Засіб імунотерапії деяких видів пухлин, у тому числі раку шлунково-кишкового тракту і раку шлунка

Реферат: Винахід належить до пептидів, нуклеїнових кислот та клітин для їх застосування в імунотерапії, зокрема імунотерапії раку, а також до активованих цитотоксичних Т-лімфоцитів, які самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованими пептидами служать активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції. UA 111711 C2 (12) UA 111711 C2 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується пептидів, нуклеїнових кислот та клітин для їх використання в імунотерапії. Зокрема, цей винахід стосується імунотерапії раку. Цей винахід має також відношення до епітопів пухлино-асоційованих пептидів, що розпізнаються CD8-позитивними Tклітинами, самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованими пептидами, котрі служать активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції. Цей винахід стосується 33 нових пептидних послідовностей та їх варіантів, отриманих із молекул HLA I класу клітин пухлин людини, які можуть застосовуватися у вакцинних композиціях з метою викликати протипухлинну імунну відповідь, особливо відповідь цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ). Передумова створення винаходу Рак шлунка є захворюванням, за якого у слизовій оболонці шлунка утворюються злоякісні клітини. Рак шлунка може розвиватися в будь-якій частині шлунка і може розповсюджуватися на весь шлунок і на інші органи, особливо стравохід, легені та печінку. Рак шлунка є четвертим по захворюваності видом раку на земній кулі: 930 000 випадків діагностували в 2002 році. Він є захворюванням з високим рівнем смертності (~800 000 щорічно), що робить його другою за кількістю серед усіх видів раку причиною смерті на земній кулі після раку легенів. Він більш поширений серед чоловіків і частіше спостерігається в країнах Азії та у країнах, що розвиваються. (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.) Він щороку становить приблизно 2 % (25 500 випадків) від нових випадків раку в Сполучених Штатах, але він більш поширений в інших країнах. Він займає перше місце серед усіх видів раку в Кореї, де складає 20,8 % злоякісних новоутворень. У Японії рак шлунка залишається найбільш поширеним видом раку серед чоловіків. Щорічно у Сполучених Штатах у приблизно 13 000 чоловіків і у 8000 жінок діагностують рак шлунка. Більшість з них старіше 70 років. Рак шлунка є четвертим по захворюваності видом раку на земній кулі після раку легенів, молочної залози, товстої кишки та прямої кишки. До того ж, рак шлунка залишається другою за поширеністю причиною смерті від раку. За оцінкою Американського онкологічного товариства, у 2007 році було близько одного мільйону нових випадків захворювання на рак, приблизно 70 % у країнах, що розвиваються, і близько 800 000 смертей (http://www.cancer.org/downloads/STT/Global_Facts_and_Figures_2007_rev2.pdf). Існує величезна географічна різниця у захворюваності цією хворобою в усьому світі. Захворюваність є найвищою в Азії та в деяких частинах Південної Америки і найнижчою – у Північній Америці. Найвища смертність зареєстрована у Чилі, Японії, Південній Америці та в країнах колишнього Радянського Союзу. Рак шлунка часто діагностується на пізніх стадіях, оскільки скринінг у більшості країн світу не проводиться, за виключенням Японії (та у обмежений спосіб у Кореї), де часто спостерігається раннє виявлення. Таким чином, він продовжує становити головний виклик для професіоналів в охороні здоров'я. Факторами ризику раку шлунка є інфекція Helicobacter pylori (H. pylori), паління, дієта з високим вмістом солі та інші дієтичні фактори. Деяка кількість випадків раку (від 1 до 3 %) пов'язана зі спадковою схильністю до раку шлунка. Мутації гена Ecadherin виникають приблизно у 25 % сімей із аутосомно-домінантним типом успадкування раку шлунка дифузного типу. Цей різновид раку шлунка отримав назву сімейного дифузного раку 12 шлунка. Може виявитися корисним провести медико-генетичне консультування і розглянути доцільність профілактичної гастректомії у молодих асимптоматичних носіїв усіченої форми гена. Стінка шлунка складається з трьох тканинних шарів: шару (найглибшого) слизової оболонки, м'язового (середнього) шару і серозного (зовнішнього) шару. Ракова пухлина шлунка виникає у клітинах, що вистилають м'язовий шар, і поширюється крізь зовнішні шари з ростом пухлини. Використовують чотири види стандартного лікування. Лікування раку шлунка може включати хірургію, хіміотерапію, променеву терапію або хіміопроменеву терапію. Хірургія є головним методом лікування раку шлунка. Метою хірургічного втручання є повне видалення шлунка з гістологічно негативними краями резекції (радикальна, або R0-резекція). Однак приблизно 50 % пацієнтів із місцево-поширеним раком шлунка не підлягають R0-резекції. R1 вказує на те, що резидуальну пухлину визначають мікроскопічно (позитивний край), а R2 свідчить про те, що резидуальну пухлину діагностують макроскопічно, але метастазів немає. Результати лікування для пацієнта залежить від стадії раку в той час, коли його діагностували (Настанови з клінічної практики в онкології™ Національної мережі NCCN). 5-річна виживаємість для куративної хірургічної резекції лежить у діапазоні 30-50 % у пацієнтів з II стадією захворювання і 10-25 % у пацієнтів з III стадією захворювання. У цих пацієнтів існує висока ймовірність місцевого і системного рецидиву. Метастази виникають у 8090 % суб'єктів із раком шлунка, а шестимісячна виживаємість становить 65 % у пацієнтів з ранніми стадіями і менше ніж 15 % у пацієнтів, яким діагностовані пізні стадії. 1 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Таким чином, залишається потреба у нових ефективних і безпечних методах лікування раку шлунка, карциноми передміхурової залози, карцином порожнини рота, плоскоклітинного раку порожнини рота (OSCC), гострої мієлоїдної лейкемії (ГМЛ), пов'язаної з H. Pylori MALT-лімфоми, карциноми товстої кишки/колоректального раку, гліобластоми, немілкоклітинного раку легенів (NSCLC), карциноми шийки матки, раку молочної залози людини, раку передміхурової залози, раку товстої кишки, раку підшлункової залози, аденокарциноми протоків підшлункової залози, раку яєчника, гепатоцелюлярної карциноми, раку печінки, пухлин мозку різних фенотипів, лейкемій таких як гостра лімфобластна лейкемія (ГЛЛ), раку легенів, саркоми Юінга, раку ендометрію, плоскоклітинного раку голови та шиї, епітеліального раку гортані, езофагеальної карциноми, карциноми порожнини рота, карциноми сечового міхура, карцином яєчника, нирково-клітинної карциноми, атипової менінгіоми, папілярної карциноми щитоподібної залози, пухлин мозку, карцином слинних протоків, раку шийки матки, екстранодальних лімфом T/NKклітин, неходжкінської лімфоми та злоякісних солідних пухлин легенів і молочної залози та інших пухлин, які сприятимуть покращенню стану пацієнтів без використання хіміотерапевтичних засобів та інших засобів, що можуть призвести до серйозних побічних ефектів. Цей винахід стосується пептидів, які стимулюють імунну систему та діють як протипухлинні препарати у неінвазивний спосіб. Коротке формулювання сутності винаходу Стимуляція імунної відповіді залежить від присутності антигенів, що сприймаються імунною системою організму-хазяїна як чужорідна речовина. Відкриття пухлино-асоційованих антигенів зробило можливим використання імунної системи хазяїна для втручання в ріст пухлини. Зараз вивчається можливість використання для імунотерапії раку різних механізмів, як гуморальної, так і клітинної ланки імунної системи. Специфічні елементи клітинного імунного відгуку здатні специфічно розпізнавати та знищувати пухлинні клітини. Виділення цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) із популяції пухлиноінфільтруючих клітин або з периферичної крові говорить про те, що такі клітини відіграють важливу роль у природному імунному захисті проти раку. Особливо важливу роль у цій відповіді + відіграють, зокрема, CD8-позитивні Т-клітини (TCD8 ), які розпізнають пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності I класу (MHC). Ці пептиди складаються з 8-10 амінокислотних залишків, що отримані з білків або дефектних рибосомних продуктів (DRIP), які містяться у цитозолі. Молекули MHC людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA). Існує два класи молекул MHC. Молекули MHC I класу можна виявити в більшості клітин, що мають ядро. Молекули MHC складаються з альфа-важких ланцюгів і бета-2-мікроглобуліна (рецептори молекул MHC I класу) або альфа- і бета-ланцюгів (рецептори молекул MHC II класу), відповідно. Їхня тримірна конформація приводить до утворення зв'язувальної щілини, що використовується для нековалентної взаємодії з пептидами. Молекули MHC I класу презентують пептиди, які утворюються в результаті розщеплення протеолітичними ферментами переважно ендогенних білків, продуктів DRIP та більш великих пептидів. Молекули MHC II класу містяться головним чином в професійних антиген-презентуючих клітинах (АПК). Вони головним чином презентують пептиди екзогенних або трансмембранних білків, які поглинаються клітинами АПК в ході ендоцитозу, і проходять подальше трансформування. Комплекси пептидів і молекул MHC I класу розпізнаються CD8-позитивними цитотоксичними Т-лімфоцитами, що несуть відповідні Т-клітинний рецептор (ТКР), в той час як комплекси пептиду і молекул MHC II класу розпізнаються CD4-позитивними Т-хелперами, що несуть відповідний ТКР. Загальновідомо, що ТКР, пептид і MHC, таким чином, є присутніми у стехіометричних кількостях при співвідношенні 1:1:1. Щоби пептид викликав клітинну імунну відповідь, він має зв'язатися з молекулою MHC. Цей процес залежить від алеля молекули MHC і специфічних поліморфізмів амінокислотних послідовностей пептиду. Пептиди, що зв'язують молекули MHC I класу, зазвичай мають 8-12 амінокислотних залишків у довжину і зазвичай містять два консервативні залишки ("якорі") у своїй послідовності, які взаємодіють з відповідною зв'язувальною щілиною молекули MHC. У такий спосіб кожний алель MHC має "зв'язувальний мотив", що визначає, які пептиди зможуть специфічно зв'язатися зі зв'язувальною щілиною. В імунній реакції, залежній від молекул MHC I класу, пептиди не тільки мають бути здатними зв'язатися з певними молекулами MHC I класу, що експресуються клітинами пухлини, але вони також мають розпізнаватися Т-клітинами, що несуть специфічний Т-клітинний рецептор (ТКР). Антигенами, які розпізнаються пухлино-специфічними ЦТЛ, тобто їхніми епітопами, можуть бути молекули, що отримані з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, фактори 2 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 транскрипції тощо, які експресуються і, у порівнянні з незміненими клітинами того ж походження, активовані у клітинах відповідної пухлини. Сучасна класифікація пухлино-асоційованих антигенів (TAA) охоплює наступні головні групи: a) Раково-тестикулярні антигени: Перші будь-коли ідентифіковані TAA, які можуть бути розпізнані Т-клітинами, належать до цього класу, які були спочатку названі раковотестикулярними (CT) антигенами завдяки експресії його представників у гістологічно різних пухлинах людини і, поряд із нормальними тканинами, тільки в сперматоцитах/сперматогоніальних клітинах яєчок і іноді в плаценті. Оскільки клітини яєчок не експресують молекули HLA I та II класу, ці антигени не можуть розпізнаватися Т-клітинами у нормальних тканинах і можуть, таким чином, вважатися пухлинно-специфічними, з точки зору імунології. Добре відомими прикладами CT антигенів є члени сімейства MAGE або NY-ESO-1. b) Антигени диференціації: Ці TAA розподілені між пухлинами та нормальними тканинами, з яких виникла пухлина, більшість з них знайдена в меланомах і нормальних меланоцитах. Багато цих меланоцитарних білків задіяні у біосинтезі меланіну і тому не є пухлиноспецифічними, але, тим не менше, широко застосовуються для імунотерапії раку. Приклади включають, але не обмежуються ними, тирозиназу і Melan-A/MART-1 для меланоми або PSA для раку передміхурової залози. c) Надмірно експресовані TAA Гени, що кодують TAA з високим рівнем експресії, були виявлені в гістологічно різних видах пухлин, а також у багатьох нормальних тканинах, загалом з нижчими рівнями експресії. Можливо, що багато епітопів, що були процесовані і, можливо, презентовані нормальними тканинами, присутні у кількості, що нижча за пороговий рівень розпізнання Т-клітинами, в той час як їх надмірна експресія в пухлинних клітинах може запустити антиракову реакцію, порушивши раніш встановлену толерантність. Відомими прикладами для цього класу TAA є Her-2/neu, сурвівін, теломераза або WT1. d) Пухлино-специфічні антигени: Ці унікальні TAA утворюються в результаті мутацій нормальних генів (таких як бета-катенін, CDK4 тощо). Деякі з цих молекулярних змін зв'язані з неопластичною трансформацією та/або пухлинною прогресією. Пухлино-специфічні антигени загалом можуть викликати сильні імунні відповіді, не спричиняючи ризику аутоімунних реакцій проти нормальних тканин. З іншого боку, ці TAA у більшості випадків мають відношення тільки до певної пухлини, на якій вони були ідентифіковані, і зазвичай не розподіляються між багатьма окремими пухлинами. e) TAA, що виникають в результаті аномалій у посттрансляційних модифікаціях. Такі TAA можуть виникати з білків, які не є ні специфічними, ні надмірно експресованими у пухлинах, але, незважаючи на це, стають асоційованими в результаті пост трансляційних процесів, первинно активних у пухлинах. Прикладами TAA цього класу є антигени, що виникають в результаті змінень характеру гликозилювання, що приводить до утворення у пухлинах нових епітопів, таких як MUC1, або таких подій як білковий сплайсинг під час деградації, які можуть бути пухлино-специфічними, а можуть і не бути. f) Онковірусні білки: Ці TAA є вірусними білками, які можуть відігравати вирішальну роль в онкогенному процесі і, оскільки вони є чужорідними (не походять від людини), вони можуть викликати відповідь Т-клітин. Прикладами таких білків є білки вірусу папіломи людини типу 16, E6 і E7, які експресуються клітинами карциноми шийки матки. Для того, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними Т-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино-асоційовані антигени, та щоб їх було можливо застосовувати в терапії, необхідно створити особливі передумови. Антиген має експресуватися, головним чином, пухлинними клітинами і не експресуватися або експресуватися у порівняно невеликих кількостях нормальними здоровими тканинами До того ж бажано, щоб відповідний антиген не тільки був присутнім у пухлині певного виду, але також у високих концентраціях (тобто, як декілька копій відповідного пептиду на клітину). Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто отримують із білків, які беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину, завдяки їх функції, наприклад, в контролі клітинного циклу або пригніченні апоптозу. Крім цього, низхідні мішені білків, що є безпосередньою причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, таким чином, можуть бути опосередковано пухлиноасоційованими. Такі опосередковані пухлино-асоційовані антигени можуть бути мішенями вакцинаційного підходу (Singh-Jasuja H., Emmerich N. P., Rammensee H. G., Cancer Immunol. Immunother. 2004 Mar; 453 (3): 187-95). У обох випадках важливим є те, щоби в амінокислотній послідовності антигену були присутні епітопи, оскільки такий пептид ("імуногенний пептид"), отриманий із пухлино-асоційованого антигену, має приводити до відповіді Т-клітин in vitro or in vivo. По суті, будь-який пептид, що здатний зв'язуватися з молекулою MHC, може функціювати як 3 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 епітоп Т-клітини. Передумовою індукції відповіді Т-клітин in vitro or in vivo є присутність Т-клітин із відповідним Т-клітинним рецептором і відсутність імунологічної толерантності до цього окремого епітопу. Таким чином, TAA є стартовою точкою для розробки протипухлинних вакцин. Методи ідентифікації та визначення характеристик TAA базуються на використанні ЦТЛ, які можна виділити з організму пацієнтів або здорових суб'єктів, або вони ґрунтуються на генерації різних профілів транскрипції або різному характері експресії пептидів тканинами пухлин і нормальними тканинами. Проте ідентифікація генів, які надмірно експресуються пухлинними тканинами або лініями клітин пухлин людини, або селективно експресуються в таких тканинах або клітинних лініях, не дає точної інформації щодо застосування антигенів, що транскрибуються цими генами, в імунній терапії. Причиною цього є те, що тільки окрема субпопуляція епітопів цих антигенів придатна для такого застосування, оскільки має бути присутня Т-клітина з відповідним ТКР і імунологічна толерантність по відношенню до цього епітопу повинна бути відсутньою або мінімальною. Таким чином, важливо вибрати тільки такі пептиди з надмірно експресованих або селективно експресованих білків, які презентуються зв'язаними з молекулами MHC, проти яких можливо знайти функціонуючу Т-клітину. Така функціонуюча Т-клітина визначається як Тклітина, яка при стимуляції специфічним антигеном може бути клонована і здатна виконувати функції ефектора (ефекторна Т-клітина)… Т-хелперні клітини відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ у протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, які запускають реакцію цих клітин типу T H1, підтримують ефекторні функції CD8-позитивних Т-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлини, що експресують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/MHC на поверхнях своїх клітин. У такий спосіб епітопи пухлино-асоційованих пептидів T-клітин-хелперів, самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованих пептидами, можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції. Короткий опис ілюстрацій Фігура 1: Зразок мас-спектру CDC2-001, що демонструє його презентацію на зразку первинної пухлині GC2464. Дослідження за допомогою РХ-МС із системою іонізації у наноелектроспреї було проведено на пулі пептидів, що був елюйований із РХ зразка 2464. Масхроматограма для m/z 597,3501±0,001 Да, z=2 містить пік пептидів із часом утримання 151,63 хв. В). Виявлений пік на мас-хроматограмі при 151.63 хв. відповідає сигналу для m/z 597,3501 на спектрі МС. C) Мас-спектр з індукованою зіткненнями дисоціацією вибраного прекурсора з m/z 597,3501, записаний в експерименті на РХ-МС системі іонізації у наноелектроспреї при даному часі утримання, підтвердив присутність CDC2-001 у зразку пухлини GC2464. D) Був записаний шаблон фрагментації синтетичного контрольного пептиду CDC2-001. Було проведене його порівняння з отриманим шаблоном фрагментації природного пухлиноасоційованого пептиду (TUMAP), наведеним на фіг. C для верифікації послідовності. Фігура 2: Профілі експресії мРНК вибраних білків в нормальних тканинах і в 25 зразках тканин раку шлунка a) CDC2 (Ідентифікатор набору проб: 203213_at) b) ASPM (Ідентифікатор набору проб: 219918_s_at) Фігура 3: Приклади результатів для пептид-специфічної імуногенності in vitro для TUMAP класу I. CD8-позитивні Т-клітини були примовані з використанням штучних АПК, навантажених відповідним (ліва панель) і невідповідним (права панель) пептидом, у вказаному порядку. Після трьох циклів стимуляції були проведене визначення клітин, що реагують із пептидом, за допомогою подвійного фарбування з відповідними та невідповідними A*2402-мультимерами. Серед показаних клітин проводиться "гейтування" живих CD8+ лімфоцитів, і цифри на графіку відображають відсоткові частки мультимер-позитивних клітин. Повний опис винаходу Якщо не зазначено інше, під нижче наведеними термінами, що використовуються у цьому описі, розуміються наступні поняття. Термін "пептид" використовується в цьому описі для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані одне з одним зазвичай пептидним зв'язком між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Бажано, щоб пептиди були довжиною у 9 амінокислот, але можуть бути такими короткими, як довжиною у 8 амінокислот, і такими довгими, як довжиною у 10, 11, 12, 13 або 14 амінокислот. Термін "олігопептид" використовується в цьому описі для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані одне з одним зазвичай пептидними зв'язками між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Довжина олігопептиду не критична для цього 4 UA 111711 C2 5 10 15 20 винаходу за умови, що він містить правильний епітоп чи епітопи. Олігопептиди зазвичай коротші, ніж довжиною близько 30 амінокислотних залишків, і довші, ніж довжиною близько 14 амінокислотних залишків. Термін "поліпептид" використовується для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані одне з одним зазвичай пептидними зв'язками між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Довжина поліпептиду не критична для цього винаходу за умови, що він містить правильні епітопи. На відміну до термінів "пептид" і "олігопептид", під терміном "поліпептид" маються на увазі молекули, що містять більш ніж 30 амінокислотних залишків. Пептид, олігопептид, білок або полінуклеотид має назву "імуногенного" щодо такої молекули (і, отже, є "імуногеном" в межах цього винаходу), якщо він здатний індукувати імунну відповідь. У межах цього винаходу імуногенність точніше визначається як здатність викликати відповідь Тклітин. Отже, "імуногеном" може бути молекула, яка здатна індукувати імунну відповідь, і що стосується цього винаходу, молекула, що здатна індукувати відповідь Т-клітин. "Епітоп" Т-клітини потребує короткого пептиду, який зв'язаний із рецептором молекули MHC I класу, утворюючи потрійний комплекс (альфа-ланцюг молекули MHC I класу, бета-2мікроглобулін і пептид), який може розпізнаватися Т-клітиною, що несе відповідний Т-клітинний рецептор, який зв'язується із комплексом MHC/пептид із належної афінністю. Пептиди, які зв'язані з молекулою MHC I класу, зазвичай мають довжину в 8-14 амінокислот, і, найбільш типово, довжину в 9 амінокислот. У людини є три різні генетичні локуси, які кодують молекули MHC I класу (молекули MHC людини мають також відношення до лейкоцитарних антигенів людини (HLA)): HLA-A, HLA-B і HLA-C. HLA-A*0l, HLA-A*02 і HLA-A*024 є прикладами різних алелів MHC I класу, які можуть експресуватися з цих локусів. Таблиця 1: Частоти експресії F для HLA*A024 і найбільш поширених серотипів HLA*A02402. Частоти отримані з частот виявлення галотипів Gf серед населення США, адаптовано з публікації (Mori і співавт., 1017-27) з використанням формули Харді-Вайнберга: F=1-(1-Gf)². Детальну інформацію див. у (Chanock і співавт., 1211-23). Частоти експресії серотипів HLA*24 і A*2402 у всьому світі Алель Популяція Фенотип, розрахований із частоти алелів A*24 Філіппіни 65 % A*24 Ненці Росії 61 % A*2402 Японія 59 % A*24 Малайзія 58 % A*2402 Філіппіни 54 % A*24 Індія 47 % A*24 Південна Корея 40 % A*24 Шрі Ланка 37 % A*24 Китай 32 % A*2402 Індія 29 % A*24 Західна Австралія 22 % A*24 США 22 % A*24 Росія, Самара 20 % A*24 Південна Америка 20 % A*24 Європа 18 % 25 30 Для цілей цього винаходу посилання на послідовність ДНК означає як одноланцюгову, так і дволанцюгову ДНК. Отже, конкретна послідовність, якщо контекст на вказує на інше, відноситься до одноланцюгової ДНК такої послідовності, дуплекса такої послідовності з її комплементом (дволанцюгова ДНК) і комплементу такої послідовності. Термін "кодуюча ділянка" відноситься до тієї частини гена, яка або природно, або нормально кодує продукт експресії цього гена в його природному геномному оточенні, тобто, до ділянки, що кодує in vivo 5 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 природний продукт експресії гена. Кодуюча ділянка може бути ділянкою немутованого ("нормального"), мутованого або зміненого гена, або навіть ділянкою послідовності ДНК або гена, повністю синтезованого в лабораторії з використанням методів, добре відомих фахівцям у галузі синтезу ДНК. Термін "нуклеотидна послідовність" відноситься до гетерополімеру дезоксирибонуклеотида. Нуклеотидна послідовність, що кодує конкретний пептид, олігопептид або поліпептид, може зустрічатися в природі або може бути сконструйована синтетично. Загалом, сегменти ДНК, які кодують пептиди, поліпептиди та білки за цим винаходом, зібрані з фрагментів кДНК і коротких олігонуклеотидних лінкерів або з серії олігонулеотидів з утворенням синтетичного гена, що здатний експресуватися в рекомбінантній транскрипційній одиниці, що містить регуляторні елементи, які отримані з оперона мікроорганізму або вірусу. Термін "продукт експресії" означає поліпептид або білок, котрий є природним трансляційним продуктом гена та будь-якої нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує еквіваленти, які є результатом виродження генетичного коду, і, таким чином, кодує ту ж амінокислоту (ті ж амінокислоти). Термін "фрагмент", стосовно кодуючої послідовності, означає частину ДНК, яка вміщує менш ніж повну кодуючу ділянку, і продукт експресії якої зберігає по суті ту ж біологічну функцію чи активність, що й продукт експресії повної кодуючої ділянки. Термін "сегмент ДНК" відноситься до полімеру ДНК у формі окремого фрагмента чи як компонент більшої конструкції ДНК, що одержаний з ДНК, виділеної принаймні один раз по суті в чистій формі, тобто без забруднюючих ендогенних матеріалів та в кількості чи концентрації, яка дає змогу ідентифікувати, виконувати маніпуляції та відновлювати сегмент і його складові нуклеотидні послідовності за допомогою стандартних біохімічних методів, наприклад, з використанням вектору клонування. Такі сегменти надаються у формі відкритої рамки зчитування, без порушень внутрішніми нетрансльованими послідовностями, чи інтронів, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованих ДНК можуть бути присутні за відкритою рамкою зчитування, де вони не заважають маніпуляціям або експресії кодуючих ділянок. Термін "праймер" означає коротку нуклеїново-кислотну послідовність, котра може бути спарена з одним ланцюгом ДНК та надає вільний 3'OH-кінець, на якому ДНК-полімераза починає синтез дезоксирибонуклеотидного ланцюга. Термін "промотор" означає ділянку ДНК, задіяну у зв'язуванні РНК-полімерази для ініціації транскрипції. Термін "виділений" означає, що матеріал видаляється зі свого первісного середовища (наприклад, природного середовища, якщо він має природне походження). Наприклад, існуючий у природі полінуклеотид чи поліпептид, присутній у живих тваринах, не є виділеним, але той самий полінуклеотид чи поліпептид, відокремлений від якихось чи всіх співіснуючих матеріалів в природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути часткою вектору, та/або такі полінуклеотиди чи поліпептиди можуть становити частину композиції і все ж таки бути виділеними, якщо такий вектор чи композиція не є частиною свого природного середовища. Ці полінуклеотиди та рекомбінантні чи імуногенні поліпептиди, розкриті відповідно до цього винаходу, також можуть бути в "очищеній" формі. Термін ««очищений" не вимагає абсолютної чистоти; скоріше він має відносне значення та може включати препарати високого ступеню очищення або препарати, які тільки частково очищені, в тому сенсі, як спеціалісти в цій галузі розуміють такі терміни. Наприклад, окремі клони, виділені з бібліотеки кДНК, були стандартним чином очищені до електрофорезної однорідності. Очищення вихідного матеріалу чи природного матеріалу принаймні на порядок величини, переважно на два-три порядки, та більш переважно, на чотири-п'ять порядків величини, чітко передбачається в цьому винаході. Крім того, заявлений поліпептид, котрий має чистоту переважно в 99.999 %, або принаймні в 99.99 % чи 99.9 %; і навіть бажано 99 % за масою чи більше, також чітко пропонується у винаході. Нуклеїнові кислоти та поліпептиди як продукти експресі, що розкриваються відповідно до цього винаходу, а також вектори експресії, які вміщують такі нуклеїнові кислоти та/або такі поліпептиди, можуть бути в "збагаченій формі". Термін "збагачений" в тому виді, в якому він використовується тут, означає, що концентрація матеріалу принаймні приблизно в 2, 5, 10, 100 або 1000 разів перевищує його природну концентрацію (наприклад), бажано 0,01 %, за масою, принаймні краще приблизно 0,1 % за масою. Також маються на увазі збагачені препарати приблизно в 0.5 %, 1 %, 5 %, 10 % та 20 % за масою. Послідовності, конструкції, вектори, клони та інші матеріали, які складають цей винахід, можуть, що більш сприятливо, бути у збагаченій чи виділений формі. Термін "активний фрагмент" означає фрагмент, що генерує імунну реакцію (тобто, має 6 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуногенну активність) при введенні індивідуально чи, необов'язково, з прийнятним ад'ювантом, тварині, наприклад, ссавцю, такому як кролик чи миша, і також включаючи людину, до того ж така імунна реакція має вид стимуляції Т-клітинної відповіді у тварини-реципієнта, такої як людина. Альтернативно, "активний фрагмент" також може використовуватись для індукування Т-клітинної відповіді in vitro. В цьому винаході терміни "частка", "сегмент" і "фрагмент", якщо вони використовуються по відношенню до поліпептидів, означають безперервну послідовність залишків, таких як амінокислотні залишки, причому ця послідовність утворює підгрупу більшої послідовності. Наприклад, якщо поліпептид був підданий обробці будь-якою з типових ендопептідаз, таких як трипсин або хімотрипсин, олігопептиди, одержані в результаті такої обробки, будуть представляти частки, сегменти чи фрагменти початкового поліпептиду. Це означає, що будьякий такий фрагмент буде обов'язково містити як частину своєї амінокислотної послідовності сегмент, фрагмент або частину, яка є по суті ідентичною, якщо не повністю ідентичною, послідовності від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO:33, котра відповідає природним або "вихідним" білкам послідовностей від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO:33. Якщо такі терміни використовуються стосовно полінуклеотидів, вони означають продукти, одержані після обробки зазначених полінуклеотидів будь-якою з типових ендонуклеаз. Відповідно до цього винаходу, термін "відсоткова ідентичність" або "відсоток ідентичності" відносно послідовності означає, що послідовність порівнюється із заявленою або описаною послідовністю після вирівнювання послідовності, яка порівнюється ("Послідовність, що порівнюється"), з описаною або заявленою послідовністю ("Контрольна послідовність"). Відсоткова ідентичність визначається відповідно до наведеної нижче формули: Відсоткова ідентичність = 100 [I -(C/R)] де C - кількість відмінностей між Контрольною послідовністю та Послідовністю, що порівнюється, на довжині вирівнювання між Контрольною послідовністю та Послідовністю, що порівнюється, де (i) кожна основа чи амінокислота в Контрольній послідовності, котра не має відповідної вирівняної основи чи амінокислоти у Послідовності, що порівнюється, і (ii) кожний розрив у Контрольній послідовності та (iii) кожна вирівняна основа чи амінокислота у Контрольній послідовності, яка відрізняється від вирівняної основи чи амінокислоти у Послідовності, що порівнюється, являє собою різницю, та R – це кількість основ чи амінокислот в Контрольній послідовності на довжині вирівнювання з Послідовністю, що порівнюється, з будь-яким розривом, утвореним в Контрольній послідовності, також зарахованим як основа чи амінокислота. Якщо існує вирівнювання між Послідовністю, що порівнюється, та Контрольною послідовністю, для якої відсоткова ідентичність, що розрахована вище, є приблизно рівною чи більшою, ніж зазначена мінімальна Відсоткова ідентичність, то Послідовність, що порівнюється, має зазначену мінімальну відсоткову ідентичність до Контрольної послідовності, хоча можуть існувати вирівнювання, в яких розрахована, як описано вище, Відсоткова ідентичність є меншою, ніж зазначена Відсоткова ідентичність. Первісні пептиди, що розкриваються в цьому винаході, можуть модифікуватися заміщенням одного чи кількох залишків на різних, можливо, селективних, ділянках пептидного ланцюгу, якщо не зазначено інакше. Такі заміщення можуть бути консервативного характеру, наприклад, коли одна амінокислота замінюється амінокислотою подібної структури та характеристик, тобто, коли гідрофобна амінокислота замінюється іншою гідрофобною амінокислотою. Навіть більш консервативною буде заміна амінокислот такого ж чи подібного розміру та хімічного характеру, наприклад, коли лейцин замінюється ізолейцином. В дослідженнях варіацій послідовностей в сімействах природних гомологічних білків певні амінокислотні заміщення допускаються частіше, ніж інші, і вони часто демонструють кореляцію зі схожістю за розміром, зарядом, полярністю та гідрофобністю між первісною амінокислотою та її заміною, і це є основою для визначення "консервативних заміщень". Консервативні заміщення визначаються в цьому документі як обмін в межах однієї з наведених нижче п'яти груп: Група 1 – малі аліфатичні, неполярні чи слабо полярні залишки (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Група 2 – полярні, негативно заряджені залишки та їхні аміди (Asp, Asn, Glu, Gln); Група 3 – полярні, позитивно заряджені залишки (His, Arg, Lys); Група 4 – великі аліфатичні неполярні залишки (Met, Leu, Ile, Val, Cys); та Група 5 - великі ароматичні залишки (Phe, Tyr, Trp). Менш консервативні заміщення можуть включати заміну однієї амінокислоти іншою, котра має подібні характеристики, але дещо відрізняється за розміром, наприклад, заміна аланіну ізолейциновим залишком. Високо-неконсервативні заміни можуть включати заміщення кислої 7 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислоти полярною, або навіть такою, що є основною за своїм характером. Такі "радикальні" заміщення не можуть, однак, відхилятись як потенційно неефективні, оскільки їх хімічні наслідки не є повністю прогнозованими, та радикальні заміщення також можуть несподівано призвести до сприятливих ефектів, які неможливо передбачити за простими хімічними принципами. Безумовно, такі заміщення можуть включати структури, що відрізняються від звичайних Lамінокислот. Отже, D-амінокислоти можуть заміщуватися L-амінокислотами, котрі зазвичай виявляються в антигенних пептидах цього винаходу та все ж охоплюються розкриттям в ньому. Крім того, амінокислоти, які мають нестандартні R-групи (тобто R-групи інші, ніж можна знайти в 20 стандартних амінокислотах природних білків) також можуть використовуватись для заміщення, з метою отримання імуногенів та імуногенних поліпептидів, відповідно до цього винаходу. Якщо виявляється, що заміщення в більш ніж одній позиції приводять до утворення пептиду по суті з еквівалентною чи більшою антигенною активністю, як визначено нижче, тоді комбінації цих заміщень будуть досліджуватись з метою визначення, чи мають комбіновані заміщення додатковий чи синергічний вплив на антигенність пептиду. Як правило, в пептиді замінюються одночасно не більш ніж 4 позиції. Термін "Т-клітинна відповідь" означає специфічну проліферацію та активацію ефекторних функцій, індукованих пептидом in vitro чи in vivo. Для ЦТЛ, обмежених MHC класу I, ефекторними функціями можуть бути лізис клітин-мішеней із завантаженим пептидом чи пептидним прекурсором чи клітин-мішеней, природно презентуючих пептид, секреція цитокінів, переважно гамма-інтерферону, TNF-альфа, або ІЛ-2, індукована пептидом, секреція ефекторних молекул, переважно гранзимів чи перфоринів, індукована пептидом, або дегрануляція. Переважно, коли ЦТЛ, специфічні по відношенню до пептиду з послідовністю від SEQ ID NO: 1 до SEQ ID NO:33 досліджують у порівнянні із заміщеними пептидами, то концентрація пептиду, за якої заміщені пептиди досягають половини максимального росту лізису відносно фонових значень, є не більше ніж 1 мМ, переважно не більше ніж 1 мкМ, ще більш переважно не більше ніж приблизно 1 нМ, і ще більш переважно не більше ніж приблизно 100 пМ, і найбільш переважно не більше ніж приблизно 10 пМ. Переважно також, щоб заміщений пептид розпізнавався ЦТЛ, отриманими від більш ніж однієї особи, принаймні двох, і більш переважно трьох осіб. Отже, епітопи відповідно цього винаходу можуть бути ідентичними природним пухлиноасоційованим та пухлино-специфічним епітопам або можуть включати епітопи, які відрізняються не більше ніж на 4 залишка від контрольного пептиду, оскільки вони мають по суті ідентичну антигенну активність. Імунотерапевтичні підходи до лікування Стимуляція імунної відповіді залежить від присутності антигенів, що сприймаються імунною системою хазяїна як чужорідна речовина. Відкриття пухлино-асоційованих антигенів зробило можливим використання імунної системи хазяїна для втручання в ріст пухлини. Зараз вивчається можливість використання для імунотерапії раку різних механізмів, як гуморальної, так і клітинної ланки імунної системи. Специфічні елементи клітинного імунного відгуку здатні специфічно розпізнавати та знищувати пухлинні клітини. Виділення цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) із популяції пухлиноінфільтруючих клітин або з периферичної крові говорить про те, що такі клітини відіграють важливу роль у природному імунному захисті проти раку. Особливо важливу роль у цій відповіді + відіграють, зокрема, CD8-позитивні Т-клітини (TCD8 ), які розпізнають пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності I класу (MHC). Ці пептиди зазвичай складаються з 8-12 амінокислотних залишків, що отримані з білків або дефектних рибосомних продуктів (DRIP), які містяться у цитозолі. Молекули MHC людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (HLA). Молекули MHC I класу можна виявити в більшості клітин, що мають ядра, ці молекули презентують пептиди, які утворюються в результаті розщеплення протеолітичними ферментами переважно ендогенних, цитозольних білків чи білків ядра, продуктів DRIP та великих за розміром пептидів. Однак, пептиди, одержані з ендосомальних компартментів чи екзогенних джерел, також часто зустрічаються на молекулах MHC I класу. Цей некласичний спосіб презентації молекулами I класу називається у науковій літературі крос-презентацієй. Для того, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними Т-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино-асоційовані антигени, та щоб їх було можливо застосовувати в терапії, необхідно створити особливі передумови. Антиген має експресуватися, головним чином, пухлинними 8 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинами і не експресуватися або експресуватися у порівняно невеликих кількостях нормальними здоровими тканинами. До того ж бажано, щоб відповідний антиген не тільки був присутнім у пухлині певного виду, але також був присутнім у високих концентраціях (тобто, як декілька копій відповідного пептиду на клітину). Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто походять від білків, які беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину, завдяки їх функції, наприклад, в контролі клітинного циклу або апоптозі. Крім цього, низхідні мішені білків, що є безпосередньою причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, таким чином, можуть бути опосередковано пухлиноасоційованими. Такі опосередковано пухлино-асоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході. У обох випадках важливим є те, щоби в амінокислотній послідовності антигену були присутні епітопи, оскільки такий пептид ("імуногенний пептид"), отриманий із пухлино-асоційованого антигену, має приводити до відповіді Т-клітин in vitro or in vivo. По суті, будь-який пептид, що здатний зв'язувати молекулу MHC, може функціювати як епітоп Т-клітини. Передумовою індукції відповіді Т-клітин in vitro or in vivo є присутність Т-клітин із відповідним Т-клітинним рецептором і відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу. Таким чином, TAA є стартовою точкою для розробки протипухлинних вакцин. Методи ідентифікації та визначення характеристик TAA базуються на використанні ЦТЛ, які можна виділити з організму пацієнтів або здорових суб'єктів, або вони ґрунтуються на генерації різних профілів транскрипції або різному характері експресії пептидів тканинами пухлин і нормальними тканинами (Lemmel і співавт., 450-54;Weinschenk і співавт., 5818-27). Проте ідентифікація генів, які надмірно експресуються пухлинними тканинами або лініями клітин пухлин людини, або селективно експресуються в таких тканинах або клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, що кодуються цими генами, в імунній терапії. Причиною цього є те, що тільки окрема субпопуляція епітопів цих антигенів придатна для такого застосування, оскільки має бути присутня Т-клітина з відповідним ТКР і імунологічна толерантність по відношенню до цього епітопу повинна бути відсутньою або мінімальною. Таким чином, важливо вибрати тільки такі пептиди з надмірно експресованих або селективно експресованих білків, які презентуються зв'язаними з молекулами MHC, проти яких можливо знайти функціонуючу Т-клітину. Така функціонуюча Т-клітина визначається як Т-клітина, яка при стимуляції конкретним антигеном може бути клонована і здатна виконувати функції ефектора ("ефекторна Т-клітина"). Т-хелперні клітини відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ у протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, які запускають відповідь цих клітин типу T H1, підтримують ефекторні функції CD8-позитивних клітин Т-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлини, що експресують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/MHC на поверхнях своїх клітин. У такий спосіб епітопи пухлино-асоційованих пептидів T-хелперів самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованих пептидами можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції. Оскільки обидва типи реакцій, залежні від CD8 та CD4, спільно та синергічно роблять свій внесок у протипухлинну дію, для розробки протипухлинних вакцин важливими є ідентифікація та характеристика пухлино-асоційованих антигенів, які розпізнаються CD8-позитивними ЦТЛ (молекули MHC I класу) чи CD4- позитивними ЦТЛ (молекули MHC II класу). Отже, метою цього винаходу є в розробка композицій пептидів, які вміщують пептиди, що зв'язуються з комплексами MHC будь-якого класу. Беручи до уваги серйозні побічні ефекти і витрати, пов'язані з лікуванням раку, існує нагальна потреба у кращих методах прогнозування і діагностики. Отже, є потреба в ідентифікації інших чинників, які виконують роль біомаркерів раку взагалі і раку шлунка зокрема. Отже, існує потреба ідентифікувати фактори, які можливо буде використовувати для лікування раку взагалі і раку шлунка зокрема. До того ж, немає стандарту лікування пацієнтів, хворих на рак шлунка з біохімічним рецидивом після радикальної простатектомії, зазвичай обумовленим залишковою пухлиною in situ за наявності росту місцево-поширеної пухлини. Бажано розробити нові терапевтичні підходи, що забезпечать більш низьку захворюваність при аналогічній терапевтичній ефективності по відношенню до існуючих терапевтичних підходів. Предметом цього винаходу є пептиди для лікування раку шлунка та інших пухлин, які експресують на високому рівні пептиди за винаходом. Ці пептиди, за даними мас-спектрометрії, презентуються природно молекулами HLA на зразках тканин первинного раку шлунка (див. 9 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приклад 1 і фігуру 1). Було показано, що вихідний ген, із якого отримані пептиди, дуже надмірно експресується у випадку раку шлунка, нирково-клітинної карциноми, раку товстої кишки, немілкоклітинного раку легенів, аденокарциноми, раку передміхурової залози, доброякісної пухлини та злоякісної меланоми у порівнянні з нормальними тканинами (див. приклад 2 і фігуру 2), що свідчить про високий ступінь зв'язку пептиду з пухлиною, тобто, ці пептиди у значній мірі презентуються на тканинах пухлини, але не на нормальних тканинах. Зв'язані з HLA пептиди розпізнаються імунною системою, а саме Т-лімфоцитами/Тклітинами. Т-клітини можуть руйнувати клітини, що презентують розпізнаний комплекс HLA/пептид, наприклад, клітини раку шлунка, що презентують отримані пептиди. Було показано, що всі пептиди, які були сумісні з платформою валідації, - див. приклад 3,цього винаходу, здатні стимулювати відповідь Т-клітин (див. Приклад 3 і Фігуру 3). Отже, пептиди можуть використовуватись для генерації імунної відповіді організму пацієнта, завдяки чому клітини пухлини можуть бути зруйновані. Імунна відповідь організму пацієнта може індукуватися прямим введенням пацієнту описаних пептидів або відповідних прекурсорних речовин (наприклад, подовжених пептидів, білків або нуклеїнових кислот, які кодують ці пептиди), ідеально в комбінації з агентом, що підвищує імунну реакцію (тобто, ад'юванта). Можна очікувати, що імунна відповідь, що виникає в результаті такої терапевтичної вакцинації, є високо специфічною по відношенню до клітин пухлини, оскільки пептиди-мішені за цим винаходом не є присутніми на нормальних тканинах у достатній кількості копій, що попереджає ризик небажаних аутоімунних реакцій проти нормальних клітин в організмі пацієнта. Фармацевтичні композиції включають пептиди або у вільній формі, або у формі фармацевтично прийнятної солі. Термін "фармацевтично прийнятна сіль" в тому виді, в якому він використовується тут, означає похідну сполуку розкритих пептидів, в якій пептид модифікується шляхом створення кислої чи основної солі речовини. Наприклад, кислі солі готуються з вільної основи (як правило, де нейтральна форма лікарського засобу має нейтральну –NH2-групу), за участю реакції з прийнятною кислотою. Прийнятні кислоти для приготування кислих солей включають органічні кислоти, такі, наприклад, як оцтова кислота, пропіонова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, щавлева кислота, яблучна кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, корична кислота, мигдальна кислота, метансульфокислота, етансульфокислота, p-толуолсульфокислота, саліцилова кислота і т.ін., а також неорганічні кислоти, наприклад, соляна кислота, бромисто-воднева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота і т. ін. І навпаки, приготування основних солей кислотних компонентів, які можуть бути присутніми на пептиді, здійснюється з використанням фармацевтично прийнятної основи, такої як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид амонію, гідроксид кальцію, триметиламін і тому подібні. В особливо переважному втіленні фармацевтичні композиції вміщують пептиди у вигляді солей оцтової кислоти (ацетати) або соляної кислоти (хлориди). На додаток до можливості використання для лікування раку, пептиди за цим винаходом можуть також використовуватися як діагностичні реактиви. Оскільки пептиди генерувалися з клітин раку шлунка і оскільки було визначено, що ці пептиди не є присутніми у нормальних тканинах, ці пептиди можуть використовуватися для діагностики наявності раку. Присутність пептидів за цим винаходом на біоптатах тканин може допомогти патоморфологу в діагностуванні раку. Виявлення певних пептидів за допомогою антитіл, мас-спектрометрії або інших методів, відомих фахівцям у цій галузі, може дати патоморфологу інформацію, чи є тканина злоякісною або запаленою або взагалі ураженою хворобою. Наявність груп пептидів може дозволити віднести хворі тканини до певного класу чи підкласу. Виявлення пептидів на зразках хворої тканини дає можливість прийняти рішення відносно користі від методів лікування за участю імунної системи, особливо якщо відомо або передбачається, що Т-лімфоцити причетні до механізму дії. Втрата експресії комплексом MHC є добре відомим механізмом, за яким інфіковані або злоякісні клітини уникають імунного контролю. Отже, наявність пептидів свідчить про те, що цей механізм не використовується клітинами, що аналізуються. Пептиди за цим винаходом можливо використовувати для аналізу відповіді лімфоцитів на дію таких пептидів, такої як реакція Т-клітин або відповідь антитіл на пептид або комплекс пептиду і молекул MHC. Ці відповіді лімфоцитів можливо використовувати як прогностичні маркери для прийняття рішень щодо наступних терапевтичних дій. Ці відповіді можна також використовувати як сурогатні маркери в імунотерапевтичних підходах, що мають на меті викликати відповіді лімфоцитів у різний спосіб, наприклад, вакцинацією білками, нуклеїновими 10 UA 111711 C2 5 10 15 кислотами, аутологічними матеріалами, адоптивне перенесення лімфоцитів. В закладах, де застосовують генну терапію, для оцінки побічних ефектів рекомендується проаналізувати реакції лімфоцитів на пептиди. Моніторинг реакцій лімфоцитів може також бути цінним інструментом під час подальшого спостереження після трансплантації, наприклад, для виявлення реакцій "трансплантат проти хазяїна" та "хазяїн проти трансплантата". Ці пептиди можуть використовуватися для продукції і розробки антитіл, специфічних до комплексів MHC/пептид. Вони можуть застосовуватися для лікування, націлюючи токсини або радіоактивні речовини на хворі тканини. Іншим використанням цих антитіл може бути націлювання радіонуклідів на хворі тканини з метою формування зображень, таких як позитронна емісійна томографія (ПЕТ). Таке використання може виявляти невеликі метастази або визначати розмір і точну локалізацію хворих тканин. Крім того, вони можуть використовуватися для підтвердження патоморфологічного діагнозу: рак на основі дослідження біоптату. У Таблиці 2 описані пептиди за цим винаходом, їх відповідні SEQ ID NO: і білки, з яких можуть походити ці пептиди. Всі пептиди зв'язуються з алелями HLA A*024. Таблиця 2: Пептиди за цим винаходом SEQ ID NO: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Код пептиду CDC2-001 ASPM-002 UCHL5-001 MET-006 PROM1-001 MMP11-001 MST1R-001 NFYB-001 SMC4-001 UQCRB-001 PPAP2C-001 AVL9-001 NUF2-001 ABL1-001 MUC6-001 ASPM-001 EPHA2-005 MMP3-001 NUF2-002 PLK4-001 ATAD2-002 COL12A1-001 COL6A3-001 FANCI-001 RPS11-001 ATAD2-001 ATAD2-003 HSP90B1-001 SIAH2-001 SLC6A6-001 IQGAP3-001 ERBB3-001 KIF2C-001 Послідовність LYQILQGIVF SYNPLWLRI NYLPFIMEL SYIDVLPEF SYIIDPLNL VWSDVTPLTF NYLLYVSNF VYTTSYQQI HYKPTPLYF YYNAAGFNKL AYLVYTDRL FYISPVNKL VYGIRLEHF TYGNLLDYL NYEETFPHI RYLWATVTI VYFSKSEQL VFIFKGNQF RFLSGIINF QYASRFVQL KYLTVKDYL VYNPTPNSL SYLQAANAL FYQPKIQQF YYKNIGLGF AYAIIKEEL LYPEVFEKF KYNDTFWKEF VFDTAIAHLF VYPNWAIGL VYKVVGNLL VYIEKNDKL IYNGKLFDLL 11 «Вихідний" білок (Вихідні білки) CDK1 ASPM UCHL5 MET PROM1 MMP11 MST1R NFYB SMC4 UQCRB PPAP2C AVL9 NUF2 ABL1 MUC6 ASPM EPHA2 MMP3 NUF2 PLK4 ATAD2 COL12A1 COL6A3 FANCI RPS11 ATAD2 ATAD2 HSP90B1 SIAH2 SLC6A6 IQGAP3 ERBB3 KIF2C UA 111711 C2 Додаткові перспективні HLA A*024 пептиди за винаходом SEQ ID NO: 34 35 36 37 Послідовність QYIDKLNEL MYMTVSIIDRF RYLPQCSYF IYAPKLQEF 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 5 Код пептиду CCDC88A-001 CCNB1-003 CCND2-001 CCNE2-001 CEA-010 CLCN3-001 DNAJC10-001 DNAJC10-002 EIF2S3-001 EIF3L-001 EPPK1-001 ERBB2-001 GPR39-001 ITGB4-001 LCN2-001 SDHC-001 PBK-001 POLD3-001 PSMD14-001 PTK2-001 RPS11-001 TSPAN1-002 ZNF598-001 ADAM10-001 MMP12-001 RRM2-001 TMPRSS4-001 TSPAN8-001 IYPDASLLI VYLLNSTTL IYLEVIHNL AYPTVKFYF IFSKIVSLF YYYVGFAYL RYLEGTSCI TYLPTNASLSF SYATLLHVL DYTIGFGKF SYNVTSVLF SYLELVKSL SYQKVIELF LYLENIDEF VYISSLALL RYLPKGFLNQF YYKNIGLGF VYTTMAEHF DYAYLREHF LYIQTDHLFF TYKYVDINTF YFISHVLAF VYTKVSAYL VYKETCISF «Вихідний" білок (Вихідні білки) CCDC88A CCNB1 CCND2 CCNE2 CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6 CLCN3 DNAJC10 EIF2S3, LOC255308 EIF3L, LOC340947 EPPK1 ERBB2 GPR39 ITGB4 LCN2 LOC642502, SDHC PBK POLD3 PSMD14 PTK2 RPS11 TSPAN1 ZNF598 ADAM10 MMP12 RRM2 TMPRSS4 TSPAN8 У іншому втіленні цього винаходу розкриваються як засіб проти раку шлунка пептиди, що зв'язуються з HLA A*02. Для людей, що є A*02- та/або A*24-позитивними, суміші пептидів, розкритих у винаході, можуть застосовуватися для лікування раку шлунка. Переважними є суміші від 2 до 20 пептидів і суміші 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 і 20 пептидів. SEQ ID NO: 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 Код пептиду DIO2-001 IGF2BP3-001 LMNB1-001 WNT5A-001 FAP-003 COPG-001 COL6A3-002 COL6A3-003 COL6A3-004 PSMC2-001 UBE2S-001 KIF11-001 ADAM8-001 CCNB1-001 Послідовність ALYDSVILL KIQEILTQV LADETLLKV AMSSKFFLV YVYQNNIYL VLEDLEVTV FLLDGSANV NLLDLDYEL FLIDSSEGV ALDEGDIAL ALNEEAGRLLL ILSPTVVSI KLLTEVHAA ALVQDLAKA 12 «Вихідний" білок (Вихідні білки) DIO2 IGF2BP3 LMNB1 WNT5A FAP COPG, COPG2, TSGA13 COL6A3 COL6A3 COL6A3 PSMC2 UBE2S KIF11 ADAM8 CCNB1 UA 111711 C2 SEQ ID NO: 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 5 10 15 20 25 30 35 Код пептиду CDC6-001 F2R-001 OLFM4-001 THY1-001 CEP250-001 HIF1A-001 KRAS-001 MET-001 NCAPG-001 NCAPG-002 TOP-004 TOP-005 LAMC2-002 AHR-001 CCNB1-002 CEACAM6-001 COPB1-001 HMMR-001 TPX2-001 TOP-001 Послідовність ILQDRLNQV TLDPRSFLL TLDDLLLYI SLLAQNTSWLL SLAEVNTQL ALDGFVMVL GVDDAFYTL YVDPVITSI YLLSYIQSI QIDDVTIKI YLYGQTTTYL KLDETGNSL RLDDLKMTV LTDEILTYV ILIDWLVQV VLYGPDVPTI SIFGEDALANV KLLEYIEEI KILEDVVGV KIFDEILVNA «Вихідний" білок (Вихідні білки) CDC6 F2R OLFM4 THY1 CEP250 HIF1A KRAS MET NCAPG NCAPG TOP2A TOP2A LAMC2 AHR CCNB1 CEACAM6 COPB1 HMMR TPX2 TOP2A, TOP2B Білок циклу 2 поділу клітин (CDC2) Серин/треонін кіназа CDC2, відома також під назвою Cdk1 (циклін-залежна кіназа 1) відіграє ключову роль у контролі клітинного циклу. Відомо, що вона є головним регулятором переходу G2/M клітинного циклу. У кінці інтерфази вона зв'язується з циклінами А-типу. Після руйнування ядерної оболонки цикліни А-типу заміщуються цикліном В, який утворює разом із Cdc2 фактор, що стимулює мітоз (MPF). Фактор MPF регулює проходження клітин по мітотичному циклу. Функція кінази Cdc2 у процесі мітозу не дублюється нічим і не може компенсуватися активністю інших протеїнкіназ, таких як Cdk2, 4 та 6. На протилежність цьому, повідомлялося, що Cdc2 виявляє активність під час інших фаз клітинного циклу, також таких як G1/S перехід, і що вона здатна заміняти "Cdk інтерфази". Отже, припускається, що Cdc2 є єдиною ключовою Cdk клітинного циклу. Надмірна експресія Cdc2 була виявлена в клітинах декількох видів пухлин, причому це часто було зв'язано з несприятливим прогнозом. Серед них карцинома передміхурової залози, карциноми порожнини рота, плоскоклітинного раку порожнини рота (OSCC), гострої мієлоїдної лейкемії (ГМЛ) (Qian і співавт.), пов'язаної з H. pylori MALT-лімфоми (Banerjee і співавт., 217-25) і карциноми товстої кишки (Yasui і співавт., 36-41). У випадку раку шлунка повідомлялось про надмірну експресію та/або підвищену активність, що може бути причиною виникнення хвороби. Інгібітори Cdc2 та інших Cdk розглядались як "кандидати у лікарський засіб" для терапії раку (Shapiro 1770-83). Білок веретена поділу, що асоційований із аутосомною рецесивною первинною мікроцефалією (ASPM) Аномальний ген аутосомної первинної мікроцефалії (ASPM), що кодує білок веретена поділу, є у людини ортологом гена asp Drosophila. Він бере участь в регуляції розвитку нервової клітини, і його мутації призводять до аутосомної рецесивної первинної мікроцефалії. Ген ASPM локалізований у полюсах веретена під час мітозу. Підвищену експресію гена ASPM запропонували використовувати як маркер і потенційну терапевтичну мішень при гліобластомі. Опосередкований siРНК "нокдаун" інгібує проліферацію клітин пухлини і нервових стовбурових клітин. Підвищена експресія гена ASPM може також передбачити підвищений інвазивний/метастатичний потенціал, ранній рецидив пухлини і несприятливий прогноз розвитку гепатоцелюлярної карциноми. Ген ASPM показав підвищену експресію в іморталізованих клітинах і тканинах немілкоклітинного раку легенів (Jung, Choi та Kim 703-13). Матричні металопротеїнази 3 (MMP3) MMP3, яка має також назву прожелатиназа або стромелізин 1, є ендопептидазою, що розщеплює такі компоненти позаклітинного матриксу (ECM) як фібронектин, ламінін, еластин, коров'ячий білок протеогліканів і неспіральні ланцюги колагену. MMP є важливим компонентом 13 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кількох фізіологічних процесів, що потребують перегрупування ECM, таких як міграція клітин під час ембріогенезу, реконструювання тканин, васкуляризація, інволюція молочної залози та загоєння ран. MMP3 також відіграє певну роль у агрегації тромбоцитів. Клінічні прояви патологічного стану, що охоплюють підвищену експресіюі секрецію MMP3, включають запальні стани і рак. MMP3 має підвищену експресію в деяких пухлинах і відіграє важливу роль у епітеліальномезенхімальному переході (ЕМП). Вона також робить внесок у ранні стадії канцерогенезу, запускаючи епігенетичні зміни, які призводять до злоякісного фенотипу (Lochter і співавт., 18093). Було показано, що поліморфізми промотора MMP3, що зв'язані з рівнями експресії, впливають на ризики і прогноз для деяких видів раку, таких як аденокарцинома стравоходу (Bradbury і співавт., 793-98) і плоскоклітинний рак порожнини рота (Vairaktaris і співавт., 4095100) (Liu і співавт., 430-35). У H. pylori-позитивних пацієнтів, хворих на рак шлунка з підвищеним рівнем MMP3 і MMP7 у сироватці, спостерігались вищі рівні інвазії лімфатичних вузлів і коротше виживання. У когорті із 74 пацієнтів, які мають рак шлунка, MMP3 експресувався у 27 % випадків (Murray і співавт., 791-97). Ген c-Met Ген c-Met є посередником потенціально онкогенної активності фактора росту гепатоцитів (HGF)/фактора розсіювання, у тому числі сприянню клітинному росту, рухливості клітин, коротшому виживанню, деградації позаклітинного матриксу і ангіогенезу. Зв'язування HGF активує низхідні сигнальні шляхи, включаючи Ras, фосфатиділінозитол 3’-кіназний, фосфоліпазний Cγ і міоген-активовані протеїнкіназні шляхи (Dong і співавт., 5911-18;Furge і співавт., 10722-27;Furge, Zhang та Vande Woude 5582-89;Montesano і співавт., 355-65;Naldini і співавт., 501-04;Ponzetto і співавт., 4600-08). c-Met експресується переважно у клітинах епітелію. Онкогенна активація c-Met (що також відбувається в неепітеліальних тканинах злоякісних пухлин) може відбуватися в результаті ампліфікації/надмірної експресії, активуючих мутацій, переходу на HGF/c-Met аутокринне зачароване коло або конститутивне фосфорилювання. 14754; Ferracini і співавт., 739-49; Fischer і співавт., 733-39; Koochekpour і співавт., 5391-98;L і співавт., 8125-35; Maulik і співавт., 41-59;Qian і співавт., 589-96;Ramirez і співавт., 635-44; Tuck і співавт., 225-32) (Nakaigawa і співавт., 3699-705). Конститутивна активація c-Met в організмі трансгенних мишей, у яких спостерігається надмірна експресія HGF, сприяє онкогенезу широкого спектру (Takayama і співавт., 701-06; Wang і співавт., 1023-34). Сайленсинг MET приводить до інгібування росту пухлин і метастазування (Corso і співавт., 684-93). Ампліфікація MET була пов'язана прогресуванням раку шлунка людини (Lin і співавт., 5680-89).(Yokozaki, Yasui і Tahara 49-95). Убіквітин-карбоксил-термінальна гідролаза L5 (UCHL5) UCHL5, відома також під назвою убіквітин-карбоксил-термінальна гідролаза (UCH37) або INO80R, є протеасомо-асоційованою деубіквітиназою. Вона розбирає зв'язані з білком поліубіквітинові ланцюги, починаючи з дистального кінця шляхом розщеплення ізопептидного зв'язку між С-термінальними Cys76 і Lys48 (Nishio і співавт., 855-60). У ядрі UCHL5 утворює зв'язок із Ino80 хроматин-ремоделюючим комплексом. Після зв'язування протеасоми він активується і може сприяти управлінню процесом транскрипції або репарації ДНК, яка, як припускається, опосередкована Ino80 і протеасомою. Специфічні до убіквітину протеази, такі як UCHL5, беруть участь у декількох процесах, таких як управління проходженням клітинного циклу, диференціація, реплікація і репарація ДНК, транскрипція, контроль якості білка, імунна відповідь і апоптоз. UCHL5 може сприяти злоякісному переродженню. Його активність, як було показано, підвищується у клітинах карциноми шийки матки у порівнянні з прилеглими нормальними тканинами. Можливо знизити активність убіквітину і таким чином стабілізувати рецептор TGF-бета та його медіатори по низхідній, транскрипційні фактори Smad, таким чином активуючи TGF-бета-сигнальний шлях. Активація сигнального шляху за участю TGF-бета може діяти як промотор пухлини на пізніх стадіях раку, хоча він має подвійну функцію і може також бути супресором пухлинного росту на ранніх стадіях та перед ініціацією (Bierie і Moses 29-40;Horton і співавт., 138-43;Wicks і співавт., 8080-84;Wicks і співавт., 761-63). Макрофаг-стимулюючий білковий рецептор (MST1R) Рецептор MST1R (інакше RON) є членом сімейства Met присутніх на поверхні клітин рецепторів тирозинових кіназ і головним чином експресується на епітеліальних клітинах і макрофагах. MST1R може індукувати міграцію, інвазію, проліферацію і виживання клітини у відповідь на її ліганд. Були описані його онкогенні властивості in vitro, а також у моделях in vivo у тварин, і часто спостерігається його дерегуляція у хворих на рак людей (Dussault і Bellon, 2009 Клінічні дослідження показали, що надмірна експресія MST1R пов'язана із несприятливим 14 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прогнозом і метастазами. Експресія MST1R є значною у тканинах раку і відповідних паранеопластичних тканинах, але не спостерігається у нормальній слизовій оболонці шлунка (Zhouі співавт., 236-40). "Нокдаун" MST1R в клітинах раку передміхурової залози приводить до зниження хемотаксису клітин ендотелію in vitro і до уповільнення росту пухлини і зниження щільності мікросудин після ортотопічної трансплантації в передміхурову залозу in vivo. siРНКопосередкований нокдаун MST1R у висококанцерогенній лінії клітин раку товстої кишки приводив до зниження проліферації у порівнянні з контрольними клітинами. Кінезиноподібний білок (KIF2C) KIF2C – це деполімераза мікротрубочок, що регулює належне їх прикріплення до кінетохора під час формування веретена поділу. Це є важливим для сегрегації хромосом в анафазі і може бути необхідним для координації початку розщеплення сестринських хроматид. Порушення прикріплення мікротрубочок до кінетохора призводить до порушення сегрегації хромосом і анеуплоїдії, які спостерігаються в найбільш солідних пухлинах (Maney і співавт., 67-131;Moore і Wordeman 537-46). KIF2C є надмірно експресованим у клітинах раку молочної залози (Shimo і співавт., 62-70), раку товстої кишки, колоректального раку і раку шлунка (Nakamura і співавт., 543-49). Лінія клітин раку шлунка (AZ521), яка стабільно експресує KIF2C, показала підвищену проліферацію і міграцію у порівнянні з клітинами з імітованою трансфекцією. Підвищена експресія KIF2C клітинами раку шлунка може свідчити про інвазію лімфатичних вузлів, метастази в лімфатичні вузли і несприятливий прогноз. Обробка клітин раку молочної залози короткими інтерферуючими РНК проти KIF2C інгібує їхній ріст. Білки 4 структурної підтримки хромосом (SMC4) SMC-білки є хромосомними АТФазами, що відіграють певну роль в організації вищих порядків структури хромосом і її динаміці. SMC4 є ключовим компонентом конденсинового комплексу, що бере участь у конденсації хроматину, і він також зв'язаний із сегрегацією хромосом і репарацією ДНК і підтримкою хромати нового скелету. Було показано, що ген SMC4 експресується на високому рівні у нормальній передміхуровій і слинній залозі, дуже слабо у товстій кишці, підшлунковій залозі і тонкій кишці і взагалі не експресується в інших тканинах. Експресія РНК на високому рівні спостерігалася у багатьох лініях клітин раку і зразках ракових тканин, включаючи рак молочної залози, передміхурової залози, товстої кишки і підшлункової залози (Egland і співавт., 5929-34). Рецептор 2 ефрину А (EPAH2) Ефринові рецептори - це унікальне сімейство рецепторів тирозинкіназ (RTK), які відіграють головну роль в формування органів і систем ембріону, нейронному націлюванні та розвитку сосудів під час нормального ембріогенезу. Стимуляція EphA2 його лігандом (ефрин-А1) приводить до автофосфорилювання EphA2, ця стимуляція змінює напрямок онкогенної трансформації. Ефринові рецептори та їх ліганди, ефрини, часто експресуються на високому рівні при самих різних видах раку. Рецептор EphA2 часто експресується на високому рівні і функціонально змінюється в клітинах агресивних пухлин. Вважають, що він сприяє росту пухлини шляхом підвищення адгезії клітини до позаклітинного матриксу, без'якірного росту і ангіогенезу. Надмірна експресія EphA2 і EphrinA-1 була виявлена у тканинах раку шлунка, що корелювало з глибиною інвазії пухлини, стадіями поширення пухлини (TNM), метастазуванням у лімфатичні вузли і несприятливим прогнозом (Yuan і співавт., 2410-17). ATAD2 ATAD2 (відомий також як ANCCA) є новим членом сімейства білків, що є АТФазами AAА+. Він підсилює транскрипційну активність андрогенового рецептора (AR) і естрогенового рецептора (ER), що приводить до транскрипції генів, включаючи IGF1R, IRS-2, SGK1 і виживання (AR) і цикліну D1, c-myc і E2F1 (ER), відповідно. Він також збільшує транскрипційну активність c-Myc. Експресія ATAD2 є високою у декількох пухлинах людини, таких як рак молочної залози, рак передміхурової залози і остеосаркома. Така експресія пов'язана з несприятливим прогнозом. AVL9 Несподівано, цей білок був описаний як вихідний білок, і доступні лише неякісні і дуже обмежені дані про білок AVL9 і про функцію відповідного гена. Колаген альфа-1(XII) (Col12A1) Колаген альфа-1(XII) є білком, амінокислотну послідовність альфа-1 ланцюга якого кодує ген COL12A1. Цей ген кодує альфа-ланцюг колагену типу XII, члена сімейства колагенів FACIT (фібріл-асоційованих колагенів із потрійною колагенової спіраллю). Колаген типу XII є гомотримером, який, як було виявлено, асоційований із колагеном типу I, причому ця асоціація, як вважається, модифікує взаємодію між фібрілами колагену I і оточуючим матриксом. Були ідентифіковані альтернативні сплайс-варіанти транскрипта, що кодує різні ізоформи. 15 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Колаген альфа-3(VI) (COL6A3) COL6A3 кодує альфа-3 ланцюг, один із трьох альфа-ланцюгів колагену типу VI. Було показано, що домени білку зв'язують білки позаклітинного матриксу. Ця взаємодія пояснює важливість цього колагену в організації компонентів матриксу. Ремоделювання позаклітинного матриксу шляхом надмірної експресії колагену VI сприяє розвитку резистентності клітин раку яєчника до дії цисплатину. Присутність колагену VI має зв'язок із ступенем злоякісності пухлини, прогностичним фактором для раку яєчника (Sherman-Baust і співавт., 377-86). COL6A3 надмірно експресувався в тканинах колоректальної пухлини (Smith і співавт., 1452-64), карциноми слинної залози (Leivo і співавт., 104-13) і інакше експресувався у хворих на рак шлунка (Yang і співавт., 1033-40). COL6A3 був ідентифікований як один із семи генів із пухлино-специфічними сплайсваріантами. Підтверджені пухлино-специфічні змінення сплайсингу були послідовними, даючи змогу легко розділити нормальні і ракові зразки і у деяких випадках навіть зразки різних стадій розвитку пухлини (Thorsen і співавт., 1214-24). Анемія Фанконі, комплементаційна група I (FANCI) Білок FANCI локалізується у хроматин у відповідь на ушкодження ДНК і бере участь у репарації ДНК (Smogorzewska і співавт., 289-301). Мутації у гені FANCI є причиною анемії Фанконі, генетично гетерогенного рецесивного захворювання, для якого характерні цитогенетична нестабільність, гіперчутливість до агентів, що зшивають ДНК, висока кількість розривів хромосом і дефектність репарацій ДНК. Змінений сплайсинг FANCI приводить до двох шляхів сплайсинга транскрипта, що кодує різні ізоформи. Білок теплового шоку 90 кДа бета-1 HSP90B1) HSP90 (відомий також під назвою білка 94, що регулюється глюкозою, Grp94), член 1, належить до групи білків людини, що забезпечують коректне посттрансляційне згортання білкових молекул. Він бере участь у ER (ендоплазматичний ретикулум)-асоційованих процесах: трансляції, контролю якості білка і ER-асоційованої деградації (ERAD), ER-стрес чутливості та зв'язування / утримання кальцію в ER (Christianson і співавт., 272-82;Fu і Lee 741-44). HSP90 містить послідовність KDEL, типову для білків, що утримують ER, але вона також є присутньою на поверхні пухлинних клітин (Altmeyer і співавт., 340-49), так само як і поза клітиною. HSP (білки теплового шоку), як відомо, вивільняються з некротичних (але не апоптотичних) клітин і клітин, що були піддані різним видам стресу, таким як тепловий і окислювальний шок, і їх можна виявити у кровообігу (Basu і співавт., 1539-46;Tsan і Gao 274-79). Позаклітинно HSP90 модулює (головним чином, стимулює) імунні відповіді і бере участь у презентації антигенів. На поверхні клітин він може відігравати роль рецептора входження патогену та/або сигналювання (Cabanes і співавт., 2827-38). У разі пухлино-специфічної експресії на поверхні клітини або вивільнення з неї він може індукувати протипухлинний імунітет (Zheng і співавт., 6731-35). Було продемонстровано, що вакцини на основі HSP90 імунізують проти раку та інфекційних хвороб у дослідженнях ефективності як при профілактиці, так і при лікуванні (див. огляд Bolhassani і Rafati 1185-99;Castelli і співавт., 227-33;Murshid, Gong, і Calderwood 1019-30)). Проте HSP90 може також розглядатися як мішень для протипухлинної терапії, оскільки 1) його вміст корелює з прогресуванням пухлини і приводить до резистентності по відношенню до апоптозу, а також до опромінення або хіміотерапії і 2) він у великій кількості експресується в багатьох пухлинах, включаючи рак шлунка, остеосаркому (Guo і співавт., 62-67), рак молочної залози (Hodorova і співавт., 31-35). Надмірна експресія HSP90 пов'язана з агресивністю пухлин і несприятливим прогнозом для хворих на рак шлунка (Wang, Wang, і Ying 35-41; Zheng і співавт., 1042-49). Знижений рівень експресії HSP90 у клітинах раку шлунка приводить до апоптозу ракових клітин (Sheu, Liu, і Lan e1096). Muc 6 MUC6 експресується клітинами слизової оболонки. Його головна функція, як вважається, слугувати засобом захисту уразливих епітеліальних поверхонь від руйнівної дії постійного впливу широкого діапазону ендогенних їдких або протеолітичних агентів (Toribara і співавт., 1997). MUC6 може також відігравати роль в епітеліальному органогенезі (Reid і Harris, 1999). Була виявлена експресія MUC6 в нормальній слизовій оболонці шлунка. Він надмірно експресується тканинами деяких видів пухлин, таких як аденома і карцинома товстої і тонкої кишки, карцинома легенів (Hamamoto і співавт., 891-96), колоректальні поліпи (Bartman і співавт., 210-18), рак молочної залози (Pereira і співавт., 210-13), в той час як він не експресується у відповідних нормальних тканинах. Припускається, що висока швидкість експресії MUC6 у ракових пухлинах слизових оболонок діє як бар'єр для розповсюдження пухлини, що приводить до їх менш агресивної біологічноїповедінки (Matsukita і співавт., 26-36). Експресія MUC6 була більш низькою у карциномах шлунка, ніж в аденомах або нормальних слизових оболонках, і обернено залежить від розміру пухлини, її глибини і ступеню інвазії, 16 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лімфатичної і венозної інвазії, метастазів у лімфатичні вузли і стадії за класифікацією UICC. Низька експресія MUC6 може сприяти злоякісному переродженню клітин епітелію шлунка і лежати в основі росту, інвазії, метастазування і диференціації карцином шлунка (Zheng і співавт., 817-23). Є також докази того, що інфекція Helicobacter pylori, одна з головних причин розвитку карцином шлунка, зв'язана зі зниженою експресією MUC6 (Kang і співавт., 29-35;Wang і Fang 425-31). Білок кінетохора Nuf2 Ген NUF2 (CDCA-1) кодує білок, що є дуже подібним до дріжджового Nuf2, компонента стабільного білкового комплексу, асоційованого з центромерою. Дріжджовий Nuf2 зникає із центромери під час профази мейозу, коли центромери втрачають свій зв'язок із полюсами веретена. Він відіграє регуляторну роль в сегрегації хромосом. Було показано, що міРНК сурвівіну і hNuf2 здійснюють тимчасовий "нокдаун" їхніх мРНК, спричиняючи багатоядерність і загибель клітин завдяки затримці клітини в мітозі, відповідно (Nguyen і співавт., 394-403). Nuf2 і Hec1 необхідні для організації стабільних сайтів зв'язування на плюс-кінці мікротрубочок на зовнішній мембрані, які необхідні для стабільних сил у напрямку полюсів для біологічної орієнтації на кінетохорах (DeLuca і співавт., 519-31). Було виявлено, що білок Nuf2 експресується у великій кількості в пухлинах NSCLC, що зв'язано з несприятливим прогнозом (Hayama і співавт., 10339-48), і в тканинах раку шийки матки (Martin і співавт., 333-59). У видалених хірургічно тканинах раку шлунка (дифузного типу, 6, кишкового типу, 4) 2 варіанти NUF2 експресуються на високому рівні. Припускається, що альтернативні сплайс-варіанти, виявлені у цьому дослідженні, потенційно придатні для використання як діагностичні маркери та/або нові мішені для протиракової терапії (Ohnuma і співавт., 57-68). Було виявлено, що siРНК-опосередкований "нокдаун" інгібує проліферацію та індукцію апоптозу в тканинах NSCLC, раку яєчника, раку шийки матки, раку шлунка, колоректального раку і гліоми (Kaneko і співавт., 1235-40). Ліпід-фосфат-фосфогідролаза 2 (PPAP2C) Фосфатази фосфатидної кислоти (PAP) сприяють перетворенню фосфатидної кислоти в діацилгліцерин і беруть участь у синтезі гліцероліпідів de novo, а також у активованій рецепторами передачі сигналів, опосередкованій фосфоліпазою D. Повідомлялося про три альтернативні сплайс-варіанти транскрипта, що кодують певні ізоформи. Активність PPAP2C є підвищеною у трансформованих первинних зрілих мезенхімальних стовбурових клітинах (MSC) і тканинах багатьох видів пухлин у людини. Це може бути необхідним для підвищеної проліферації клітин. Підвищена експресія PPAP2C, але не каталітично неактивного мутанта, приводила до передчасного входу у S-фазу, що супроводжувалось передчасним накопиченням цикліну А. "Нокдаун" зменшує проліферацію клітин, відтерміновуючи вхід у S-фазу (Flanagan і співав. 249-60). 40S рибосомальний білок S11 є білком (RPS11) Рибосоми складаються з малих 40S субодиниць і великих 60S субодиниць. Разом ці субодиниці складаються з 4 видів РНК і приблизно 80 різних за структурою білків. Ген RPS11 кодує рибосомальний білок, який є компонентом 40S-субодиниці. RPS11 був одним із шести генів, виявлених під час скринінгу на фекальні маркери на основі РНК для діагностики колоректального раку. Його знайшли тільки у фекальних колоноцитах пацієнтів, хворих на рак (Yajima і співавт., 1029-37). E3 убіквітин-лігаза Seven in absentia, гомолог 2 (SIAH2) SIAH2 є E3 убіквітинлігазою. Серед її субстратів є бета-катенін, TRAF2 і DCC (загублена алель, що містить ген колоректального раку) (Habelhah і співавт., 5756-65;Hu і Fearon 72432;Nakayama, Qi, і Ronai 443-51). SIAH2 також веде до руйнування ядерного білка repp86, що приводить до аброгації затримки клітини в мітозі, індукованої підвищеною експресією цього білка (Szczepanowski і співавт., 485-90). SIAH2 виявляє як пухлино-, так і метастазостимулюючими властивостями, через принаймні два шляхи (див. огляд Nakayama, Qi, і Ronai 443-51): По-перше, він приводить до убіквітинації і деградації білків шляхом гіпоксичної відповіді, які приводять до підвищеної транскрипційної активності індукованих гіпоксією факторів (HIF) (Nakayama, Qi, і Ronai 443-51)(Calzado і співав. 85-91). По-друге, він пригнічує Sprouty2, специфічний інгібітор сигнального шляху Ras/ERK. Для активності SIAH2 спостерігається кореляція з розвитком пухлин підшлункової залози, ймовірно, за рахунок його позитивного впливу на Ras-сигнальний шлях (Nakayama, Qi, і Ronai 443-51). Хоча роль SIAH2 при раку дещо суперечлива, деякі звіти описують зв'язок низьких рівнів SIAH2 із більш несприятливим прогнозом або терапевтичною відповіддю (Confalonieri і саівавт. 17 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2959-68) (Jansen і співавт., 263-71), інші демонструють пухлиногенну функцію (Frasor і співавт., 13153-57). Інгібування SIAH2 вважалось за протиракову терапію, оскільки, як було показано, воно інгібує ріст ксенотрансплантата у моделі меланоми миші (Qi і співавт., 16713-18;Shah і співавт., 799-808), і ліній клітин раку легенів людини, трансплантованих "голій" миші (Ahmed і співавт., 1606-29). Натрій- і хлорид-залежний тауриновий транспортер (SLC6A6) SLC6A6 є натрій- і хлорид-залежним тауриновим транспортером (TauT) (Han і співавт., 2006). Миші з "нокаутом" тауринового транспортера (taut-/-) можуть страждати хронічною хворобою печінки у зв'язку з дефіцитом таурину, яка може включати мітохондріальну дисфункцію (Warskulat і співавт., 2006). Експресія SLC6A6 є пригніченою геном-супресором пухлинного росту p53 і активується протоонкогенами, такими як WT1, c-Jun, і c-Myb. Надмірна експресія SLC6A6 захищає клітини нирки від цисплатин-обумовленої нефротоксичності (Han і співавт., 2006; Han і Chesney, 2009) Експресія SLC6A6 мРНК підтримувалась на високому рівні фактором некрозу пухлини альфа (ФНП-альфа) у клітинах Caco-2 кишкового епітелію людини (Mochizuki і співавт., 2005). Убіхінон-зв'язувальний білок комплексу убіхінол-цитохром С оксиредуктаза (UQCRB) Білок, що кодується геном UQCRB, є частиною комплексу убіхінол-цитохром С – оксидоредуктаза. Він зв'язує убіхінон і бере участь у переносі електрона. Мутації в цьому гені пов'язані із дефіцитом мітохондріального комплексу III. Був описаний псевдоген на Х хромосомі. UQCRB-ген може бути потенційним онкогеном або геном-супресором пухлинного росту у разі аденокарциноми протоків підшлункової залози (Harada і співавт., 13-24). Було показано, що він активно експресується в тканинах гепатоцелюлярної карциноми (Jia і співавт., 1133-39) Рецептор 3 епідермального фактора росту людини (ERBB3) ERBB3 кодує одного члена сімейства рецепторів епідермального фактора росту з тирозинкіназною активністю (EGFR). Він активується нейрегулінами, іншими ERBB- і не-ERBBрецпторами, а також іншими кіназами і новими механізмами. По низхідній він інтенсивно взаємодіє з фосфоінозитол 3-кіназою/білками, що беруть участь в антиапоптозному AKT-залежному/мітогенному сигнальних шляхах, але також із GRB, SHC, SRC, ABL, rasGAP, SYK і регулятором транскрипції EBP1 (Sithanandam і Anderson 413-48). Надмірна експресія ERBB3 була виявлена у багатьох ракових пухлинах, включаючи рак шлунка, де він може відігравати причинну роль і негативно впливати на прогноз (Kobayashi і співавт., 1294-301) (Slesak і співавт., 2727-32). (Zhang і співавт., 2112-18) виявили, що надмірна експресія ERBB3 була більш характерною для дифузного типу (26,2 %) раку шлунка, ніж для кишкового (5,0 %). Для обох типів його надмірна експресія зв'язана з несприятливим прогнозом. Підходи для націлювання на ERBB3 у терапії раку включають РНК-аптамери на позаклітинний домен (Chen і співавт., 9226-31), блокаду експресії генів синтетичними факторами транскрипції (Lund і співавт., 9082-91), використання невеликих молекул інгібіторів, таких як ізомер вітаміну E γ-токотриєнол (Samant і Sylvester 563-74), міРНК (Scott і співавт., 1479-86) і siРНК (Sithanandam і співавт., 1847-59). Промінін-1 (Prom1) Функція: Промінін-1, який також відомий як CD133, був ідентифікований як молекула, специфічна до гематопоетичних клітин-попередників CD34+ (Yin і співавт., 1997), і, як було показано, є маркером для нормальних стовбурових клітин і ракових стовбурових клітин (CSC) різних тканин. Він міститься, головним чином, на виступах плазматичних мембран і може брати участь в організації топології мембран або у підтримці ліпідного складу плазматичної мембрани. Було зроблене припущення, що сплайс-ізоформа промініна-1, що має назву AC133-2 і в якій є відсутнім невеликий екзон із 27 амінокислот, може слугувати навіть кращим маркером стовбурових клітин (Mizrak і співавт., 2008; Bidlingmaier і співавт., 2008). Тільки невеликий відсоток пухлинних клітин зазвичай є промінін-1-позитивними, як це очікувалося для маркера CSC. Залежно від виду пухлини, кількість позитивних клітин на масу пухлини лежить в діапазоні від 1 до 15 % і найчастіше становить близько 2 %. Спостерігався зв'язок промініна-1 з утворенням пухлини, ангіогенезом і стійкістю до впливу хімічних речовин (Zhu і співавт., 2009a) (Bruno і співавт., 2006; Hilbe і співавт., 2004) (Bertolini і співавт., 2009). Проте промінін-1-позитивні клітини можуть бути доступними для дії імунної системи, оскільки вони можуть бути знищені NK-клітинами (Castriconi і співавт., 2007; Pietra і співавт., 2009) і цитотоксичними T-клітинами (Brown і співавт., 2009). Хоча для багатьох видів раку було показано, що промінін-1-позитивні клітини функціонально є CSC і експресія часто пов'язана з несприятливим прогнозом, все ж таки існують деякі протиріччя. Деякі звіти свідчать, що він не є ні необхідним, ні достатнім для ідентифікації CSC (Cheng і співавт., 2009; Wu і Wu, 2009). Можливо, що комбінація промініна-1 з іншими 18 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекулами, такими як CD44, або навіть складні комбінації, такі як prom1(+), CD34(+), CD44(+), CD38(-), CD24(-), можуть служити кращими маркерами CSC. Для дифузного раку шлунка було зроблене припущення щодо експресії PROM1 на основі результатів аналізу in silico (Katoh і Katoh, 2007), і про високий рівень його експресії у порівнянні з нормальними тканинами шлунка при рівні білка повідомлялось у роботі (Smith і співавт., 2008). Проте (Boegl і Prinz, 2009) повідомляли, що експресія промініна-1 була зниженою в тканинах раку шлунка, особливо на пізніх стадіях, і стверджували, що експресія промініна-1 скоріше корелює з ангіогенезом – який також є зниженим на пізніх стадіях – ніж із ростом пухлини. У дослідженні з використанням ліній клітин раку шлунка (Takaishi і співавт., 2009) стверджується, що не промінін-1 є маркером CSC раку шлунка. Матрична металопротеїназа 11 (MMP11) Як інші MMP, MMP11 є ендопептидазою, що бере участь у процесах, які потребують відновлення тканин, таких як розвиток, загоєння ран і утворення шраму. Він також може негативно регулювати гомеостаз жирів, зменшуючи диференціацію адипоцитів. На відміну від інших MMP, він не здатний розщеплювати типові молекули позаклітинного матриксу, за винятком колагену VI. Проте були ідентифіковані інші субстрати, такі як альфа-2-макроглобулін, певні інгібітори серинпротеаз (серпіни), включаючи альфа-1-антитрипсин, білок-1, що зв'язує інсуліноподібний фактор росту, і ламініновий рецептор. При раку MMP11 головним чином експресується у стромальних клітинах, що оточують пухлинну тканину. Це було показано для багатьох видів раку. Як було встановлено, MMP11 надмірно експресується в стромі найбільш інвазивних карцином людини, але рідко у саркомах та інших неепітеліальних пухлинах. У більшості, але не в усіх випадках, MMP11 експресується у клітинах строми, безпосередньо прилеглих до пухлини, тоді як самі пухлинні клітини, нормальні тканини і клітини строми, відділені від пухлини, є негативними. Більш високі рівні MMP11 пов'язані з злоякісним фенотипом / більшою інвазією пухлин і несприятливим прогнозом. Проте у випадку папілярних карцином щитоподібної залози експресія MMP11 обернено пов'язана з агресивністю. MMP11 був виявлений у тканині пухлини, а також у сироватці пацієнтів, хворих на рак шлунка, і спостерігалась кореляція його експресії з метастазуванням (Yang і співавт.). Окрім того, (Deng і співавт., 274-81) показали, що MMP11 на високому рівні експресується в лініях клітин пухлин і у первинній пухлині хворих на рак шлунка – на відміну від інших видів раку, не виключно у стромі – і що він, можливо, прискорює проліферацію клітин пухлини. Субодиниця Y ядерного фактора транскрипції (NFYB) NFYB, відома також під назвою CBF-B або CBF-A, є, окрім NFYA і NFYC, частиною гетеротримерного базального фактора транскрипції NF-Y (також відомий як CCAATзв'язувальний фактор або CBF), який зв'язується з мотивами CCAAT – або з протилежними мотивами, ATTGG, що має назву Y-box – у промоторах і енхансерах багатьох генів. Серед генівмішеней NF-Y є гени MHC II класу, рецептор PDGF-бета, декілька білків теплового шоку, ген hMLH1 репарації помилково спарених нуклеотидів і топоізомераза II альфа. NFYB не є класичним онкогеном, проте його активність може сприяти онкогенезу. По-перше, гени клітинного циклу, такі як гени цикліну А, цикліну В1, Aurora A і cdk1, є мішенями NF-Y. Відбувається арешт клітинного циклу під час фази G2 / M без дії NFYB. (Park і співавт.) показали, що підвищений рівень цикліну B2 та інших пов'язаних із клітинним циклом генів у колоректальній аденокарциномі спостерігається завдяки активності NF-Y. По-друге, активність NF-Y протидіє апоптозу. Клітини, у яких не вистачає NF-Y, зазнають апоптоз завдяки активації p53 і зниженій транскрипції антиапоптотичних генів, які містять CCAAT-box у своїх промоторах, таких як Bcl-2 (Benatti і співавт., 1415-28). По-третє, його онкогенні властивості підсилюються в комбінації з іншими факторами транскрипції. Наприклад, мутований p53 з'єднується з NF-Y і p300-білками, підвищуючи експресію NF-Y-індукованих генів клітинного циклу. ABL1 Білок тирозинкіназа c-Abl курсує між ядерним і цитоплазматичним компартментами. Ядерний c-Abl бере участь у інгібуванні росту клітини і апоптозі, в той час як цитоплазматичний -Abl може відігравати роль у динаміці актину, морфогенезі і сигнальних шляхах, індукованих позаклітинними стимулами, такими як фактор росту і ліганди інтегрину. Повідомлялося, що цитоплазматичний c-Abl є промотором мітогенезу. Активність c-Abl-білка гальмується за негативним зворотнім зв'язком його SH3-доменом, і делеція SH3-домену перетворює ABL1 на онкоген. При захворюванні хронічною мієлоїдною лейкемією (ХМЛ) цей ген активується завдяки транслокації на ділянці BCR (розрив у двох ділянках) гена на хромосомі 22. Цей злитий білок, що утворився, BCR-ABL переходить у цитозоль і дозволяє клітинам проліферувати без регуляції цитокінами (Zhao і співавт.). Активність c-Abl також підвищується за позитивним зворотнім зв'язком у солідних пухлинах, як 19 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 було показано для карцином молочної залози і NSCLC. Надмірна експресія є недостатньою, і конститутивна активність кіназ потребує фосфорилювання білка. У клітинах раку молочної залози фосфорилювання c-Abl індукується тирозинкіназами плазматичної мембрани, включаючи SFK, членів сімейства EGFR і рецептор IGF-1. Злиті білки ABL не були виявлені у солідних пухлинах (Lin і Arlinghaus, 2008). Було показано, що ABL експресується в карциномі шлунка і зв'язаних мікросудинах, що дозволяє припустити його можливу участь у ангіогенезі. Слід завважити, що присутній у H.pylori цитотоксин-асоційований ген (CagA) приводить до активації c-Abl, який в результаті фосфорилює EGFR і, таким чином, блокує ендоцитоз EGFR (Bauer, Bartfeld і Meyer 156-69). Декілька інгібіторів тирозинкінази є більш-менш специфічними до Abl. Іматиніб (глівек) використовується як терапевтичний засіб першої лінії при CML і був також дозволений до застосування у пацієнтів на пізніх стадіях пухлин строми шлунковокишкового тракту (GIST), і він також має своєю мішенню онкоген KIT (Pytel і співавт., 66-76) (Croom і Perry, 2003). Іншими інгібіторами, що застосовуються для лікування раку, є дезатиніб і нілотиніб (Pytel і співавт., 66-76) (Deremer, Ustun, і Natarajan 1956-75). Polo-подібна кіназа 4 (Plk4) Члени сімейства Polo-подібних кіназ Plk1-4) є важливими під час поділу клітин, регулюючи кілька стадій мітозу. Plk4 регулює формування і дуплікацію центриолей (Rodrigues-Martins і співавт., 1046-50). Хоча загальновідомо, що Plk1 є онкогеном, функція Plk4 у захворюванні на рак є двозначною. Знижений, як і надмірний рівень експресії Plk4 пов'язаний з захворюванням раком у людей, мишей і мух. 43-49). Наприклад, в тканинах колоректального раку була виявлена надмірна експресія Plk4, але у невеликої кількості пацієнтів спостерігалась сильно знижена експресія Plk4 (Macmillan і співавт., 729-40). Це можна пояснити тим, що як надмірна експресія, так і дефіцит Plk4 призводить до формування дефектних центриолей, що є причиною аномальної кількості і структури хромосом, які часто виявляються у пухлинних клітинах і сприяють пошкодженню мітотичного апарату, який призводить до порушення сегрегації хромосом і анеуплоїдії (Peel і співавт., 834-43). (Kuriyama і співавт., 2014-23). (Korzeniewski і співавт., 6668-75). Білок 3, який активує ГТФазу, що містить IQ мотив (IQGAP3) IQGAP3 беруть участь у сигнальних шляхах клітин, а також у формуванні архітектури цитоскелету і неспецифічній адгезії клітин. Вони містять домен зі схожою послідовністю до комплексів RasGAP і, відповідно, зв'язуються з малими ГТФазами. Проте (і незважаючи на їхню назву) жоден з них не має ГТФазу-активуючих властивостей. Для IQGAP1 і IQGAP2 було показано, що вони навіть стабілізують зв'язок Rac1 і Cdc42 із ГТФазою, і було зроблене припущення, що IQGAP3 стабілізує активований Ras (Nojima і співавт., 971-78;White, Brown і Sacks 1817-24). Через свій IQ-домен вони зв'язуються з комплексом кальцій/калмодулін, а через кальпоніноподібний домен – з волокнами актину (White, Brown і Sacks 1817-24). (Wang і співавт., 567-77) повідомляють, що IQGAP3 експресується в мозку, де він зв'язується з волокнами актину, а також із Rac1 і Cdc42. Він накопичується в дистальній частині аксонів і прискорює Rac1/Ccd42-залежний ріст аксонів Білки IQGAP причетні до виникнення раку. Вважається, що IQGAP1 є онкогеном. Він підсилює декілька пов'язаних із раком сигнальних шляхів, таких як MAP-кіназний, бета-катеніновий і VEGF-асоційований шлях передачі сигналу і надмірно експресується у багатьох пухлинах. Вважається, що IQGAP2, навпаки, відіграє роль супресора пухлинного росту, і, як було виявлено, його вміст знижений у хворих на рак шлунка з несприятливим прогнозом (White, Brown і Sacks 1817-24). Щодо IQGAP3 доступна інформація є недостатньою. (Skawran і співавт., 505-16) показали, що він належить до генів, які мають дуже високий ступінь експресії в тканинах гепатоцелюлярної карциноми. У двох дослідженнях відзначалося, що IQGAP3 є специфічно експресованим у клітинах, що проліферують (Ki67+) у тонкій та товстій кишці і печінці мишей (Nojima і співавт., 971-78) (Kunimoto і співавт., 621-31). Двоспіральний домен, щомістить 88a (CCDC88A) CCDC88A є актин-зв'язувальним субстратом Akt, який задіяний в організації актину, Aktзалежній рухливості клітин у фібробластах. CCDC88A/Akt сигнальний шлях також є важливим у VEGF-опосередкованому постнеонатальному ангіогенезі. CCDC88A на високому рівні експресується у багатьох тканинах злоякісних пухлин у людини, включаючи карциноми молочної залози, товстої кишки, легенів і шийки матки. Він відіграє важливу роль у прогресуванні з аберантною активацією Akt-сигнального шляху. Циклін B1 (CCNB1) CCNB1 індукується під час G2/M фази мітозу і утворює фактор, стимулюючий мітоз (MPF) разом із циклін-залежною кіназою 1 (Cdk1)/Cdc2. Надмірна експресія була виявлена у багатьох видах ракових пухлин і часто пов'язана з несприятливим прогнозом перебігу, наприклад, раку молочної залози (Aaltonen і співавт., 2009; Agarwal і співавт., 2009; Suzuki і співавт., 2007), 20 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 медулобластоми (de? і співавт., 2008), NSCLC (Cooper і співавт., 2009), раку шийки матки (Zhao і співавт., 2006) та інших. Він був одним із генів, що входять у генетичний підпис, який складається із 11 генів і, як було виявлено, передбачає короткий термін до рецидиву хвороби у пацієнтів із 12 різними видами раку (Glinsky, 2006). Ніякої інформації щодо власне раку шлунка знайдено не було. Циклін D2 (CCND2) CCND2 зв'язує і активує, як інші цикліни D-типу (D1 і D3), циклін-залежну кіназу 4 (Cdk4) або Cdk6. Це є необхідним для переходу від G1- до S-фази. Було виявлено, що CCND2 надмірно експресується у багатьох пухлинах, включаючи пухлини яєчка і яєчника (Sicinski і співавт., 1996), злоякісні гематологічні хвороби (Hoglund і співавт., 1996; Gesk і співавт., 2006) і рак шлунка, де це може бути спричинено інфекцією H.pylori, і пов'язано з несприятливим прогнозом (Yu і співавт., 2003). (Yu і співавт., 2001) (Oshimo і співавт., 2003) (Takano і співавт., 1999) (Takano і співавт., 2000). Циклін E2 (CCNE2) CCNE2 зв'язує і активує, подібно до іншого Е-подібного цикліну CCNE1, Cdk2. Активність має пікове значення при переході від G1 до S-фази. В умовах здорового організму CCNE2 не виявляється в клітинах у стані спокою і може бути виявлений лише у тканинах, клітини яких активно діляться (Payton і Coats, 2002). Він часто аберантно експресується у ракових пухлинах, наприклад, раку молочної залози, що корелювало в несприятливим прогнозом (Desmedt і співавт., 2006; Ghayad і співавт., 2009; Payton і співавт.; 2002; Sieuwerts і співавт., 2006), і метастатичному раку передміхурової залози (Wu і співавт., 2009). Пов'язані з раковоембріональним антигеном молекули клітинної адгезії 1, 5 і 6 (CEACAM 1, 5 і 6) CEACAM є мембрано-заякореними глікопротеїнами, які опосередковують міжклітинні взаємодії і активують сигнальні шляхи інтегринів (Chan і Stanners, 2007). Вони також можуть відігравати роль рецепторів для патогенів, таких як E.coli (Berger і співавт., 2004) (Hauck і співавт., 2006) і брати участь в імунній регуляції (Shao і співавт., 2006). CEACAM5 і CEACAM6 мають проканцерогенні властивості. Вони інгібують аноїкіс (Ordonez і співавт., 2000), сприяють утворенню метастазів (Marshall, 2003; Ordonez і співавт., 2000) і порушують поляризацію клітинних мембран і архітектуру тканини (Chan і Stanners, 2007). Роль CEACAM1 у захворюванні на рак є двозначною. Він може бути супресором пухлини на ранніх стадіях і сприяти формуванню метастазів, уникненню імунної відповіді і ангіогенезу на пізніх стадіях (Hokari і співавт., 2007; Liu і співавт., 2007; Moh і Shen, 2009). Його функціональна роль залежить від ізоформи, оскільки CEACAM1 зустрічається в 11 сплайс-варіантах, співвідношення між якими визначається результатом сигналювання (Gray-Owen і Blumberg, 2006; Leung і співавт., 2006; Neumaier і співавт., 1993; Nittka і співавт., 2008). Співвідношення сплайс-варіантів може мінятися при захворюванні на рак (Gaur і співавт., 2008). CEACAM5 або CEACAM6 або вони обидва надмірно експресуються у багатьох випадках, аж до 70 % усіх пухлин людини, що часто пов'язано з несприятливим прогнозом (Chan і Stanners, 2007; Chevinsky, 1991). CEACAM5 сироватки є стандартним клінічним маркером карциноми товстої і прямої кишки, причому високі рівні пов'язані з несприятливим прогнозом або рецидивом (Chevinsky, 1991; Goldstein і Mitchell, 2005). Його також запропоновано використовувати як маркер інших видів раку, включаючи рак шлунка, але з обмеженою прогностичною цінністю (Victorzon і співавт., 1995). CEACAM1 може експресуватися на високому або низькому рівні при захворюванні на рак, залежно від виду пухлини (Kinugasa і співавт.,1998) (Dango і співавт., 2008) (Simeone і співавт., 2007). (Han і співавт., 2008) виявили дуже високі рівні CEACAM5 і CEACAM6 у дев'яти лініях клітин раку шлунка, в той час як CEACAM1 не був виявлений. На протилежність цьому, аналіз зразків первинної пухлини від 222 пацієнтів показав або цитоплазматичне, або мембранне забарвлювання для CEACAM1. Мембранозв'язана форма мала відношення до підвищеного ангіогенезу (Zhouі співавт., 2009). Дослідження (Kinugasa і співавт., 1998) також продемонструвало високій рівень експресії в аденокарциномах шлунка. У деяких пухлинах CEACAM1 у клітинах експресувався на низькому рівні, що приводило до надмірної експресії VEGF, а VEGF або гіпоксія можуть індукувати CEACAM1 у прилеглому ендотелії. Відповідно, моноклональне антитіло проти CEACAM1 блокувало VEGF-індуковане формування капіляроподібних структур ендотелію (Oliveira-Ferrer і співавт., 2004; Tilki і співавт., 2006; Ergun і співавт., 2000). Серед інших сполук головним чином як мішень для протиракових препаратів з використанням вакцинаційних підходів вивчався CEACAM5. Ці дослідження показали, що CEACAM5 може бути мішенню клітинних імунних реакцій (Cloosen і співавт., 2007; Marshall, 21 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2003). Огляд епітопів CEACAM5 для Т-клітин наведений у роботі (Sarobe і співавт., 2004). Хлоридний канал 3 (CLCN3) CLCN3 є Cl-каналом, що може бути механозалежним і сприяє регуляторному зменшенню об'єму (RVD), що відбувається як реакція на зростання об'єму клітини в ході клітинного циклу або в умовах гіпоосмосу (Lemonnier і співавт., 2004; Sardini і співавт., 2003). Проте з приводу цієї проблеми є суперечлива дискусія (Wang і співавт., 2004), і канал, що зменшує об'єм і який активується під час апоптозу, є відмінним від CLCN3 (Okada Wang і співавт., 2006) Експресія CLCN3 змінюється під час клітинного циклу, і пік її спостерігається у S-фазі (Wang і співавт.). Струми CLCN3 можуть бути важливими у процесах, що пов'язані з захворюванням на рак, для видів пухлин, в яких рівень експресії CLCN3 високий, таких як гліома. Пухлинні клітини потребують засобів корекції підвищення об'єму за рахунок проліферації і гіпоосмотичних впливів, наприклад, в результаті перітуморального набряку (Ernest і співавт., 2005; Olsen і співавт., 2003; Sontheimer, 2008). Окрім того, повідомлялося, що CLCN3 підсилює резистентність до етопозида, підвищуючи підкислення компартмента пізніх ендосом (Weylandt і співавт., 2007). siРНК-опосередкований "нокдаун" CLCN3 знижував міграцію клітин назофарингеальної карциноми in vitro (Mao і співавт., 2008). DNAJC10 DNAJC10 є компонентом надмолекулярного комплексу ER-асоційованої деградації (ERAD), який розпізнає і розкриває білки, що нездатні формувати нативну структуру, що є необхідним для ефективної реалізації ретроградного шляху їхньої ядерної транслокації (Ushioda і співавт., 2008). Було продемонстровано, що рівень цього білка є підвищеним у гепатоцелюлярній карциномі (Cunnea і співавт., 2007). Нокдаун DNAJC10, опосередкований siРНК, у клітинах нейроектодермальної пухлини підсилював апоптотичну відповідь на дію хіміотерапевтичного препарату фенретинід (Corazzari і співавт., 2007). Було показано, що ERdj5 знижує виживаність клітин нейробластоми шляхом зниження відповіді білків, що нездатні формувати нативну структуру (UPR) (Thomas і Spyrou, 2009). Фактор 2 ініціації трансляції у еукаріот, гамма-субодиниця 3 (EIF2S3) EIF2S3 є найбільшою субодиницею білкового комплексу (EIF2), що залучає метионіл-тРНК до рибосомної 40S-субодиниці (Clemens, 1997). Дія кіназ, що знижують активність EIF, таких як РНК-залежна протеїнкіназа (PKR), може мати проапоптотичний характер і пригнічувати ріст пухлин (Mounir і співавт., 2009). Повідомлялось, що у пухлинах раку шлунка спостерігаються більш високі рівні фосфорильованого і нефосфорильованого EIF2 і перерозподіл у ядро. Ці порушення регуляції вказують на причетність eIF2-альфа до захворювання на рак шлунковокишкового тракту (Lobo і співавт., 2000). Фактор 3 ініціації трансляції у еукаріот, субодиниця L (EIF3L) EIF3L є одною з 10-13 субодиниць EIF3, які зв'язують малу субодиницю рибосоми. EIF3 відіграє важливу роль у ранньому зв'язуванні великої субодиниці рибосоми. EIF3L належить до групи з п'яти субодиниць, про які повідомлялось, що вони не є суттєвими для формування EIF3 (Masutani і співавт., 2007). Скринінг із бібліотеками антисенсових послідовностей наводить на думку, що низький рівень експресії EIF3L посилює антионкогенну активність 5-фторурацилу по відношенню до клітин гепатоцелюлярної карциноми (Doh, 2008). Епіплакін 1 (EPPK1) EPPK1 є геном сімейства плакінів зі значною мірою невідомими функціями. Відомо, що гени сімейства плакінів задіяні у процесах зв'язування волокон цитоскелету і їхнього заякорювання на зоні злипання плазматичних мембран ((Yoshida і співавт., 2008). G-білок-асоційований рецептор 39 (GPR39) GPR39 є рецептором, зв'язаним із Gq-білком, який, як вважається, задіяний у роботі шлунково-кишкового тракту і в процесах метаболізму (Yamamoto і співавт., 2009). Його сигнальний шлях активує цАМФ і фактори транскрипції (Holst і співавт., 2004). Ендогенним лігандом для GPR39, ймовірно, є цинк (Chen і Zhao, 2007). GPR39 є новим інгібітором клітинної смерті, який може являти собою терапевтичну мішень у контексті процесів, що включають апоптоз і стрес ендоплазматичного ретикулуму, такий як рак (Dittmer і співавт., 2008). Було виявлено, що GPR39 експресується на високому рівні в мікроматрицях на основі як ліній клітин нирок ембріонів людини HFK, так і ксенотрансплантатів пухлини Вільямса зі збагаченням клітинної популяції клітинами пухлин, які за характеристиками схожі на стовбурові (Metsuyanim і співавт., 2009), і в лінії клітин гіпокампусу, стійкій до дії різних стимуляторів клітинної смерті (Dittmer і співавт., 2008). ERBB2/HER2/NEU ERBB2 є членом сімейства рецепторів тирозинкінази EGFR. Його точний ліганд невідомий, 22 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 але він є кращим партнером по гетеродимеризації для інших рецепторів сімейства HER (Olayioye, 2001). У карциномах HER2 діє як онкоген, головним чином, оскільки високий рівень ампліфікації гена індукує надмірну експресію білка у клітинній мембрані і подальше набуття злоякісною клітиною властивих їй ознак (Slamon і співавт., 1989). Надмірний рівень експресії спостерігається у певної частини багатьох видів раку, включаючи рак шлунка. Здебільшого це пов'язано з несприятливим прогнозом (Song і співавт., 2010), (Yonemura і співавт., 1991), (Uchino і співавт., 1993), (Mizutani і співавт., 1993). ERBB2 є мішенню моноклональних антитіл трастузумаб (що продається під назвою герцептин), який запропоновано як препарат вибору для пацієнтів із HER2-позитивним раком шлунка на пізніх стадіях в комбінації з хіміотерапією (Meza-Junco і співавт., 2009; Van Cutsem і співавт., 2009). Інші моноклональні антитіла, пертузумаб, який інгібує димеризацію рецепторів HER2 і HER3, проходить останні фази клінічних іспитів (Kristjansdottir і Dizon, 2010). Вибіркова надмірна експресія HER2 і HER3 в пухлинах двох гістологічних типів раку шлунка (кишкового типу і дифузного типу) чітко пов'язана з несприятливим прогнозом (Zhang і співавт., 2009). Інтегрин бета-4 (ITGB4) Інтегрини опосередковують міжклітинну адгезію, а також двонаправлену передачу регуляторних сигналів з клітини в клітину. Субодиниця інтегрин бета-4 гетеродимеризується з альфа-6-субодиницею. Інтегрин, що сформувався, прискорює утворення гемідесмосом між внутрішньоклітинним кератиновим цитоскелетом і базальною мембраною (Giancotti, 2007). Інтегрин бета-4 виконує подвійну функцію при ракових захворюваннях, оскільки він може бути посередником у процесі стабільної адгезії, з одного боку, і проінвазивному сигналюванні (включаючи Ras/Erk і PI3K сигнальні шляхи) і ангіогенезі, з іншого боку (Giancotti, 2007; Raymond і співавт., 2007). Він надмірно експресується у багатьох пухлинах, а також у клітинах ендотелію з ангіогенним потенціалом, що часто корелює з прогресуванням пухлини і утворенням метастазів. Високі рівні спостерігались у тканинах раку шлунка, особливо в клітинах пухлини з ознаками інвазії в строму (Giancotti, 2007; Tani і співавт., 1996). Проте в недиференційованій карциномі шлунка спостерігались низькі рівні його експресії тоді, коли інвазія пухлини ставала глибшою, завдяки поступовому епітеліально-мезенхімальному переходу, оскільки інтегрин бета4 є епітеліальним інтегрином (Yanchenko і співавт., 2009). Ліпокалін (LCN2) LCN2, або нейтрофільний желатиназа-асоційований ліпокалін (NGAL) є білком, що транспортує залізо, який існує у формі мономеру, гомодимеру або гетеродимеру, де він є зшитим дисульфідним зв'язком із MMP9 (Coles і співавт., 1999; Kjeldsen і співавт., 1993). Експресія підвищується у декількох видів пухлин, в деяких випадках це пов'язано з прогресуванням. З точки зору механізмів, він може стабілізувати MMP9 і змінити Е-кадхеринопосередковану міжклітинну адгезію, у такий спосіб це підвищує інвазію пухлин. Комплекси MMP-9 і LCN2 були пов'язані з гіршою виживаністю хворих на рак шлунка (Kubben і співавт., 2007) (Hu і співавт., 2009). Хоча спостерігався чіткий ефект сприяння розвитку пухлини для різних пухлин людини, у деяких дослідженнях було показано, що LCN2 може інгібувати регуляторний фактор HIF-1-альфа, який сприяє розвитку новоутворень, інгібувати ЖК-кіназний шлях фосфорилювання, а також синтез VEGF, у такий спосіб підтверджуючи, що в альтернативних умовах LCN2 також, як це не парадоксально, але має протипухлинну і протиметастатичну дію у новоутвореннях, наприклад, товстої кишки, яєчника і підшлункової залози. (Bolignano і співавт., 2009; Tong і співавт., 2008). LCN2 доцільно використовувати для інгібування ангіогенезу в пухлинах, на додаток до пригнічення метастазування пухлин при таких видах раку, що демонструють ras-активацію (Venkatesha і співавт., 2006). Сукцинатдегідрогеназний комплекс, субодиниця С (SDHC) SDHC є однією з чотирьох субодиниць сукцинатдегідрогенази, що кодуються ядерною ДНК (мітохондріальний комплекс II), яка переносить електрони від сукцинату до убіхінону з утворенням фумарату і убіхінолу. Нестача сукцинатдегідрогенази може призвести до GIST (McWhinney і співавт., 2007). Спадкові пухлини строми шлунково-кишкового тракту можуть виникати в результаті мутацій у генах SDHB, SDHC, і SDHD, що кодують субодиниці сукцинатдегідрогенази, а абдомінальні парагангліоми, пов'язані з шлунково-кишковими пухлинами, можуть виникати тільки в результаті мутацій у SDHC (Pasini і співавт., 2008). Білковий продукт мутантного SDHC у трансгенних мишей викликає окислювальний стрес і може сприяти ушкодженню ДНК, мутагенезу і, зрештою, онкогенезу (Ishii і співавт., 2005). Вважають, що сукцинатдегідрогеназа є супресором пухлин (Baysal, 2003; Gottlieb і Tomlinson, 2005). Зменшені рівні комплексу цього ферменту можуть призводити до онкогенезу (Eng і співавт., 2003). Кіназа із PDZ-зв'язувальним мотивом (PBK) 23 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 PBK є членом зв'язаної із MEK3/6 MAPKK, яка активує p38 MAP кіназу, наприклад, після рецепторів факторів росту (Abe і співавт., 2000; Ayllon і O'connor, 2007). JNK може бути вторинною мішенню (Oh і співавт., 2007). Оскільки у дорослих PBK експресується в яєчках (див. нижче), було висловлено припущення, що він бере участь у сперматогенезі (Abe і співавт., 2000; Zhao і співавт., 2001). Окрім того, він сприяє проліферації і резистентності до апоптозу в пухлинних клітинах. Він фосфорилюється і активується під час мітозу, що необхідно для формування веретена поділу і цитокінезу (Gaudet і співавт., 2000; Matsumoto і співавт., 2004; Park і співавт., 2009) (Abe і співавт., 2007). Інші його властивості щодо стимулювання росту і антиапоптотичні властивості включають пригнічення експресії p53 і фосфорилювання гістонів (Park і співавт., 2006; Zykova і співавт., 2006) (Nandi і співавт., 2007). PBK був класифікований як раково-тестикулярний антиген (Abe і співавт., 2000; Park і співавт., 2006), і, як було виявлено, він надмірно експресується при багатьох видах раку. ДНК-полімераза, дельта-3, додаткова субодиниця (POLD3) Комплекс ДНК-полімерази дельта бере участь у реплікації і репарації ДНК. Він складається із ядерного антигену клітин, що проліферують (PCNA), фактора реплікації С, що складається з декількох одиниць, і полімеразного комплексу із 4 субодиниць: POLD1, POLD2, POLD3 і POLD4 (Liu і Warbrick, 2006). POLD3 відіграє ключову роль у ефективній реактивації PCNA під час циклів дисоціації-асоціації POL-дельта під час стадії елонгації реплікації ДНК (Masuda і співавт., 2007). 26S протеасома (Prosome, macropain), неАТФазна субодиниця, 14 (PSMD14) PSMD14 є компонентом 26S протеасоми. Вона належить до комплексу 19S (19S структура cap; PA700), який забезпечує деубіквітинування субстрату під час протеасомної деградації (Spataro і співавт., 1997). Надмірний рівень експресії PSMD14 в клітинах ссавців впливає на проліферацію клітин і на відповідь на дію цитотоксичних препаратів, таких як вінбластин, цисплатин і доксорубіцин (Spataro і співавт., 2002). Пригнічування PSMD14 у клітинах HeLa під час дії siРНК приводило до зменшення життєздатності клітин і до підвищення рівня поліубіквітинованого білка (Gallery і співавт., 2007). Інгібування експресії PSMD14 при дії siРНК суттєво впливає на життєздатність клітин, призводячи до затримки клітин у G0-G1-фазі, що зрештою веде до старіння (Byrne і співавт., 2010). 26S протеасома (Prosome, macropain), АТФазна субодиниця, 2 (PSMC2) PSMC2 є частиною 26S-протеасомної системи. Вона є членом сімейства triple-A АТФаз, який виявляє шапероноподібну активність. Було продемонстровано, що ця субодиниця взаємодіє з кількома базальними факторами транскрипції, так що, на додаток до участі у протеосомному шляху, ця субодиниця може бути задіяною у регуляції транскрипції. Було показано, що 26Sпротеасомна система в скелетних м'язах може активуватися за рахунок TNF-альфа (Tan і співавт 2006). У трансгенних мишей, яким впроваджено ген HBx і які є носіями регуляторного гена HBx гепатиту В у своїй зародковій лінії, і у яких розвивається гепатоцелюлярна карцинома, PSMC2 та інші протеасомні субодиниці експресуються на високому рівні у тканинах пухлин (Cui і співавт., 2006). Рівні мРНК для АТФазної субодиниці PSMC2 комплексу 19S збільшувалися при раковій кахексії (Combaret і співавт., 1999). Білок тирозинкіназа 2 (PTK2) PTK2 є безрецепторною тирозинкіназою, яка модулює інтегриновий сигнальний шлях і може прискорювати ріст пухлини, її прогресування і утворення метастазів (Giaginis і співавт., 2009); (Hauck і співавт., 2002); (Zhao і Guan, 2009)). Було зроблено припущення, що PTK2 є маркером канцерогенезу і прогресування раку (Su і співавт., 2002; Theocharis і співавт., 2009; Jan і співавт., 2009). Її надмірна експресія та/або підвищена активність спостерігається у дуже багатьох ракових пухлинах людини, включаючи рак шлунка. PTK2 також передає сигнали по низхідній від гастринового рецептора, що сприяє проліферації клітин раку шлунка (Li і співавт., 2008b). Було показано, що 8 % карцином шлунка є носіями вірусу Епштейна-Барра (EBV). Для інфікованих EBV субліній клітин раку шлунка людини є характерним підвищене фосфорилювання за участю PTK2 (Kassis і співавт., 2002). Рівень фосфорилювання тирозина за участю PTK2 у клітинах епітелію шлунка знижується за рахунок дії cagA-позитивного продукту Helicobacter pylori. Тетраспанін 1 (TSPAN1) і тетраспанін 8 (TSPAN8) TSPAN1 і TSPAN8 належать до сімейства тетраспанінів, для яких характерні чотири трансмембранні домени і внутрішньоклітинний N- і C-кінець і які приймають участь в різних процесах, включаючи клітинну адгезію, рухливість клітин, активацію і інвазію пухлини. Вони часто утворюють великі молекулярні комплекси з іншими білками, такими як інтегрини, на поверхні клітини (Tarrant і співавт., 2003; Serru і співавт., 2000). Функції TSPAN1 поки що невідомі і можуть включати участь у секреції (Scholz і співавт., 2009). TSPAN1 надмірно 24 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експресується в деяких видах пухлин, часто у кореляції зі стадією, прогресуванням і гіршими результатами для пацієнта. Слід завважити, що повідомлялося про те, що він був надмірно експресований у 56,98 % із 86 хворих на рак шлунка, і спостерігалася позитивна кореляція зі стадією хвороби, інфільтрацією і станом лімфовузлів і негативна кореляція з виживаністю і ступенем диференціації пухлини (Chen і співавт, 2008). Повідомлялося, що TSPAN8 є геном, що був пов'язаним із метастазами у багатьох видів пухлин (PMID: 16467180). Для рака шлунка і кишечника експресія TSPAN8 пов'язана з несприятливим прогнозом (PMID: 16849554). Пальцеподібний білок 598, що містить цинк (ZNF598) ZNF598 є пальцеподібним білком, що містить цинк, із поки що невідомими функціями. Дезінтегрин і металопротеїназа 10 (ADAM-10) ADAM-10 приймає участь в ангіогенезі, розвитку пухлини і онтогенезі. Він експресується на високому рівні в карциномі шлунка. Селективні інгібітори ADAM-10 проходять зараз клінічні дослідження як препарати для лікування раку. (PMID: 19408347) Матрична металопротеїназа 12 (MMP12) MMP12 є цинк-залежною ендопептидазою, що розкладає еластин і багато інших матричних і нематричних білків і яка задіяна у міграції макрофагів і інгібуванні ангіогенезу (Chakraborti і співавт., 2003; Chandler і співавт., 1996; Sang, 1998). Вона також відіграє роль у патологічних процесах руйнування тканин, таких як астма, емфізема і хронічна обструктивна хвороба легенів (ХОХЛ), ревматоїдний артрит і ріст пухлин (Cataldo і співавт., 2003; Wallace і співавт., 2008). Обговорювалася доцільність використання інгібіторів MMP12 як препаратів для лікування цих захворювань (Churg і співавт., 2007; Norman, 2009). Часто спостерігається надмірна експресія MMP12 при захворюванні на рак, де її функції є неоднозначними. Хоча вона може мати відношення до розчинення позаклітинного матриксу і, у такий спосіб, до утворення метастазів, вона може також інгібувати ріст пухлин шляхом продукування ангіостатину, який негативно впливає на ангіогенез. Повідомлялося про підвищену експресію MMP12 у хворих на рак шлунка, і було показано, що це має сприятливий вплив. Було показано, що вона негативно корелює зі щільністю мікросудин, VEGF, ступенем диференціації пухлини, судинною інвазією, метастазами у лімфатичні вузли і ймовірністю рецидиву. Пацієнти з надмірною експресією MMP12 показували суттєво кращу виживаність (Cheng і співавт., 2010; Zhang і співавт., 2007b; Zhang і співавт., 2007a). Рибонуклеотидредуктаза M2 (RRM2) RRM2 є одною із субодиниць рибонуклеотидредуктази, яка продукує дезоксирибонуклеотиди із рибонуклеотидів. Надмірна експресія RRM2 спостерігалася в пухлинах, включаючи рак шлунка, вона підвищує метастатичний потенціал (PMID: 18941749) (PMID: 19250552) siРНК-опосередкований "нокдаун" RRM2 уповільнює ріст пухлин в організмах різних біологічних видів (миша, пацюк, мавпа) (PMID: 17929316; PMID: 17404105). Трансмембранна протеаза, серин 4 (TMPRSS4) TMPRSS4 є трансмембранною серин-протеазою типу II, яка знайдена на поверхні клітин, що мають високий рівень експресії у тканинах декількох видів пухлин, включаючи рак підшлункової залози, товстої кишки і шлунка. Біологічні функції TMPRSS4 при раку поки що невідомі. TMPRSS4 має чотири сплайс-варіанти (Scott і співавт., 2001; Sawasaki і співавт., 2004). Експресія у карциномі яєчника корелювала зі стадією (Sawasaki і співавт., 2004). TMPRSS4 є значно підвищеним у тканинах раку легенів, і siРНК-опосередкований "нокдаун" TMPRSS4 при лікуванні малими інтерферуючими РНК в лініях клітин раку легенів і товстої кишки був пов'язаний зі зменшенням інвазії клітин і адгезії клітин на матриксі, а також із модуляцією проліферації клітин (Jung і співавт., 2008). Дейодиназа, йодтиронін, тип II (DIO2) DIO2 перетворює прогормон тироксин (Т4) у біологічно активний 3,3",5-трийодтиронін (Т3). Він експресується на високому рівні у щитоподібній залозі, і було виявлено, що його експресія та/або активність розрегульована при раку щитоподібної залозі (de Souza Meyer і співавт., 2005) (Arnaldi і співавт., 2005). Проте його було також виявлено в інших тканинах, таких як нормальні тканини легенів і тканини раку легенів (Wawrzynska і співавт., 2003), і в пухлинах мозку (Murakami і співав., 2000). Білок 3 (IGF2BP3), що зв'язує мРНК гена інсуліноподібного фактора росту 2 () IGF2BP3 головним чином міститься у ядрі, де він зв'язує мРНК гена IGF2 і пригнічує її трансляцію. Він відіграє роль в ембріогенезі, і його експресія є низькою у тканинах дорослих. У пухлинних клітинах може спостерігатися високий рівень його експресії, і, таким чином, його вважають онкофетальним білком (Liao і співавт., 2005). Було виявлено, що при багатьох видах раку, включаючи рак шлунка, він надмірно експресується, що пов'язано з несприятливим прогнозом (Jeng і співавт., 2009)(Jiang і співавт., 2006). Пептиди, що були отримані із IGF2BP3, 25 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перевірялися в дослідженнях протиракової вакцинації (Kono і співавт., 2009). Ламін B1 (LMNB1) Ламін В1 є білком ядерної ламіни і він бере участь в забезпеченні стабільності клітинного ядра, в хроматинових структурах і в експресії генів. На ранніх стадіях апоптозу ламін розкладається (Neamati і співавт., 1995) (Sato і співавт., 2008b; (Sato і співавт., 2008a; (Sato і співавт., 2009). LMNB1 до деякої міри експресується в майже усіх нормальних соматичних клітинах, і раніше проведені дослідження показали, що його вміст може зменшуватися під час патологічних процесів при деяких видах раку, включаючи рак шлунка (Moss і співавт., 1999). Було показано, що при інших видах раку, таких як гепатоцелюлярна карцинома, LMNB1 експресується на високому рівні і його вміст позитивно корелює зі стадією розвитку пухлини, розміром і кількістю вражених лімфовузлів (Lim і співавт., 2002). Сімейство сигнальних білків типу Wingless вірусів MMTV, що мають інтеграційний модуль, член 5А WNT5A є сигнальним білком, що секретується, задіяним у процесах розвитку і в онкогенезі. Канонічне сигналювання за участю WNT5A через рецептори Frizzled і LRP5/LRP6 приводить до підтримки стовбурових клітин/попередників, в той час як неканонічне сигналювання за участю WNT5A через рецептори Frizzled і ROR2/PTK/RYK контролює полярність тканин, їх адгезію або рух, наприклад, на межі поділу пухлина/строма, що призводить до інвазії пухлин (Katoh і Katoh, 2007). Він може відігравати роль супресора у деяких ракових пухлинах, але експресується на високому рівні в інших пухлинах, включаючи рак шлунка, де він сприяє прогресуванню і утворенню метастазів і призводить до несприятливого прогнозу (Li і співавт., 2010) (Yamamoto і співавт., 2009) (Kurayoshi і співавт., 2006). Білок активації фібробластів, альфа (FAP) FAP є інтегральною мембранною желатиназою. Її передбачувана серин-протеазна активність може відігравати роль у контролі росту фібробластів або епітеліальномезенхімальних взаємодіях під час розвитку і відновлення тканин і епітеліального канцерогенезу (Scanlan і співавт., 1994). FAP може відігравати певну роль у рості ракової пухлини, розвитку метастазів і ангіогенезі за рахунок процесів адгезії і міграції клітин, а також швидкої деградації компонентів ECM. Він є присутнім на пухлинних клітинах, які проникають до ECM, у реактивних раково-асоційованих фібробластах і клітинах ендотелію, що беруть участь в ангіогенезі, але не в неактивних клітинах того ж типу. (Dolznig і співавт., 2005; Kennedy і співавт., 2009; Rettig і співавт., 1993; Rettig і співавт., 1994; Scanlan і співавт., 1994; Zhang і співавт., 2010). Біла виявлена експресія FAP у клітинах раку шлунка і асоційованих фібробластах строми (Zhi і співавт., 2010) (Chen і співавт., 2006)(Mori і співавт., 2004; Okada і співавт., 2003). В моделі миші було показано, що клітини, які експресують FAP, є обов'язковим імуносупресивним компонентом мікросередовища, що оточує пухлину (Kraman і співавт., 2010). У дослідженнях протипухлинної вакцинації на моделі миші FAP успішно використовувався як мішень для CD8+ і CD4+T-клітинної відповіді (Loeffler і співавт., 2006; Wen і співавт., 2010)(Lee і співавт., 2005) (Fassnacht і співавт., 2005). Комплекс білка Coatomer, субодиниця гамма (COPG); комплекс білка Coatomer, субодиниця гамма 2 (COPG2); комплекс білка Coatomer, субодиниця бета 1 (COPB1) COPG, COPG2 і COPB1 є субодиницями комплексу білка coatomer, який також має назву цитозольного білкового комплексу 1 (COPI), який пов'язаний із везикулами, що не покриті клатрином. Везикули, що покриті COPI, є посередниками ретроградного транспорту із апарату Гольджі назад до ER і транспорту всередині апарату Гольджі (Watson і співавт., 2004). Вони можуть також бути задіяними в антероградному транспорті (Nickel і співавт., 1998). Ретроградний транспорт регулює, серед інших, залежний від EGF (епідермального фактора росту) ядерний транспорт EGFR (рецептора епідермального фактора росту), який зв'язується з COPG (Wang і співавт., 2010). Було показано, що COPG надмірно експресується в клітинах раку легенів і тканинах ендотелію мікросудин ракової пухлини легенів (Park і співавт., 2008). Послідовність повсюдно експресованого COPG2 на 80 % ідентична послідовності GOPG (Blagitko і співавт., 1999). COPG2 може утворювати COP I-подібний комплекс замість GOPG, який, ймовірно, є функціонально надмірним (Futatsumori і співавт., 2000). Нокдаун COPB1 у клітинній лінії, яка експресує ген трансмембранного регулятора муковісцидозу (CFTR), дав змогу припустити, що комплекс білка Coatomer бере участь у транспорті CRTR у плазматичну мембрану (Denning і співавт.,1992), (Bannykh і співавт., 2000). Фермент, що кон'югує з убіквітином E2S (UBE2S) UBE2S є допоміжним фактором комплексу, що стимулює анафазу (APC), Е3убіквітинлігазою, яка регулює вихід клітин зі стадії мітотичного поділу і фази G1 за рахунок 26 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 націлювання на регулятори клітинного циклу. UBE2S подовжує убіквітинові ланцюги після того, як субстрати були попередньо піддані убітиквінуванню іншими компонентами (Wu і співавт., 2010). UBE2S є також націленим на білок VHL для протеасомної деградації, у такий спосіб стабілізуючи HIF-1-альфа (Lim і співавт., 2008) і, можливо, підтримуючи проліферацію, епітеліально-мезенхімальний перехід і утворення метастазів (Chen і співавт., 2009) (Jung і співавт., 2006). UBE2S є надмірно експресованим у декількох видах пухлин. Член сімейства кінезинів 11 (KIF11) KIF11 є необхідним для формування біполярного мітотичного веретена. Було виявлено, що він надмірно експресується у декількох видах ракових пухлин, часто спостерігається кореляція із параметрами клінічної патології (Liu і співавт., 2010), (Peyre і співавт., 2010). Невеликі молекули інгібіторів KIF11, такі як S-тритил-L-цистеїн (STLC), які були розроблені як потенціальні препарати проти раку, затримують клітини в мітозі і сприяють апоптозу ракових клітин (Tsui і співавт., 2009), (Wiltshire і співавт., 2010), (Ding і співавт., 2010). В клінічних дослідженнях було показано, що інгібітори KIF11 виявляють лише помірну активність (Kaan і співавт., 2010; Tunquist і співавт., 2010; Wiltshire і співавт., 2010; Zhang і Xu, 2008). Білок із дезінтегриновим і металопротеїназним доменом 8 (ADAM8) Спочатку вважали, що ADAM8 є імуноспецифічним білком ADAM, але його виявили також в клітинах інших типів, часто за умов, яки були пов'язані з запаленням і реконструкцією ECM, включаючи ракові пухлини і респіраторні захворювання, такі як астма (Koller і співавт., 2009). Багато видів білків ADAM, включаючи ADAM8, експресуються у злоякісних пухлинах людини, де вони беруть участь у регулюванні активності фактора росту і функцій інтегрину, що призводить до стимулювання росту і інвазії пухлин, хоча точні механізми цих процесів поки що невідомі (Mochizuki і Okada 2007). У пухлинах шлунка миші рівень ADAM8 та інших білків ADAM є підвищеним, ймовірно, завдяки активації передачі сигналу від рецептора EGFR (Oshima і співавт., 2011). Гомолог білка 6 циклу поділу клітин (S.cerevisiae) (CDC6) CDC6 є важливим для ініціювання реплікації ДНК. Він локалізований у ядрі під час G1, але переходить у цитоплазму на початку фази S. CDC6 також регулює активацію реплікації в точці звірення шляхом взаємодії з ATR (Yoshida і співавт., 2010). Порушення регуляції CDC6 може призвести до інактивації локусу INK4/ARF, який кодує три важливих гена-супресора пухлин: p16INK4a і p15INK4b, обидва є активаторами ретинобластомного шляху, і ARF, активатора p53 (Gonzalez і співавт., 2006). siРНК-опосередкований "нокдаун" CDC6 може перешкоджати проліферації і сприяти апоптозу (Lau і співавт., 2006). CDC6 є надмірно експресованим у ракових пухлинах, включаючи рак шлунка (Nakamura і співавт., 2007) (Tsukamoto і співавт., 2008). Рецептор фактора коагуляції II F2R (тромбіну) (F2R) F2R, який також має назву рецептору, що активується протеїназами (PAR1), є G-протеїнзв'язаним рецептором. Сигнали PAR1, PAR2 і PAR4 можуть регулювати вивільнення кальцію або активацію міоген-активованої протеїнкінази і приводити до агрегації тромбоцитів, релаксації судин, проліферації клітин, вивільнення цитокінів і запалення (Oikonomopoulou і співавт., 2010). Вважається, що F2R бере участь у проліферації епітеліальних і пухлинних клітин і в ангіогенезі і є надмірно експресованим у інвазивних і метастатичних пухлинах багатьох видів. Рівні експресії позитивно корелюють із ступенем інвазивності ракової пухлини (Garcia-Lopez і співавт., 2010) (Lurje і співавт., 2010). У клітинах карциноми шлунка активація F2R може запустити каскад реакцій, які прискорюютьріст і інвазію пухлинних клітин, наприклад, надмірну експресію NFkappaB, EGFR і тенасцин-C (TN-C) (Fujimoto і співавт., 2010). Відповідно, було виявлено, що експресія F2R у хворих на рак шлунка пов'язана з глибиною інвазії в стінки, перитонеальним поширенням і несприятливим прогнозом (Fujimoto і співавт., 2008). Були описані моноклональні мишині антитіла до PAR1 людини (ATAP-2), які розпізнають епітоп (SFLLRNPN) на N-кінці тромбінового рецептору, а також агоніст рецептору пептиду TFLLRNPNDK (Hollenberg і Compton 2002; Mari і співавт., 1996; Xu і співавт., 1995) Олфактомедин 4 (OLFM4) OLFM4, чия функція значною мірою невідома, має високі рівні експресії при запаленні епітелію товстої кишки і при декількох видах пухлин у людини, особливо пухлин системи травлення (Koshida і співавт., 2007). OLFM4 є стійким маркером стовбурових клітин у кишечнику людини і він "мітить" субпопуляцію клітин колоректального раку (van der Flier і співавт., 2009). OLFM4 інгібує білок GRIM-19, що відповідає за апоптоз Zhang і співавт., 2004), (Huang і співавт., 2010), регулює клітинний цикл і прискорює перехід від S-фази під час проліферації ракових клітин. Крім того, OLFM4 пов'язаний з адгезією ракових клітин і метастазуванням (Yu і співавт., 2011b). Примусова надмірна експресія OLFM4 у клітинах пухлини передміхурової залози у 27 UA 111711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мишей призводило до прискореного утворення пухлини у тварин із сингенним трансплантатом (Zhang і співавт., 2004). Було показано, що OLFM4 надмірно експресується при раку шлунка (Aung і співавт., 2006). Інгібування експресії OLFM4 може викликати апоптоз у присутності цитотоксичних агентів у клітинах ракової пухлини шлунка (Kim і співавт., 2010). Була також виявлена підвищена концентрація OLFM4 у сироватці пацієнтів перед операцією з приводу раку шлунка у порівнянні зі здоровими донорами (Oue і співавт., 2009). OLFM4 був ідентифікований як новий ген-мішень для ретиноєвих кислот (RA) і агент для деметилювання, як і 5-аза-2'дезоксицитидин. Ці два агенти, як виявилося, є ефективними при лікуванні деяких пацієнтів із мієлоїдною лейкемією (Liu і співавт., 2010). Набір Thy-1 cell surface antigen (THY1) Thy-1 (CD90) є GPI-заякореним глікопротеїном, який був виявлений на багатьох видах клітин, включаючи Т-клітини, нейрони, клітини ендотелію і фібробласти. Thy-1 бере участь у декількох процесах, таких як адгезія, відновлення нервової тканини, ріст пухлин, пригнічення росту пухлини, міграція, клітинна смерть і активація Т-клітин. (Rege і Hagood 2006b; Rege і Hagood 2006a) (Jurisic і співавт., 2010). Thy-1 є, очевидно, маркером для ангіогенезу у дорослих, але не у ембріонів (Lee і співавт., 1998). Окрім того, його вважають маркером різних видів стовбурових клітин (мезенхімальних стовбурових клітин, стовбурових клітин печінки ("овальних клітин") (Masson і співавт., 2006), кератиноцитів (Nakamura і співавт., 2006) і гематопоетичних стовбурових клітин (Yamazaki і співавт., 2009). Thy-1 експресується на високому рівні у декількох видах ракових пухлин, включаючи рак шлунка і GIST, для яких його пропонували використовувати як маркер (Yang і Chung 2008; Zhang і співавт., 2010) (Oikonomou і співавт., 2007). Центросомальний білок 250 кДа (CEP250) Cep250 приймає участь у когезії центрів організації мікротрубочок (Mayor і співавт., 2000) Він також має назву цетросомного Nek2-асоційованого білка, або C-Nap1, оскільки він локалізуються сумісно із серин/треонінкіназою Nek2 і є її субстратом. Nek2-кіназа і її субстрати регулюють зв'язок між центросомами (Bahmanyar і співавт., 2008). На початку мітозу, коли центросоми розділяються, щоб утворити біполярне веретено, C-Nap1 фосфорилюється і потім дисоціює від центросом. Досліди in vitro показали, що надмірна експресія Cep250 пошкоджувала організацію мікротрубочок на центросомі (Mayor і співавт., 2002). Фактор 1, що індукується гіпоксією, альфа-субодиниця (фактор транскрипції із основним доменом типу спіраль-петля-спіраль) (HIF1A) HIF1A є чутливою до кисню субодиницею фактора, що індукується гіпоксією (HIF), фактора транскрипції, що є активним в умовах гіпоксії, яка часто спостерігається в пухлинах. Він опосередковує транскрипцію більш ніж 60 генів, задіяних у виживанні, метаболізмі глюкози, інвазії, метастазуванні і ангіогенезі (наприклад, VEGF). HIF1 має високий рівень експресії при багатьох видах раку, часто пов'язаних із несприятливим прогнозом, і вважається цікавою мішенню для фармакологічних маніпуляцій (Griffiths і співавт., 2005; Quintero і співавт., 2004; Stoeltzing і співавт., 2004) (Zhong і співавт., 1999). При раку шлунка HIF1A сприяє ангіогенезу (Nam і співавт., 2011), його вміст корелює із розміром пухлини, більш низьким рівнем диференціації, більш пізньою стадією розвитку пухлини, коротшим виживанням (Qiu et al. 2011) і частішими метастазами (Wang і співавт., 2010) (Han і співавт., 2006; Kim і співавт., 2009; Oh і співавт., 2008; Ru і співавт., 2007). Також вважається, що він веде до резистентності до хіміотерапевтичних препаратів, таких як 5-FU, за рахунок інгібування апоптозу, що викликаний ліками, і знижує внутрішньоклітинне накопичення препаратів (Nakamura і співавт., 2009) (Liu і співавт., 2008). Інгібітор HIF-1альфа 2метоксиестрадіол значно знижує метастатичні властивості клітин раку шлунка (Rohwer і співавт., 2009). Гомолог онкогену V-Ki-ras2 саркоми пацюків Кірстена (KRAS) KRAS є членом суперсімейства малих ГТФаз і протоонкогеном, що бере участь у ранніх стадіях багатьох шляхів передачі сигналів, таких як MAPK- і AKT-опосередковані шляхи, які є потенційно онкогенними. Одиночні амінокислотні заміни ведуть до активації мутацій, приводячи до трансформації білків, які відіграють ключову роль у різних злоякісних пухлинах, включаючи рак шлунка (Capella і співавт., 1991) Онкогенні мутації KRAS рідко спостерігаються при раку шлунка. В одному різновиді раку шлунка локус KRAS був ампліфікованим, що приводило до надмірної експресії білка KRAS. Отже, ймовірно, що ампліфікація гена створює молекулярну основу для надмірної активації KRAS при раку шлунка (Mita і співавт., 2009). Мутантні алелі KRAS сприяють індукції VEGF, спричиненій гіпоксією (Kikuchi і співавт., 2009; Zeng і співавт., 2010). Мутований KRAS можливо також виявити у сироватці або плазмі пацієнтів, хворих на рак, і тому було запропоновано використовувати його як легко доступний пухлинний маркер 28