Застосування cry1da в сполученні з cry1be для запобігання розвитку стійкості в комах

Реферат: Винахід належить до рослини для контролювання комах, кукурудзяної листової совки, де вказані рослини містять білок Cry1Da, який має інсектицидну дію, і білок Cry1Be, який має інсектицидну дію, а також містить різні комбінації інших білків, що містять вказану пару білків, для сповільнення або запобігання розвитку стійкості у комах. UA 111710 C2 (12) UA 111710 C2 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Люди вирощують кукурудзу для використання при виробництві їжі і енергії. Люди також вирощують велику кількість інших видів зернових, включаючи сою і бавовну. Комахи поїдають і пошкоджують рослини і, тим самим, підривають зусилля людей. Мільярди доларів щорічно витрачаються на контроль комах-шкідників і, крім цього, мільярди доларів втрачаються у вигляді збитку, нанесеного комахами. Синтетичні органічні хімічні інсектициди є основним інструментом контролю комах-шкідників, але біологічні інсектициди, наприклад, білки, що мають інсектицидну дію, отримані з Bacillus thuringiensis (Bt), грають важливу роль в тих же галузях застосування. Можливість отримання стійких до комах рослин шляхом трансформації генами Bt білків, що мають інсектицидну дію, здійснила революцію в сучасному сільському хазяйстві і підвищила важливість і цінність білків, які мають інсектицидну дію і їх генів. Декілька Bt білків були використані для створення стійких до комах трансгенних рослин, які до теперішнього часу успішно зареєстровані і виведені на ринок. Вказані білки включають Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F і Cry3Bb у кукурудзи, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовни і Cry3A у картоплі. Комерційні продукти, що експресують ці білки, експресують один білок за винятком випадків, коли бажаний комбінований інсектицидний спектр дії двох білків (наприклад, Cry1Ab і Cry3Bb у кукурудзи комбінують для забезпечення стійкості, відповідно, до лускокрилих комах-шкідників і кореневих черв'яків), або коли незалежна дія білків дозволяє використовувати їх як засіб, що сповільнює розвиток стійкості в цільовій популяції комах (наприклад, Cry1Ac і Cry2Ab у бавовни комбінують для забезпечення контролю розвитку стійкості у тютюнової листовійки-брунькоїда). Див. також публікацію заявки на патент США № 2009/0313717, що стосується білка Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F або Cry1A для контролю Helicoverpa zea або armigerain. WO 2009/132850 стосується використання Cry1F або Cry1A і Vip3Aa для контролю Spodoptera frugiperda. Публікація заявки на патент США №2008/0311096 частково стосується використання Cry1Ab для контролю ECB, стійкого до Cry1F. Таким чином, деякі властивості трансгенних рослин, стійких до комах, які привели до швидкого і широкого впровадження цієї технології, також викликали побоювання, що популяції комах-шкідників вироблять стійкість до білків, які мають інсектицидну дію, що продукується цими рослинами. Було запропоновано декілька стратегій для збереження утилітарності пов'язаних зі стійкістю до комах ознак, основаних на Bt, які включали введення білків у високих дозах в комбінації з організацією сховищ (рефугій), і почергове або одночасне введення різних токсинів (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol, 16:144-146). Білки, вибрані для використання в наборі для керування стійкістю комах (IRM) повинні виявляти свою інсектицидну дію незалежно таким чином, щоб стійкість, розвинена до одного білка, не спричиняла появи стійкості до другого білка (тобто, щоб була відсутня перехресна стійкість до білків). Наприклад, якщо популяція комахи-шкідника, яка відібрана на стійкість до "Білка А", є чутливою до "Білка В", можна зробити висновок, що перехресна стійкість відсутня і, що комбінація Білка А і Білка В буде ефективною для сповільнення розвитку стійкості до Білка А, що застосовується ізольовано. За відсутності популяцій комах, що мають стійкість, може бути проведений аналіз на основі інших характеристик, які, як передбачається, пов'язані з механізмом дії і потенціалом розвитку перехресної стійкості. Були висунуті припущення, згідно з якими для ідентифікації білків, що мають інсектицидну дію, які, ймовірно, не мають властивості перехресної стійкості, можна використовувати опосередковане рецептором зв'язування (van Mellaert et al. 1999). Ключовий прогнозуючий параметр відсутності перехресної стійкості, природно властивий такому підходу, полягає в тому, що білки, які мають інсектицидну дію, не конкурують за рецептори у чутливих до них видів комах. Якщо два Bt токсини конкурують за один і той ж рецептор, то у випадку мутації цього рецептора у комахи, при якій один з токсинів більше не зв'язується з цим рецептором і, отже, який більше не має інсектицидної дії, відносно цієї комахи, ця комаха може стати стійкою також і до другого токсину (який конкурентно зв'язується з тим же рецептором). При цьому комаха розглядається як така, що має перехресну стійкість до обох Bt токсинів. Однак якщо два токсини зв'язуються з різними рецепторами, це може служити вказівкою на те, що комаха може не бути одночасно стійкою до цих двох токсинів. Наприклад, білок Cry1Fa застосуємо для контролю багатьох лускокрилих комах-шкідників, включаючи метелика кукурудзяного (ECB; Ostrinia nubilalis (Hubner)) і FAW, і виявляє активність відносно вогнівки цукрової тростини (SCB; Diatraea saccharalis). Білок Cry1Fa, що виробляється в трансгенних рослинах кукурудзи, що містять фактор TC1507, є відповідальним за розвиток стійкості до домінуючих в даній галузі комах, тобто для контролю FAW. Cry1Fa також використовується в продуктах Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. 1 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Здатність проводити дослідження (конкурентного або гомологічного) опосередкованого рецептором зв'язування з використанням білка Cry1Fa обмежена, оскільки більшість доступних методик мічення білків для їх виявлення в аналізі опосередкованого рецептором зв'язування інактивують інсектицидну активність білка Cry1Fa. Додаткові Cry токсини перераховані на веб-сайті офіційного комітету по номенклатурі B.t. (Crickmore et al.; lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). У даний час існує приблизно 60 основних груп "Cry" токсинів (Cry1-Cry59) з додатковими Cyt токсинами, VIP токсинами і т. п. Багато груп з числовими позначеннями мають підгрупи, позначені великими буквами, а позначені великими буквами підгрупи мають підгрупи, позначені маленькими буквами. (Наприклад, Cry1 має підгрупи A-L, а Cry1A має підгрупи a-i). Короткий опис винаходу Даний винахід частково стосується несподіваного відкриття, що полягає в тому, що Cry1Da і Cry1Be не конкурують за ділянки зв'язування в мембранних препаратах, отриманих з клітин кишечнику кукурудзяної листової совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Фахівець в даній галузі техніки зрозуміє, з урахуванням даного розкриття, що рослини, які виробляють обидва ці білки (включаючи частини повнорозмірних білків, що мають інсектицидну дію) можуть сповільнити або запобігти розвитку стійкості до даних білків, що мають інсектицидну дію, окремо. Кукурудза і соя являють собою переважні рослини. Таким чином, даний винахід частково стосується застосування білка Cry1Da в комбінації з білком Cry1Be. Рослини (і площа угідь, засіяних такими рослинами), які виробляють обидва ці білки, включені в об'єм даного винаходу. Даний винахід також стосується пакетів або "пірамід" з трьох (або більше) токсинів, в яких Cry1Da і Cry1Be є основною парою. У деяких переважних варіантах здійснення пірамід комбінація вибраних токсинів забезпечує активність відносно FAW в трьох місцях дії. Деякі переважні комбінації-піраміди з "трьома місцями дії" включають основну пару білків, плюс Cry1Fa, Vip3Ab або Cry1E як третій білок, що впливає на FAW. Ці конкретні потрійні пакети, згідно з даним винаходом, несподівано забезпечують три місця дії відносно FAW. Це може сприяти пом'якшенню або усуненню вимоги до посівної площі. Згідно з даним винаходом також можуть бути додані додаткові токсини/гени. Наприклад, якщо Cry1Fa вводять в пакет разом з парою білків за винаходом (обидва білки Cry1Fa і Cry1Be виявляють активність як відносно FAW так і відносно метелика кукурудзяного (ECB)), додавання двох додаткових білків в цей потрійний пакет, в якому два додаткові білки націлені на ECB, забезпечить три місця дії відносно FAW і три місця дії відносно ECB. Цей доданий білок (четвертий білок) може бути вибраний з групи, яка складається з Cry2A, Cry1I, DIG-3 і Cry1Ab, що дає в результаті пакет з чотирьох білків, які мають по три місця дії у двох комах (ECB і FAW). ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід частково стосується несподіваного відкриття, яке полягає в тому, що Cry1Da і Cry1Be не конкурують один з одним за ділянки зв'язування в мембранних препаратах, отриманих з клітин кишечнику кукурудзяної листової совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким чином, білок Cry1Da може бути використаний в комбінації з білком Cry1Be в трансгенній кукурудзі (і інших рослинах, наприклад, бавовні і сої) для сповільнення або запобігання розвитку у FAW стійкості до кожного зі вказаних білків окремо. Пара білків, що розглядається, може бути ефективною при захисті рослин (таких рослин, як маїс і соя) від пошкоджень, що наносяться кукурудзяною листовою совкою, стійкою до Cry. Іншими словами, одна з галузей застосування даного винаходу стосується захисту кукурудзи і інших економічно важливих видів рослин від пошкоджень і втрати урожаю, викликаних популяціями кукурудзяної листової совки, у яких може розвинутися стійкість до Cry1Da або Cry1Be. У даному винаході, таким чином, розкривається пакет для керування стійкістю комахами (IRM), що містить Cry1Da і Cry1Be, призначений для запобігання або послаблення розвитку у FAW стійкості до кожного або обох цих білків. Даний винахід забезпечує композиції для контролю лускокрилих комах-шкідників, що містять клітини, які продукують білок Cry1Da, що має інсектицидну дію, і білок Cry1Be, що має інсектицидну дію. Винахід також стосується хазяїна, трансформованого для продукування як білка, який має інсектицидну дію, Cry1Da, що так і білка Cry1Be, який має інсектицидну дію, причому вказаний хазяїн являє собою мікроорганізм або клітину рослини. Полінуклеотид(и), що розглядається, переважно знаходиться в генетичній конструкції під керуванням промотору(ів), що не належать Bacillus thuringiensis. Полінуклеотиди, що розглядаються, можуть містити кодони, що використовуються для посиленої експресії в рослинах. Додатково передбачається, що винахід забезпечує спосіб контролю лускокрилих комах 2 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шкідників, що містить приведення в контакт вказаних комах-шкідників з ефективною кількістю композиції, яка містить білок, що містить ядро токсину Cry1Da, і білок, що містить ядро токсину Cry1Be. Один з варіантів здійснення винаходу містить рослину маїсу, що містить експресований в рослині ген Cry1Be, що кодує білок, який має інсектицидну дію, і експресований в рослині ген Cry1Da, що кодує білок, який має інсектицидну дію. Інший варіант здійснення винаходу містить рослину маїсу, в якій експресований в рослині ген, що кодує білок Cry1Be, який має інсектицидну дію, і експресований в рослині ген Cry1Da, що кодує білок, який має інсектицидну дію, були введені у вказану рослину маїсу шляхом інтрогресії. Як описано в Прикладах, дослідження конкурентного зв'язування з рецептором з використанням мічених радіоактивним ізотопом білків Cry1Da і Cry1Be показали, що білок Cry1Be не конкурує за зв'язування в тканинах FAW, в яких відбувається зв'язування Cry1Da. Ці результати також вказують на те, що комбінація білків Cry1Da і Cry1Be може являти собою ефективний засіб для послаблення розвитку стійкості в популяціях FAW до кожного з цих білків. Таким чином, частково основуючись на даних, представлених в цьому документі, можна передбачити, що спільне продукування (пакетування) білків Cry1Be і Cry1Da може бути використане для отримання IRM пакету з високими дозами для FAW. До цієї пари можуть бути додані інші білки. Наприклад, винахід, що розглядається, також частково стосується потрійних пакетів або "пірамід", що складаються з трьох (або більше) токсинів, де Cry1Da і Cry1Be є основною парою. У деяких переважних варіантах здійснення піраміди, вибрані токсини мають три окремі місця дії у FAW. Деякі переважні комбінації-піраміди з "трьома місцями дії" включають основну пару білків, плюс Cry1Fa, Vip3Ab або Cry1E як третій білок, що впливає на FAW. Ці конкретні потрійні пакети, згідно з даним винаходом, несподівано забезпечують три місця дії у FAW. Це може сприяти пом'якшенню або усуненню вимоги про посівні площі. Під "окремими місцями дії" мається на увазі те, що кожний з даних білків не викликає розвитку перехресної стійкості з іншими білками. Згідно з даним винаходом також можуть бути додані додаткові токсини/гени. Наприклад, якщо Cry1Fa вводять в пакет разом з парою білків за винаходом (обидва білки Cry1Fa і Cry1Be виявляють активність як відносно FAW, так і відносно метелика кукурудзяного (ECB)); при цьому додавання одного додаткового білка в цей потрійний пакет, в якому четвертий додатковий білок націлений на ECB, забезпечить три місця дії відносно FAW і три місця дії відносно ECB. Ці додані білки (четвертий білок) можуть бути вибрані з групи, яка складається з Cry2A, Cry1I, DIG3 (див. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 грудня 2009) і US 2010 00269223) і Cry1Ab (US 2008 0311096). Це дає в результаті пакет з чотирьох білків, що мають по три місця дії відносно двох комах (ECB і FAW). Таким чином, одна з можливих схем обробки являє собою використання пари білків, що розглядається в комбінації з третім токсином/геном, і використання цього потрійного пакету для послаблення розвитку у FAW стійкості до кожного з цих токсинів. Відповідно, винахід, що розглядається, також стосується потрійних пакетів або "пірамід", що складаються з трьох (або більше) токсинів. У деяких переважних варіантах здійснення піраміди, вибрані токсини мають три окремі місця дії відносно FAW. Серед інших схем обробки за даним винаходом можуть бути використані два, три або більше білків з білків, що розглядаються, в регіонах зростання кукурудзи, в яких FAW може формувати популяції з розвиненою стійкістю. Наприклад, що стосується використання Cry1Fa плюс Cry1D, в заявці на патент США № 61/284252 (подана 16 грудня 2009) показано, що Cry1D активний відносно FAW, стійкої до Cry1F. У цій заявці показано, що Cry1D не конкурує з Cry1F за зв'язування в мембранних препаратах FAW. Для рекомендацій відносно використання Cry1Fa і Cry1Be, див. заявку на патент США № 61/284294, а відносно використання з Vip3Ab, див. одночасно подану заявку, озаглавлену "COMBINED USE OF Vip3Ab AND Cry1Fa FOR MANAGEMENT OF RESISTANT INSECTS". З урахуванням того, що Cry1Fa активний відносно FAW (і метелика кукурудзяного (ECB)), Cry1Da плюс Cry1Сa плюс Cry1Fa несподівано забезпечують, згідно з даним винаходом, три місця дії відносно FAW. Це може сприяти пом'якшенню або усуненню вимоги до посівної площі. Cry1Fa міститься в продуктах Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. Пара генів (Cry1Da і Cry1Be), що розглядається, може бути скомбінована, наприклад з продуктом, що містить Cry1Fa, таким як Herculex®, SmartStax™ і WideStrike™. Відповідно, пара білків, що розглядається, може відіграти значну роль в зменшенні тиску відбирання на ці і інші комерційно доступні білки. Пара білків, що розглядається, може бути використана в комбінаціях з трьох генів для кукурудзи і інших рослин (наприклад, бавовни і сої). 3 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як вже вказувалося вище, згідно з даним винаходом також можуть бути додані додаткові токсини/гени. Для впливу на ECB може бути використаний Cry2A, Cry1I і/або DIG-3. Див. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 грудня 2009). Відносно використання Cry1Ab (для контролю ECB) див. публікацію заявки на патент США № 2008/0311096. Відносно використання Cry1E (для контролю FAW) див. заявку на патент США № 61/284278 (подана 16 грудня 2009). Рослини (і площі угідь, засіяні такими рослинами), які виробляють будь-яку з комбінацій білків, що розглядаються, включені в об'єм даного винаходу. Також можуть бути додані додаткові токсини/гени; однак конкретні пакети, що обговорюються вище, несподівано забезпечують множину місць дії проти FAW і ECB. Це може сприяти пом'якшенню або усуненню вимоги про площі сховищ. Отже, поле, засіяне таким чином, площа якого перевищує десять акрів, входить в об'єм даного винаходу. Для отримання послідовностей будь-яких генів і білків, що обговорюються в цьому документі, також може бути використаний GENBANK. Див. Додаток А нижче. У патентах також розкриваються релевантні послідовності. Наприклад, патент США № 5188960 і патент США № 5827514 описують білки, що містять ядро токсину Cry1Fa, які є прийнятними для здійснення даного винаходу. Патент США № 6218188 описує оптимізовані для рослин послідовності ДНК, що кодують білки, які містять ядро токсину Cry1Fa, які підходять для використання в даному винаході. Комбінації білків, описаних в цьому документі, можуть бути використані для контролю лускокрилих комах-шкідників. Дорослі лускокрилі, наприклад, метелики і метелі, в основному харчуються квітковим нектаром і є важливими запилювачами. Практично всі личинки лускокрилих, тобто гусениці, харчуються рослинами, і багато з них є важливими комахамишкідниками. Гусениці поїдають внутрішню частину листя, коріння або стебло рослини, позбавляючи рослину можливості отримувати поживні речовини і часто руйнуючи фізичну опорну структуру рослини. Крім цього, гусениці поїдають плоди, тканини і зерно і борошно, що зберігаються, надаючи цим продуктам нетоварного вигляду або серйозно знижуючи їх цінність. Як використовується в цьому документі, під лускокрилими комахами-шкідниками маються на увазі різні стадії життєвого циклу комахи-шкідника, включаючи стадії личинки. Деякі химерні токсини за даним винаходом містять повну N-кінцеву частину ядра токсину Bt і, в деякій точці від кінця частини, що містить ядро токсину, білок переходить в гетерологічну послідовність протоксину. N-кінцева частина токсину Bt, що має інсектицидну активність, називається "ядром" токсину. Перехід від сегмента ядра токсину до сегмента гетерологічного протоксину може знаходитися приблизно в місці з'єднання токсин/протоксин, або як альтернатива, може бути збережена частина природного протоксину (що простягається за межі частини ядра токсину) з переходом в гетерологічну частину, протоксин, розташовану далі. Як приклад, один з химерних токсинів за даним винаходом являє собою частину, що стосується ядра токсину Cry1Da (приблизно від 1 до 601 амінокислоти) і/або гетерологічний протоксин (амінокислоти від 602 до С-кінця). У одному з переважних варіантів здійснення частину химерного токсину, що містить протоксин, отримують з білка-токсину Cry1Ab. У переважному варіанті здійснення, частину химерного токсину, що містить протоксин,отримують з білка-токсину Cry1Ab. Фахівець в даній галузі техніки визнає, що Bt токсини, навіть в рамках певного класу, такого як Cry1Be, дещо розрізнюються по довжині і точному положенню переходу від ядра токсину до частини, що стосується протоксину. Звичайно, токсини Cry1Be мають довжину від приблизно 1150 до приблизно 1200 амінокислот. Перехід від частини, що стосується ядра токсину, до частини, що стосується протоксину, звичайно знаходиться в межах від 50 % до 60 % повної довжини токсину. Химерний токсин винаходу, що розглядається, повністю включає вказану Nкінцеву частину ядра токсину. Таким чином, химерний токсин містить щонайменше 50 % повної довжини білка-токсину Cry1Be, що звичайно складає щонайменше 590 амінокислот. Що стосується частини, яка стосується протоксину, то повна довжина частини, що стосується протоксину Cry1Ab, простягається від кінця частини, що стосується ядра токсину, до С-кінця молекули. Гени і токсини. Гени і токсини, що використовуються за даним винаходом, включають не тільки розкриті послідовності повної довжини, але також фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають характеристики пестицидної активності токсинів, приклади яких приведені в цьому документі. У цьому документі, термін "варіанти" або "варіації" генів стосується нуклеотидних послідовностей, які кодують одні і ті ж токсини або кодують токсини-еквіваленти, що мають пестицидну активність. У цьому документі, термін "токсиниеквіваленти" стосується токсинів, що мають таку ж або по суті таку ж біологічну активність відносно цільових комах-шкідників, що і заявлені токсини. 4 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У цьому документі використовуються наступні обмежувальні ознаки: приблизно 95 % (для Cry1Da і Cry1Be), 78 % (для Cry1D і Cry1B) і 45 % (для Cry1) ідентичність послідовностей згідно з "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62:807-813. Ці обмеження застосовні тільки відносно ядра токсинів. Для фахівця в даній галузі техніки очевидно, що гени, які кодують активні токсини, можуть бути ідентифіковані і отримані декількома способами. Конкретні гени або частини генів, проілюстровані в цьому документі, можуть бути отримані з ізолятів, депонованих в депозитарії культур. Ці гени або їх частини, або варіанти також можуть бути сконструйовані синтетично, наприклад, з використанням синтезатора генів. Варіації генів можуть бути легко сконструйовані стандартними методами для здійснення точкових мутацій. Фрагменти цих генів також можуть бути отримані з використанням комерційно доступних екзонуклеаз або ендонуклеаз згідно зі стандартними процедурами. Наприклад, для послідовного відщеплення нуклеотидів від кінців цих генів можуть бути використані такі ферменти, як Bal31, або сайт-направлений мутагенез. Гени, що кодують активні фрагменти, також можуть бути отримані з використанням різних рестрикційних ферментів. Для безпосереднього отримання активних фрагментів вказаних білків-токсинів можуть бути використані протеази. Фрагменти і еквіваленти, які зберігають пестицидну активність проілюстрованих токсинів також знаходяться в межах об'єму даного винаходу. Внаслідок надмірності генетичного коду амінокислотні послідовності, розкриті в цьому документі, можуть кодуватися множиною різних ДНК-послідовностей. Фахівцеві в даній галузі техніки не складе труднощів створити альтернативні ДНК-послідовності, що кодують такі ж або по суті такі ж токсини. Такі варіанти ДНК-послідовностей знаходяться в межах об'єму даного винаходу. У цьому документі "по суті такі ж" послідовності означають послідовності, що мають заміни, делеції, додавання або вставки, які істотно не впливають на пестицидну активність. Це визначення також охоплює фрагменти генів, що кодують білки, які зберігають пестицидну активність. Ще один спосіб ідентифікації генів, що кодують токсини, і частин генів, придатних згідно з даним винаходом, полягає у використанні олігонуклеотидних зондів. Такі зонди являють собою детектовані нуклеотидні послідовності. Ці послідовності можуть бути детектованими внаслідок наявності відповідної мітки або можуть бути виконані з можливістю їх природної флуоресценції, як описано в міжнародній заявці WO93/16094. Як відомо з рівня техніки, якщо зонд і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються, формуючи сильний зв'язок між двома вказаними молекулами, можна зробити досить обґрунтоване припущення, що зонд і зразок є по суті гомологічними. Переважно, гібридизацію проводять в жорстких умовах методом, добре відомим з рівня техніки, наприклад, описаним в Keller, Г. FL, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Деякі приклади комбінацій концентрації солі і температури є наступними (в порядку зростання жорсткості): 2X SSPE або SSC при кімнатній температурі; 1X SSPE або SSC при 42 °C; 0,1X SSPE або SSC при 42 °C; 0,1X SSPE або SSC при 65 °C. Детектування зонда забезпечує засіб для визначення відомим способом, чи сталася гібридизація. Такий зондовий аналіз забезпечує швидкий спосіб ідентифікації кодуючих токсин генів за даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, що використовуються як зонди, згідно з винаходом, можуть синтезуватися в ДНК-синтезаторі і за допомогою стандартних процедур. Дані нуклеотидні послідовності також можуть використовуватися як ПЛР-праймери для ампліфікації генів за винаходом. Варіанти токсинів. У цьому документі, зокрема, приведені приклади деяких токсинів за винаходом. Оскільки ці токсини є усього лише прикладами токсинів за винаходом, очевидно, що даний винахід містить варіанти або еквівалентні токсини (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні токсини), які мають пестицидну активність, таку ж або аналогічну пестицидну активність токсину, приведеного як приклад. Еквівалентні токсини мають гомологію по амінокислотах з приведеним як приклад токсином. Така гомологія по амінокислотах звичайно перевищує 75 %, переважно перевищує 90 % і найбільш переважно перевищує 95 %. Гомологія по амінокислотах є найбільшою в критичних областях, які відповідальні за біологічну активність або беруть участь у визначенні тривимірної конфігурації, яка, зрештою, і відповідає за біологічну активність. У цьому відношенні, певні амінокислотні заміни є прийнятними і допустимими, якщо ці заміни знаходяться в областях, які не є критичними для активності або являють собою консервативні амінокислотні заміни, які не впливають на тривимірну конфігурацію молекули. Наприклад, амінокислоти можуть бути віднесені до наступних класів: неполярні, незаряджені полярні, основні і кислі. Консервативні заміни, в яких амінокислота одного класу замінюється амінокислотою з того ж класу, знаходяться в межах об'єму даного винаходу при умові, що така 5 UA 111710 C2 заміна не змінює істотно біологічну активність сполуки. Нижче приводиться список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. Клас амінокислот неполярні незаряджені полярні кислі основні 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Asp, Glu Lys, Arg, His У деяких прикладах також можуть бути використані неконсервативні заміни. При цьому критичним фактором є те, що такі заміни не повинні істотно погіршувати біологічну активність токсину. Рекомбінантні хазяї. Гени, що кодують токсини за даним винаходом, можуть бути введені у множину різних мікроорганізмів-хазяїнів або рослин-хазяїнів. Експресія гена токсину приводить в результаті, прямо або опосередковано, до внутрішньоклітинного продукування і підтримування пестициду. Для створення штаму Bt, що експресує обидва токсини за винаходом, можуть бути використані кон'югаційне перенесення і рекомбінантне перенесення. Один або обидва гени токсинів можуть бути перенесені також в інші організми-хазяїни, які можуть потім використовуватися для отримання синергічного ефекту. При використанні прийнятних мікроорганізмів-хазяїнів, наприклад, Pseudomonas, такі мікроорганізми можна застосовувати в місцях знаходження комахи-шкідника, де вони будуть розмножуватися і потрапити в кишечник комахи, що приведе в результаті до контролю комахи-шкідника. Як альтернатива, мікроорганізми, що містять ген токсину, можуть бути оброблені в умовах, що продовжують активність токсину і стабілізують клітину. Потім оброблені клітини, які зберігають токсичну активність, вносять в середовище проживання цільової комахи-шкідника. Якщо ген Bt токсину вводять за допомогою прийнятного вектора в мікроорганізм-хазяїн, а вказаний хазяїн потім вводять в середовище проживання в живому стані, то принциповим моментом є використання певних мікроорганізмів-хазяїнів. Вибираються такі мікроорганізмихазяїни, стосовно яких відомо, що вони проживають в "фітосфері" (філоплані, філосфері, ризосфері і/або ризоплані) однієї або більше зернових культур, які представляють інтерес. Такі мікроорганізми вибирають таким чином, щоб вони мали здатність успішно конкурувати в конкретному середовищі проживання (зерновій культурі або інших місцях проживання комах) з дикими типами мікроорганізмів, забезпечували стабільну підтримку і експресію поліпептидупестициду і, бажано, забезпечували поліпшений захист пестициду від розкладання і інактивації під дією навколишнього середовища. Відносно величезної кількості мікроорганізмів відомо, що вони проживають в філоплані (поверхні листя рослин) і/або в ризосфері (ґрунті, що оточує кореневу систему рослини) множини важливих зернових культур. Ці мікроорганізми включають бактерії, водорості і гриби. Особливий інтерес представляють такі мікроорганізми, як бактерії, наприклад, що належать до родів Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc і Alcaligenes; гриби, зокрема, дріжджі, наприклад, що належать до видів Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula і Aureobasidium. Особливий інтерес представляють такі види, що проживають в фітосфері бактерії, як Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus і Azotobacter vinlandii, такі види дріжджів, що проживають в фітосфері, як Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, С. diffluens, С. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae і Aureobasidium pollulans. Особливий інтерес представляють пігментовані мікроорганізми. Існує широкий спектр способів введення Bt генів, що кодує токсин, в мікроорганізм-хазяїн в умовах, що забезпечують стабільну підтримку і експресію цього гена. Ці способи добре відомі фахівцям в даній галузі техніки і описані, наприклад, в патенті США № 5135867, який включений в цей документ у вигляді посилання. Обробка клітин. Клітини Bacillus thuringiensis або рекомбінантні клітини, що експресують Bt токсини, можуть бути оброблені з метою продовження активності токсину і стабілізації клітини. Мікрокапсула, що формується з пестицидом містить Bt токсин або токсини всередині клітинної структури, яка була стабілізована і захищає токсин при внесенні мікрокапсули в середовище проживання цільової комахи-шкідника. Прийнятні клітини-хазяїни можуть включати або клітини 6 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прокаріот, або еукаріот, і звичайно обмежені тільки тими клітками, які не виробляють речовини, токсичні для вищих організмів, таких як ссавці. Проте, можуть бути використані організми, що виробляють речовини, токсичні для вищих організмів, якщо ці токсичні речовини є нестабільними, або кількість, що вноситься, є досить низькою, настільки, що при цьому відсутня яка-небудь імовірність інтоксикації ссавця-хазяїна. Як хазяїни особливий інтерес представляють прокаріоти і нижчі еукаріоти, такі як гриби. При обробці клітини звичайно є інтактними і по суті знаходяться в проліферативній формі, а не в формі спор, хоча в деяких випадках можуть бути використані спори. Обробка клітин мікроорганізмів, тобто клітин, що містять ген або гени Bt токсину, може виконуватися з використанням хімічних або фізичних засобів або з використанням комбінації хімічних і/або фізичних засобів при умові, що ці методи не впливають негативного чином на властивості токсину, а також не погіршують здатність клітини захищати токсин. Прикладами хімічних реагентів є галогенуючі агенти, зокрема, галогени з атомними номерами 17-80. Точніше, можна використовувати йод в м'яких умовах протягом часу, достатнього для досягнення бажаних результатів. Інші прийнятні методи включають обробку альдегідами, такими як глутаральдегід; протиінфекційними засобами, такими як зефіран хлорид і цетилпіридинхлорид; спиртами, такими як ізопропіловий спирт і етанол; різними гістологічними фіксаторами, такими як Люголь-йод, фіксатор Буена, різні кислоти і фіксатор Helly (див. Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); або комбінацією фізичних (тепло) і хімічних агентів, які захищають і сприяють пролонгуванню активності токсину, продукованого в клітині при введенні цієї клітини тварині-хазяїну. Прикладами фізичних засобів є короткохвильове випромінювання, таке як гаммавипромінювання і рентгенівське випромінювання, заморожування, УФ-опромінення, ліофілізація і інші. Способи обробки клітин мікроорганізмів описані в патентах США №№ 4695455 і 4695462, які включені в цей документ у вигляді посилання. Клітини звичайно мають підвищену структурну стабільність, що збільшує їх стійкість до умов навколишнього середовища. Якщо пестицид знаходиться в проформі, спосіб обробки клітини потрібно вибирати таким чином, щоб патогеном цільової комахи-шкідника не пригнічувався процесинг від проформи до зрілої форми пестициду. Наприклад, формальдегід буде зшивати білки і може пригнічувати процесинг проформи поліпептиду-пестициду. Спосіб обробки клітини повинен сприяти збереженню щонайменше істотної частки біодоступності або біоактивності токсину. Характеристики, які представляють особливий інтерес, при виборі клітини-хазяїна з метою продукування, включають легкість введення Bt гена або генів в клітину-хазяїна, доступність експресуючої системи, ефективність експресії, стабільність пестициду в клітині-хазяїні і наявність допоміжних генетичних можливостей. Характеристики, які представляють особливий інтерес, у випадку використання у вигляді пестицидної мікрокапсули включають захисні властивості відносно пестициду, такі як товсті клітинні стінки, пігментація і внутрішньоклітинна упаковка або формування включень; виживання у водному середовищі; відсутність токсичності для ссавця; привабливість для поглинання комахами-шкідниками; легкість в знищенні і фіксації без пошкодження токсину, і тому подібне. Також може розглядатися легкість в створенні і звертанні, економічність, стабільність при зберіганні і тому подібне. Вирощування клітин. Клітину-хазяїна, що містить інсектицидний Bt ген або гени можна вирощувати в будь-якому прийнятному поживному середовищі, в якому ДНК-конструкція забезпечує селективну перевагу, забезпечуючи таке селективне середовище, що всі або по суті всі клітини зберігають Bt ген. Потім ці клітини можуть бути зібрані відомими методами. З іншого боку, клітини можна обробляти до їх збирання. Bt клітини, продукуючі токсини за винаходом, можуть бути культивовані з використанням стандартних середовищ і методів ферментації, відомих в даній галузі техніки. Після завершення циклу ферментації бактерії можуть бути зібрані спочатку шляхом виділення спор і кристалів Bt з ферментаційного бульйону способами, добре відомими в даній галузі. Відновлені спори і кристали Bt можуть бути представлені в складах у вигляді змочуваного порошку, рідкого концентрату, гранул або у вигляді інших складів з додаванням поверхнево-активних речовин, диспергуючих речовин, інертних наповнювачів і інших компонентів для полегшення поводження з ними і їх застосування відносно конкретних цільових комах-шкідників. Такі склади і процедури нанесення добре відомі в даній галузі. Склади. Сформовані гранули-приманки, що містять атрактант і спори, кристали і токсини Bt ізолятів, або рекомбінантні мікроби, що містять гени, отримані з Bt ізолятів, розкритих в цьому документі, можуть бути внесені в ґрунт. Сформований продукт також може наноситися у вигляді покриття на насіння або в процесі обробки коріння або обробки всієї рослини на пізніх стадіях 7 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 циклу розвитку кукурудзи. Обробка рослин і ґрунту Bt клітинами може проводитися з використанням змочуваних порошків, гранул або пудри шляхом змішування з різними інертними матеріалами, такими як неорганічні мінерали (філосилікати, карбонати, сульфати, фосфати і т. п.) або рослинними матеріалами (подрібненої серцевини кукурудзяного качана, рисовою лузгою, горіховою шкаралупою і т. п.). Склади можуть включати адгезивні ад'юванти, стабілізуючі агенти, інші пестицидні добавки або поверхнево-активні речовини. Рідкі склади можуть бути водними або неводними і можуть застосовуватися у вигляді пін, гелів, суспензій, емульгованих концентратів і т. п. Інгредієнти можуть включати реологічні агенти, поверхневоактивні речовини, емульгатори або полімери. Як добре відомо фахівцеві в даній галузі, пестицидна концентрація може варіювати в широких межах залежно від природи конкретної композиції, зокрема, від того, чи буде вона являти собою концентрат або буде використовуватися безпосередньо. Пестицид може бути присутнім щонайменше в кількості 1 ваг. % і може становити 100 % ваги композиції. Сухі композиції можуть містити пестицид в кількості приблизно від 1 до 95 ваг. %, в той час як рідкі склади, як правило, можуть містити приблизно від 1 до 60 ваг. % твердої речовини в рідкій фазі. 2 4 Композиції, як правило, можуть містити приблизно від 10 до 10 клітин/мг. Ці склади застосовуються в кількості від приблизно 50 мг (в рідкому або сухому вигляді) до 1 кг або більше на гектар. Склади можуть наноситися на середовищі проживання лускокрилої комахи-шкідника, наприклад, на листя або на ґрунту, шляхом зрошування, запилення, оббризкування і т. п. Трансформація рослин. Переважним рекомбінантним хазяїном для продукування білків, що мають інсектицидну дію, за винаходом є трансформована рослина. Гени, що кодують білки Bt токсину, як це розкрито в цьому документі, можуть бути введені в клітини рослини множиною різних методів, які добре відомі в даній галузі техніки. Наприклад, для підготовки до введення чужорідних генів у вищі рослини доступна множина клонуючих векторів, що містять реплікаційну систему Escherichia coli і маркер, який забезпечує можливість відбирання трансформованих клітин. У число таких векторів входять, крім інших, pBR322, pUC серія, M13mp серія і pACYC184. Відповідно, фрагмент ДНК, що містить послідовність, що кодує білок Bt токсину, може бути вставлений у вектор у відповідному сайті рестрикції. Отримана в результаті плазміда використовується для трансформації в Е. coli. Клітини E. coli культивують у прийнятному поживному середовищі, потім збирають і лізують. Плазміди виділяють. Як способи аналізу звичайно використовують секвенування, рестрикційний аналіз, електрофорез і інші біохімічні і молекулярно-біологічні способи. Після кожної операції використана ДНК-послідовність може бути відщеплена і приєднана до наступної ДНК-послідовності. Кожна плазмідна послідовність може бути клонована в тих же або інших плазмідах. Залежно від способу введення в рослину бажаних генів, також можуть бути необхідні інші ДНК-послідовності. Наприклад, якщо для трансформації клітини рослини використовуються плазміди Ti або Ri, то щонайменше правий кінець, а часто як правий, так і лівий кінці Ti або Ri плазмідної Т-ДНК, повинні бути приєднані як фланкуючі області призначені для вставки генів. Використання Т-ДНК для трансформації клітин рослин детально досліджено і вичерпно розкрито в EP 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al, (1986) і An et al, (1985) і є добре відомим в даній галузі техніки. Після того як введена ДНК інтегрується в геном рослини, вона стає відносно стабільною. Трансформаційний вектор звичайно містить забезпечуючий можливість відбору маркер, який забезпечує стійкість трансформованої клітини рослини до біоциду або антибіотику, такого як, наприклад, Біалафос, Канаміцин, G418, Блеоміцин або Гігроміцин. Окремо використовуваний маркер повинен, відповідно, забезпечувати відбір трансформованих клітин, а не тих клітин, які не містять ДНК, що вводиться. Існує множина способів введення ДНК в рослинну клітину-хазяїна. Ці способи включають трансформацію за допомогою Т-ДНК, використовуючи Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як трансформуючий агент, злиття, ін'єкцію, біолістику (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі способи. Якщо для трансформації використовуються Agrobacteria, призначені для введення ДНК повинна бути клонована в спеціальні плазміди, а саме, або в проміжний вектор, або в бінарний вектор. Проміжні вектора можуть бути вбудовані в Ti або Ri плазміду методом гомологічної рекомбінації завдяки послідовностям, які гомологічні послідовностям в Т-ДНК. Ti або Ri плазміди також стримають vir-область, необхідну для перенесення Т-ДНК. Проміжні вектора не можуть самореплікуватися в Agrobacteria. Проміжний вектор може бути перенесений в Agrobacterium tumefaciens за допомогою плазміди-хелпера (кон'югація). Бінарні вектора можуть самореплікуватися як в Е. coli, так і в Agrobacteria. Вони містять ген маркера селекції і лінкер або полілінкер, який обмежений областями правої і лівої меж Т-ДНК. Вони можуть бути трансформовані 8 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 безпосередньо в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). Agrobacteria, що використовуються як клітина-хазяїн, повинні містити плазміду, що несуть vir-область. Vir-область необхідна для перенесення Т-ДНК в клітину рослини. Також можуть міститися додаткові Т-ДНК. Трансформованим таким чином бактерії використовуються для трансформації клітин рослини. Для перенесення ДНК в клітину рослини рослинні експлантанти можна переважно культивувати з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes. Потім з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, частин листя, сегментів стебла, коріння, а також з протопластів або клітин, культивованих в суспензії) у прийнятному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди для селекції, може бути регенерована ціла рослина. Отриманим таким чином рослини потім можуть бути досліджені на наявність впровадженої ДНК. У випадку ін'єкції або електропорації до плазмід не пред'являється ніяких додаткових вимог. Можливе використання звичайних плазмід, таких як, наприклад, похідні від pUC. Трансформовані клітини ростуть в рослинах звичайним чином. Вони можуть формувати зародкові клітини і передавати трансформовану ознаку(ознаки) рослинам-нащадкам. Такі рослини можна вирощувати звичайним способом і схрещувати з рослинами, які мають такі ж трансформовані спадкові фактори або інші спадкові фактори. Отримані в результаті гібридні особини мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, рослини трансформують генами, у яких використання кодона оптимізовано для рослин. Див., наприклад, патент США № 5380831, включений у даний документ у вигляді посилання. Хоча в даному документі як приклади приведені укорочені токсини, в області використання Bt добре відомо, що 130 кДа (повнорозмірні) токсини мають N-кінцеву половину, що є ядром токсину, і С-кінцеву половину, що являє собою "хвіст" протоксину. Таким чином, з укороченими/ядерними токсинами за даним винаходом можна використовувати придатні "хвости". Див., наприклад, патент США № 6218188 і патент США № 6673990. Крім цього, способи створення синтетичних Bt генів для використання в рослинах відомі в даній галузі техніки (Stewart and Burgin, 2007). Одним з необмежувальних прикладів трансформованої рослини є плодоносна рослина маїсу, що містить експресований рослиною ген, що кодує білок Cry1Da, і додатково містить експресований рослиною ген, що кодує білок Cry1Be. Перенесення (або інтрогресія) ознаки(к), що визначається Cry1Da і Cry1Be в інбредні лінії маїсу може досягатися шляхом виведення рослини на основі рекурентного відбору, наприклад, шляхом зворотного схрещування. У цьому випадку, бажаний рекурентний батько спочатку схрещується з донорною інбредною особиною (нерекурентним батьком), що несе придатний ген(и) для ознак, що визначається Cry1D і Cry1Be. Потім потомство від цього зворотного схрещування спаровують з рекурентним батьком з наступним відбором отриманого потомства на предмет бажаної ознаки(к), що повинна бути перенесена від нерекурентного батька. Після трьох, переважно, чотирьох, більш переважно, п'яти або більше поколінь, отриманих методом зворотного схрещування з рекурентним батьком і в результаті відбору по бажаній ознаці(ах), потомство стає гетерозиготним по локусу, що контролює переносиму ознаку(и), але залишається подібним до рекурентного батька по більшості або майже по всіх інших генах (див., наприклад, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Стратегії керування стійкістю комах (IRM) Наприклад, Roush et al описує стратегії з двома токсинами, що також називається створенням "пірамід" або "пакетів", для керування трансгенними рослинами, що мають інсектицидні властивості. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). На іншому веб-сайті Агентство США по захисту навколишнього середовища (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) опублікувало наступні вимоги для забезпечення нетрансгенних (тобто що не містять Bt генів) сховищ (рефугій) (розділ зернові культури/кукурудза, що не містять Bt генів) для використання з трансгенними зерновими культурами, що продукують один Bt білок, активний стосовно цільових комах-шкідників. "Конкретні структуровані вимоги до кукурудзи, захищеної від метелика кукурудзяного Bt білками (Cry1Ab чи Cry1F) є наступними: структуровані сховища: 20 % сховища з кукурудзи, що не має Bt захисту від лускокрилих в областях, де кукурудза є основною культурою; 50 % сховища з рослин, що не мають Bt захисту від лускокрилих, в областях, де бавовна є основною культурою"; Блоки Внутрішні (тобто усередині Bt поля). Зовнішні (тобто окремі поля в межах 1/2 милі (1/4 милі, якщо можливо) від Bt поля для 9 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечення максимального обсягу випадкового спарювання). Розташовані на полі смуги Смуги повинні мати щонайменше 4 ряди в ширину (переважно 6 рядів) для зменшення ефекту переміщення личинок. Крім цього, Національна Асоціація Виробників Кукурудзи на своєму веб-сайті (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) також представила схожі рекомендації відносно вимог до сховищ. Наприклад: "Вимоги відносно IRM для метелика кукурудзяного: - засівати щонайменше 20 % від площі висівання кукурудзи під гібриди-сховища; - у регіонах, що вирощують бавовну, сховища повинні складати 50 %; - посіви необхідно висаджувати в межах 1/2 милі від гібридів-сховищ; - сховища можна засівати у вигляді смуг усередині Bt поля; смуги-сховища повинні складати щонайменше 4 ряди в ширину; - сховища можуть оброблятися звичайними пестицидами тільки у випадку досягнення економічного порога, що досягається для цільової комахи; - основані на Bt розпилювані інсектициди не можна використовувати відносно кукурудзисховища; - придатні сховища необхідно висаджувати на кожній фермі з Bt кукурудзою". Як зазначено в Roush et al. (наприклад, на стор. 1780 і 1784, правий стовпчик), створення пакетів або пірамід із двох різних білків, кожний з який є активним відносно цільової комахишкідника, і з малою або без перехресної стійкості може забезпечувати можливість використання менших сховищ. Roush указує, що для успішно розробленого пакета розмір притулку менший ніж 10 % може забезпечити ефект по керуванню стійкістю, порівнянний з 50 % притулком для одиночної (не організованої у вигляді піраміди) ознаки. Для доступних у даний час Bt продуктів кукурудзи Агентство Захисту Навколишнього Середовища США вимагає істотно меншого обсягу (звичайно 5 %) висаджених структурованих сховищ кукурудзи, що не містить Bt гени, ніж у випадку продуктів з єдиною ознакою (звичайно 20 %). Існують різні способи забезпечення IRM ефектів сховищ, включаючи різні геометричні патерни саджань на полях (як уже згадувалося вище) і змішування насіння перед висіванням як обговорювалося в Roush et al. (см. вище) і в патенті США № 6551962. Приведені вище процентні співвідношення або близькі до них співвідношення сховищ можуть використовуватися для розглянутих подвійних і потрійних пакетів або пірамід. Для потрійних пакетів і трьома місцями дії проти однієї цільової комахи-шкідника цільовим значенням є нульова площа притулку (або сховище із площею, наприклад, меншою 5 %). Це особливо вірно для комерційних посівних площ, наприклад, більших ніж 10 акрів. Усі патенти, заявки на патент, попередні заявки і публікації, на які приведені посилання або які цитуються в даному документі, включені у вигляді посилання у всій своїй повноті в тій частині, у якій вони не суперечать зведенням, що у явному вигляді приводиться в даному описі. За винятком випадків, коли це спеціально обговорено або випливає з контексту, граматичні форми однини варто розуміти як такі, що означають "щонайменше один". Нижче приведені приклади, що ілюструють способи здійснення винаходу. Ці приклади не слід розглядати як обмежуючі. Усі процентні співвідношення зазначені по масі, а співвідношення в розчинах зазначені по об'ємі. Усі температури зазначені в градусах Цельсія. ПРИКЛАДИ 125 Приклад 1- I мічення Cry білків Йодування Cry токсинів. Очищені укорочені Cry токсини йодували, використовуючи йодогранули Iodo-beads або IODOGEN (Pierce). Коротко, дві йодогранули двічі промивали 500 мкл забуференого фосфатом розсолу, PBS (20 мМ фосфату натрію, 0,15 M NaCl, pH 7,5), і поміщували в 1,5 мл центрифугальну пробірку за свинцевим екраном. Додавали 100 мкл PBS. У тубус, використовуючи відповідні способи роботи з радіоактивними речовинами, в PBS розчин з 125 йодогранулою додавали 0,5 мКі Na I (17,4 Кі/мг, Lot 0114, Amersham). Реакцію між компонентами проводили протягом 5 хвилин при кімнатній температурі, потім в цей розчин додавали 2-25 мкг укороченого Cry білка високої чистоти і проводили реакцію протягом наступних 3-5 хвилин. Реакцію завершували шляхом видалення розчину з йодогранул і введення його в 0,5 мл центрифугальну колонку Zeba для знесолення (InVitrogen), урівноважену PBS. Йодогранулу двічі промивали по 10 мкл PBS і промивальний розчин також вносили в колонку для знесолення. Радіоактивний розчин елюювали, використовуючи колонку для знесолення, центрифугуванням при 1000x g протягом 2 хв. У випадку Cry1Da, для виконання процедури по введенню радіоактивної мітки використовували спосіб IODOGEN. Використовуючи цю процедуру, токсин Cry в 100 мМ фосфатному буфері (pH 8) спочатку 10 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 очищали від ліпополісахаридів (ЛПС), пропускаючи його декілька разів через невелику 0,5 мл колонку на основі поліміксину. У пробірку IODOGEN (Pierce Chem. Co.) додавали 20 мкг Cry1Da 125 токсини, що не містить ЛПС, а потім 0,5 мКі Na I. Реакційну суміш струшували протягом 15 хв при 25 °C. Розчин з пробірки видаляли, і для завершення реакції додавали 50 мкл 0,2 М нерадіоактивного NaI. Білок діалізували проти PBS тричі змінюючи буфер, для видалення будь125 якого незв'язаного I. Радіочистоту йодованих Cry білків визначали методами ДСН-ПААГ електрофорезу, формування зображення на люмінесцентному покритті і підрахунку гамма подій. Коротко, 2 мкл радіоактивного білка виділяли методом ДСН-ПААГ електрофорезу. Після виділення гелі сушили в пристрої для сушіння гелів BioRad згідно з інструкцією виробника. Зображення висушених гелів отримували шляхом обгортання їх плівкою Mylar (товщиною 12 мкм) і експонування під люмінесцентним екраном з тривалим післясвітінням Molecular Dynamics (35 см × 43 см) протягом 1 години. Пластини виявляли на люмінесцентному пристрої візуалізації Molecular Dynamics Storm 820, і зображення аналізували за допомогою програмного забезпечення ImageQuant™. Радіоактивну смугу разом з областями, розташованими безпосередньо вище і нижче цієї смуги, вирізали з гелю лезом бритви, і здійснювали підрахунок подій за допомогою гамма-лічильника. Радіоактивність детектували тільки в смузі, що відповідає Cry білку, і в областях, розташованих нижче ніж ця смуга. Відсутність радіоактивності в областях, розташованих вище ніж смуга, вказувала на те, що всі радіоактивні речовини складалися з компонентів білка, дрібніших в порівнянні з укороченим Cry білком. Ці компоненти, найбільш ймовірно, являли собою продукти розпаду. Приклад 2 - Протокол отримання BBMV Отримання і фракціонування розчиненого BBMV. Личинок Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis або Heleothis zea на останній віковій стадії витримували без їжі всієї ночі, а потім вранці препарували після охолоджування на льоду протягом 15 хвилин. З порожнини тіла видаляли тканину середньої кишки, залишаючи розташовану позаду задню кишку, прикріплену до зовнішнього покриву. Середню кишку поміщували в 9X об'єм охолодженого льодом буфера для гомогенізації (300 мМ маніту, 5 мМ EGTA, 17 мМ основи Тріс, pH 7,5), доповненого коктейлем інгібіторів протеаз (Sigma Р-2714), розбавленим згідно з рекомендаціями постачальника. (Кінцева концентрація компонентів коктейлю (в мкМ) складає AEBSF (500), ЕДТА (250 мМ), бестатин (32), Е-64 (0,35), лейпептин (0,25) і апротинін (0,075)). Тканину гомогенізували 15 ударами, використовуючи скляний гомогенізатор тканин. BBMV отримували преципітацією MgCl2 по методу Wolfersberger (1993). Коротко, рівний об'єм 24 мМ розчину MgCl 2 в 300 мМ маніту змішували з гомогенатом середньої кишки, перемішували протягом 5 хвилин і вистоювали на льоду протягом 15 хв. Розчин центрифугували при 2500x g протягом 15 хв при 4 °C. Супернатант зберігали, а осад суспендували у вихідному об'ємі 0,5-X розведеного буфера для гомогенізації і знову центрифугували. Два супернатанти об'єднували, центрифугували при 27000x g протягом 30 хв при 4 °C для отримання фракції BBMV. Осад суспендували в 10 мл буферу для гомогенізації, додавали до інгібіторів протеаз і знову центрифугували при 27000x g протягом 30 хв при 4 °C для промивання BBMV. Отриманий осад суспендували в буфері для зберігання BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10 % гліцерину, pH 7,4) до отримання концентрації білка приблизно 3 мг/мл. Концентрацію білка визначали методом Бредфорда (Bradford, 1976), використовуючи бичачий сироватковий альбумін (BSA) як стандарт. Перед заморожуванням зразків визначали активність лужної фосфатази методом аналізу Sigma згідно з інструкцією виробника. Питома активність маркерного ферменту у фракції BBMV, як правило, в 7 разів перевищувала активність, визначену у фракції гомогенату середньої кишки. BBMV фасували по 250 мкл зразків, швидко заморожували в рідкому N2 і зберігали при -80 °C. 125 Приклад 3 - Спосіб вимірювання зв'язування I Cry білків з BBMV білками 125 Зв'язування I Cry білка з BBMV. Для визначення оптимальної кількості білка BBMV для 125 використання в аналізі зв'язування будували криву насичення. I- мічений Cry білок (0,5 нМ) інкубували протягом 1 години при 28 °C з різними кількостями білка BBMV в межах від 0 до 500 мкг/мл в буфері для зв'язування (8 мМ NaHPO4, 2 мМ ΚH2ΡО4, 150 мМ NaCl, 0,1 % бичачого 125 сироваткового альбуміну, pH 7,4). Загальний об'єм становив 0,5 мл. Зв'язаний I Cry білок відділяли від незв'язаного шляхом перенесення 150 мкл зразка реакційної суміші в трьох примірниках з 1,5 мл центрифугальної пробірки в 500 мкл центрифугальну пробірку і центрифугування зразків при 14000x g протягом 6 хвилин при кімнатній температурі. Супернатант дбайливо видаляли, а осад дбайливо промивали три рази охолодженим льодом буфером для зв'язування. Дно центрифугальної пробірки з осадом, що знаходиться в ньому відрізали і поміщували в 13×75-мм скляну культуральну пробірку. У кожному зразку підраховували події гамма-лічильником протягом 5 хвилин. Число подій, визначених в зразку, 11 UA 111710 C2 5 10 15 20 25 30 35 віднімали з кількості фонових подій (реакція без якого-небудь білка) і наносили на графік залежно від концентрації білка BBMV. Оптимальна для використання кількість білка була визначена як таке, що дорівнює 0,15 мг/мл BBMV білка. Для визначення кінетичних характеристик зв'язування будували криву насичення. Коротко, 125 BBMV (150 мкг/мл) інкубували протягом 1 години при 28 °C з I Cry токсином з концентрацією, що збільшується в межах від 0,01 до 10 нМ. Загальне зв'язування визначали, шляхом триразового відбирання по 150 мкл кожної концентрації, центрифугування і підрахунку подій, як описано вище. Неспецифічне зв'язування визначали таким же способом, при цьому в реакційну суміш додавали 1000 нМ гомологічного трипсинізованого нерадіоактивного Cry токсину до насичення всіх неспецифічних сайтів зв'язування з рецепторами. Специфічне зв'язування обчислювали у вигляді різниці між загальним зв'язуванням і неспецифічним зв'язуванням. Аналіз конкурентного гомологічного і гетерологічного зв'язування виконували, 125 використовуючи 150 мкг/мл BBMV білка і 0,5 нМ Cry білка з радіоактивною I міткою. Конкурентний немічений Cry токсин додавали в реакційну суміш в концентраціях, що змінюються від 0,045 до 1000 нМ, і в той же самий час додавали радіоактивний ліганд для забезпечення істинного конкурентного зв'язування. Інкубували протягом 1 години при 28 °C, і 125 вимірювали кількість I Cry білка, пов'язаного з рецептором токсину, як описано вище, з відніманням неспецифічного зв'язування. Стопроцентне загальне зв'язування визначали за відсутності всіх конкурентних лігандів. Результати представлені у вигляді графіка з використанням напівлогарифмічної шкали у вигляді залежності вираженого в процентах загального специфічного зв'язування від концентрації доданого конкурентного ліганду. Приклад 4 - Короткий огляд результатів 125 На Фіг. 1 показане виражене в процентах загальне специфічне зв'язування I Cry1Be (0,5 нМ) з BBMV, виділеним з FAW, залежно від ступеня конкуренції з неміченими гомологічним Cry1Be () і гетерологічним Cry1Da (○). Крива заміщення для гомологічної конкуренції з Cry1Be має вигляд сигмоїдальної кривої, що показує 50 % заміщення радіоактивно міченого ліганду при приблизно 2 нМ Cry1Be. Cry1Da при концентрації 1000 нМ (в 2000 разів більше, ніж 125 концентрація I Cry1Be, що заміщується) дає в результаті заміщення менше ніж 50 %. Вказані помилки представляють діапазон значень, отриманих при потрійному визначенні. 125 На Фіг. 2 показане виражене в процентах загальне специфічне зв'язування I Cry1Da (0,5 нМ) з BBMV, виділеним з FAW, залежно від ступеня конкуренції з неміченими гомологічним Cry1Da () і гетерологічним Cry1Be (○). Крива заміщення для гомологічної конкуренції з Cry1Da має вигляд сигмоїдальної кривої, що показує 50 % заміщення радіоактивно міченого ліганду при 125 приблизно 1,5 нМ Cry1Da. Cry1Be не зміщує специфічне зв'язування I Cry1Da ні при якій з 125 досліджених концентрацій, аж до 1000 нМ, що в 2000 разів більше концентрації I Cry1Da, використаної в аналізі. 12 UA 111710 C2 13 UA 111710 C2 14 UA 111710 C2 15 UA 111710 C2 16 UA 111710 C2 17 UA 111710 C2 18 UA 111710 C2 19 UA 111710 C2 20 UA 111710 C2 21 UA 111710 C2 22 UA 111710 C2 23 UA 111710 C2 24 UA 111710 C2 25 UA 111710 C2 26 UA 111710 C2 27 UA 111710 C2 28