресії у формі фрагмента. Антитіла або фрагменти антитіл згідно з винаходом можуть також бути гуманізовані, де CDR послідовності або ділянки (наприклад, CDR1, CDR2, CDR3) можуть бути не-людськими, наприклад, мишачими. Антитіла або фрагменти антитіл згідно з винаходом, або композиції, що включають антитіла або фрагменти, можуть включати цитотоксичний агент, що є кон'югованим з антитілом або його фрагментом. В одному аспекті цитотоксичний агент являє собою майтансиноїд або його похідну, проте також забезпечуються інші цитотоксичні агенти, які можуть включати, наприклад, інші цитотоксичні агенти, наприклад, аплідин, ауристатин, aзарибін, анастрозол, азацитидин, блеоміцин, бортезоміб, бріостатин-1, бусульфан, каліхіміцин, камптотецин, 10гідроксикамптотецин, кармустин, целебрекс, хлорамбуцил, цисплатин, iринотекан (CPT-I 1), SN38, карбоплатин, кладрибін, циклофосфамід, цитарабін, дакарбазин, доцетаксел, дактиноміцин, дауноміцин глюкуронід, даунорубіцин, дексаметазон, діетилстибестрол, доксорубіцин, доксорубіцин глюкуронід, епірубіцин глюкуронід, етиніл естрадіол, естрамустин, етопозид, етопозид глюкуронід, етопозид фосфат, флоксуридин (FUdR), 3',5'-O-діолеїл-FudR (FUdR-dO), флударабін, флутамід, фторурацил, флуоксиместерон, гемцитабін, гідроксипрогестерон капроат, гідроксисечовину, ідарубіцин, іфосфамід, L-аспарагіназу, лейковорин, ломустин, мехлоретамін, медропрогестерон ацетат, мегестрол ацетат, мелфалан, меркаптопурин, 6меркаптопурин, метотрексат, мітоксантрон, мітраміцин, мітоміцин, мітотан, фенілбутират, преднізон, прокарбазин, паклітаксел, пентостатин, PSI-341, семустин, стрептозоцин, тамоксифен, таксани, таксол, тестостерон пропіонат, талідомід, тіогуанін, тіотепа, теніпозид, топотекан, урамустин, велкад, вінбластин, вінорелбін, вінкристин, рицин, абрин, рибонуклеазу, oнконазу, rapLRl, ДНКазу I, стафілококовий ентеротоксин-A, антивірусний білок фітолакки, гелонін, дифтерійний токсин або їх комбінацію. Будь-який із цитотоксичних агентів може також включати їх функціональні аналоги або їх похідні. В іншому аспекті даний винахід забезпечує імунокон'югати, в яких цитотоксичний агент є неімуногенним, тобто не підвищує імуногенності вихідного антитіла за рахунок внесення епітопів B-клітин людини або ссавців або епітопів Т-клітин у лікарську композицію. Композиції згідно з винаходом можуть включати на доповнення до антитіл та фрагментів (з або без згаданих вище кон'югованих цитотоксичних агентів) різноманітні протиракові агенти, які можуть включати, наприклад, блеоміцин, доцетаксел (Таксотер), доксорубіцин, едатрексат, ерлотиніб (Taрцева), етопозид, фінастерид (Проскар), флутамід (Eулексин), гемцитабін (Гемзар), генітиніб (Lrresa), гозерелін ацетат (Золадекс), гранісетрон (Kітрил), іматиніб (Глівек), іринотекан (Кампто/Камптосар), ондасетрон (Зофран), паклітаксел (Taксол), пегаспаргазу (Oнкаспар), пілокарпін гідрохлорид (Салаген), порфімер натрію (Фотофрин), інтерлейкін-2 (Пролейкін), ритуксимаб (Ритуксан), топотекан (Хікамтин), трастузумаб (Герцептин), Tріапін, 2 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вінкристин та вінорелбін тартрат (Навелбін), або терапевтичні антитіла або їх фрагменти, або анти-aнгіогенний aгент, такий, як, наприклад, ангіостатин, бевацизумаб (Aвастин®), сорафеніб (Нексавар®), бакулостатин, канстатин, маспін, анти-VEGF антитіла або пептиди, антитіла або пептиди до плацентарного фактора росту, анти-Flk-1 антитіла, анти-Fit-1 антитіла або пептиди, ламінінові пептиди, пептиди фібронектину, інгібітори активатора плазміногену, інгібітори тканинної металопротеїнази, інтерферони, інтерлейкін 12, IP-IO, Gro-β, тромбоспондин, 2метоксіестрадіол, споріднений з проліферином білок, карбоксиімідотриазол, CMlOl, марімастат, пентозан полісульфат, ангіпоетин 2, інтерферон-aльфа, гербіміцин A, PNU145156E, 16K фрагмент пролактину, ліномід, талідомід, пентоксифілін, геністеїн, TNP-470, eндостатин, паклітаксел, акутин, цидофовір, вінкристин, блеоміцин, AGM-1470, фактор тромбоцитів 4 або міноциклін. Даний винахід додатково забезпечує в іншому аспекті спосіб лікування пов'язаного з мезотеліном розладу за допомогою введення терапевтично ефективної кількості імунокон'югатів згідно з винаходом або композиції згідно з винаходом, яка включає імунокон'югати згідно з винаходом. Пов'язаний з мезотеліном розлад може включати, наприклад, рак, такий як рак солідних пухлин. Солідні пухлини можуть знаходитися у або походити від яєчника, підшлункової залози, респіраторного тракту, легень, кишечнику, шлунка, стравоходу, шийки матки, печінки, молочної залози, голови та шиї. Ці та інші втілення розкриваються або є очевидними та охоплюються наступним детальним описом винаходу. Опис фігур Фігура 1 показує протипухлинну ефективність анти-мезотелінового імунокон'югату MF-TSPDB-DM4 стосовно мезотелін-трансфікованих клітин карциноми підшлункової залози людини у мезотелін-трансфікованій ксенографтній моделі (A), а також у нетрансфікованих контрольних пухлинах (B). Фігура 2 показує протипухлинну ефективність анти-мезотелінових імунокон'югатів із стабільними та здатними до розщеплення, а також полярними та неполярними, лінкерами у HeLaMATU ксенографтній моделі з клітинами карциноми, що експресують мезотелін eндогенно. Фігура 3 показує протипухлинну ефективність анти-мезотелінових імунокон'югатів із стабільними та здатними до розщеплення, а також полярними та неполярними, лінкерами у мезотелін-трансфікованій ксенографтній моделі (A), а також у нетрансфікованих контрольних пухлинах (B). Фігура 4 показує приклад кривої залежності ефекту від дози токсичності MF-T-SPDP-DM4 на позитивних за мезотеліном клітинах HelaMatu. Детальний опис винаходу Даний винахід базується на відкритті нових імунокон'югатів, які є специфічними до або мають високу специфічність для мезотеліну та можуть забезпечувати терапевтичні переваги для суб'єкта. Імунокон'югати згідно з винаходом можуть використовуватися у багатьох контекстах, які більш докладно описуються в даній заявці. При цьому є зрозумілим, що даний винахід, як описується в даній заявці, не є обмежений конкретними деталями, представленими в даній заявці стосовно будь-якого аспекту згідно з винаходом, включаючи, анти-мезотелінові антитіла, імунокон'югати, способи лікування, прописи, лінії клітин, види або роди тварин, конструкції та описані реагенти, оскільки вказані можуть варіювати. Також є зрозумілим, що термінологія, яка використовується в даній заявці, є призначеною тільки для цілей опису конкретних втілень та не є призначеною для обмеження об'єму згідно з даним винаходом. Визначення Якщо не вказано інше, то усі технічні та наукові терміни, що використовуються в даній заявці, мають традиційне значення, зрозуміле для середнього спеціаліста в області техніки, до якої відноситься даний винахід. Проте наступні посилання можуть забезпечувати спеціаліста в області техніки, до якої відноситься винахід, загальним визначенням багатьох термінів, що використовуються у даному винаході, та можуть давати посилання та використовуватися до тих пір, поки такі визначення є послідовними зі значеннями, як традиційно розуміють у галузі техніки. Такі посилання включають, але без обмеження, Singleton та ін., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2-е вид., 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ред., 1988); Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991); та Lackie та ін., The Dictionary of Cell & Molecular Biology (3-є вид., 1999); та Cellular and Molecular Immunology, Ред. Abbas, Lichtman та Pober, 2-е вид., W.B. Saunders Company. Будь-які технічні джерела, що є доступними середньому спеціалістові в даній галузі техніки та забезпечують визначення термінів, що використовуються в даній заявці, які мають традиційні значення, як їх розуміють у галузі техніки, можуть братися до уваги. Для цілей даного винаходу наступні 3 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 терміни додатково визначаються. Додаткові терміни визначаються у будь-якому місці даного опису. Як використовується в даній заявці та у прикладених пунктах формули, форми "будьякий", "та" і "цей" включають множинне посилання, якщо контекст чітко не визначає інше. Таким чином, наприклад, посилання на "будь-який ген" є посиланням на один або більше генів та включає їх еквіваленти, які є відомими спеціалістові у даній галузі техніки і т.д. Як використовується в даній заявці, термін "антитіло" включає молекули імуноглобуліну (наприклад, будь-якого типу, включаючи IgG, IgE, IgM, IgD, IgA та IgY, та/або будь-який клас, включаючи IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl та Ig A2), ізольовані з природного середовища або одержані рекомбінантними способами. Антитіла також розуміють для охоплення антигензв'язувальних фрагментів антитіла, таких як Fab, F(ab')2, scFv (одноланцюговий Fvs), Fv, одноланцюгові антитіла, діатіла, зв'язані дисульфідним містком Fvs (sdFv) та фрагменти, що включають VL або VH домен, які одержують з інтактних імуноглобулінів або готують за допомогою рекомбінантних способів. Антитіла та/або антигензв'язувальні фрагменти антитіл даного винаходу можуть бути моноспецифічними (наприклад, моноклональними), біспецифічними, триспецифічними або мати більш високу мультиспецифічність. Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічними для різних епітопів антигену або можуть бути специфічними для епітопів більше ніж одного антигену. Див., наприклад, PCT публікації WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, та ін., 1991, J. Immunol. 147:60 69; патенти США №№ 4,474,893; 4,714,681; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,819; Kostelny та ін., 1992, J. ImmunoL 148:1547 1553, кожний з яких є введеним у дану заявку як посилання. Антигензв'язувальні фрагменти антитіла можуть включати варіабельну(і) ділянку(и) самостійно або у комбінації з цільними або частиною наступних компонентів: шарнірна ділянка, CH1, CH2, CH3 та CL домени. У винахід також є включеними антигензв'язувальні фрагменти антитіла, які також включають будь-яку комбінацію варіабельної(их) ділянки(ділянок) з шарнірною ділянкою, CH1, CH2, CH3 та CL домени. Переважно, антитіла або антигензв'язувальні фрагменти антитіл є людськими, гуманізованими, мишачими (наприклад, миші та пацюка), віслюків, овечими, кролячими козячими, морських свинок, верблюда, коня або курки. Як використовується в даній заявці, "людські" антитіла включають антитіла, що мають амінокислотну послідовність людського імуноглобуліну та включають антитіла, ізольовані з бібліотек людського імуноглобуліну, з людських B-клітин або з тварин, трансгенних за одним або більше людських імуноглобулінів, як описано вище та, наприклад, у патенті США № 5,939,598, що відноситься до Kucherlapati та ін. Термін "антитіло" також охоплює інші білкові каркаси, що є здатними орієнтувати інсерти CDR антитіла у такій самій активній зв'язувальній конформації, що є виявленою у природних антитіл, так, що зв'язування цільового антигену, яке спостерігається з цими химерними білками, підтримується стосовно зв'язувальної активності природного антитіла, з якого одержані ці CDR. Як використовується в даній заявці, термін "гуманізовані" форми не-людських (наприклад, мишачих) антитіл являють собою химерні антитіла, що містять мінімальну послідовність, яка одержана з не-людського імуноглобуліну. У більшості випадків гуманізовані антитіла являють собою людські імуноглобуліни (реципієнтне антитіло), в яких залишки гіперваріабельної ділянки (наприклад, ділянки, що визначають комплементарність "CDR") реципієнта замінюються залишками гіперваріабельної ділянки (CDR) з видів, відмінних від людини (донорне антитіло), таких як миша, пацюк, кролик або примат, відмінний від людини, що має бажану специфічність, афінність та ємність. У деяких випадках залишки каркасної ділянки (FR) людського імуноглобуліну можуть бути замінені відповідними не-людськими залишками. Крім того, гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не виявляються у реципієнтного антитіла або у донорного антитіла. Такі модифікації здійснюються до подальшого поліпшення поведінки антитіла. В загальному випадку гуманізовані антитіла можуть включати суттєво всі або принаймні один, або типово два варіабельні домени, в яких усі або суттєво усі гіперваріабельні ділянки відповідають таким не-людського імуноглобуліну, та всі або суттєво всі FR є такими, що мають послідовність людського імуноглобуліну. Гуманізоване антитіло необов'язково також може включати принаймні частину константної ділянки імуноглобуліну (Fc), типово, таку людського імуноглобуліну. Для огляду, див. Jones, та ін., (Nature 321:522-525, 1986); Reichmann, та ін., (Nature 332:323-329, 1988); та Presta, (Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992). Опис одержання гуманізованих антитіл може бути знайдений у патентах США №№ 7,049,135, 6,828,422, 6,753,136, 6,706,484, 6,696,248, 6,692,935, 6,667,150, 6,653,068, 6,300,064, 6,294,353 та 5,514,548, кожний з яких є введеним в дану заявку у своїй цілісності. Як використовується в даній заявці, термін "одноланцюгові Fv" або "sFv" фрагменти антитіл включає VH та VL домени антитіла, де ці домени є присутніми в одному поліпептидному 4 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ланцюзі. В загальному випадку Fv поліпептид додатково включає поліпептидний лінкер між VH та VL доменами, що дозволяє sFv формувати бажану структуру для зв'язування антигену. Для огляду, див. Pluckthun (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies. том 113, Rosenburg та Moore, ред. Springer-Verlag, New York, стор. 269-315, 1994), що є введеним в дану заявку як посилання у своїй цілісності. Термін "діатіла" відноситься до малих фрагментів антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, при цьому ці фрагменти включають варіабельний домен важкого ланцюга (VH), сполучений з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) у тому самому поліпептидному ланцюзі (VH-VL). При використанні лінкера, який є настільки коротким, що дозволяє здійснювати спарювання між двома доменами на тому самому ланцюзі, домени змушують спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга та створюють два антигензв'язувальні сайти. Діатіла є описаними більш повно, наприклад, у EP 404,097; WO 93/11161; та Hollinger, та ін., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993), кожний з яких є введеним в дану заявку як посилання. Експресія "лінійних антитіл" відноситься до антитіл, описаних у галузі техніки, наприклад, у Zapata, та ін., (Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995), що є введеним в дану заявку як посилання. Стисло, такі антитіла включають пару тандемних Fd сегментів (VH-CHI-VH-CHI) що утворюють пару антигензв'язувальних ділянок. Лінійні антитіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними. Термін "моноклональне антитіло", як використовується в даній заявці, відноситься до антитіла, одержаного з популяції суттєво гомогенних антитіл, тобто, 10 індивідуальних антитіл, що складають ідентичну популяцію, за винятком можливих існуючих у природі мутацій, що можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Моноклональні антитіла є високо специфічними, тобто, є направленими проти одного антигенного сайту. Крім того, на противагу до препаратів традиційного (поліклонального) антитіла, які типово включають різні антитіла, направлені проти відмінних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло є направленим проти однієї детермінанти на антигені. Визначення "моноклональний" вказує на характер антитіла як такого, що є одержаним з суттєво гомогенної популяції антитіл, та не повинно трактуватися як таке, що вимагає продукції антитіла за допомогою будь-якого особливого способу. Наприклад, моноклональні антитіла, що використовуються у відповідності з даним винаходом, можуть бути одержані за допомогою гібридомного способу, який вперше був описаний Kohler, та ін., (Nature 256:495, 1975), або можуть бути одержані за допомогою методів рекомбінантної ДНК (див., наприклад, патент США № 4,816,567). Моноклональні антитіла можуть бути також ізольовані з фагових бібліотек антитіла при використанні методик, описаних, наприклад, у Clackson, та ін., (Nature 352:624-628,1991) та Marks, та ін., (J. MoI. Biol. 222:581-597, 1991). Моноклональні антитіла в даній заявці також включають "химерні" антитіла, в яких частина важкого та/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною відповідній послідовності в антитілі, що походить від певних видів або належить до певного класу або підкласу антитіл, у той час, як інший(і) ланцюг(и) є ідентичними(и) або гомологічним відповідній послідовності в антитілі, що походить від інших видів або належить до іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, до тих пір, поки вони демонструють бажану біологічну активність (див., наприклад, патент США № 4,816,567; та Morrison, та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984, кожний з яких є введеним в дану заявку як посилання). Як використовується в даній заявці, терміни "біологічний зразок" або "зразок пацієнта", як використовується в даній заявці, відносяться до зразка, одержаного з організму або з компонентів (наприклад, клітин) організму. Зразок може являти собою будь-яку біологічну тканину або рідину. Зразок може бути "клінічним зразком", який є зразком, що є одержаним від пацієнта. Такі зразки включають, але без обмеження, мокротиння, кров, сироватку, плазму, клітини крові (наприклад, лейкоцити), зразки тканини, зразки біопсії, сечу, перитонеальну рідину та плевральну рідину, слину, сперму, ексудат молочної залози, цереброспінальну рідину, сльози, слизовий секрет, лімфу, цитозолі, асцитну рідину, амніотичну рідину, промивну рідину сечового міхура та бронхоальвеолярні змиви або клітини, одержані з них, серед інших зразків рідини організму. Зразок пацієнта може бути свіжим або замороженим та може бути обробленим гепарином, цитратом або ЕДТА. Біологічні зразки можуть також включати зрізи тканин, такі як заморожені зрізи, узяті для гістологічних цілей. Термін "рак" включає, але без обмеження, солідні пухлини, такі як різні види раку підшлункової залози, молочної залози, респіраторного тракту, мозку, репродуктивних органів, травного тракту, сечового тракту, очей, печінки, шкіри, голови та шиї, щитовидної залози, паращитовидної залози та їх віддалені метастази. Термін також включає саркоми, лімфоми, лейкемії та мієломи плазматичних клітин. 5 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пухлини респіраторного тракту включають, але без обмеження, дрібноклітинну та недрібноклітинну карциному легень, а також бронхіальну аденому та плевро-легеневу бластому. Пухлини молочної залози включають, але без обмеження, інвазивну дуктальну карциному, інвазивну лобулярну карциному, дуктальну карциному in situ та лобулярну карциному in situ. Пухлини мозку включають, але без обмеження, гліому стовбура мозку та гіпоталамуса, церебелярну та церебральну астроцитому, медулобластому, eпендимому, а також нейроектодермальні та пініальні пухлини. Пухлини чоловічих репродуктивних органів включають, але без обмеження, рак простати та яєчок. Пухлини жіночих репродуктивних органів включають, але без обмеження, рак ендометрію, шийки матки, яєчників, вагіни та вульви, а також саркому сечового міхура. Пухлини травного тракту включають, але без обмеження, анальний, кишковий, колоректальний рак, рак стравоходу, жовчного міхура, шлунка, підшлункової залози, ректальний рак, рак тонкого кишечнику та рак слинних залоз. Пухлини сечового тракту включають, але без обмеження, рак сечового міхура, пеніальний рак, рак нирки, ниркових мисок, сечоводу, уретральний рак. Різні види раку очей включають, але без обмеження, інтраокулярну меланому та ретинобластому. Пухлини печінки включають, але без обмеження, гепатоцелюлярну карциному (карциноми печінкових клітин з або без фіброламелярного варіанту), холангіокарциному (карцинома внутрішньопечінкових жовчних протоків), та змішану гепатоцелюлярну холангіокарциному. Види шкірного раку включають, але без обмеження, карциному лускатих клітин, саркому Капоші, злоякісну меланому, шкірний рак клітин Меркеля та не-меланомний шкірний рак. Види раку голови та шиї включають, але без обмеження, ларингеальний / гіпофарингеальний / назофарингеальний / орофарингеальний рак та рак губи та оральної порожнини. Лімфоми включають, але без обмеження, лімфому, пов'язану зі СНІДом, лімфому не-Ходжкіна, шкірну T-клітинну лімфому, хворобу Ходжкіна та лімфому центральної нервової системи. Саркоми включають, але без обмеження, саркому м'якої тканини, oстеосаркому, злоякісну фіброзну гістіоцитоксантому, лімфосаркому та рабдоміосаркому. Лейкемії включають, але без обмеження, гострий мієлолейкоз, гострий лімфобластний лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз, хронічну гранулоцитарну лейкемію та злоякісний ретикулоендотеліоз. Як використовується у даному винаході, термін "епітоп" означає будь-яку антигенну детермінанту на антигені, наприклад, білок мезотеліну, з яким антитіло зв'язується за допомогою антигенного сайту зв'язування. Детермінанти або антигенні детермінанти звичайно складаються з поверхневих хімічно активних груп молекул, таких як бічні ланцюги амінокислот або цукру, та звичайно мають специфічну трьохвимірну структуру, а також специфічні характеристики заряду. Термін "специфічно імунореактивний" відноситься до реакції зв'язування між антитілом та білком, сполукою або антигеном, що має епітоп, який впізнається антигенним сайтом зв'язування антитіла. Ця реакція зв'язування є визначальною для присутності білка, антигена або епітопа, що має здатний до впізнання епітоп серед 10, що є присутніми у гетерогенній популяції білків або інших біологічних сполук. У контексті імуноаналізу специфічно імунореактивні антитіла можуть зв'язуватися з білком, що містить здатний до впізнання епітоп, та зв'язуватися, якщо це взагалі відбувається, у значно меншій з іншими білками, що не мають епітопу, які є присутніми у зразку. В контексті in vivo "специфічно імунореактивний" може відноситися до умов, за яких тварина формує імунну відповідь проти вакцини або антигену, наприклад, гуморальну відповідь на антиген (одержання антитіл проти вакцини, білка, сполуки або антигену, що є представленим при цьому, за умов імунологічної реактивності) або опосередковану клітинами відповідь (що також згадується в даній заявці як "клітинна імунна відповідь", тобто, відповідь, опосередкована T-лімфоцитами проти вакцини, білка, сполуки або антигену, що є представленим при цьому). Як використовується в даній заявці, термін "імунологічно реактивні умови" використовується у контексті імуноаналізу або реакції in vitro, де фізичні умови реакції, включаючи, наприклад, температуру, концентрацію солі, pH, реагенти та їх концентрації, а також концентрації антигену та спорідненого антитіла, що є специфічно імунореактивним до антигену, забезпечуються або доводяться для того, щоб дозволити здійснювати зв'язування спорідненого антитіла з антигеном. Імунологічно реактивні умови є залежними від формату реакції зв'язування антитіла та, типово, є такими, що використовуються у прописах імуноаналізу. Див. Harlow та Lane (1988) Аntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, для опису формату імуноаналізів та умов. Термін "пацієнт" або "суб'єкт", як використовується в даній заявці, включає ссавців (наприклад, людей та тварин). Як використовується в даній заявці, термін "інваріантне зв'язування' певного антитіла з мезотеліном відноситься до його здатності зв'язуватися з мезотеліном на широкому спектрі ліній ракових клітин, що експресують мезотелін та які експресують різні форми мезотеліну. 6 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інваріантне зв'язування може бути викликане, але без обмеження, тим фактом, що антитіла або антигензв'язувальні фрагменти антитіл, або їх варіанти впізнають епітоп мезотеліну, що не маскується іншим позаклітинним антигеном, таким, як раковий антиген 125 (CA125), який взаємодіє з мезотеліном. Для інваріантного зв'язування антитіл EC50 значення, визначені за допомогою FACS титрування на двох різних лініях ракових клітин, можуть відрізнятися не більше, ніж у десять разів або переважно, у п'ять разів, та найбільш бажано від 1 до 3 разів. Як використовується в даній заявці, термін "імунокон'югат" відноситься до молекули кон'югату, що включає принаймні oдне антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, зв'язаний з цитотоксичним агентом, наприклад, a майтансиноїдом або його похідною, переважно за допомогою прийнятної зв'язувальної групи або її попередника. Імунокон'югати згідно з винаходом Даний винахід відноситься до способів інгібування росту позитивних за мезотеліном ракових клітин та розвитку неопластичного захворювання шляхом забезпечення анти-мезотелінових імунокон'югатів. Залишки антитіла забезпечуваних імунокон'югатів є специфічно імунореактивними з 40 кДа C-термінальним доменом поліпептиду, що є попередником мезотеліну, (SEQ ID NO 36), який називається в даній заявці "мезотелін". В одному аспекті винаходу антитіла, антигензв'язувальні фрагменти антитіла та варіанти антитіла та фрагменти згідно з винаходом були описані у PCT/EP2008/009756 та складаються з варіабельної ділянки легкого ланцюга та варіабельної ділянки важкого ланцюга. Варіанти антитіла або антигензв'язувальні фрагменти антитіла, що розглядаються у винаході, являють собою молекули, в яких підтримується зв'язувальна активність антитіла або антигензв'язувального фрагменту антитіла щодо мезотеліну. Даний винахід також відноситься до імунокон'югатів, які складаються з анти-мезотелінового антитіла, антигензв'язувальних фрагментів антитіла, варіантів антитіла та фрагментів згідно з винаходом, відмінних від тих, що були описані у (PCT/EP2008/009756), та зв'язаних з хіміотерапевтичним агентом, наприклад, майтансиноїдами або їх похідними. Майтансиноїди, що можуть використовуватися у даному винаході є добре відомими у галузі техніки та можуть бути ізольовані з природних джерел згідно з відомими способами або можуть бути одержані синтетично згідно з відомими способами. Приклади прийнятних майтансиноїдів включають майтансинол та аналоги майтансинолу. Приклади прийнятних аналогів майтансинолу включають ті, що мають модифіковане ароматичне кільце, та такі, що мають модифікації в інших положеннях. Специфічні приклади прийнятних аналогів майтансинолу, що мають модифіковане ароматичне кільце, включають: (1) C-19-дехлор (патент США № 4,256,746) (одержаний шляхом LAH відновлення aнсамітоцину P2); (2) C-20-гідрокси (або C-20-деметил) +/-C-19-дехлор (патенти США №№ 4,361,650 та 4,307,016) (одержаний шляхом деметилування при використанні Streptomyces або Actinomyces або дехлорування при використанні LAH); та (3) C-20-деметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлор (патент США № 4,294,757) (одержаний шляхом ацилування при використанні ацилхлоридів). Специфічні приклади прийнятних аналогів майтансинолу, що мають модифікації інших положень, включають: (1) C-9-SH (патент США № 4,424,219) (одержаний шляхом реакції майтансинолу з H2S або P2S5); (2) C-14-алкоксиметил (деметокси/CH2OR) (патент США № 4,331,598); (3) C-14-гідроксиметил або ацилоксиметил (CH2OH або CH2OAc) (патент США № 4,450,254) (одержані від Nocardia); (4) C-15-гідрокси/ацилокси (патент США № 4,364,866) (одержаний шляхом перетворення майтансинолу за допомогою Streptomyces); (5) C-15-метокси (патенти США №№ 4,313,946 та 4,315,929) (ізольований з Trewia nudiflora); (6) C-18-N-деметил (патенти США №№ 4,362,663 та 4,322,348) (одержаний шляхом деметилування майтансинолу Streptomyces); та (7) 4,5-дезокси (патент США № 4,371,533) (одержаний шляхом відновлення майтансинолу за допомогою трихлориду титану/LAH). Синтез тіолвмісних майтансиноїдів, що є корисними у даному винаході, є повністю розкритим у патентах США №№ 5,208,020, 5,416,064 та 7,276,497. Майтансиноїди із залишком тіолу у C-3 положенні, C-14 положенні, C-15 положенні або C-20 положенні усі передбачаються як корисні. C-3 положення є бажаним, а C-3 положення майтансинолу є особливо бажаним. Також бажаними є C-3 залишок тіолу майтансиноїду, що 7 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить N-метилаланін, та C-3 залишок тіолу майтансиноїду, що містить N-метилцистеїн, та аналоги кожного. Бажані майтансиноїди є такими, що описані у патентах США №№ 5,208,020; 5,416,064; 6,333.410; 6,441,163; 6,716,821; RE39,151 та 7,276,497, кожний з яких є введеним у дану заявку як посилання у своїй цілісності. У бажаному втіленні естерифікований майтансинол є вибраним з N2’-деацетил-N2’-(3-меркапто-1-оксопропіл)майтансину (DM1, реєстрац. номер CAS 139504-50-0), N2’-деацетил-N2’-(4-меркапто-1-оксопентил)майтансину (DM3, реєстрац. номер CAS 796073-54-6), та N2’-деацетил-N2’-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансину (DM4 реєстрац. номер CAS 796073-69-3). В усьому цьому документі робляться посилання на наступні репрезентативні антитіла згідно з винаходом: "MF-J", "MOR06640", "MF-226" та "MF-T". MF-J представляє собою антитіло, що має варіабельну важку ділянку, яка відповідає SEQ ID NO: 28 (ДНК)/SEQ ID NO: 20 (білок), та варіабельну легку ділянку, що відповідає SEQ ID NO: 32 (ДНК)/SEQ ID NO: 24 (білок). MOR 06640 представляє собою антитіло, що має варіабельну важку ділянку, яка відповідає SEQ ID NO: 29 (ДНК)/SEQ ID NO: 21 (білок), та варіабельну легку ділянку, що відповідає SEQ ID NO: 33 (ДНК)/SEQ ID NO: 25 (білок). MF-226 представляє собою антитіло, що має варіабельну важку ділянку, яка відповідає SEQ ID NO: 30 (ДНК)/SEQ ID NO: 22 (білок), та варіабельну легку ділянку, що відповідає SEQ ID NO: 34 (ДНК)/SEQ ID NO: 26 (білок). MF-T представляє собою антитіло, що має варіабельну важку ділянку, яка відповідає SEQ ID NO: 31 (ДНК)/SEQ ID NO: 23 (білок), та варіабельну легку ділянку, що відповідає SEQ ID NO: 35 (ДНК)/SEQ ID NO: 27 (білок). Винахід не є обмеженим цими антитілами, які використовуються в даній заявці як приклади. Інші корисні антитіла є розкритими, наприклад, у PCT/EP2008/009756. В одному аспекті винахід забезпечує імунокон'югати, що є специфічно імунореактивними до мезотеліну у присутності ракового антигену 125 (CA 125/MUC 16), та таким чином, є ефективно націленими на ракові клітини, які експресують як мезотелін, так і CA125, наприклад, OVCAR-3 клітини. В інших аспектах винахід забезпечує імунокон'югати, які є специфічно імунореактивними до однієї або більше амінокислот епітопів антитіл MOR 06640 або MF-T. У деяких аспектах вказані імунокон'югати є специфічно імунореактивними до принаймні двох, принаймні трьох, принаймні чотирьох, принаймні п'яти або принаймні шести амінокислот епітопів антитіл MOR 06640 або MF-T. У деяких аспектах імунокон'югати даного винаходу є специфічно імунореактивними до однієї або більше амінокислот епітопу, що впізнається антитілом MOR 06640. В альтернативних аспектах антитіла даного винаходу є специфічно імунореактивними до однієї або більше амінокислот епітопу, що впізнається антитілом MF-T. В іншому аспекті винахід забезпечує імунокон'югати, що мають антигензв'язувальну ділянку, яка є специфічно імунореактивною до або має високу афінність для однієї або більше ділянок мезотеліну, амінокислотна послідовність якого є показаною у SEQ ID NO: 36. Імунокон'югат, як кажуть, має "високу афінність" для антигену, якщо вимірювання афінності забезпечує значення принаймні 100 нМ (моновалентна афінність Fab фрагменту). Імунокон'югат згідно з винаходом бажано може бути специфічно імунореактивним до мезотеліну з афінністю менше, ніж приблизно 100 нM, більш бажано менше, ніж приблизно 60 нM, та ще більш бажано менше, ніж приблизно 30 нM. Додатково бажаними є антитіла, що зв'язуються з мезотеліном з афінністю менше, ніж приблизно 10 нM, та більш бажано менше, ніж приблизно 3 нM. Наприклад, афінність антитіла згідно з винаходом проти мезотеліну може складати приблизно 9,1 нМ або 0,9 нМ (моновалентна афінність IgG1 формату). Термін "лікування" включає будь-який процес, дію, застосування, терапію або подібні до них, де суб'єкт (або пацієнт), включаючи людину, забезпечується медичною допомогою за допомогою об'єкту, що поліпшує стан суб'єкта, безпосередньо або опосередковано, або уповільнює розвиток стану або розладу у суб'єкта, або полегшує принаймні один симптом захворювання або розладу при лікуванні. Термін "комбінаційна терапія" або "співтерапія" означає введення двох або більше терапевтичних агентів для лікування захворювання, стану та/або розладу. Таке введення охоплює сумісне введення двох або більше терапевтичних агентів суттєво одночасно, так, як, наприклад, в одній капсулі, що має фіксоване співвідношення активних інгредієнтів або у декількох окремих капсулах для кожного інгібіторного агента. Крім того, таке введення охоплює застосування кожного типу терапевтичного агенту послідовним чином. Порядок введення двох або більше терапевтичних агентів, що сумісно вводяться послідовно, не є обмеженим. Фраза "терапевтично ефективна кількість" означає кількість кожного агенту, що вводиться, яка буде досягати мети поліпшення захворювання, стану та/або тяжкості розладу та/або його симптому, де усунення або мінімізація шкідливих побічних ефектів асоціюється з даним терапевтичним лікуванням. 8 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "фармацевтично прийнятний" означає, що об'єкт є прийнятним для застосування у фармацевтичному продукті. Імунокон'югати згідно з даним винаходом передбачаються як цінні терапевтичні агенти. Згідно з цим втілення даного винаходу включає спосіб лікування різноманітних станів у пацієнта (включаючи ссавців), що включає введення вказаному пацієнту композиції, яка містить певну кількість імунокон'югату згідно з винаходом, що є ефективною у лікуванні цільового стану. Імунокон'югати даного винаходу можуть використовуватися у лікуванні або запобіганні захворювань та/або змін, що асоціюються з білком мезотеліну. Такі захворювання та/або зміни включають, наприклад, рак, такий як карциноми підшлункової залози, яєчника, шлунку, стравоходу, шийки матки, кишечнику, печінки, респіраторного тракту та легень. Даний винахід також відноситься до способів полегшення симптомів розладу, в яких рівень мезотеліну є підвищеним або іншим чином патологічно експресується. Такі розлади включають, але без обмеження, карциноми підшлункової залози, яєчника, шлунку, стравоходу, шийки матки, кишечнику, печінки, респіраторного тракту та легень (див., наприклад (Liao, Cancer Res. 57:2827-2831, 1997; Turner, Hum. Pathol. 28:740-744, 1997; Liao, та ін., Am. J. Pathol. 145:598-609, 1994; Saarnio, та ін., Am. J. Pathol. 153:279-285, 1998; Vermylen, та ін., Eur. Respir. J. 14:806-811, 1999). В одному втіленні згідно з винаходом терапевтично ефективна доза імунокон'югату згідно з винаходом вводиться пацієнтові, що має розлад, де рівень мезотеліну є підвищеним. Імунокон'югати даного винаходу можуть вводитися самостійно або у комбінації з одним або більше додаткових терапевтичних агентів. Комбінаційна терапія включає введення одиничної фармацевтичної дозованої композиції, що містить імунокон'югат даного винаходу та один або більше додаткових терапевтичних агентів, а також введення імунокон'югату даного винаходу та кожного з додаткових терапевтичних агентів у своїй окремій фармацевтичній дозованій композиції. Наприклад, імунокон'югат даного винаходу та терапевтичний агент можуть вводитися пацієнтові разом в одиничній пероральній дозованій композиції або кожний агент може вводитися в окремій пероральній дозованій композиції. Коли використовуються окремі дозовані композиції, імунокон'югат даного винаходу та один або більше додаткових терапевтичних агентів можуть вводитися суттєво у той самий час (наприклад, одночасно) або в розділені моменти часу (наприклад, послідовно). Порядок введення агентів не є обмеженим. Наприклад, в одному аспекті сумісне введення анти-мезотелінового імунокон'югату згідно з винаходом разом з одним або більше протиракових агентів для посилення ефекту або антимезотелінового імунокон'югату або протиракового(их) aгента(ів) або обох передбачається для застосування у лікуванні розладів, пов'язаних із мезотеліном, таких як рак. Такі комбінаційні терапії можуть також використовуватися для запобігання раку, для запобігання рецидивів раку, запобігання поширення або метастазів раку або для зниження або полегшення симптомів, асоційованих з раком. Один або більше протиракових агентів можуть включати будь-яку відому та прийнятну у галузі техніки сполуку, таку як, наприклад, хіміотерапевтичні агенти, інші імунотерапевтичні агенти, протиракові вакцини, антиангіогенні агенти, цитокіни, гормональні терапії, генні терапії та способи променевої терапії. Хіміотерапевтичний агент (або "протираковий агент" або "протипухлинний агент" або "протираковий терапевтичний агент") відноситься до будь-якої молекули або сполуки, що допомогає у лікуванні раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів, що передбачаються даним винаходом, включають, але без обмеження, цитозин арабінозид, таксоїди (наприклад, паклітаксел, доцетаксел), антитубулінові агенти (наприклад, паклітаксел, доцетаксел, eпотілон B або їх аналоги), макроліди (наприклад, ризоксин) цисплатин, карбоплатин, адріаміцин, тенопозид, мітоксантрон, діскодермолід, eлеутеробін, 2хлородезоксіаденозин, алкілувальні агенти (наприклад, циклофосфамід, мехлоретамін, тіотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамід, бусульфан, дибромоманітол, стрептозотоцин, мітоміцин C та цис-дихлородіамін платини (II) (DDP) цисплатин, тіотепа), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (колишній актиноміцин), блеоміцин, мітраміцин, антраміцин), антиметаболіти (наприклад, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, флавопіридол, 5-фторурацил, флударабін, гемцитабін, дакарбазин, темозоламід), аспарагіназу, бацилу Кальметта-Герена, дифтерійний токсин, гексаметилмеламін, гідроксисечовину, LYSODREN.RTM., аналоги нуклеозидів, рослинні алкалоїди (наприклад, таксол, паклітаксел, камптотецин, топотекан, іринотекан (CAMPTOSAR, CPT-I l), вінкристин, алкалоїди барвінку, такі як вінбластин), подофілотоксин (включаючи похідні, такі як eпiподофілотоксин, VP-16 (етопозид), VM-26 (теніпозид)), цитохалазин B, колхіцин, граміцидин D, бромід етидію, eметин, мітоміцин, прокарбазин, мехлоретамін, антрацикліни (наприклад, даунорубіцин (колишній дауноміцин), доксорубіцин, доксорубіцин ліпосомальний), 9 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дигідроксіaнтрациндіон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин D, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол, пуроміцин, антимітотичні агенти, абрин, рицин A, екзотоксин Рseudomonas, фактор росту нервів, фактор росту гранулоцитів, активатор тканинного плазміногену, aльдеслейкін, aлутамін, aнастрозол, бікалутамід, біоміцин, бусульфан, капецитабін, карбоплатин, хлорабусил, кладрибін, циларабін, дакліоміцин, естрамустин, флоксуридин, гемцитабін, гозерелін, ідарубіцин, ітосфамід, лаупролід ацетат, левамізол, ломустин, мехлоретамін, мегестрол, ацетат, меркаптопурино, месна, мітоланк, пегаспергазу, пентостатин, пікамелін, ритуксимаб, кампт-1, страплозоцин, тіогуанін, третіоноїн, вінорелбін або будь-які фрагменти, члени родини або їх похідні, включаючи їх фармацевтично прийнятні солі. Композиції, що включають один або більше хіміотерапевтичних агентів (наприклад, FLAG, CHOP), також передбачаються даним винаходом. FLAG включає флударабін, цитозин арабінозид (Ara-C) та G-CSF. CHOP включає циклофосфамід, вінкристин, доксорубіцин та преднізон. Хіміотерапевтичний агент може являти собою антиангіогенний aгент, такий, як, наприклад, ангіостатин, бевацизумаб (Avastin®), сорафеніб (Nexavar®), бакулостатин, канстатин, маспін, анти-VEGF антитіла або пептиди, антитіла або пептиди до плацентарного фактора росту, антиFlk-1 антитіла, анти-Fit-1 антитіла або пептиди, ламінінові пептиди, фібронектинові пептиди, інгібітори активатора плазміногену, інгібітори тканинної металопротеїнази, інтерферони, інтерлейкін 12, IP-10, Gro-β, тромбоспондин, 2-метоксіестрадіол, білок, споріднений з проліферином, карбоксіімідотриазол, CMlOl, марімастат, пентозан полісульфат, ангіопоетин 2, інтерферон-aльфа, гербіміцин A, PNU145156E, 16K фрагмент пролактину, ліномід, талідомід, пентоксифілін, геністеїн, TNP-470, eндостатин, паклітаксел, акутин, цидофовір, вінкристин, блеоміцин, AGM-1470, тромбоцитарний фактор 4 або міноциклін. В одному аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою гемцитабін при дозі, що коливається від 100 дo 1000 мг/м2/цикл. В одному втіленні вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою дакарбазин при дозі, що коливається від 200 дo 4000 мг/м2/цикл. В іншому аспекті вказана доза коливається від 700 дo 1000 мг/м2/цикл. Ще в одному аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою флударабін при дозі, що коливається від 25 дo 50 мг/м2/цикл. В іншому аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою цитозин арабінозид (Ara-C) при дозі, що коливається від 200 дo 2000 мг/м2/цикл. Ще в одному аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою доцетаксел при дозі, що коливається від 1,5 дo 7,5 мг/кг/цикл. Ще в одному аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою паклітаксел при дозі, що коливається від 5 дo 15 мг/кг/цикл. У додатковому аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою цисплатин при дозі, що коливається від 5 дo 20 мг/кг/цикл. Ще в одному аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою 5-фторурацил при дозі, що коливається від 5 до 20 мг/кг/цикл. В іншому аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою доксорубіцин при дозі, що коливається від 2 дo 8 мг/кг/цикл. Ще в іншому аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою eпiподофілотоксин при дозі, що коливається від 40 дo 160 мг/кг/цикл. Ще в одному аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою циклофосфамід при дозі, що коливається від 50 дo 200 мг/кг/цикл. У додатковому аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою іринотекан при дозі, що коливається від 50 дo 150 мг/м2/цикл. Ще в одному аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою вінбластин при дозі, що коливається від 3,7 дo 18,5 мг/м2/цикл. В іншому аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою вінкристин при дозі, що коливається від 0,7 дo 2 мг/м2/цикл. В одному аспекті вказаний хіміотерапевтичний агент являє собою метотрексат при дозі, що коливається від 3,3 дo 1000 мг/м2/цикл. В іншому аспекті імунокон'югати анти-мезотеліну даного винаходу вводяться у комбінації з одним або більше імунотерапевтичних агентів, таких як антитіла або імуномодулятори, які включають, але без обмеження, Герцептин®, Ретуксан®., OваРекс, ПаноРекс, BEC2, IMC-C225, Вітаксин, Кампт I/H, Смарт MI95, ЛімфоЦид, Смарт I D 10 та онколін, ритуксан, ритуксимаб, гемтузумаб або трастузумаб. Винахід також передбачає введення імунокон'югатів анти-мезотеліну даного винаходу з одним або більше антиангіогенних агентів, які включають, але без обмеження, ангіостатин, талідомід, крінгл 5, ендостатин, серпін (інгібітор серинпротеази) анти-тромбін, 29 кДа Nтермінальний та 40 кДа C-термінальний протеолітичні фрагменти фібронектину, 16 кДа протеолітичний фрагмент пролактину, 7,8 кДа протеолітичний фрагмент тромбоцитарного фактора-4, β-aмінокислотний пептид, що відповідає фрагменту тромбоцитарного фактора-4 (Maione та ін., 1990, Cancer Res. 51:2077), пептид, що складається з 14 амінокислот, який відповідає фрагменту колагену I (Tolma та ін., 1993, J. Cell Biol. 122:497), пептид, що складається з 19 амінокислот, який відповідає фрагменту тромбоспондину I (Tolsma та ін., 1993, 10 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 J. Cell Biol. 122:497), пептид, що складається з 20 амінокислот, який відповідає фрагменту SPARC (Sage та ін., 1995, J. Cell. Biochem. 57: 1329-), або будь-які фрагменти, члени родини або їх похідні, включаючи їх фармацевтично прийнятні солі. Інші пептиди, які інгібують ангіогенез та відповідають фрагментам ламініну, фібронектину, проколагену та EGF, також були описані (див. огляд Cao, 1998, Prog. MoI. Subcell. Biol. 20:161). Моноклональні антитіла та циклічні пентапептиди, що блокують деякі інтегрини, які зв'язуються з RGD білками (тобто такими, що мають пептидний мотив Arg-Gly-Asp), були продемонстровані як такі, що володіють активністю, направленою проти васкуляризації (Brooks та ін., 1994, Science 264:569; Hammes та ін., 1996, Nature Medicine 2:529). Крім того, інгібування урокіназного рецептора активатора плазміногену за допомогою антагоністів інгібує ангіогенез, ріст пухлин та метастази (Min та ін., 1996, Cancer Res. 56:2428-33; Crowley та ін., 1993, Proc Natl Acad. Sci. USA 90:5021). Застосування таких антиангіогенних агентів також передбачається даним винаходом. В іншому аспекті анти-мезотелінові імунокон'югати даного винаходу вводяться у комбінації з режимом опромінення. Імунокон'югати анти-мезотеліну даного винаходу можуть також вводитися у комбінації з одним або більше цитокінів, які включають, але без обмеження, лімфокіни, фактори некрозу пухлин, подібні до фактора некрозу пухлин цитокіни, лімфотоксин-α, лімфотоксин-β, інтерферон-β, запальні білки макрофагів, фактор стимуляції колоній гранулоцитів / моноцитів, інтерлейкіни (включаючи, але без обмеження, інтерлейкін-1, інтерлейкін-2, інтерлейкін-6, інтерлейкін-12, інтерлейкін-15, інтерлейкін- 18), OX40, CD27, CD30, CD40 або CD 137 ліганди, Fas-Pas ліганд, 4-IBBL, активувальний білок для моноцитів ендотелію або будь-які їх фрагменти, члени родини або їх похідні, включаючи їх фармацевтично прийнятні солі. Імунокон'югати анти-мезотеліну даного винаходу можуть також вводитися у комбінації з протираковою вакциною, приклади яких включають, але без обмеження, aутологічні клітини або тканини, неаутологічні клітини або тканини, канцероембріональний антиген, альфа-фетобілок, людський хоріонічний гонадотропін, BCG живу вакцину, білки, які мають походження від клітинних ліній меланоцитів (наприклад, gplOO, MART-1/MelanA, TRP-I (gp75), тирозиназу, широко поширені, асоційовані з пухлинами антигени, включаючи специфічні для пухлин антигени (наприклад, BAGE, GAGE-I, GAGE-2, MAGE-I, MAGE-3, Nацетилглюкозамінілтрансфераза-V, pl5), мутовані антигени, які є асоційованими з пухлинами (βкатенін, MUM-I, CDK4), немеланомні антигени (наприклад, HER-2/neu (карцинома молочної залози та яєчника), людський 5 папіломавірус-E6, E7 (цервікальна карцинома), MUC-1 (карцинома молочної залози, яєчника та підшлункової залози). Для людських пухлинних антигенів, що впізнаються T-клітинами, див. в загальному випадку Robbins та Kawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628. Протиракові вакцини можуть бути очищеними препаратами або можуть не бути такими. Ще в одному втіленні імунокон'югати анти-мезотеліну даного винаходу використовуються у поєднанні з гормональним лікуванням. Гормональні терапевтичні способи лікування включають агоністи гормонів, антагоністи гормонів (наприклад, флутамід, тамоксифен, лейпрорелін ацетат (LUPRON), LH-RH анатагоністи), інгібітори біосинтезу та процесингу гормонів та стероїди (наприклад, дексаметазон, ретиноїди, бетаметазон, кортизол, кортизон, преднізон, дегідротестостерон, глюкокортикоїди, мінералокортикоїди, eстроген, тестостерон, прогестини), антигестагени (наприклад, міфепристон, oнапристон), та антиaндрогени (наприклад, ципротерон ацетат). Імунокон'югати анти-мезотеліну згідно з винаходом можуть використовуватися у комбінації з, наприклад, можуть сумісно вводитися з анти-MDR (множинна стійкість до лікарських засобів) фенотипічним агентом. Багато форм людського раку за своєю природою або спонтанно розвивають стійкість до кількох класів протиракових лікарських засобів одночасно, незважаючи на те, що кожний з класів лікарських засобів має відмінні структури та механізми дії. Цей феномен, який може маскуватися у культивованих клітинах ссавців, в загальному випадку називається множинною стійкістю до лікарських засобів ("MDR") або фенотипом множинної стійкості до лікарських засобів. MDR фенотип представляє значні перешкоди до успішних способів хіміотерапевтичного лікування раку пацієнтів, що являють собою людей. Стійкість злоякісних пухлин до множини хіміотерапевтичних агентів є основною причиною невдалого лікування (Wittes та ін., Cancer Treat. Rep. 70:105 (1986); Bradley, G. та ін., Biochim. Biophys. Acta 948:87 (1988); Griswald, D. P. та ін., Cancer Treat. Rep. 65(S2):51 (1981); Osteen, R. T. (ed.), Cancer Manual, (1990)). Пухлини, що спочатку є чутливими до цитотоксичних агентів, часто дають рецидиви або стають такими, що не піддаються лікуванню множиною хіміотерапевтичних лікарських засобів (Riordan та ін., Pharmacol. Ther. 28:51 (1985); Gottesman та ін., Trends Pharmacol. Sci. 9:54 (1988); Moscow та ін., J. Natl. Cancer Inst. 80:14 (1988); Croop, J. M. та ін., J. 11 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Clin. Invest. 81:1303 (1988)). Клітини або тканини, одержані з пухлин та вирощені у присутності селективного цитотоксичного лікарського засобу, можуть приводити до перехресної резистентності до інших лікарських засобів у цьому класі, а також в інших класах лікарських засобів, включаючи, але без обмеження, aнтрацикліни, алкалоїди барвінка та eпiподофілотоксини (Riordan та ін., Pharmacol. Ther. 28:51 (1985); Gottesman та ін., J. Biol. Chem. 263:12163 (1988)). Таким чином, набута резистентність до одного лікарського засобу приводить до одночасної резистентності різноманітної групи лікарських засобів, що є структурно та функціонально неспорідненими. Така резистентність може бути проблемою як для солідних форм пухлин та рідинних форм пухлин (наприклад, види раку крові та лімфи). Один з основних механізмів множинної стійкості до лікарських засобів у клітинах ссавців втягує підвищену експресію насосної системи 170 кДа глікопротеїну плазматичної мембрани (Juranka та ін., FASEB J 3:2583 (1989); Bradley, G. та ін., Blochem. Biophys. Acta 948:87 (1988)). Ген, що кодує цю насосну систему, яку іноді називають транспортером множинних лікарських засобів, було клоновано з культивованих людських клітин, в загальному випадку називається mdrl. Цей ген експресується в декількох класах нормальних тканин, проте фізіологічні субстрати, що транспортуються для продукту гена mdrl у цих тканинах, не були ідентифіковані. MDRl являє собою члена родини ABC суперродини білка транспортера є групою білків, що мають енергетично залежну функцію експорту. Білковий продукт гена, що в загальному випадку є відомим як P-глікопротеїн ("P-170", "P-gp"), являє собою 170 кДа трансплазматичний мембранний білок, що утворює згаданий вище енергетично залежний відкачувальний насос. Експресія P-gp на поверхні клітин є достатньою для забезпечення множинної резистентності клітин до цитотоксичних агентів, включаючи багато протиракових агентів. P-gp-опосередкована MDR виявляється важливим клінічним компонентом пухлинної резистентності у пухлинах різних типів, а експресія гена mdrl корелює з резистентністю до хіміотерапії при різних формах раку. Нуклеотидна послідовність гена mdrl (Gros, P. та ін., Cell 47:371 (1986); Chen, C. та ін., Cell 47:381 (1986)) показує, що він кодує поліпептид, подібний та ідентичний з P-глікопротеїном та що такі є членами класу висококонсервативних мембранних білків, подібних до бактеріальних транспортерів та втягнених у процеси нормального фізіологічного транспорту. Аналіз послідовності гена mdrl свідчить про те, що Pgp складається з 1280 амінокислот, що розподіляються між двома гомологічними (43 % ідентичності) половинами. Кожна половина молекули має шість гідрофобних трансмембранних доменів та кожна має сайт зв'язування ATФ у межах великої цитоплазматичної петлі. Тільки приблизно 8 % молекули є позаклітинними, а вуглеводневий залишок (розміром приблизно 30 кДа) є зв'язаним із сайтами у цій ділянці. Таким чином, буде зрозумілим, що клітини ссавців, які мають "множинну резистентність до лікарських засобів" або фенотип "множинної резистентності до лікарських засобів" характеризуються здатністю до ізоляції, eкспорту або видалення множини цитотоксичних речовин (наприклад, хіміотерапевтичних лікарських засобів) з внутрішньоклітинного середовища. Клітини можуть набувати цього фенотипу в результаті тиску селекції, що здійснюється шляхом піддання впливу одного хіміотерапевтичного лікарського засобу (селективний токсин). Альтернативно, клітини можуть демонструвати фенотип перед піддаванням впливу токсину, оскільки експорт цитотоксичних речовин може втягувати механізм, подібний до нормального експорту клітинних продуктів секреції, метаболітів та подібних до них. Множинна резистентність до лікарських засобів відрізняється від простої набутої резистентності до селективного токсину тим, що клітина набуває компетентності до експорту додаткових цитотоксинів (інших хіміотерапевтичних лікарських засобів), впливу яких клітина раніше не піддавалася. Наприклад, Mirski та ін. (1987), 47 Cancer Res. 2594-2598, описує ізоляцію популяції клітин з множинною резистентністю до лікарських засобів шляхом культивування клітинної лінії H69, що походить від людської дрібноклітинної карциноми легень, у присутності адріаміцину (доксорубіцину) як селективного токсину. Клітини, що вижили, були виявлені резистентними до цитотоксичних ефектів аналогів антрацикліну (наприклад, дауноміцину, епірубіцину, меногарилу та мітоксантрону), ацивіцину, етопозиду, граміцидину D, колхіцину та алкалоїдів барвінка (вінкристин та вінбластин), а також адріаміцину. Подібні методики селективного культивування можуть використовуватися для одержання додаткових популяцій клітин з множинною резистентністю до лікарських засобів. Згідно з цим фармацевтичні композиції згідно з винаходом можуть додатково включати сполуки, які діють для інгібування MDR фенотипу та/або умов, асоційованих з MDR фенотипом. Такі сполуки можуть включати будь-які відомі у галузі техніки сполуки для інгібування MDR, такі як антитіла, специфічні для MDR компонентів (наприклад, антитіла до MDR транспортеру) або дрібні молекули інгібіторів MDR транспортерів, включаючи специфічно, тамоксифен, верапаміл та циклоспорин A, які являють собою агенти, відомі як такі, що переключають або інгібують множинну резистентність 12 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до лікарських засобів. (Lavie та ін. J. Biol. Chem. 271: 19530-10536, 1996, що є введеним у дану заявку як посилання). Такі сполуки можуть бути знайдені у патентах №№ 5,773,280, 6,225,325 та 5,403,574, кожний з яких є введеним у дану заявку як посилання. Такі сполуки, що інгібують MDR, можуть сумісно вводитися з імунокон'югатами анти-мезотеліну згідно з винаходом для різноманітних цілей, включаючи, зміну MDR фенотипу в результаті визначення MDR фенотипу для надання допомоги у лікуванні або поліпшенні хіміотерапевтичного лікування. Інгібітор MDR, такий, як, наприклад, тамоксифен, верапаміл та циклоспорин A, можуть використовуватися у поєднанні зі сполуками згідно з винаходом для допомоги у визначенні MDR фенотипу. У відповідності із цим аспектом інгібітор MDR може поліпшувати поглинання та акумуляцію сполук згідно з винаходом у MDR раковій клітині, оскільки здатність транспортної системи MDR до транспорту або "викачування" сполук, що утворилися, стосовно домену субстрату буде знищуватися у присутності інгібітора MDR. Ще в одному втіленні анти-мезотелінові імунокон'югати даного винаходу використовуються у поєднанні з програмою генної терапії у лікуванні раку. Генна терапія при використанні рекомбінантних клітин, що секретують інтерлейкін-2, може вводитися у комбінації з імунокон'югатами згідно з винаходом для запобігання або лікування раку, зокрема, раку молочної залози (див., наприклад, Deshmukh та ін., 2001, J. Neurosurg. 94:287). Для оцінки здатності конкретного імунокон'югату бути терапевтично корисним для лікування раку, імунокон'югат, наприклад, може піддаватися аналізу in vivo у мишачій ксенографтній пухлинній моделі. Приклади терапевтичних моделей є докладно приведеними у Прикладах 1 та 2. Активність антитіла може також піддаватися аналізу при використанні в аналізі залежної від антитіла клітинної цитотоксичності, як описується у Прикладі 3. Фармацевтичні композиції та дозування Імунокон'югати, описані в даній заявці, можуть забезпечуватися у фармацевтичній композиції, що включає фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтично прийнятний носій може бути непірогенним. Композиції можуть вводитися самостійно або у комбінації з принаймні одним іншим агентом, таким, як стабілізувальна сполука, яка може вводитися у стерильному, біосумісному фармацевтичному носії, включаючи, але без обмеження, фізіологічний розчин, забуферений фізіологічний розчин, декстрозу та воду. Може використовуватися різноманітність водних носіїв, включаючи, але без обмеження фізіологічний розчин, гліцин та подібні до них. Такі розчини є стерильними та у загальному випадку вільними від матеріалу у вигляді частинок. Такі розчини можуть піддаватися стерилізації за допомогою традиційних, добре відомих методик стерилізації (наприклад, фільтрування). В загальному випадку фраза "фармацевтично прийнятний носій" є визнаною у галузі техніки та включає фармацевтично прийнятний матеріал, композиції або носії, прийнятні для введення сполук даного винаходу ссавцям. Такі носії включають рідинний або твердий наповнювач, розріджувач, матеріал наповнювача, розчинника або інкапсулюючого матеріалу, вони є втягненими у перенесення або транспортування у суб'єкті агента від одного органа або частини тіла, в інший орган або частину тіла. Кожний носій має бути "прийнятним" у значенні бути сумісним з іншими інгредієнтами композиції та не бути шкідливим для пацієнта. Деякі приклади матеріалів, що можуть служити як фармацевтично прийнятні носії, включають: цукри, такі як лактоза, глюкоза та цукроза; крохмалі, такі як кукурудзяний крохмаль та картопляний крохмаль; целюлозу, та ї похідні, такі як карбоксиметил целюлоза натрію, етилцелюлоза та ацетат целюлози; подрібнену трагакантову камедь; солод; желатин, тальк; наповнювачі, такі як масло какао та воски для супозиторіїв; масла та олії, такі як арахісова олія, олія насіння бавовника, соняшникова олія, сезамова олія, оливкова олія, кукурудзяна олія та соєва олія; гліколі, такі як пропіленгліколь; поліоли, такі як гліцерин, сорбіт, маніт та поліетилeнгліколь; естери, такі як етил олеат та етил лаурат; aгар; забуферювальні агенти, такі як гідроксид магнію та гідроксид алюмінію; альгінову кислоту; вільну від пірогену воду; iзотонічний фізіологічний розчин; розчин Рінгера; етиловий спирт; розчини фосфатного буфера; та інші нетоксичні сумісні речовини, що використовуються у фармацевтичних композиціях. Зволожувальні агенти, емульгатори та змащувальні агенти, такі як лаурилсульфат натрію та стеарат магнію, а також барвники, агенти, що сприяють вивільненню, агенти для покриття, підсолоджувальні агенти, смакові та ароматичні агенти, консерванти та антиоксиданти можуть також бути присутніми у композиції імунокон'югату згідно з винаходом. Приклади фармацевтично прийнятних антиoксидантів включають: розчинні у воді антиoксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію та подібні до них; розчинні в олії антиoксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутильований гідроксиaнізол (BHA), бутильований гідрокситолуол (BHT), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол та подібні до них; та хелатуючі метали агенти, такі як 13 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТА), сорбітол, винна кислота, фосфорна кислота та подібні до них. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні допоміжні речовини, що є необхідними до наближення до фізіологічних умов, такі як агенти для доведення та буферизації значення pH та подібні до них. Концентрація імунокон'югату згідно з винаходом у такій фармацевтичній композиції може варіювати у широких межах та може бути вибраною на основі об'ємів рідини, густини, тощо, згідно з конкретним вибраним способом введення. Якщо це є бажаним, то у фармацевтичні композиції може включатися більше одного типу антитіла або імунокон'югату (наприклад, антитіло з відмінним значення Ka для зв'язування мезотеліну). Композиції можуть вводитися пацієнтові окремо або у комбінації з іншими агентами, лікарськими засобами або гормонами. На доповнення до активних інгредієнтів, ці фармацевтичні композиції можуть містити прийнятні фармацевтично сумісні носії, що включають наповнювачі та допоміжні речовини, що сприяють перетвоернню активних сполук у препарати, які можуть використовуватися фармацевтично. Фармацевтичні композиції згідно з винаходом можуть вводитися будь-яким шляхом, включаючи, але без обмеження, оральний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, інтраартеріальний, інтрамедулярний інтратекальний, інтравентрикулярний, трансдермальний, підшкірний, інтраперитонеальний, інтраназальний, парентеральний, місцевий, сублінгвальний або ректальний шляхи. Композиції згідно з винаходом додатково передбачають використання прийнятних імуноносіїв, таких як, білки, поліпептиди або пептиди, такі як aльбумін, гемоціанін, тироглобулін та їх похідні, зокрема, бичачий сироватковий альбумін (BSA) та гемоціанін лімфи равлика (KLH), полісахариди, вуглеводи, полімери та тверді фази. Інші білкові та небілкові речовини є відомими спеціалісту у даній галузі техніки. В аспектах, що втягують вакцини, наприклад, протиракові вакцини, разом з антитілами згідно з винаходом, композиціями згідно з винаходом можуть вводитися з або без ад'юванта. Введення може проводитися за відсутності ад'юванта для того, щоб уникнути індукованої ад'ювантом токсичності. Спеціаліст у даній галузі техніки, до якої відноситься винахід, наприклад, лікар, який спеціалізується на ракових захворюваннях, зможе оцінити та зрозуміти, як визначити ад'ювант, який може використовуватися або не використовуватися, що залежить від медичної історії суб'єкта, родинних даних, даних щодо токсичності, результатів, пов'язаних з алергією, тощо. У втіленнях, де використовується ад'ювант, є бажаним, щоб ад'ювант сприяв утворенню протективного антитіла, такого, як протективні IgG антитіла. Будь-який прийнятний ад'ювант, який є відомим середньому спеціалісту у даній галузі техніки, передбачаєтся даним винаходом та легко адаптується до даного винаходу. Прийнятні ад'юванти для застосування у вакцинації тварин можуть включати, але без обмеження, гідроксид алюмінію, сапонін та його очищений компонент Quit A, повний ад'ювант Фрейнда (CFA) та неповний ад'ювант Фрейнда (IFA). Сульфат декстрану був продемонстрований як потужний стимулятор IgG2 антитіла проти стафілококових антигенів поверхні клітин, він також є прийнятним як ад'ювант. Спеціаліст у даній галузі техніки зможе оцінити, що деякі ад'юванти можуть бути більш переважними для ветеринарного застосування, у той час як інші ад'юванти будуть бажаними для застосування у людей, та що токсичності ад'ювантів небхідно брати до уваги кваліфікованому спеціалісту перед введенням сполуки людині. Композиції, прийнятні для парентерального, підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового ведення та подібних до них; а також прийнятні фармацевтичні носії; та методики для композицій та введення можуть бути одержані шляхом будь-якого зі способів, що є добре відомими у галузі техніки (див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20-е видання, 2000). Рідкі дозовані форми для перорального введення сполук згідно з винаходом включають фармацевтично прийнятні емульсії, мікроемульсії, розчини, суспензії, сиропи та еліксири. На доповнення до активного інгредієнту, рідкі дозовані форми можуть містити інертний розріджувач, що звичайно використовується у галузі техніки, такий, як, наприклад, вода або інші розчинники, солюбілізувальні агенти та eмульгатори, такі як етиловий спирт, ізопропіловий спирт, етил карбонат, етил ацетат, бензиловий спирт, бензилбензоат, пропіленгліколь, 1,3-бутиленгліколь, олії (зокрема, олія з насіння бавовника, земляного горіху, кукурудзи, зародків, маслин, касторові та сезамові олії), гліцерин, тетрагідрофуриловий спирт, поліетиленгліколі та естери жирної кислоти сорбіту та їх суміші. Фрази "парентеральне введення" та "вводиться парентерально", як використовується в даній заявці, означає способи введення, відмінні від ентерального та топікального введення, що звичайно вводяться шляхом ін'єкції та включають, без обмеження, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, інтраартеріальну, інтратекальну, інтракапсулярну, інтраорбітальну, 14 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтракардіальну, інтрадермальну, інтраперитонеальну, інтратрахеальну, підшкірну, внутрішньошкірну, інтраартикулярну, субкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну та інтрастернальну ін'єкцію та iнфузію. Визначення терапевтично ефективної дози знаходиться у межах професійної кваліфікації спеціаліста у даній галузі техніки. Терапевтично ефективна доза відноситься до кількості імунокон'югату, що може використовуватися для ефективного лікування захворювання (наприклад, раку), у порівнянні з ефективністю, що є вираженою у разі відсутності терапевтично ефективної дози. Tерапевтично ефективна доза може бути спочатку оцінена на тваринних моделях (наприклад, пацюках, мишах, кролях, собаках або свинях). Тваринна модель може також використовуватися для визначення прийнятного інтервалу концентрації та способу введення. Така інформація може потім використовуватися для визначення корисних доз та способів введення людям. Терапевтична ефективність та токсичність (наприклад, ED50 - доза, що є терапевтично ефективною у 50 % популяції, а LD50 - це доза, що є летальною для 50 % популяції) імунокон'югату може бути визначена за допомогою стандартних фармацевтичних процедур у культурі клітин або на експериментальних тваринах. Співвідношення дози токсичності та терапевтичних ефектів являє собою терапевтичний індекс, він може виражатися як співвідношення LD50/ED50. Дані, одержані з дослідження на тваринах, можуть можуть використовуватися для рецептування інтервалу дозувань для використання у людини. Дозування, що міститься у такій композиції, може перебувати у межах інтервалу циркулюючих концентрацій, що включають ED50 з невеликою токсичністю або за її відсутності. Дозування варіюють у межах цього інтервалу в залежності від використовуваної дозованої форми, чутливості пацієнта та способу введення. Точне дозування може визначатися практикуючим лікарем у зв'язку з факторами, пов'язаними з пацієнтом, який вимагає лікування. Дозування та введення можуть доводитися для забезпечення достатніх рівнів імунокон'югату або для підтримання бажаного ефекту. Фактори, що можуть враховуватися, включають тяжкість стану захворювання, загальний стан здоров'я суб'єкта, вік, масу та стать суб'єкта, харчування, час та частоту введення, комбінацію(ії) лікарського засобу, реакції чутливості та толерантності/відповіді на терапію. Полінуклеотиди, що кодують імунокон'югати згідно з винаходом, можуть бути сконструйовані та вводитися у клітину або ex vivo, або in vivo при використанні добре відомих методик включаючи, але без обмеження, трансферин-катіон-опосередкований ДНК перенос, трансфекцію незахищених або інкапсульованих нуклеїнових кислот, опосередковане ліпосомами злиття клітин, внутрішньоклітинне транспортування латексних кульок, вкритих ДНК, злиття протопластів, вірусну інфекцію, електропорацію, "генну гармату" та опосередковану DEAE або фосфатом кальцію трансфекцію. Ефективні in vivo дозування токсофорних компонентів імунокон'югату перебувають в інтервалі від приблизно 5 мкг до приблизно 500 мкг/кг від маси тіла пацієнта. Спосіб введення фармацевтичної композиції, що містить імунокон'югат даного винаходу, може являти собою будь-який прийнятний спосіб, який доставляє антитіло до хазяїна. Як приклад, фармацевтичні композиції згідно з винаходом можуть бути корисними для парентерального введення (наприклад, підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньовенного або інтраназального введення). Всі патенти та патентні заявки, які згадані у даному розкритті, є чітко введеними у дану заявку як посилання. Приведене вище розкриття у загальних рисах описує даний винахід. Більш повне розуміння може бути одержане з посиланням на наступні специфічні приклади, які забезпечуються тільки з метою ілюстрації та не є призначеними для обмеження об'єму згідно з даним винаходом. ПРИКЛАДИ ПРИКЛАД 1: Ефективність імунокон'югату у мишачій ксенографтній моделі карциноми підшлункової залози людини, що експресує мезотелін Для того, щоб проаналізувати, чи є здатними анти-мезотелінові імунокон'югати знижувати ріст пухлини залежним від мезотеліну чином, клітини карциноми підшлункової залози людини (MiaPaCa-2) стабільно трансфікували за допомогою мезотеліну та використовували для забезпечення підшкірного росту мишачої моделі пухлини. Клітинну лінію карциноми кишечнику людини HT29 використовували для встановлення мезотелін-негативного контролю пухлини у дослідженні ефективності. MiaPaCa клітини підтримували як прикріплені культури у DMEM середовищі з доданням 10 % (об./об.) FCS, 2,5 % (об./об.) сироватки коня, 1,5 г/л карбонату натрію, 4,5 г/л глюкози, 4 мM глутаміну та 0,4 % (об./об.) гігроміцину. HT29 клітинми культивували у 5a середовищі МакКоя з 1,5 мМ глутаміну, 2,2 г/л карбонату натрію та 10 % (об./об.) FCS. Експресію мезотеліну MiaPaCa-2 клітинами та відсутність мезотеліну у HT29 15 UA 106492 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинах підтверджували за допомогою FACS (не представлено). Для оцінки росту in vivo пухлинних клітин самок NMRI безтимусних мишей підшкірно інокулювали у праву сторону тулуба за допомогою 3 × 106 MiaPaCa-2 клітин або 1 × 106 HT29 клітин, що були ресуспендовані у 50 % MatrigelTM та 50 % середовища. Як анти-мезотелінові імунокон'югати аналізували MF-J-SPDB-DM4, MF-T-SPDB-DM4, MF226-SPDB-DM4 та MOR6640-SPDB-DM4 при лікувальних дозах 0,01 мг/кг, 0,03 мг/кг, 0,05 мг/кг та 0,2 мг/кг (відносяться до кількості токсофору). MF-J-SPDB-DM4, MF-T-SPDB-DM4, MF226-SPDB-DM4 та MOR6640-SPDB-DM4 одержували при використанні наступної процедури: анти-мезотелінові антитіла модифікували при використанні 4-[2-піридилдитіо]масляної кислоти N-гідроксисукцинімідного естеру (SPDB) для введення груп дитіопіридилу. При концентрації антитіла 8 мг/мл використовували ~6кратний молярний надлишок SPDB (~20 мM маточний розчин у EtOH) для модифікації антитіла. Модифіковані антитіла піддавали реакції з 1,7-кратним молярним надлишком вільної форми тіолу майтансиноїду з доданням тіопіридилу. Реакцію здійснювали при концентрації антитіла 2,5 мг/мл у присутності 3 % диметилацетаміду (3 % об./об.) протягом 20 годин при кімнатній температурі. Реакційну суміш для кон'югації очищали від лікарського засобу, що не прореагував, та побічні продукти реакції видаляли при використанні знесолювальної колонки Sephadex G25. Кількість молекул майтансиноїду на антитіло підраховували шляхом вимірювання поглинання при 252 нм та при 280 нм, використовуючи коефіцієнти екстинкції 224000 M-1 cм-1 для антитіла та 5180 M-1 cм-1 для DM4 при 280 нм. Співвідношення поглинання 252 нм/280 нм складало 0,37 для антитіла та 5,05 для DM4. Лікування починали після приживлення пухлини через 5 днів після інокуляції пухлини, після чого проводили два додаткових лікування у дні 8 та 12 після інокуляції пухлиною. Контрольних мишей обробляли або при використанні 0,2 мг/кг нецільового імунокон'югату (анти-лізоцимSPDB-DM4), або при використанні рівних об'ємів, що містили тільки носій (10 мМ гістидину, 130 мМ гліцину, 5 % (мас./об.) цукрози, pH 5,5). Лікування проводили при використанні об'єму дози 100 мкл/10 г ваги тіла за допомогою внутрішньовенного введення. Групи складалися з 6 тварин кожна. Стан здоров'я мишей перевіряли щоденно. Довжину та ширину підшкірних пухлин вимірювали при використанні електронного штангенциркуля двічі на тиждень. Площу пухлини підраховували за допомогою формули: площа пухлини [мм2] = довжина [мм] x ширина [мм]. Усі одержані в експерименті дані записували. Приклад протипухлинної ефективності антимезотелінового імунокон'югату MF-T-SPDB-DM4 стосовно трансфікованих мезотеліном клітин карциноми підшлункової залози людини при різних дозах лікування є представленим на Фігурі 1. Самок NMRI безтимусних мишей інокулювали при використанні 3 × 106 позитивних за мезотеліном клітин карциноми підшлункової залози людини MiaPaCa-2 (A) або 1 × 106 негативних за мезотеліном клітин карциноми кишечнику людини HT29 (B), ресуспендованих у 50 % MatrigelTM/50 % середовища, в їх праву частину тулуба. Через 5, 8 та 12 днів після інокуляції пухлинними клітинами миші одержували 0,01, 0,03, 0,05, 0,2 мг/кг MF-T-SPDB-DM4, (усі концентрації відносяться до кількості токсофору) або тільки носій. Вимірювали довжину та ширину пухлини двічі на тиждень, та площу пухлини підраховували шляхом множення ширини на довжину. Будували графік на основі середніх значень та середнього квадратичного відхилення для кожної групи та часу вимірювання. Усі n=6. Зірочка показує P-значення 100 >100 >100 >100 >100 >100 0,3 0,21 1,5 8 18 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 0,35 1,2 1,0 1,3 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 5,2 9,0 > 50 > 50 > 50 0,2 0,9 9,2 5,1 20,7 > 50 > 50 > 50 0,6 1,07 0,19 9 17,2 > 50 > 50 > 50 0,45 2,8 16,3 10 26,5 > 50 > 50 > 50 0,9 14,8 58,3 33,1 > 50 > 50 > 50 0,4 >100 30 18 UA 106492 C2 Таблиця 3: Послідовності антитіл VH VL VH VL білкова білкова нуклеотидна нуклеотидна SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 1 4 7 10 13 16 20 24 28 32 Антитіло HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3 MF-J MOR 06640 MF-226 MF-T 1 4 7 10 13 17 21 25 29 33 2 3 5 6 8 9 11 12 14 15 18 19 22 23 26 27 30 31 34 35 19 UA 106492 C2 20 UA 106492 C2 21 UA 106492 C2 22 UA 106492 C2 23 UA 106492 C2 24 UA 106492 C2 25 UA 106492 C2 26 UA 106492 C2 27 UA 106492 C2 28