Застосування суміші галактоолігосахаридів, що мають ступінь полімеризації 3 або більше

Реферат: Винахід стосується застосування суміші галактоолігосахаридів, що мають ступінь полімеризації 3 або більше для профілактики запального захворювання кишечнику. UA 106491 C2 (12) UA 106491 C2 UA 106491 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується застосування олігосахариду, зокрема, галактоолігосахариду, для профілактики або лікування запалення, зокрема, для профілактики або лікування запального захворювання кишечнику. Галактоолігосахариди являють собою неперетравлювані вуглеводи, що стійкі до дії травних ферментів шлунково-кишкового тракту ссавців, але розщеплюються особливими бактеріями товстої кишки. Кишкова флора людини включає групи хвороботворних, нешкідливих і корисних мікроорганізмів. Перевага перших може приводити до захворювань кишечнику, що можуть бути як гострими (наприклад, гастроентерит), так і хронічними (наприклад, запальне захворювання кишечнику і деякі види злоякісних новоутворень кишечнику). Було показано, що пребіотики, під якими маються на увазі неперетравлювані харчові інгредієнти, що здійснюють корисний вплив на організм за допомогою вибіркової стимуляції росту і/або активності одного або декількох видів бактерій у товстій кишці і тим самим сприяючі поліпшенню стану здоров'я, мають непрямий захисний ефект при ряді запальних станів, таких як запальні захворювання кишечнику (ЗЗК). Було встановлено, що адаптивна імунна система деяких пацієнтів із ЗЗК гіперчутлива стосовно симбіонтної флори кишечнику (дивися Guarner F, Malagelada JR, Best Pract. Res. Clin. Gatroentero, (2003); 17; 793-804). Як наслідок, пребіотики застосовують з метою корекції корисної мікрофлори кишечнику, що допомагає запобігати рецидиву захворювання (дивися Sartor RD., Gastroenterology, (2004), 126, 1620-1633). Однією з груп сполук, які класифікуються як пребіотики, є галактоолігосахариди. Це галактозовмісні олігосахариди виду Глю(β 1-4)[Гал(β 1-6)]n, де n=2-5, що одержують з лактозного сиропу використовуючи трансгалактозилазну активність ферменту β-галактозидази (НВittenden, (1999) Probiotics: Α НВitical Review, Tannock, G. (ed) Horizon Scientific Press, Wymondham, pp 141-156). EP1644482 описує новий штам Bifidobacterium bidifum, який продукує активність ферменту галактозидази, що перетворює лактозу в суміш нових галактоолігосахаридів. Така суміш галактоолігосахаридів включає дисахариди Гал(β 1-3)-Глю; Гал(β 1-3)-Гал; Гал(β 1-6)-Гал; Гал(β 1-6)-Гал; трисахариди Гал (β 1-6)-Гал(β 1-4)-Глю або Гал(β 1-3)-Гал(β 1-4)-Глю; тетрасахарид Гал(β 1-6)-Гал(β 1-6)-Гал(β 1-4)-Глю або пентасахарид Гал(β 1-6)-Гал(β 1-6)-Гал(β 1-6)-Гал(β 14)-Глю і, як було показано, має пребіотичні властивості і збільшує чисельність корисних бактерій Bifidobacteria і Lactobacilli. Така суміш галактоолігосахаридів представлена на ринку за назвою Bimuno (зареєстрована торгова марка) і продається фірмою Clasado Ltd. (Milton Keynes, UK). Vulevic, J et al. описали в Am. J Clin. Nutr., (2008), 88: 1438-46, що призначення галактоолігосахаридів здоровим людям літнього віку приводило до позитивних ефектів як на сполуку мікрофлори фекалій, так і на імунну відповідь. До даного часу установлено, що галактоолігосахарид, що має СП (ступінь полімеризації) 3 або більше, здатний напряму модулювати запальну відповідь слизової кишечнику ссавців. Зокрема, він знижує прозапальну хемокінову відповідь у присутності факторів запалення. Таким чиног, подібний галактоолігосахарид може бути придатний для лікування таких запальних станів кишечнику як запальне захворювання кишечнику, коліт, некротичний ентероколіт, псевдомембранозний коліт, виразковий коліт, хвороба Крона, дивертикуліт, ішемія і т. д. Згідно із даним винаходом забезпечується галактоолігосахарид зі СП3 або більше для застосування з метою профілактики або лікування запалення, переважно для профілактики або лікування запальних захворювань кишечнику. Переважний галактоолігосахарид має СП від 3 до 5. Галактоолігосахарид має формулу трисахарида Гал-Гал-Глю, тетрасахариду Гал-гал-галглю або пентасахариду Гал-гал-гал-гал-глю, у якій Гал позначає залишок галактози і Глю позначає залишок глюкози. Структури галактоолігосахаридів являють собою Гал(β 1-6)-Гал (β 14)-Глю, Гал(β 1-3)-Гал(β 1-4)-Глю, Гал (β 1-6)-Гал (β 1-6)-Гал(β 1-4)-Глю і Гал(β 1-6)-Гал(β 1-6)Гал (β 1-6)-Гал(β 1-4)-Глю. Галактоолігосахарид переважно вибраний із групи, що складається з зазначених вище галактоолігосахаридів. Ентероцити утворюють однорядний поляризований епітеліальний шар, що розмежовує організм і вміст кишкової порожнини. Вони беруть активну участь у захисті організму. Їх уроджена імунна відповідь на різні запальні стимули, головним чиног, відповідає за швидке відновлення бар'єрної функції епітелію. При необхідності стимульований епітелій здатний виділяти прозапальні цитокіни і хемокіни, що запускають процес залучення в ушкоджені слизові клітин уродженого імунітету, таких як нейтрофіли. Наприклад, у ході імунної відповіді епітеліальні клітини і макрофаги можуть секретувати прозапальні хемокіни, такі як IL-8, для залучення в збуджені слизові нейтрофілів і ПЯЛ (поліморфноядерних лейкоцитів). Макрофагальний запальний білок-3a (MIP-3α) або CCL20 є ще одним хемокіног, що запускає адаптивну імунну систему за допомогою активації лімфоцитів і дендритних клітин через 1 UA 106491 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активацію їх хемокінового рецептора CCR6. Індукція IL-8 і MIP-3α (CCL20) відбиває виразність відповіді на запальний вплив. Вивчено вплив галактоолігосахариду на запальну відповідь у різних модельних культурах клітин товстої кишки дорослих людей. Зненацька було встановлено, що в епітеліальних клітинах кишечнику, тобто ентероцитах людини, вона у фізіологічних концентраціях послаблює прозапальну хемокінову відповідь, викликану запальною стимуляцією TNF-α. Галактоолігосахарид можна одержувати з комерційно доступної суміші галактоолігосахаридів, відомої як Bimuno, за допомогою очищення, наприклад, методом ексклюзійної хроматографії (гель-фільтрації) проведеної при кімнатній температурі за допомогою, наприклад, стовпчика Biogel P2. Зразок можна одержувати за допомогою розчинення порошку у воді 10 % мас./об. і елюювати зі швидкістю 2 мл/хв у деіонізованій воді. Альтернативно, активну фракцію суміші Bimuno можна одержувати за допомогою ферментативного трансгалактозилування з використанням відповідного ферменту. Галактоолігосахарид може бути представлений у формі порошку, або сиропу у виді м'якої пастилки. Його можна давати пацієнту, що страждає на запальне захворювання, наприклад, запальне захворювання кишечнику, щодня в ефективному дозуванні активного галактоолігосахариду від 1 до 10 г, переважно від 2 до 5 г, найбільш переважно 2,75 г. Його можна приймати або однократно в двох роздільних дозах через кілька годин. Порошок галактоолігосахариду можна додавати в гаряче питво або насипати в їжу. Сироп можна споживати або безпосередньо, альтернативно, додавати в напій або змішувати з їжею. М'яку пастилку розжовують у роті. З метою профілактики запалення індивідууму можна вводити галактоолігосахарид в ефективному щоденному дозуванні від 1 до 10 г, переважно 2 до 5 г, найбільш переважно 2,75 г. Відповідно до іншого аспекту винаходу, даним забезпечується спосіб лікування або профілактики запалення, такого як запалення кишечнику, що включає введення ефективної кількості галактоолігосахариду. Даний винахід буде доповнено за допомогою посилань на наступні приклади і фігури. на фігурі 1 показаний вплив B-ГОС на індуковану TNF-α секрецію IL-8 у клітинах T84; фігури 2(А) і (B) показують вплив B-ГОС на індуковану TNF-α секрецію IL-8 і MIP-3 у клітинах NCM-460; фігури 3(А)і (B) показують вплив B-ГОС на експресію IL-8 і MIP-3α мРНК у клітинах NCM-460, оброблених TNF-α; фігури 4(А), (B) і (C) показують вплив B-ГОС на переміщення білка NF-κB p65 у ядра клітин NCM-460, оброблених TNF-α; фігури 5 і 6 показують вплив B-ГОС на індуковану TNF-α секрецію IL-8 у клітинах NCM-460; фігури 7(А) і (B) показують вплив B-ГОС на секрецію IL-6 і MIP-2 у мишей, що одержували декстран сульфату натрію (ДСН); фігури 8(Α) і (B) показують вплив різних фракцій галактоолігосахаридів на продукцію IL-8 і MIP-3α, відповідно; і фігури 9(Α) і (B) показують вплив на індуковану TNF-α продукцію IL-8 і MIP-3, відповідно, у випадках, коли клітини NCM460 обробляють Bimuno і його фракціями СП3 і СП>3. Приклад 1 Вплив галактоолігосахаридів на секрецію цитокінів Епітеліальні клітини кишечнику вирощували в моношарі в 24-ямкових планшетах з 5 початкової концентрації 5×10 клітин/мл. Коли клітини досягали 70 % конфлюентності, їх обробляли в такий спосіб у чотирьох повторах: (i) негативний контроль, (ii) позитивний контроль TNF-α (10 нг/мл), (iii) B-ГОС (5 г/л) і (iv) TNF-α (10 нг/мл) з B-ГОС (5 г/л). Концентрацію олігосахаридів 5 г/л використовували виходячи з того, що вона є фізіологічною концентрацією олігосахаридів, виявлених у людському молоці. Через 16 годин збирали супернатанти і зберігали при -20 °C для подальшого вимірювання рівнів секреції IL-8 і MIP-3α методом ELISA. У наступних експериментах TNF-α замінювали на IL-1β або флагелін. Вимірювання IL-8. Концентрацію IL-8 вимірювали методом ELISA як було описано раніше (Claud EC, Savidge T, Walker WA 2003 Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatr Res 53:419-425). У короткому викладі, кожну ямку 96-ямкового високоадгезивного планшета (Nunc Immulon, Fisher Scientific, Middletown, VA, USA) покривали протягом ночі 100 мкл 3 мкг/мл моноклональних антитіл миші до IL-8 людини, тричі промивали за допомогою 200 мкл 1 % BSA у PBS і інкубували по 100 мкл зразків протягом однієї години при 37 °C. Потім ямки тричі промивали і інкубували в присутності 100 мкл 0,1 мкг/мл біотинілованих антитіл миші до IL-8 людини протягом однієї години. Після ще одного 2 UA 106491 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 промивання, кожну ямку інкубували в присутності 100 мкл пероксидази хрону і знову промивали перед інкубацією з 100 мкл O-фенілендіамін дигідрохлориду і пероксиду водню. Реакцію зупиняли 100 мкл 2Н H2S04 і вимірювали оптичну густину при 490 нм. Концентрацію IL-8 у зразках розраховували по каліброваній кривій стандарту IL-8. Вимірювання MIP-3α. Рівень секреції MIP-3α вимірювали методом ELISA аналогічно IL-8, за винятком того, що планшет покривали протягом ночі 100 мкл 2,0 мкг/мл моноклональних антитіл миші до MIP-3α людини. Детектовані антитіла, біотиніловані антитіла миші до MIP-3α людини, використовували як детектовані антитіла у концентрації 50 нг/мл у кінцевому об'ємі 100 мкл. Концентрацію MIP-3α у зразках розраховували по каліброваній кривій стандарту MIP-3α. Аналіз життєздатності клітин. Цитотоксичність B-ГОС оцінювали методом виключення по фарбуванню трипановим синім. Клітини NCM-460 вирощували на покривних стеклах з 5 початкової концентрації 2×10 клітин/мл. Клітини обробляли в трьох повторах B-ГОС (5 г/л) або контрольним середовищем. Через 16 годин життєздатність клітин NCM-460 вивчали методом виключення по фарбуванню трипановим синім (Raimondi F, НВivaro V, Capasso L, Maiuri L, Santoro P, Tucci M, Barone MV, Pappacoda S, Paludetto R 2006 Unconjugated bilirubin modulates the intestinal epithelial barrier function in a human-derived in vitro model. Pediatr Res 60:30-33). При даній концентрації не було виявлено істотного впливу B-ГОС на життєздатність клітин. Вплив B-ГОС на індукцію транскрипції цитокінів. Клітини NCM-460 ростили в моношарі в 65 ямкових планшетах з початкової концентрації 5×10 клітин/мл. Коли клітини досягали 70 % конфлюентності, їх обробляли в такий спосіб у чотирьох повторах: (i) негативний контроль, (ii) позитивний контроль TNF-α або IL-1β або флагелін (10 нг/мл), і (iii) TNF-α або IL-1 або флагелін (10 нг/мл) з B-ГОС (5 г/л). Через 18 годин виділяли загальну клітинну РНК методом екстракції в тризолі з хлороформом. Експресію мРНК IL-8, MIP-3α і MCP-1 вимірювали на MJ Opticon 2 за допомогою набору Superscript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR і стандартизували по експресії мРНК гена GAPDH. Вплив B-ГОС на переміщення NF-κB. Клітини NCM-460 вирощували до 70 % конфлюентності на покривних стеклах і обробляли в такий спосіб протягом 10 або 30 хвилин у двох повторах: (і) негативний контроль, (ii) позитивний контроль TNF-α (10 нг/мл), і (iii) TNF-α (10 нг/мл) з B-ГОС (5 г/л). Видаляли середовище і клітини фіксували 4 % параформальдегідом. Після пермеабілізації метанолом і блокування 10 % сироваткою кози в 0,25 % BSA у TBS, клітини обробляли поліклональними антитілами кролика до NF-κB p65 людини. Після промивання клітини інкубували з кон'югованими з CyTM-3 антитілами кози до антитіл кролика. Потім покривні стекла промивали і поміщали на предметні стекла для подальшої візуалізації під мікроскопом (Nikon Eclipse TE2000-S). Матеріали Цитокіни TNF-α, ІЛ-1β, флагелін, стрептавідин-пероксидаза хрону і комерційні набори ELISA для CCL20-MIP-3α людини (Quantikine) отримані від R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). IL-8 людини й антитіла миші до IL-8 людини отримані від Pierce Endogen (Woburn, MA, USA). Таблетки O-фенілендіаміну отримані від Pierce (Rockford, IL, USA). Тризол, набори Superscript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR і інші реагенти, необхідні для проведення кількісної ПЛР отримані від Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Середовище DMEM/F12, середовище CMRL, пеніцилін, стрептоміцин і буфер Hepes отримані від Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Фетальна бичача сироватка отримана від Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA, USA). M3D отримана від Incell Corp. (San Antonio, TX, USA). Поліклональні антитіла кролика до NF-κB (p65) людини отримані від Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA). Кон'юговані з CyTM-3 F(ab')2 фрагменти антитіл кози до IgG кролика отримані від Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA). Всі інші реагенти для імунофлуоресценції отримані від Vector Lab (Burlingame, CA, USA). Інші реагенти відповідали вимогам аналітичних або медико-біологічних досліджень і були отримані від Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). B-Галактоолігосахариди B-ГОС. Bimuno® був наданий Clasado Ltd., Milton Keynes, UK. Клітинні лінії епітелію кишечнику. У даних дослідженнях використовували модельні епітеліальні культури з кишечнику двох дорослих людей: клітини T84 і NCM-460 являють собою трансформовані і нетрансформовані епітеліальні клітини товстої кишки, відповідно. Клітини культивували в культуральних флаконах Falcon при 37 °C в атмосфері 95 % O2 і 5 % CO2, насиченій водяною парою. Середовище для культивування T84 складалося з DMEM/F12, доповненого FBS (5 %), буфером Hepes, глутаміног, замінними амінокислотами, пеніциліном і стрептоміцином (12). Середовище для культивування NCM-460 складалися із середовища M3D, доповненого FBS (10 %), пеніциліном і стрептоміцином як описано раніше (13). Статистична обробка. Індукцію цитокінів стандартизували по позитивному контролі з планками погрішностей, що відбивають середньоквадратичні відхилення (СО). Порівняння між 3 UA 106491 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 групами здійснювали за допомогою двостороннього t-тесту Ст'юдента. Результати генетичної експресії, отримані методом кількісної ПЛР, відбиті у вигляді середніх значень із вказуванням СО. Порівняння між групами здійснювали за допомогою двостороннього t-тесту Ст'юдента після логарифмічного перетворення. Значення p