Спосіб інгібування опосередкованого avb5 ангіогенезу у тканині у пацієнта з неоваскулярним захворюванням рогівки

1. Спосіб інгібування опосередкованого αvβ5 ангіогенезу у тканині, який містить αvβ5, де вказаний ангіогенез має місце у пацієнта з неоваскулярним порушенням рогівки, вибраним з групи порушень, яка складається з трансплантації рогівки, герпетичного кератиту, люе тичного кератиту, птеригіуму та неоваскулярного панусу, пов'язаного з носінням контактних лінз, що включає введення C2 2 (19) 1 3 84665 4 інтегринів в специфічній адгезії клітин в багатьох Інгібування адгезії клітин in vitro із використанклітинних взаємодіях в тканинах, ще досі досліням моноклональних антитіл, імуноспецифічних до джуються. Проте, зрозуміло, що існують різні інтерізних a- або b-субодиниць інтегрину припускає грини з різними біологічними функціями, так само, участь рецептора a vb 5 вітронектину в клітинній як і різні інтегрини і субодиниці, що мають окремі адгезії різних типів клітин, включаючи міроваскувиди біологічної специфічності. Важливим розпілярні ендотеліальні клітини. [Davis et al., J. Cell. знавальним сайтом у ліганді для багатьох інтегриBiochem., 51: 206-218 (1993)]. Крім того, [Nicosia et нів є трипептидна послідовність аргінін-гліцинal., Am. J. Pathol., 138: 829-833 (1991)] описали аспарагінова кислота (RGD). RGD виявлений у використання RGD-пептиду, GRGDS, для інгібувсіх лігандах інтегринів, які, як зазначено вище, є вання in vitro утворення «мікросудин» з аорти парецепторами вітронектину. Цей RGD розпізнавацюка, культивовані у колагеновому гелі. льний сайт може бути імітований поліпептидами Однак інгібування утворення «мікросудин» in («пептидами»), що містять RGD-послідовність, і vitro у культурах на колагеновому гелі не є копією відомо, що такі RGD- пептиди інгібують функцію інгібування ангіогенезу в тканині, тому що не доінтегринів. Важливо проте, відзначити, що в залеведено, що мікросудинні структури є такими ж, як жності від послідовності і структури RGD-пептиду капілярні розростання, або що утворення мікросуспецифічність інгібування може змінюватися в подини в культурі на колагеновому гелі є такимо ж, рівнянні зі специфічністю заданих інтегринів. як і неоваскулярний розвиток у інтактній тканині, RGD-розпізнавальний сайт розглядався в такій, як тканина при артриті, тканина пухлини або огляді [Pierschbacher et al., Nature, 309: 30-33 тканина при такому захворюванні, де інгібування (1984), Pierschbacher et. al., Proc. Natl. Acad. Sci ангіогенезу є бажаним. USA, 81: 5985-5988 (1984)]. Різні RGDРоль a vb 3 в ангіогенезі була недавно підтверполіпептиди, що змінюють специфічність інтегриджена, [Cм. Broors et al., Science, 264: 569-571 нів, були також описані [Grant et al., Cell, 58: 933(1994)]. Було показано, що Інтегрин експресується 943 (1989); Cheresh et al., Cell, 58: 945-953 (1989); на кровоносних судинах грануляційної тканини Aumailley et al., FEBS Letts. 291: 50-54 (1991); Pfaff рани людини, але не в нормальній шкірі. Моноклоet al., J. Biol. Chem., 269: 20233-20238 (1984) і в нальні антитела до a vb 3 рецептора інгібували ангіпатентах США №№ 4517686, 4578079, 4589881, огенез, викликаний чинниками росту (цитокінами), 4614517, 4661111, 4792525, 4683291, 4879237, основним чинником росту фібробластів (bFGF) і a4988621, 5041380 і 5061693]. фактором некрозу пухлини (TNF-a), так само, як і Ангіогенез, називаний також неоваскулярізаціфрагментами меланоми. Однак антагоністи інгібуєю, є процес тканинної васкулярізації, що тягне за вали тільки утворення нових, але не вже існуючих собою ріст нових кровоносних судин, що розвивасудин. Крім цього показано, що специфічні лінійні і ються в тканині Процес обумовлений інфільтраціциклічні пептиди, що містять RGD, інгібують неоєю клітин ендотелію і клітин гладкого м'яза. Вваваскулярізацію. жають, що цей процес має місце в будь-якому із Було висловлене припущення, що інгібування трьох нижченазваних випадків: 1) Судини можуть ангіогенезу повинно бути корисним засобом для розростатися з вже існуючих судин; 2) Новий розобмеження росту пухлин. виток судин може початися на основі клітинІнгібування ангіогенезу передбачалося: 1) інгіпопередників; або 3) Існуючі дрібні судини можуть буванням виділення «ангіогенних молекул», таких, збільшуватися в діаметрі. [Blood et al., Bioch. як bFGF (основний чинник росту фібробластів), 2) Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990)]. Відомо, що нейтралізацією ангіогенних молекул, наприклад, васкулярні, ендотеліальні клітини містять, принайвикористанням анти-bFGF антитіл, і 3) інгібуванмні, п'ять RGD-залежних інтегринів, включаючи ням реакції клітин ендотелію, на ангіогенні стимурецептор вітронектину (a vb 3 або a vb 5), рецептор ли. Цей останній напрямок вивчався, і [Folkman et колагену Типів І і IV, рецептор ламініну (a 2b 1), реal., Cancer Biology, 3: 89-96 (1992)] описали декільцептор фібронектину (ламініну) колагену (a 3b 1) і ка інгібіторів ендотеліально-клітинної реакції, рецептор фібронектину (a 5b 1). [Davis et al., J. Cell. включаючи інгібітор колагенази, інгібітори основBiochem., 51: 206-218 (1993)]. Відомо, що клітина ного мембранного обміну, ангіостатичні стероїди, гладкого м'яза містить принаймні RGD-эалежних інгібітори ангіогенезу, що виділяються з грибів, інтегринів, включаючи a 5b 1, a vb 3 і a vb 5. тромбоцитний чинник 4, тромбоспондин, препараАнгіогенез - процес, що має важливе значення ти, використовувані при артриті, такі як Dв неонатальному розвитку, він також важливий при пеніциламін і тіомолат золота, аналоги вітаміну D3 загоєнні ран і в патогенезі великої кількості клінічальфа-інтерферон і їм подібні, що могли б бути но важливих захворювань, що включають запавикористані для інгібування ангіогенезу. Додаткові лення тканин, артрити, псоріаз, рак, діабетичну передбачувані інгібітори ангіогенезу - [див. Blood ретинопатію, плямисту дегенерацію й інші неовасet al.. Biochim. Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990), кулярні захворювання очей. Ці клінічні ситуації, Moses et al., Science, 248: 1408-1410 (1990), lngber зв'язані з ангіогенезом, називають ангіогенними et. al., Lab. Invest., 59: 44-51 (1988) і US патенти захворюваннями. [Folkman et al., Science, 235: 442№№ 5092885, 5112946, 5192744 і 5202352]. 447 (1987)]. Проте, для даного винаходу про роль інтегриАнгіогенез в основному відсутній у розвинути х ну a vb 5 в ангіогенезі не висловлювалося ніяких зрілих тканинах, незважаючи на те, що він виникає припущень, вона не була визначена, і жодний з при ранозагоїнні, у циклі росту жовтого тіла. [Див., інгібіторів, описаних у ви щевказаних джерелах не наприклад, Moses et al., Science, 248: 1408-1410 був пов'язаний із інгібуванням за допомогою a vb 5. (1990)]. 5 84665 6 Більш того, крім даного винаходу відсутні повідомється з неоваскуляризацією райдужної оболонки ока, що спостерігалася і була описана: [Miller et аl., лення, що наводять на думку про роль a vb 5 інтегрину в неоваскуляризації, особливо такої, що індуAm. J. Path., 145: 574-584 (1994)]. Додатковими даними на модельній системі проліферативної кується чинниками росту, чинником судинного ретинопатії миші, у якій була створена гіпоксія, ендотеліального росту (VEGF), чинником-a (TGFбуло показано, що VEGF матрична PHK збільшуa), що змінює ріст, чинником росту епідермісу валася протягом 6-12 часів відносної гіпоксії і за(EGF). лишалася збільшеною доти, поки не розвивалася Незважаючи на те, що число чинників росту, неоваскуляризація. Як тільки розвиток нових кровключених у контроль ангіогенезу, лімітовано, ісвоносних судин закінчувався, знижувалася й екснують різні рівні контролю за перетворенням стана пресія VEGF, як описано [Pierce et al., Ргос. Natl. спочинку в неоваскулярний стан. [Див. D,Amore, Acad. Sci. USA, 92: 905-909 (1995)]. Investigative Ophthal. Visual Sci., 35: 3974-3979 Таким чином, отримані нещодавно дані на мо(1994)]. У той час як деякі чинники росту, що беделях ішемії з використанням тварин показують руть участь в ангіогенезі, регулюються рівнем синвідповідність між індукцією VEGF і початком ішемії, тезу, інші регулюються станом активації. Ці події в за якою слідує неоваскуляризація. VEGF, а також і клітинах відбуваються, коли судина, яка знахоінші чинники росту, беруть участь і при інших умодиться у стані спокою, піддається неоваскуляривах у захворюваннях, при яких має місце неовасзації внаслідок ушкодження або ішемії. куляризація, як це описано [Folkman, Nature Зокрема, думають, що VEGF - головний посеMedicine, 1:27-31 (1995)]. редник в ангіогенезі при первинній пухлині й у Доповідь Folkman et al. підводить результати ішемічних захворюваннях очей. [Див. огляд поточних клінічних спроб контролювати небажаний Folkman, Nature Medicine, 1: 27-31 (1995)]. VEGF ангіогенез. При клінічних іспитах пацієнти одержуявляє собою гомодимер із молекулярною масою вали лікарські засоби з інгібіторами ангіогенезу, 46 кілодальтон (кДа), що є специфічним до клітин включаючи тромбоцитний чинник 4, похідне фумаендотелію ангіогенним [Ferrara et al., Endocrin. гіліну, карбоксиамінотриазол і їм подібні. Проте, Rev., 13: 18-32 (1992)] і судинопроникаючим чинвідсутні повідомлення про поточні терапевтичні ником, [Senger et al., Cancer Res., 46: 5629-5632 спостереження, що підтверджують кореляцію екс(1986)], що зв'язує високо-специфічні мембранозпресії a vb 5 ангіогенезом, особливо, коли останній в'язані рецептори з тирозин-кіназною активністю індуковано VEGF. Таким чином, до даного винахо[Jakeman et al. , J. Clin. Invest., 89: 244-253 (1992)]. ду ніким не описувався і не використовувався теНещодавно було показано, що активація рецепторних тирозинкіназ прискорює пересування рапевтичний прийом із використанням a vb 5 антагоністів для контролю за ангіогенезом у тканинах з інтегрин-залежних клітин до екстрацелюлярних розвинутим ангіогенезом, пов'язаний з участю й матричних білків. Зокрема, [Klemke et al. , J. Cell. Biol., 127: 859-866 (1994)] припустили, що роль активацією a vb 5. EGF рецепторної (EGFR) тирозинкінази в посиТому, крім показаних тут звітів про дослідженленні клітинної рухливості, але не адгезії FG-клітин ня a vb 5 і зв'язку чинників росту з ангіогенезом, Запанкреатичної карциноми людини на вітронектині явнику не відомо будь-яке інше підтвердження за допомогою a vb 5 інтегрину. Автори дають прятого, що ангіогенез може бути інгібований у тканині мий доказ того, що зв'язування EGFR EGFз поміччю інгібіторів a vb 5-обумовленої клітинної лігандом підвищує тирозинкіназну активність адгезії. Зокрема, ніколи раніше не було показано, EGFR, що відразу ж стимулює залежний від протещо a vb 5 функція необхідна для ангіогенезу в ткаїнкінази C (РКС) процес, що веде до виникнення нині або що a vb 5 антагоністи можуть інгібувати пересування аур5-залежних клітин до вітринонекангіогенез у тканині, особливо у випадку очних тинового субстрату, до якого клітини не спроможні неоваскулярних захворювань. мігрувати у природному стані. Таким чином, відДаний винахід показує, що крім плину ангіогекриття Klemke et al. дають доказ кореляції присутнезу в тканинах, що потребує a vb 3, існ ує також і ності цитокінів, особливо EGF з активністю інтегінший новий підхід із використанням a vb 5. Таким рину в міграції клітин. Було показано, що активація чином, у Винаході описуються інгібітори a vb 5, що РКС бере участь у регуляції ангіогенезу в модельможуть інгібувати ангіогенез. Далі винахід описує, ній системі на основі хоріоалантоїсної мембрани що активність a vb 5 у посиленні ангіогенезу, як його курчати. [Див. Tsopanoglou et al., J. Vase. Res., 30: учасника, співвідноситься з чинник-ростовою (ци202-208 (1993)]. Автори визначили специфічні актокіновою) активацією тирозинкіназ рецептора тиватори й інгібітори РКС, що відповідно стимулючинника росту і протеїнкінази C (РКС). Чинники вали і інгібували ангіогенез у модельній системі. росту (цитокіни), що діють таким чином, включаПроте ні Klemke et аl., ні Tsopanoglou et al. не ють васкулярний ендотеліальний чинник росту обговорювали вищеописану роль цитокінів і екс(VEGF), що трансформує чинник росту - a (TGF-a), пресії і/або активації a vb інтегрину в прискоренні епідермальний чинник росту (EGF) і їм подібні. ангіогенезу при різних умовах і хворобливих стаВинахід далі описує способи інгібування ангіонах і інгібування його a vb 5-специфічними антагонігенезу в тканині, що включають введення в тканистами. ну композиції, яка містить інгібуючу ангіогенез кіНещодавно було експериментально показано лькість a vb 5 антагоніста. на модельній системі захворювання очей мавпи, Тканина, яку слід опрацьовувати таким чином, що ретинальна ішемія, викликана закупоркою реможе бути будь-якою, в якій бажано інгібування тинальної вени, призводила до швидкого зростанангіогенезу, наприклад, тканини при захворювання VEGF у водяних камерах ока. Цей підйом збіга 7 84665 8 нях, коли розвивається неоваскуляризація. ПриФігури 2А і 2В - гістограми, що показують секладами таких тканин служать тканини ока, де редню неосваскулярну площу в мм 2 +/-стандартна розвилася неоваскуляризація, запалення тканин, помилка (n=8 для кожної з двох серій) після індуктверді пухлини, метастази, тканини, що зазнають ції відповідно або bFGF, або VEGF, після чого рестеноз, і подібні ім. У кращих варіантах, неовасйшло опрацювання mAb відповідно або PIF6 або LM609. Обговорення результатів приводиться в куляризація, пов'язана з експресією a vb 5, є резульПрикладі 4. татом дії чинників росту, VEGF, TGF-a і EGF. Фігури 3 A-3F (фотографії) ілюстр ують е фекти Найкращими є способи лікування, спрямовані від опрацювання Сам-препарату к урчати антина інгібування VEGF-обумовленої васкуляризації в інтегриновими антитілами. Обговорення результатканинах, таких як очна, де ангіогенез яскраво витів - у Прикладі 6А. Ангіогенез, викликаний або ражений при захворюваннях, що включають діабеbFGF, або VEGF, після чого внутрішньовенно увотичну ретинопатію (називану також проліферативдили фосфатно-сольовий буфер (PBS), для контною діабетичною ретинопатією), пов'язану з віком ролю, або моноклональні тіла PIF6 або LM609, плямисту дегенерацію, передбачуваний очний описаний в написі до Фігури 1. САМ, оброблені гістоплазмозіс, ретинопатію передчасності, клітинbFGF, показані на Фігурах 3 А, 3С і 3Е, тоді як САМ, ну ретинопатію і неоваскулярну глаукому. У подаоброблені VEGF, показані на Фігурах 3В, 3D і 3F. льших кращих варіантах способи лікування передКонтрольні САМ після внутрішньовенних ін'єкцій бачають інгібування ангіогенезу, що трапляється PBS показані на Фігурах 3 А і 3В. На Фігурах 3С і при неоваскулярних порушеннях рогової оболонки 3D показане опрацювання САМ РІР6-антитілом, а ока, які включають пересадку рогової оболонки на Фігурах 3Е і 3F - опрацювання САМ LM609ока, герпетичні кератити, сифілітичні кератити, антитілом. птеригіум, неоваскулярний панус, пов'язаний із На Фігурах 4А і 4В у виді гістограми показані використанням контактних лінз і т.п. кількісні значення результатів, показаних на Фігуa vb 5 антагоніст, використовуваний у заявлених рах 3A-3F. Показник ангіогенезу нанесений на способах, спроможний зв'язувати a vb 5 і конкурентграфіку на вісь Y проти контролю або опрацюванно інгібувати спроможність a vb 5 зв'язуватися з ня антитілом, Фігури 4А і 4В відповідно показують природним вітронектиновим лігандом. Переважно ангіогенез, викликаний bFGF і VEGF. Обго ворення антагоніст виявляє специфічність до a vb 5 у поріврезультатів у Прикладі 4. нянні з іншими інтегринами. У найбільш кращому Фігури 5A-5F фотографічно ілюструють реваріанті антагоніст інгібує зв'язування вітронектину зультати опрацювання синтетичним пептидом або інших лігандів, що містять RGD, із a vb 5, але САМ препарату курчати, як описано в Прикладі 6. незначно інгібує зв'язування вітронектину з a vb 3 Ангіогенез, викликаний або bFGF, або VEGF, із або a 11bb 3. Кращий a vb 5 антагоніст може бути лінаступним внутрішньовенним уведенням фосфатнійним або циклічним поліпептидом, моноклонано-сольового буфера (PBS) у якості контролю або льним антитілом або його функціональним фрагсинтетичних циклічних пептидів RGDf (SEQ ID No. ментом або імітуючою органічною молекулою, яка 4) або RADfV (SEQ ID No. 5). САМ оброблені є міметиком a vb 5 ліганда, що називається також bFGF, показані на Фігурах 5A, 5С і 5E, тоді як САМ органічним міметиком, усі вони специфічно взаєоброблені VEGF, показані на Фігурах 5В, 5D і 5F. модіють із a vb 5. Контрольні препарати САМ, що одержали внутріПризначення a vb 5 антагоністів, відповідно до шньовенні ін'єкції PBS, показані на Фігурах 5А і 5В. даного винаходу включають інтраокулярне, внутНа Фігурах 5С і 5D показані САМ, оброблені пепрішньовенне, трансдермальне, внутрішньосиновітидом RDGf, а на Фігурах 5Е і 5F - оброблені пепальне, внутрішньом'язове й оральне введення. У тидом RADfV. інших кращих варіантах спосіб уведення коордиНа Фігурах 6А і 6В у виді гістограми проілюстнують із хіміотерапевтичним режимом для контроровані кількісні значення результатів, показаних на лю за розвитком пухлини і ракових метастазів. Фігура х 5A-5F. Показник ангіогенезу нанесений на У графічних матеріалах, що складають частиграфіку на вісь Y проти контролю або обробки анну цього відкриття: Фігури 1A-1D ілюструють інгітитілом. Фігури 6А і 6В відповідно показують ангіобування викликаного цитокіном ангіогенезу в рогогенез, викликаний bFGF і VEGF. Результати обговій оболонці ока кролика за допомогою ворюються в Прикладі 6. антагоністів, що являють собою a v інтегринові анНа Фігурах 7 А-7Е показані результати впливу титіла. анти-інтегринових моноклональних антитіл і калВиникнення ангіогенезу в результаті опрацюфостину C на ангіогенез у САМ, викликаний різнивання або bFGF, або VEGF і результати, отримані ми цитокінами, bFGF, TNF-a, VEGF і TGF-a. Анавід цього з використанням антагоністів - антитіл до логічно оцінювалася дія PMA. Експерименти і a інтегринів, PIF6 (a vb 5) і L M609 (a vb 3), описані в результати описані в Прикладі 6. Результати наПрикладі 4. OD і OS позначають відповідно правий несені на гістограму, де ангіогенез відзначають по і лівий очі піддослідного кролика. Великі стрілки Y-oci, а різні контроль і інгібітори - на Х-осі. На Фіпоказують ангіогенез у роговиці ока, тоді як малегура х 7 А-7Е відповідно показаний ангіогенез, винькі стрілки відзначають нормальні судини кон'юнкликаний bFGF, TNF-a, VEGF, TGF-a і PMA. ктиви. Фігури 1А й AB показують картину ангіогеФігура 8 - гістограма, що показує результати незу, викликаного bFGF, тоді як Фігури 1С і 1впливу антитіл на ріст CS1 меланомної пухлини в викликаного VEGF. На Фігура х 1А і 1С показана досліджуваному САМ ембріона курчати, здійснеобробка роговиці кролика PIF6, а на Фігурах 1B i ного, як описано в Прикладах 5С і 5D. Вага пухли1D - обробка LM609. ни в міліграмах (мг) нанесена на вісь Y, тоді як 9 84665 10 різні типи обробки показані на осі X. CSAT - контC Cys цистеїн рольні антитіла до b1-субодиниці інтегрину. LM609 X Xaa невідомі і,або інші і PIF6 - описані вище. Фігура 9 - гістограма, що показує результати Крім того, нижче приводяться інші відповідні впливу контролю в порівнянні з a vb 5-пептидним позначення: антагоністом, що позначається як пептид 189 BOC трет-бутилоксикарбоніл (SEQ ID No. 5) на ріст меланомної пухлини, що DCCL дициклогексилкарбодиімід 3 визначали за обсягом пухлини в мм , нанесеним DMF диметилформамід на Y-вісь. Експеримент і результати описані в ПриОме метокси кладі 8. HOBt 1-гідроксибензотриазол Фігура 10 ілюструє синтез З'єднання 7 відповіСлід зазначити, що всі амінокислотні послідодно до опису Приклада 10 A-G. вності подані тут стр уктурами, для яких ліве і праФігура 11 ілюструє синтез З'єднання 9 відповіве обертання відповідає звичайному напрямку від дно до опису Приклада 10 A-C; H-I. N-кінця до С-кінця. Далі, варто зазначити, що тире Фігура 12 ілюструє синтез З'єднання 10 відпона початку або кінці амінокислотної послідовності відно до опису Приклада 10G. показує на пептидний зв'язок із іншим амінокислоФігура 13 ілюстр ує синтез З'єднання 12 і З'єдтним ланцюжком, що складається з однієї або нання 14, відповідно описаних у Прикладі 10 K-L і більш залишків амінокислот. 10 M-N. Поліпептид: Лінійний ланцюжок із залишків На Фігурі 14 показані хімічні структурні формуамінокислот, з'єднаних між собою пептидними ли З'єднання 15, З'єднання 16, З'єднання 17 і З'єдзв'язками між a-аміногрупою і карбоксигрупою нання 18. Детальний синтез показаних з'єднань прилягаючих друг до др уга амінокислотних залишописаний у Прикладі 10 O-R. ків. А. Визначення Пепсид: Лінійний ланцюжок із не більш ніж 50 Амінокислотний залишок: Амінокислота, отриамінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, мана в результаті розщеплення (гідролізу) пептидяк у пептиді. них зв'язків у поліпептиді. Описані тут кислотні Циклопептид: Пептид у виді кільця, утворений залишки переважно є L-ізомерами Проте залишки із відповідного лінійного пептиду, і віднесений до в D-ізомерній формі можуть заміщати будь-який Lпептидів, у яких при відсутності вільних C- і Nізомерний амінокислотний залишок доти, поки покінців, N-кінці амінокислот відповідного лінійного ліпептид зберігає необхідну функціональну власпептиду зв'язані амідним зв'язком із С-кінцями тивість. NH2 вільна аміногрупа на амінному кінці амінокислот зазначеного відповідного лінійного поліпептиду. COOH - вільна карбоксигрупа на кінці пептиду. поліпептиду з карбоксильною групою. Відповідно Протеїн: Лінійний ланцюжок із більш ніж 50 до номенклатури стандартів поліпептидів [описаамінокислотних залишків, зв'язаних між собою так ної в J. ВioІ. Chem., 243: 3552-59 (1969) і, як замосамо, як у поліпептиді. влено в 37CFR §1. 822 (b) (2)], у нижченаведеній Синтетичний пептид: Отриманий хімічним Таблиці Відповідності приводяться абревіатури шляхом ланцюжок з амінокислотних залишків, амінокислотних залишків: з'єднаних друг з другом пептидними зв'язками, і при відсутності в ланцюзі природних білків і їхніх Таблиця Відповідності фрагментів. В. Основні положення Символ Даний винахід стосується відкриття того, що 3-буквений Амінокислота 1-буквений ангіогенез опосередкований специфічним рецепY Туr тирозин тором вітронектину a vb 5 і що інгібування функції G GIu ліцин a vb 5 пригнічує ангіогенез. Це відкриття важливе через ту роль, яку ангіоF Phe фенілаланін генез грає при розвитку безлічі захворювань. ІнгіM Met метіонін буванням ангіогенезу можна втрутитися в захвоА Аlа аланін рювання, поліпшити симптоми, й у деяких S Ser серин випадках вилікувати хворобу. І llе ізолейцин Там, де ріст нових кровоносних судин виклиL Leu лейцин кає патологію, зв'язану з захворюванням, інгібуT Thr треонін вання ангіогенезу буде зменшувати небажані реV VaI валін зультати хвороби. Прикладами їх є артрити, P Pro пролін діабетична ретинопатія, запальні захворювання, K Lys лізин ретиноз і інші. Там, де розвиток нових кровоносних H His гістидин судин супроводжується розвитком небажаної ткаQ GIn глутамін нини, інгібування ангіогенезу буде зменшува ти E GIu глутамінова кислота кровопостачання цієї тканини й у такий спосіб приZ GIx GIx або GIn водити до зменшення маси цієї тканини, яке залеW Thr триптофан жить від умов кровопостачання. R Arg аргінін Приклади показують розвиток нових кровоноD Asp аспарагінова кислота сних судин у відповідь на ішемію, що приводить до N Asn аспарагін ангіогенезу, який розвинувся під впливом чинника В Asx Asn або Asp росту, ріст пухлин, при яких неоваскуляризація є 11 84665 12 неодмінною умовою для того, щоб пухлина прирогіогенезу. Як раніше було описано, ангіогенез пристала на декілька міліметрів у товщин у і для розпускає безліч процесів, при яких має місце неовасвитку щільних метастазів. куляризація тканини, включаючи розростання Способи, запропоновані в даному винаході, є судин, утворення нових судин або збільшення частково ефективними, тому що ця терапія дуже старих, вже існуючих у тканині судин, усі ці процеселективна стосовно ангіогенезу але не є такою си ангіогенезу протікають за участю a vb 5 і залежні для інших біологічних процесів. Як показано в від експресії a vb 5. Вважають, що за винятком проПрикладах, тільки при рості нових судин має місце цесів загоєння травматичної рани, утворення жовзначний рівень a vb 5 і, отже, запропоновані терапетого тіла і ембріогенезу, переважна кількість провтичні методи не діють згубно на вже розвинуті цесів ангіогенезу зв'язана з захворюваннями, і структури. тому запропоновані способи даного винаходу є Відкриття того факту, що інгібування лише одселективними і не дають небажаних побічних ефеного avp5 буде ефективно пригнічувати ангіогенез, ктів. допускає і розробку лікарських засобів із потенційІснує бага то захворювань, при яких, як вважано високою специфічністю і, відносно низькою токють, ангіогенез грає важливу роль, які називають сичністю. Незважаючи на те, що винахід розкриває анпогенними захворюваннями. Вони включають, використання реагентів на основі пептидів, які маале не обмежені ними, запальні процеси, наприють здатність інгібувати один або більш інтегринів, клад, імунне і неімунне запалення, хронічний ревможна сконструювати й інші реагенти, які селектиматизм суглобів і псоріаз, розлади, зв'язані з невно інгібують a vb 5. Тому певні реагенти пептидної відповідною або несвоєчасною інвазією, природи не мають побічного ефекту інгібування проліферацію капілярів в атеросклеротичних бляінших біологічних процесів крім тих, у яких бере шках, остеопороз, порушення, викликані раковими захворюваннями, щільні пухлинні метастази, ангіучасть a vb 5. офіброми, ретролентальну фіброплазію, гемангіоНаприклад, як тут роз'яснюється, можна ствоми, саркому Капоши і аналогічні ракові захворюрити моноклональні антитіла, високоселективні по вання, при яких неоваскуляризація підтримує ріст імуновзаємодії з a vb 5, але не a vb 1, a vb 3 або a 11bb 3, пухлини. що будуть аналогічно селективними в процесі інгіНайкращими об'єктами лікування є захворюбування функції a vb 5. Крім того, можуть бути синвання очей, що супроводжуються явищем ангіогетезовані пептиди, що містять RGD, які селективно незу Неоваскуляризація ока - найбільш поширена інгібують a vb 5, як буде описано далі. патологічна зміна, що спостерігається при більшоДо даного винаходу не було відомо, що ангіості очних захворювань, які приводять до втрати генез і будь-який із процесів, залежних від нього, зору. Розростання нових кровоносних судин із вже може бути інгібований in vivo впливом за допомоіснуючих хороідальних, ретинальних або паралімгою реагентів - антагоністів біологічної функції бальних судин приводить до набряків, геморагії a vb 5. або утворенню фіброваскулярних мембран, що C. Способи інгібування ангіогенезу обумовлює руйнування нормальних анатомічних Даний винахід пропонує спосіб інгібування анзв'язків ока і супутньої втрати його нормальної гіогенезу в тканині і, у результаті цього, пригнічензорової функції ня тих викликаних ангіогенезом явищ, що відбуваОчні захворювання, що характеризуються анються в тканині. У загальному випадку спосіб гіогенезом, включають неоваскулярні порушення в передбачає введення в тканину композиції, що рогівці, у тому числі при пересаджуванні рогівки, включає інгібуючу ангіогенез кількість антагоніста герпетичні кератити, люетичні кератити, явища a vb 5. неоваскуляризації, зв'язані з носінням контактних Тканина-мішень, у відношенні якої застосовулінз, і тому подібні. Крім цього, до таких захворюються способи даного винаходу, визначається як вань очей відносяться діабетична ретинопатія тканина, що містить a vb 5, яка характеризується (DR), зв'язана з віком плямиста дегенерація помітною наявністю в ній рецептора a vb 5 інтегрину. (AR MD), передбачуваний очний гістоплазмозіс Іншими словами, тканина, яка містить a vb 5 визна(POHC), ретинопатія передчасності (ROP), неовачається наявністю a vb 5 рецепторного комплексу в скулярна глаукома і т.п. Хоча інгібування ангіогеклітинних мембранах. До таких тканин відносяться незу необов'язково виліковує існуючи в основі його епітелій і клітини, які мезенхімно утворилися. Назахворювання, важливим є суттєве зменшення явність рецептора можна визначити за допомогою хворобливих симптомів, зв'язаних із ними. ряду засобів, включаючи імунореактивність рецепНаприклад, 90% із 300 000 чоловік, що хворітора стосовно антитіл a vb 5 інтегринового рецептоють діабетом протягом 25 років, будуть мати деяку ра, причому імунореакцію визначають у тканинах форму DR, що є ретинальним захворюванням, яке за допомогою мікроскопії, імунопреципітації, аналіхарактеризується стіканням і/або проліферуванзів конкурентного лігандного зв'язування й інших ням кровоносних судин. Тридцять, відсотків із них аналогічних методів. Найкращі антитіла, викорисбудуть фактично знаходитися в дуже поганому товувані для визначення наявності a vb 5 у тканині, стані, що може бути поліпшено використанням описані нижче й у Прикладі 1. Наприклад, пошизаявлених методів лікування. Щодо ARDM потрібрення у нирці, шкірі і тканинах ока, знайдене метоно відзначити, що 25% населення старіше 65 родом імунофлуоресцентної мікроскопії, описане в ків, приблизно 630тис., будуть мати деяку форму Прикладі 2. цього захворювання й очікується, що до 2030 року У контексті способів даного винаходу тканина, більш 6,3млн. людей занедужають ARDM. Таким що містить a vb 5, характеризується показником анчином, можливість інгібувати викликаний a vb 5 ангі 13 84665 14 огенез за допомогою заявлених у даному винаході позаклітинним матриксом, що приводять до утволікарських композицій і способів лікування має рення нових функціональних капілярних вузликів із величезну цінність з точки зору медицини. вже існуючих розвинути х судин. Отже, способи, що інгібують ангіогенез в ураЯк обговорювалося тут і в розділі «Попередній женій тканині, поліпшують симптоми хвороби і, у рівень», літературні джерела описують зв'язок між залежності від захворювання, можуть сприяти його появою чинників росту, включаючи ті з них, що лікуванню. В одному випадку, відповідно до виназв'язані з підвищенням рівня експресії a vb 5, а саме, ходу, передбачається інгібування ангіогенезу per VEGF, TGF-a і EGF, із розростанням тіла пухлини і se в тканині. Ступінь розвитку ангіогенезу в тканині початком ангіогенезу при проліферативних неоваі ступінь інгібування, що випливає звідси, за допоскулярних захворюваннях очей, як людей, так і могою запропонованих способів, може бути розратварин. хована за допомогою способів, описаних у ПриТаким чином, VEGF, EGF, TGF-a розглядакладах і використовуваних для визначення a vb 5ються серед багатьох інших як ростові чинники, імунопозитивних судинних структур, що утворющо характеризуються їх здатністю стимулювати ються знову і незрілих судинних стр уктур шляхом ріст клітин Ростові чинники являють собою протеїімуногістохімічних процедур. ни, які виробляються окремою клітиною, діють на Як описувалося вище, деякі з тканин або оргаклітину, що секретує, або іншу клітину. їхня здатнів, що включають упорядковані структури тканин, ність діяти залежить від присутності рецепторів можуть підтримувати ангіогенез у стані захворючинника росту, що як правило, є трансмембраннивання, наприклад, шкіра, тканина м'яза, кишкова ми білками. Ростові чинники, такі як VEGFm назитканина, з'єднувальна тканина, суглоби, кістки й ваються також цитокінами, які визначаються як аналогічна тканина, в якій кровоносні судини пеполіпептидні гормони, та виробляються клітиною і реважно мають ангіогенну дію. впливають на ріст і метаболізм тієї ж (автокринної) Зокрема, способи і композиції антагоністів або іншої (паракринної) клітини. Термін «цитокін» a vb 5, запропоновані у винаході, терапевтично коне обмежений молекулами, продукованими клітирисні для інгібування ангіогенезу, що був обумовнами імунної системи і модифікаторами біологічної лений чинниками росту, називаними цитокінами. відповіді тієї ж системи. Таким чином, термін «циПри фізіологічних умовах ангіогенез має високу токін» визначає численний клас сполук, у якому пристосованість і, відповідно до [публікації Brooks один підклас, заснований на типі біологічної відпоet al., Science, 264: 569-5761 (1994)], було показавіді, включає ростові чинники зі стимулюючою но, що він активується під дією специфічних ангіовластивістю або підсилювачі, такі як VEGF, bFGF, генних молекул, таких як основний чинник росту EGF, TGF-a і їм подібні. [Див. огляд Aggarwal et al., фібробластів (bFGF). Негативні регулятори ангіо«Загальні і приватні властивості цитокинов і рецегенезу також описані. Ангіогенез, таким чином, пторів цитокінів: Огляд», у «Цитокіни людину: їхня регулюється складним балансом між місцевими роль у захворюванні і лікуванні», вид. Aggarwal стимуляторами й інгібіторами. [Див. D,Amore, and Puri, Частина I, Blackwell Science, Inc. (1995). Investigative Ophtha Visual Sci., 35: 3974-3979 У цьому винаході антагоністи, специфічні до (1994)]. a vb 5 і антагоністи, що не є зрістовими чинниками, Коли фізіологічний баланс між ангіогенними як, наприклад, антитіла проти VEGF, пропонуютьстимуляторами й інгібіторами, який стійко контрося для використання в інгібуванні ангіогенезу в лює природну капілярну судину, що знаходиться в тканині. У кращих варіантах описані тут антагонісспокої, порушується, що має місце при відповідних ти avps корисні для інгібування ангіогенезу, виклистанах, викликаних захворюванням, клітини капіканого чинником росту, при якому має місце екслярів ендотелію одержують сигнал до проліферупресія рецептора a vb 5 інтегрину. Кращими вання міграції і відразу ж диференціюються з мечинниками росту в цьому випадку є VEGF, EGF, тою утворення нових кровоносних судин. TGF-a і їм подібні. Ангіогенез характеризується як каскадне явиЯк обговорювалося в розділі, що характеризує ще, що складається з ряду більш ранніх стадій, попередній рівень, ростові чинники EGF і VEGF після чого слідують наступні події, як це описувазв'язуються зі своїми клітинними рецепторами, що лося [Leibovich у: «Роль цитокінів у процесі ангіодіють як тирозинкінази. Як показано далі, активагенезу пухлини», у «Цитокіни людини: їхня роль у ція рецептора корелює з активацією протеїнкінази захворюванні і лікуванні», вид. Aggarwal and Puri, C, що приводить у результаті активації a vb 5 до Chapter 35, Blackwell Science, lnc.(1995)]. Початкоміграції специфічних клітин на вітронектиновий вим стадіям передує виділення ангіогенних чиннисубстрат. Так що механізм взаємозв'язку між ків росту і цитокінів, вироблюваних зовнєваскулявпливом цитокінів або чинників росту і відповідною рним джерелом. Ці більш ранні події потім реакцією, що виявляється в експресії інтегрину розвертаються в певних мікросудинах із розпадом або його активації, є складним біологічним процеміжклітинних функцій, порушенням експресії антисом. Як показано в даному винаході (див. Приклад генів активації ендотеліальних клітин і протеоліти6A), обробка тканин моделі ока кролика і хоріоачного фенотипу і початком міграції ендотеліальних лантоїсної моделі курчати цитокіном VEGF привоклітин по певному шляху. Наступні події характедить до a vb 5-обумовленого ангіогенезу, що залеризуються автокринною і паракринною експресією жить від активації протеїнкінази C. чинника росту і виникненням цитокіну усередині Особливу перевагу має варіант цього винахоклітин, ендотеліальних клітин, перицитів і клітин ду, за яким пропонується використовувати a vb 5 гладкого м'яза, розвитком капілярної нирки. Ці кліантагоністи для інгібування в будь-якій тканині, у тини, у свою чергу, регулюють взаємодії клітин із 15 84665 16 якій ангіогенез індукований VEGF. Наприклад, був [огляді Leek et al., J. Leukocyte Biol., 56: 423-435 ло показано, що ішемія сітківки в різних модельних (1994)], висновки якого тут коротко викладаються. системах тварин приводить до зверхрегуляції Вважають, що ряд цитокінів, включаючи VEGF, як VEGF, що виділяється Клітками Мюлера, виробіткислотний, так і основний FGF (bFGF), TGF-a і -b, ка якого викликає неоваскуляризацію в тканинах EGF, TNF-a, виділений із тромбоцитів чинник росусередині ока.[ Див. Miller et al., Am. J. Path., ту клітин ендотелію, ангиогенін, інтерферони a і g, 145:574-584 (1994) і Pierce et al., Ргос. інтерлейкіни 1, 6 і 8 і подібні їм, впливають на різNatl.Acad.Sci.USA, 92:905-909 (1995)]. номанітні клітинні механізми ангіогенезу в злоякісТаким чином, відповідно до даного винаходу, них утвореннях тканин і клітинних мішеней. Напритканина, яку слід обробляти, являє собою тканину клад, недавно було показано, що крім локалізації в сітчастої оболонки ока хворого діабетичною ретирізних типах пухлин, VEGF зв'язаний з ангіогененопатією, плямистою дегенерацією, неоваскулярзом при карциномі молочної залози, як це описав ною глаукомою або аналогічним захворюванням [Brown et al., Human Path., 26: 86-91 (1995)]. відповідно до вищеописаного, а під ангіогенезом, Пухлини, що секретують різні цитокіни й у яких який слід інгібувати, мається на увазі ангіогенез у локалізується ангіогенез (стосовно до даного висітківці, де має місце неоваскуляризація. Приклади находу, цитокіни VEGF, TGF-a і EGF і, як результканин, включаючи тканини рогівки, від пацієнтів із тат, ангіогенез, який виник при участі a vb 5) можуть неоваскуляризаційними явищами очей або захвобути ідентифіковані скринінгом зразків пухлин ткарюваннями, описані вище й у Прикладах. Зразкова нин із використанням антицитокінових, антитіл. модельна система для оцінки результатів обробки Такі методи добре відомі будь-якому середньому a vb 5 антагоністом даного винаходу при ретинальфа хівцю в даній галузі для зразків пухлин тканин, ному ангіогенезі являє собою модель ретинальної отриманих або культивуванням, або біопсією тканеоваскуляризації миші, як описано в Прикладі 9. нини. Антитіла до вищеописаних цитокінів комерВідповідно до іншого варіанта винаходу, тканина, ційно доступні через Oncogene Sciences яку слід піддати обробці, являє собою тканину в (Uniondale, NY) або Upstate Biotech. Incorporated процесі запалення, а ангіогенез, який необхідно (Lake Placid, NY). Скринінг відібраних тканинних інгібувати, являє собою ангіогенез у запаленні пухлин цими засобами дозволяє оцінити потенційтканині, де йде процес запальної неоваскуляризану інгібіторну активність a vb 5 антагоністів даного ції. У цьому випадку пропонується інгібування анвинаходу стосовно ангіогенезу. гіогенезу в тканинах при артриті, характерних для Приклади ангіогенезу в тканинних пухлинах і хворих хронічним суглобним ревматизмом, у ткайого інгібування описуються в Прикладах. нинах із запаленнями імунного і неімунного харакІнгібування ангіогенезу в тканинах пухлин - ще теру, у тканинах при псоріазі і т.п. один кращий варіант винаходу завдяки важливій Вважають, що цитокіни, інтерлейкін-1 і чинник ролі, що грає неоваскуляризація в розвитку пухлинекрозу пухлини а мають відношення до ревматони. При відсутності неоваскуляризації в тканині їдного артриту в зв'язку з їхньою безпосередньою пухлини остання не одержує необхідного харчуроллю в руйнуваннях суглобів, заснований на товання, сповільнюється її ріст, припиняється додатму, що вони викликають утворення молекул, відкове розростання, вона регресує, що відразу ж повідальних за адгезію на ендотеліальних клітинах приводить до некрозу і відмирання пухлини. і виділення ферментів. [Див. Arend et al., Arthritis Інакше кажучи, даний винахід забезпечує споand Rheumatism, 38: 151-160 (1995)]. Були запросіб інгібування пухлинної неоваскуляризації шляпоновані способи терапії, засновані на блокуванні і хом інгібування ангіогенезу в пухлині відповідно до цитокінів, і цитокін-специфічних інгібіторів, а також методів, що пропонуються. Аналогічно винахід і молекул, що забезпечують клітинну адгезію, які пропонує спосіб гальмування росту п ухлини заутворюються в даних умовах. [Див. Haskard et al., стосуванням способів, що подавляють ангіогенез. Cell Adhesion Comm., 2: 235-238 (1994)]. Способи є особливо ефективними і проти Таким чином, інгібування ангіогенезу при артутворення метастазів, тому що (1) їхнє утворення ритах спрямуванням терапії на заплутаність і вимагає васкуляризації первинної пухлини з тим, складність зв'язаної з a vb 5 адгезії молекул є іншим щоб метастатичні ракові клітини могли виходити з кращим варіантом втілення винаходу, як і поперепервинної пухлини і (2) їхнє закріплення у вториндніх винаходів. ному місці розташування вимагає неоваскуляриЩе в одному окремому випадку даного виназації для підтримки росту метастазів. У зв'язаному ходу тканина, що піддається обробці, являє собою з цим варіанті винахід пропонує використовувати тканину пухлини пацієнта, хворого раком із метацей спосіб в поєднанні з іншими терапевтичними стазами, раком шкіри і раком молочної залози, прийомами, такими як звичайна хіміотерапія, гемангіомою або ангіофібромою або аналогічними спрямована проти щільних пухлин і для контролю раковими захворюваннями, а ангіогенез, який інгіза появленням метастазів. Призначення інгібітору бують, являє собою ангіогенез у тканині пухлини, ангіогенезу звичайно здійснюють одночасно або де має місце неоваскуляризація пухлинної тканипісля хіміотерапії, хоча краще інгібувати ангіогенез ни. Типові тканини, у яких розвиваються щільні після хіміотерапевтичних процедур, під час, коли пухлини, придатні для обробки запропонованими тканина пухлини буде реагува ти на токсичний методами, включають тканини легені, підшлунковплив індукуванням ангіогенезу, щоб почати крової залози, молочної залози, товстої кишки, гортавопостачання і підживлення пухлини тканини. Крім ні, яєчників і подібні ім. того, кращим є використовува ти методи інгібуванРоль складної мережі цитокінів, що існує в ня ангіогенезу після хірургічного втручання з прищільних пухлинах людини, є предметом розгляду воду видалення пухлин як профілактику проти 17 84665 18 метастазів. шкідливих побічних ефектів, таких як синдроми Оскільки методи даного винаходу відносяться гіперв'язкості, набряк легені, серцева недостатдо інгібування пухлинної неоваскуляризації, ці меність і т.п. Загалом, дозування, буде залежати від тоди можна також застосовувати для інгібування віку, стан у, статі, ступеня захворювання пацієнта і росту п ухлини в тканини, інгібування утворення може бути визначена відповідним фахівцем. У пухлинних метастазів і для руйнування вже розвивипадку утр уднень дозування може бути також нути х п ухлин. відрегульоване конкретним лікарем. a vb 5 антагоНарешті, зменшення маси пухлини визначаніст являє собою молекулу, що блокує або інгібує ється на моделі ока кролика, як описано з метою фізіологічну або фармакологічну активність a vb 5 використання в даному винаході, або за допомоінгібуванням активності зв'язування рецептора з гою модельної системи «химерна миша: модель його лігандом, а саме, вітронектином. Кращими людини», у якій шкіра миші із сильним комбіноваa vb 5 антагоністами можуть бути моноклональні ним імунодефіцитом (SCID) була замінена шкірою антитіла, пептид або молекула органічного похокрайньої плоті людського плоду, як описано[ Jan et дження, що імітує ліганд a vb 5. al., J. Clin. In vest., 91: 986-996 (1996)], відкриття Терапевтично ефективна кількість - це така кіякого тут викладено в короткій формі. Більш пізня лькість avPs антагоніста, що досить для здійсненмодель являє собою додаткову in vivo модель для ня ступеня інгібування ангіогенезу в обробленій дослідження ангіогенезу і його інгібування метотканині, тобто кількість, що пригнічує ангіогенез. дами цього винаходу Результати, о тримані на моІнгібування ангіогенезу може бути виміряно in situ дельній пухлині кролика з a vb 5 антагоністами даноза допомогою імуногістохимії, як описано тут, або го винаходу, показані в Прикладах 5С і 6D, тоді як іншими методами, відомими фахівцям у даній обрезультати інгібування ангіогенезу з використанласті. Оскільки a vb 5 антагоніст може бути у формі ням моделі SCID миші описані у Прикладі 8. органічної молекули, що імітує a vb 5 ліганд, пептиРестеноз є процес міграції клітин гладкого м'яду, який містить RGD, моноклональних антитіл до за (SMC) і проліферації в місці підшкірної трансavps або їхніх фрагментів або міметика avp5 рецелюмінальної коронарної ангіопластики, що псує птора, варто розуміти, що дієвість і, отже, вирауспішну ангіопластичну процедуру. Вважають, що ження «терапевтично ефективна» кількість може міграція і проліферація SMC у процесі рестенозу змінюватися. Однак, як показано поданими тут може бути процесом ангіогенезу, що інгібується аналітичними методами, кваліфікований фахівець запропонованими тут способами. Отже, винахід може легко оцінити дієвість можливого кандидата також пропонує гальмування рестенозу інгібуванна роль a vb 5 антагоніста даного винаходу. ням ангіогенезу відповідно до методів даного виДієвість a vb 5 антагоніста може бути оцінена за находу у пацієнтів, що перенесли ангіопластичні допомогою багатьох засобів, включаючи інгібуванпроцедури Для гальмування рестенозу a vb 5 антаня ангіогенезу в Сам-аналізі, дослідження in vivo гоніст призначався як правило після ангіопластичока кролика і виміром інгібування зв'язування приної процедури протягом приблизно від 2 до 28 днів родного ліганду з a vb 5, як тут описано, і подібними і найбільш часто протягом перших 14 днів після дослідженнями процедури. Кращий a vb 5 антагоніст має здатність істотно Даний винахід у всіх його проявах розроблено інгібувати зв'язування природного ліганду, такого для лікування людей, хоча зрозуміло, що принцияк вітронектин, із avp5 У розчині при концентраціях пові риси цього винаходу показують, що він ефекантагоніста менше, ніж 0,5 мікромолярної (mм), тивний стосовно всіх ссавців, для яких може бути переважно менше 0,1mМ, і, більш переважно, мевикористаний термін «пацієнт». Зрозуміло, що під нше 0,05mМ. Термін «істотно» означає, що, приссавцями мають на увазі тварин, яких прагнуть наймні, 50-процентне зменшення зв'язування вітвилікувати (особливо - сільськогосподарських і ронектину спостерігається при інгібуванні під дією домашніх тварин) у відповідності зі способами a vb 5 антагоніста, і при 50% інгібування називаєтьданого винаходу. ся тут розміром IC50. Запропонований спосіб інгібування ангіогенезу Найкращий a vb 5 антагоніст виявляє виборність в тканині і застосування цих способів, що виплистосовно a vb 5 у порівнянні з іншими інтегринами. ває з цього, для лікування захворювань, зв'язаних з ангіогенезом, включає обробку тканини, у якій Так що кращий a vb 5 антагоніст істотно інгібує зв'ярозвинувся анпогенез, або існує ризик його розвизування вітронектину і a vb 5, але істотно інгібує тку, композицією, що включає терапевтично ефекзв'язування вітронектину з іншим інтегрином, тативну кількість a vb 5 антагоніста, здатного інгібуваким як a vb 1, a vb 3 або a 11bb 3. Найкращим є a vb 5 антагоніст, який показує у 10-100 разів більш низьку ти зв'язування a vb 5 із його природним лігандом. IC50 активність при інгібуванні зв'язування вітронеТаким чином, метод включає введення пацієнту терапевтично ефективної кількості фізіологічно ктину і a vb 5 у порівнянні з IC50 активністю при інгізадовільної композиції винаходу, що містить a vb 5 буванні зв'язування вітронектину з іншим інтегриантагоніст. ном. Приклади аналізів по вимірюванню IC50 активності при інгібуванні зв'язування вітронектину Дозування коливається в залежності від увез інтегрином описуються в Прикладах. дення a vb 5 антагоніста, що залежить від форми антагоніста і його сили, як описується тут далі, а Терапевтично ефективна кількість a vb 5 антайого кількості досить великі для досягнення бажагоніста цього винаходу, що представляє собою моноклональні антитіла, є як правило такою кількіного ефекту, при якому ангіогенез і симптоми застю, що при введенні у формі фізіологічно задовіхворювання, викликані їм, поліпшуються. Дозування не повинне бути надмірним, щоб не викликати льної композиції досить для досягнення концент 19 84665 20 ком, наприклад, носієм або в'яжучим. рації в плазмі від приблизно 0,01 мікрограм (mг) на Як показано в одному окремому випадку в мілілітр (mл) до приблизно 100mг/мл, переважно Прикладах, a vb 5 антагоніст вводиться у виді єдиної від приблизно 1 mг/мл до приблизно 5mг/мл, а як дози внутрішньовенно. правило - біля 5mг/мл. Композиції вводять способом, сумісним із Установлене по-різному дозування може коскладом, що дозується, і в терапевтично ефективливатися від ~0,1мг/кг до ~300мг/г, переважно від ній кількості. Кількість, що вводиться і тривалість ~0,2мг/кг~200мг/кг, переважно від ~0,5мг/кг до уведення залежать від об'єкта, здатності його ор~20мг/кг при однократному або дробному уведенні ганізму переробити активний інгредієнт і бажаного щодня протягом одного або декількох днів. ступеня терапевтичного впливу. Точні кількості Коли антагоніст являє собою фрагмент монокактивного інгредієнту, що необхідно ввести, залелонального антитіла, його кількість може бути легжать від рішення практикуючого лікаря, і специфіко відрегульована з зарахуванням маси фраґменчні для кожного. Однак, тут розкриті коливання ту в порівнянні з масою антитіла. Переважна прийнятних дозувань при систематичному викоримолярна концентрація в плазмі становить від 2 станні, і вони залежать від способу введення. Відмікромолярної (mМ) до ~5 мілімолярної (мМ) і ще повідні способи введення також різні, але вони краще ~100mМ-1мМ антагоніста на основі антитіхарактеризуються початковим способом уведення, ла. за яким слідують повторні дози при 1-годинному Терапевтично ефективна кількість a vb 5 антаабо великих інтервалах такої ін'єкції або іншого гоніста цього винаходу, що є поліпептидом або способу введення. Або ж пропонується беззупинна іншою маленькою подібною за розміром молекувнутрішньовенна інфузія, достатня для підтримки лою, що імітує ліганд a vb 5б як правило відповідає в крові концентрацій у межах, установлених для такій кількості поліпептиду, що при введенні у виді лікування in vivo. фізіологічно задовільної композиції є достатньою D. Лікарські композиції для одержання в плазмі концентрації від ~0,1 мікДаний винахід пропонує лікарські композиції, рограм (mг) на мілілітр (мл) до ~200mг/мл, перевакорисні для проведення терапії, описаної тут. Ліжно від ~1mг/мл до ~150mг/мл. З огляду на то, що карські композиції даного винаходу містять фізіомаса поліпептиду біля 500 грамів на моль, краща логічно прийнятний носій разом із a vb 5 антагонісконцентрація його в плазмі, яка виражена в молях, том, описаним тут, розчиненим або диспергованим становить від ~2 мікромолярної (мМ) до 5 мілімоу ньому в якості активного інґредієнту. Переважно лярної (мМ), і переважно становить від ~100mМ до лікарська композиція на основі a vb 5 антагоніста не 1мМ поліпептидного антагоніста. є імуногенною при уведенні тварині або людині в Іншими словами, дозування з зарахуванням терапевтичних цілях. Ужиті тут терміни «фармамаси тіла може коливатися від приблизно 0,1мг/кг цевтично прийнятний», «фізіологічно задовільний» до приблизно 300мг/кг і переважно становить від і їхні граматичні варіації, використовувані у відноприблизно 0,2мг/кг до приблизно 200мг/кг, при шенні до композицій, розчинників і реагентів, заоднократному або дробному уведенні щодня простосовуються різнозначно й означають, що ці матягом одного або декількох днів. теріали придатні для введення або нанесення Моноклональні антитіла, поліпептиди або орссавцю без небажаних фізіологічних ефектів, таганічні міметики даного винаходу можуть уводитиких як нудота, запаморочення, розлади шлунка і ся парентерально за допомогою ін'єкцій або пот.п. ступової інфузії. Незважаючи на те, що тканина, Приготування фармакологічної композиції, що яку треба обробити, як правило доступна для сисмістить активні інгредієнти, розчинені або диспертематичного введення ліка, і тому найбільш часто говані в ній, добре відомо фахівцям і не обмежузастосовується внутрішньовенне введення лікарється винятково її складом. Звичайно такі компоських композицій, для інших тканин пропонуються зиції готують готовими до введення або у виді інші засоби доставки у випадках, коли необхідно рідкого розчину, або суспензій, однак, тверді форзабезпечити спрямовану доставку ліка в тканинуми, придатні для приготування розчину або сумішень. Таким чином, моноклональні антитіла, спензії в результаті розчинення, також можуть буполіпептиди або органічні міметики даного винати приготовлені. Препарат може бути також ходу можуть уводитися внутриокулярно, внутрішотриманий емульгуванням. ньовенно, внутрішньочеревинно, внутрішньом'язоАктивний інгредієнт може бути змішаний із наво, підшкірно, внутрипорожнинним або повнювачами, що є фармацевтично прийнятними і трансдермальним шляхом, а також за допомогою сумісними з активним інгредієнтом у кількостях, перистальтичних засобів. придатних для використання в терапевтичних споТерапевтичні композиції, що містять a vb 5 антасобах, описаних тут. Придатними наповнювачами і гоніст даного винаходу, звичайно уводяться внутрозріджувачами є, наприклад, вода, фізрозчин, рішньовенно, наприклад, ін'єкцією однократної декстроза, гліцерин, етанол і т.п. і їхні комбінації. дози. Що стосується терапевтичної композиції даКрім того, за бажанням композиція може містити ного винаходу, термін «однократна доза» віднонезначні кількості допоміжних речовин, таких як ситься до фізично дискретних елементів, придатзмочувальні або агенти, що емульгують, які ствоних для дозування об'єкту в об'єднаній формі, при рюють рН агенти і їм подібні, які збільшують ефекцьому розраховано, що кожна одиниця (елемент) тивність активного інґредієнту. містить визначену заздалегідь кількість активного Лікарська композиція, відповідно до винаходу, початку для забезпечення бажаного терапевтичможе включати фармацевтично прийнятні солі її ного ефекту в сполученні з прийнятним розчинникомпонентів. Фармацевтично прийнятні солі, 21 84665 22 отримані при взаємодії з кислотами (утворені вільa vb 5 антагоністичну активність, як було зазначено. ними аміногрупами поліпептиду), утворюються при Кращий пептидний a vb 5 антагоніст містить RGD впливі неорганічних кислот, таких як соляна і фотрипептид і відповідає своєю послідовністю присфорна кислоти, або органічних кислот, таких як родному ліганду, конкретно - у ділянці, що містить оцтова, винна, мигдальна кислота й ін. Солі, утвоRGD. рені вільними карбоксильними групами, можуть Кращі поліпептиди, що містять RGD, мають бути о тримані на основі неорганічних основ, таких послідовність, відповідну амінокислотній послідовяк, наприклад, гідроксиди натрію, калію, амонію, ності частини, що містить RGD, природного ліганкальцію, заліза, і таких органічних основ як ізопроду a vb 5 , такого як вітронектин, послідовність якого піламін, триметиламін, 2-етиламіноетанол, гістидобре вивчена. дін, прокаїн і т.п. Найкращею є сіль від HCI при Як указувався раніше, переважний пептид використанні для одержання циклічних поліпептиантагоніст a vb 5 більш вибірково інгібує зв'язування дних a vb 5 антагоністів. саме a vb 5 із його природним лігандом (лігандами), Фізіологічно придатні носії є добре відомими в чим інших інтегринів. Ці a vb 5-специфічні пептиди є даній галузі. Прикладами рідких носіїв є стерильні найкращими, принаймні, тому, що специфічність водяні розчини, які не містять ніяких речовин, крім до a vb 5 зменшує виникнення небажаних побічних активних інгредієнтів і води, або містять буфер, ефектів, наприклад, інгібування інших інтегринів. такий як натрій-фосфатний при фізіологічному Ідентифікація переважних пептидних a vb 5 антагозначенні рН, фізіологічний розчин або обидва з ністів, селективних стосовно a vb 5, може бути легко них, наприклад, фосфатно-буферний фізіологічпроведена, звичайним дослідженням інгібування ний розчин. Далі, водяні носії можуть містити зв'язування, наприклад, ELISA-методом, описаним більш, ніж одну буферну сіль, а також і солі, такі, у Прикладах. як хлорид натрію і калію, декстрозу, поліетиленгліВ окремому випадку даного винаходу поліпепколь і ін. розчинені речовини. тид містить не більш, чим приблизно 100 амінокиРідкі композиції можуть також містити рідкі фаслотних залишків, переважно не більш ~60 залишзи крім і для виключення води. Прикладами таких ків, ще більш переважно не більш ~30 залишків. додаткових рідин є гліцерин, рослинні масла, такі Пептиди можуть бути лінійними або циклічними, як бавовняне масло й емульсії типу вода-масло. хоча особливо переважно циклічні. Кращі пептиди Лікарська композиція, який містить інгібуючу описуються в Прикладах. ангіогенез кількість avps антагоніста, відповідно до Варто розуміти, що розглянутий поліпептид винаходу, як правило складається таким чином, має бути не стільки ідентичним амінокислотній щоб кількість антагоніста, що міститься в ній, була, послідовності природного ліганду a vb 5, скільки попринаймні, 0,1ваг. відсотка на загальну вагу комвинний містити послідовність, необхідну для пропозиції. Ваговий відсоток відображує співвіднотидії зв'язуванню a vb 5 ліганду з a vb 5, і бути здатшення ваги інгібітору до загальної ваги композиції. ним до функціонування в якості a vb 5 антагоніста в У такий спосіб, наприклад, 0,1ваг. відсоток є 0,1 експерименті, такому як ті, що тут описані. грама інгібітора на 100 грам загальної ваги компоВласне кажучи, поліпептид являє собою аназиції. лог, фрагмент або хімічне похідне поліпептиду, E. Антагоністи інтегрину a vb 5 амінокислотна послідовність якого визначена тут Антагоністи, використовувані в заявлених спояк для поліпептиду, що є a vb 5 антагоністом. Тому собах для інгібування ангіогенезу в тканинах, морозглянутий поліпептид може бути підданий різжуть являти собою різні сполуки, до яких відноним змінам, заміщенням, доповненням і делеціям, сяться сполуки, взаємодіючі з a vb 5 у такий спосіб, у випадку, де такі перетворення забезпечують пещо функціональні взаємодії з природними a vb 5 вні переваги його використання. У цьому віднолігандами порушуються. Приклади антагоністів шенні поліпептидний a vb 5 антагоніст даного винавключають аналоги або міметики a vb 5, отримані на ходу відповідає, але не ідентичний, послідовності основі лігандзв'язуючої частини (сайта) на a vb 5, якогось уже розглянутого пептиду, у послідовності міметики природного ліганду a vb 5 , які імітують якого було зроблена одна або більш змін, і він структурну область, що бере участь у взаємодіях зберігає здатність функціонувати як a vb 5 антагопри зв'язуванні a vb 5 -ліганда, поліпептиди з послініст в однім або декількох описаних тут експеридовністю, відповідною функціональному зв'язуюментах. чому домену природного ліганду, специфічному У такий спосіб, поліпептид може являти собою для a vb 5, особливо, відповідній домену, що містить який різновид із безлічі пептидних похідних, що RGD, природного ліганду a vb 5, і антитіла, які взаєвключають аміди, кон'югати з протеїнами, циклізомодіють або з a vb 5, або з природним лігандом, вані пептиди, полімеризовані пептиди, аналоги, лігандом, усі з них виявляють антагоністичну актифрагменти, хімічно модифіковані пептиди і їм повність, як це тут описано. дібні похідні. 1. Поліпептиди Термін «аналог» припускає будь-який поліпепЯк окремий випадок, у винаході заявляються тид, що має амінокислотну послідовність, значною avps антагоністи, що представляють собою полімірою ідентичну послідовності, спеціально обговопептиди. реній тут, у якої один або більш залишків були Поліпептидний (пептидний) a vb 5 антагоніст обережно заміщені функціональним аналогічним може мати характеристику послідовності або призалишком, і який виявляє активність a vb 5 антагоніродного ліганду a vb 5, або самого a vb 5 у ділянці, де ста, як тут зазначено. Приклади таких м'яких замівідбувається взаємодія a vb 5 із лігандом, і мати щень одного неполярного (гідрофільного) залиш 23 84665 24 ку, такого як ізолейциновий, валіновий, лейцинолишками, що входять до складу лінкера, є тировий або метіоніновий іншим, заміщення одного зин, цистеїн, лізин, глутамінова й аспарагінові полярного (гідрофільного) залишку іншим, наприкислоти і їм подібні. Крім того, розглянутий поліпеклад, між аргініном і лізином, між глутаміном і асптид може відрізнятися, якщо не зазначено особо, парагіном, між гліцином і серином, заміщення одвід природної послідовності ліганду a vb 5 тим, що ного основного залишку, такого як лізин, аргінін його амінокислотний ланцюжок модифікований або гістидін на іншою, або заміщення одного кисацилюванням NH2-кінця, наприклад, ацетилуванлотного залишку, такого як аспарагінова або глуням або амідуванням тіогліколевої кислоти, амідутамінова кислота іншим. Вираження «обережне ванням кінця, що містить карбоксил, наприклад, заміщення» припускає також використання хімічно аміаком, метиламіном і ін. модифікаціями кінців модифікованого залишку замість немодифікованоланцюжка. Модифікація кінців корисна, як відомо, го залишку, що забезпечує прояв таким поліпепдля зниження чутливості до розчеплення протеїтидом необхідної інгібуючої активності. назою і тому служить для пролонгування часу на«Хімічне похідне» відноситься до сполуки на півжиття поліпептидів у розчинах, особливо в біооснові поліпептиду, у якої один або більш залишків логічних рідинах, де можуть бути присутніми хімічно модифікований у результаті реакції бічної протеази. У цьому відношенні циклізація пептидів функціональної групи. Такі модифіковані молекули також є корисною модифікацією кінців і є особливо включають, наприклад, такі, у яких вільні аміногрукращою через стабільність структур, що утворюпи були перетворені в аміногідрохлориди, n - тоються при циклізації через біологічні активності, які луолсульфонільні групи, карбобензокси-, третспостерігаються для таких циклічних пептидів, як бутил-оксикарбонільні групи, хлорацетильні або тут описано. формільні групи. Вільні карбоксильні групи можуть Будь-який пептид даного винаходу може викобути відповідним чином перетворені в солі, метилристовуватися у виді фармацевтично прийнятної овий й етиловий ефіри або інші типи ефірів або солі. Відповідними кислотами, які здатні утворювагідразидів. Вільні гідроксильні групи можуть бути ти солі з пептидами даного винаходу, є неорганічні перетворені в О-ацильні або О-алкільні похідні. кислоти, такі як трифтороцетова (TFA), соляна Імідазольний азот гістидіну може бути перетворе(HCI), бромістоводнева, хлорна, азотна, тіоцианоний у N-імбензилгістидін. Сюди ж як хімічні похідні ва, сірчана, фосфорнооцетова, пропіонова, гліковключені пептиди, які містять одне або більш похілева, молочна, піровиноградна, щавлева, малонодних природних амінокислот, із двадцятьох станва, бурштинова, малеїнова, фумарова, дартних амінокислот. Наприклад: A-гідроксипролін антранілова, корична, нафтиленсульфонова, суможе бути замінений проліном; 5-гідроксилізин льфанілова кислоти і т.п. Сіль HCI особливо переможе бути замінений лізином; 3-метилгістидін моважна. же бути замінений гістидіном; гомосерин може Відповідними основами, здатними утворювати бути замінений серином, а орнітин може бути засолі з пептидами цього винаходу, є неорганічні мінений лізином. Поліпептиди даного винаходу підстави, такі як гідроксиди натрію, калію, амонію і можуть також включати поліпептид, що має одне їм подібні, і органічні підстави, такі як моно-, ди- і або більш доповнень і/або делеций або залишків, триалкіл- або ариламіни (наприклад, триетиламін, що відповідає послідовності поліпептиду, послідодиізопропіламін, метиламін, диметиламін і їм подівність амінокислотних залишків якого тут показана бні) і необов'язково заміщені етаноламіни (наприостільки, оскільки зберігається необхідна активклад, етаноламін, диетаноламін і т.д.). ність. Пептид даного винаходу, називаний тут власТермін «фрагмент» відноситься до будь-якого не кажучи поліпептидом, може бути синтезований поліпептиду, що має амінокислотну послідовність будь-яким способом, відомим для фахівця в облабільш коротку, чим поліпептид, амінокислотна пості хімії поліпептидів, включаючи методи з застослідовність якого тут показана. суванням рекомбінантних ДНК. Методики хімічного У випадку, коли поліпептид даного винаходу синтезу, такі як твердофазний синтез за типом має послідовність, яка не ідентична послідовності Merrifield'a, є кращими в зв'язку з вимогами чистоприродного ліганду a vb 5, це частіше усього є рети, антигенної специфічності, відсутності небажазультатом того, що були зроблені одне або більш них побічних продуктів, простоти технології і т.п. обережних або необережних заміщень у структурі, Виклад більшості придатних способів можуть бути звичайно не більш ніж на приблизно 30 відсотків і, знайдені в [Steward et al., «Твердофазний синтез переважно, не більш, чим 10 відсотків амінокислопептидів», W. H. Freeman Co., San-Francico, 1969; тних залишків заміщаються. Додаткові залишки Bodansky et al., «Синтез пептидів», John Wiley & можуть бути додані до кожного або обох кінців Sons, Sec. Ed. 1976; J. Meienhofer, «Гормональні послідовності поліпептиду з метою створення «лібілки і пептиди», Vol. 2, p. 46, Academic Press (New нкера», за допомогою якого поліпептиди даного York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32: 221-96 винаходу можуть бути зручно приєднані до підкла(1969) Fields et al., Int. J. Peptide Protein Res., 35: динки твердої матриці, або носія. 161-214 (1990); і патент США №4244944 на тверПідкладинки, тверді матриці і носії, які можуть дофазний синтез пептидів, і Schroeder et аl., «Пепбути використані з поліпептидами даного винахотиди», VoI І, Academic Press (N-Y), 1965], по класиду, описані нижче. чному синтезі в розчинах, кожний із який Лінкери з амінокислотних залишків як правило зазначений тут у виді посилання. Відповідні захисвключають принаймні один такий залишок, більш ні групи, придатні для цих способів синтезу, опичасто - від 1 до 10 залишків, але не утворять епісуються у ви щевказаних джерелах і в [J. F. W. Me Omie, «Захисні групи в органічній хімії». Plenum топу ліганду a vb 5. Типовими амінокислотними за 25 84665 26 Press, New York, 1973], що зазначений тут як поним лігандом, як вже описувалося. Винахід також силання. описує лінії і методи одержання моноклональних У цілому запропоновані способи твердофазноантитіл. го синтезу включають послідовне приєднання одМоноклональні антитіла, відповідно до даного ного або більш амінокислотних залишків і відповівинаходу, являють собою молекули антитіл, які 1) дно захищених амінокислотних залишків до інгібують зв'язування вітронектину з a vb 5. Переваланцюга пептиду, що нарощується. Природно, що жні моноклональні антитіла, які переважно зв'язуаміногрупа, або карбоксильна група першого аміються з a vb 5, являють собою моноклональні антинокислотного залишку захищається відповідним тіла, що мають імунореактивні специфічні захисним угрупованням, який вибірково видаляхарактеристики mAb PlF6 і mAb P5H9, які описується. Інша, захисна група, що вибірково видаляються в Прикладах. ється, застосовується для амінокислот, які містять Термін «антитіла» або «молекула антитіла» у реакційноздатну бічну груп у, наприклад, лізину. різних граматичних формах використовується тут Керуючись способом твердофазного синтезу, як загальна назва, що відноситься до родини мозахищену або модифіковану амінокислоту приєдлекул імуноглобулінів і/або імунологічно активних нують до інертної твердої підкладинки, використочастин молекул імуноглобулінів, тобто молекул, які вуючи для цього незахищену карбоксильну або містять частину (сайт) антитіла, що забезпечує аміногрупу. За хисна група аміно- або карбоксильзв'язування, або паратоп. ної групи потім віддалиться з тільки що приєднано«Зв'язуючий сайт антитіла» є структурною чаго амінокислотного залишку, і наступна амінокисстиною молекули антитіла, що включає варіабельлота (відповідно захищена) потім також ні і гіперваріабельні ділянки важких і легких ланприєднується і так далі. Після того, як усі бажані цюгів, які специфічно зв'язують антиген. амінокислоти нанизані у відповідній послідовності, Прикладами антитіл, використовуваних у дазахисні групи кінцевих і бічних груп, що залишилиному винаході, є інтактні імуноглобулінові молекуся, (і твердої підкладинки) послідовно або відразу ли, у значній мірі інтактні імуноглобулінові молекуж віддаляться, і одержують кінцевий лінійний поліли і ті частини молекули імуноглобуліну, які пептид. містять паратоп, включаючи ті частини, який відомі Отримані в результаті лінійні пептиди можуть в даній області і позначаються як Fab, Fab', F(ab')2 бути перетворені, наприклад, відповідно до того, і F(v), а також називані як фрагменти антитіла. як тут описано, у відповідні циклічні пептиди. ПриВ іншому кращому варіанті у винаході пропокладом може служити спосіб циклізації пептидів, нується усічена молекула імуноглобуліну, що місописаний [Limmer et al., Peptides 1992, p.p. 393тить Fab фрагмент, отримана на основі монокло394, ESCOM Science Publishers, B.V., 1993]. Як нального антитіла даного винаходу. Fab фрагмент правило метиловий ефір захищеного третіз відсутнім Fc рецептором є розчинним і має тебутоксикарбонілом пептиду розчиняють у метанорапевтичні переваги у відношенні сироваткового лі, додають розчин гідроксиду натрію і здійснюють часу напівжиття і діагностичних переваг у спосореакцію в отриманій суміші при 20°C для гідролібах використання розчинного Fab фраґменту. тичного видалення метилефірної захисної групи. Одержання розчинного Fab фраґменту загально Після випару розчинника з підкисленого водяного відомо в області імунології і може бути виконане розчину екстрагують третбезліччю способів. бутоксикарбонілзахищений пептид із допомогою Наприклад, Fab і F(ab')2 частини (фрагменти) етилацетату. Трет-бутоксикарбонільний захист антитіл одержують протеолітичною дією папаїну і потім видаляють у м'яких умовах при підкисленні пепсину, відповідно, на, в основному, інтактні анпри сорозчиненні діоксану. Отриманий у такий титіла способами, що добре відомі. [Див., наприспосіб лінійний пептид із знятим захистом із вільклад, патент США №4342566]. Fab' частини антиними аміно- і карбоксикінцями, переводять у відтіл також добре відомі, і їх одержують із F(ab')2 повідний циклопептид взаємодією в суміші дихлочастин із наступним відновленням дисульфідних рметану і диметилформаміду розведеного розчину зв'язків, що з'єднують частини двох важких ланцюлінійного пептиду з дициклогексилкарбодиімідом у гів, меркаптоетанолом, за яким випливає алкілуприсутності 1-гідрокси-бензотріазолу і Nвання отриманого меркаптанового похідного білка метилморфоліну. таким реагентом, як йодацетамід. Антитіла, що Отриманий циклопептид потім очищають хромістять інтактні молекули імуноглобулінів, є краматографією. щими і використані тут як ілюстративні. Вираження Найкращий спосіб твердофазного синтезу ци«моноклональні антитіла» у його різних граматичклопептидів описаний [Gurrath et al., Eur. J. них формах відноситься до родини молекул антиBiochem., 210: 911-921 (1992)] і описаний у Притіл, які містять тільки один різновид зв'язуючого кладах. Пептиди, найкращі для використання в антитільного сайта, здатного специфічно взаємозапропонованих способах стосовно до тканин, діяти з особливим епітопом. У такий спосіб, моноспочатку ураженим ангіогенезом, викликаним a vb 5, клональне антитіло звичайно виявляє один єдиний описані в Прикладах і включають поліпептиди повид специфічності зв'язування (афінність) у відноказані в SEQ ID Nos. 4, 6, 7, 8 і 9. шенні того епітопу, із яким воно взаємодіє. Тому 2. Моноклональні антитіла моноклональне антитіло може містити молекулу В даному винаході, як окремий випадок, опиантитіла, що має багато сайтів зв'язування, кожсуються a vb 5 антагоністи, що являють собою моний із який є, імуноспецифічним для різного епітоноклональні антитіла, які специфічно взаємодіють пу, тобто є біспецифічним моноклональним антитілом. із a vb 5 і інгібують зв'язування a vb 5 із його природ 27 84665 28 Моноклональні антитіла - це звичайно антитідомна клітина і культури, що містять, клітини гібла, отримані з клонів однієї єдиної клітини, назиридоми, які продукують моноклональні антитіла ваної гібридомою, яка робить (продукує) тільки винаходу. Особливо кращою є лінія клітин гібриодин вид антитіл. Гібридомна клітина утворена доми, яка продукує моноклональні антитіла mAb злиттям клітини, що продукує антитіло, і клітини PIF6 і mAb P5H9, одержання яких описано в Примієломи або іншої клітинної лінії, що самовідтвокладах. рюється. Одержання таких антитіл першими опиЯк окремий випадок, у винаході заявляються сали [Kohler and Milstein, Nature, 256: 495-497 моноклональні антитіла, що мають імуноспецифі(1975)], опис яких доводиться тут у вигляді посичні характеристики, mAb PIF6 або mAb P5H9. лання. Інші додаткові методи описав [LoIa, «МоноБез спеціального експериментування можливо клональні антитіла: Підручник по техніці одержантакож визначити, чи має моноклональне антитіло ня», CRC Press, Ink. (1987)]. Проявлені гібридоми, ту ж саму (тобто еквівалентну) специфічність (імуотримані таким шляхом, можуть бути далі досліноспецифічні характеристики), як і моноклональне джені на присутність антитіл, які імуноспецифічні антитіло даного винаходу, з'ясуванням, чи передо ccvp5 і придатні для інгібування зв'язування шкоджає перше зв'язуванню останнього з попередньо відібраною призначеною молекулоюa vb 5 із природними лігандами. мішенню. Якщо випробуване моноклональне антиКоротко, для створення гібридоми, із якої одержують композицію моноклональних антитіл, мієтіло конкурує з моноклональним антитілом даного винаходу, що виявляється в зменшенні зв'язуванломну або іншу клітинну лінію, що самовідтворюня моноклонального антитіла даного винаходу в ється, зливають із лімфоцитами, отриманими із стандартних експериментах по конкуруванню в селезінки ссавця, гіперімунізованого джерелом зв'язуванні з призначеною молекулою, яка знахоa vb 5. диться в стані твердої фази, тоді ймовірно, що Краще щоб лінія клітин мієломи, використовуобидва моноклональні антитіла зв'язуються з тим вана для одержання гібридоми, була отримана від самим або близько родинним епітопом. тієї ж самої особи, що і лімфоцити. Звичайно краЩе один спосіб визначення, чи володіє монокщею твариною-ссавцем буває миша лінії 129СІХ*. лональне антитіло такою ж специфічністю, що і Мієломи миші, придатні для використання в даномоноклональне антитіло даного винаходу, полягає му винаході, включають гіпоксантин-аміноптеринв пре-інкубації моноклонального антитіла за винатимідин-чутливі (HAT) клітинні лінії Р3х63-Ад 8. ходом з призначеною молекулою-мішенню, з якою 653 і Sp2/0-Ag14, які одержують із American Турі воно нормально взаємодіє, і наступному додаванні Culture Collection, Rockwille, MD, під позначеннями випробуваного моноклонального антитіла з подаCRL 1580 і CRL 1581, відповідно. льшим визначенням, чи виявляє випробуване моЗвичайно клітини селезінки зливають із клітиноклональне антитіло зниження здатності зв'язунами мієломи з використанням поліетиленгліколю ватися з молекулою-мішенню Якщо у (PEC) 1500. Злиті гібриди відбираються по їхній випробуваного моноклонального антитіла його чутливості до HAT Гібридоми, що продукують моздатність до зв'язування інгібована, то, по всій ноклональні антитіла даного винаходу, ідентифіімовірності, воно наділене точно такою ж або функують імуноферментним методом (ELISA), модикціонально еквівалентною епітопною специфічнісфікація якого описується в Прикладах. тю, що і моноклональне антитіло даного винаходу. Моноклональні тіла даного винаходу можуть Додатковий шлях визначення, чи має якебути також отримані за допомогою культивування небудь моноклональне антитіло специфічність моноклональної гібридомної культури на поживмоноклонального антитіла цього винаходу, поляному середовищі, що містить гібридому, яка прогає у визначенні амінокислотної послідовності дукує антитіла відповідної специфічності. Культура CDR ділянок розглянути х антитіл. Молекули антипідтримується в умовах і протягом часу, необхідтіл, що мають ідентичну або функціонально еквіного для виділення гібридомою антитіл у середовалентну амінокислотну послідовність у їх GDR вище. Потім середовище, що містить антитіла, ділянках, мають однакову специфічність зв'язузбирають. Далі антитела можуть бути виділені вання. Методи секвенування поліпептидів є добре добре відомими способами. відомими. Середовища, використовувані для одержання Імуноспецифічність антитіла, його здатність цих речовин, добре відомі, а також комерційно зв'язуватися з молекулою-мішенню і супутня афіндоступні, і являють собою синтетичні культуральні ність, що виявляється антитілом відносно епітопу, середовища, гібридних мишей і тп. Прикладом визначаються епітопом, із яким антитіло специфісинтетичного- середовища є мінімальне основне чно взаємодіє. Епітопна специфічність визначасередовище [DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8: 396, ється, принаймні, частково, амінокислотною послі1959], доповнена 4,5мг/л глюкози, 20мМ глутаміну довністю варіабельної частини важкого ланцюга і 20% фетальної сироватки теляти. Прикладом імуноглобуліну антитіла і, частково, амінокислотштаму гібридної миші є Balb/c. ною послідовністю частини легкого ланцюга. Інші методи одержання моноклональних антиВикористання вираження «маючий специфічтіл, клітини гібридоми або культури пбридомних ність зв'язування» показує, що еквівалентні моноклітин також добре відомі. Див., наприклад, метод клональні антитіла мають ті самі або подібні, харавиділення моноклональних антитіл із імунологічктеристики імунної взаємодії (зв'язування) і них рецепторів, описаний [Sastry et al., Proc. Natl. конкурують у зв'язуванні з попередньо наміченою Acad. Sci., USA, 86: 5728-5732 (1989) і Huse et al., молекулою-мішенню. Science, 246: 1275-1281 (1989)]. Отримані від людини моноклональні антитіла У даному винаході пропонуються також гібри 29 84665 30 мають особливі переваги перед моноклональними інгібування a vb 5, структура об'єкта, що є a vb 5 антаантитілами миші, оскільки вони використовуються гоністом, корисного в запропонованих способах, для лікування людей. Зокрема, людські антитіла не повинна бути занадто обмеженою, а включає не виходять так швидко з обороту, як чужорідні будь-який a vb 5 міметик, як визначено вище. антигени. Крім того, людські антитіла не активують F. Способи ідентифікування антагоністів a vb 5 імунну систему таким же чином, як чужорідні антиВинахід також описує аналітичні способи для гени і чужорідні антитіла. Способи одержання ідентифікування можливих a vb 5 антагоністів для людських антитіл у цілому добре відомі і можуть використання відповідно до поданих способів. У бути легко застосовні для антитіл даного винахоцих аналітичних способах для передбачуваних ду. речовин оцінюють їхню можливість інгібування У такий спосіб, винахід в окремому варіанті зв'язування a vb 5 із природними лігандами і далі пропонує моноклональне антитіло, отримане від оцінюють їхню здатність інгібування ангіогенезу в людини шляхом щеплення для введення компонетканині. нтів імунної системи людини без суттєвого втруУ першому аналізі вимірюють ангіогенез у хочання в здатність антитіла зв'язувати антиген. ріоалантоїсній мембрані курчати (САМ), і це дослі3. Міметики, специфічні до a vb 5 дження називається Сам-дослідження СамЦей винахід показує, що в ньому можуть викодослідження вже було детально описано і потім ристовуватися a vb 5 антагоністи взагалі, антагонісбуло використано для виміру ангіогенезу і неовасти, які можуть являти собою поліпептиди, антитіла куляризації в тканинах пухлин. [Див. Ausprunk et й інші молекули, називані «міметиками», які мають al., Am. J. Pathol., 79: 597-618 (1975); Ossonsky et здатність заважати здійсненню функції a vb 5. Найal., Cancer Res., 40: 2300-2309 (1980)]. Самкращими є антагоністи, що специфічно порушують дослідження є добре відома дослідницька модель функцію a vb 5 і не втручаються в активність інших для ангіогенезу in vi vo, тому що відбувається неоінтегринів. васкуляризація всієї тканини. Дійсні кровоносні У цьому змісті очікується, що безліч реагентів судини ембріона курчати виростають усередині можуть опинитися придатними для використання в САМ або усередині тканини, що виросла на САМ. способах, що тут описуються, оскільки ці реагенти Як було показано тут, Сам-дослідження ілюстмають біологічну активність, яка вимагається. Ці рує інгібування неоваскуляризації, засноване як на реагенти, в основному, називаються міметиками, кількості, так і на поширенні росту нових судин. тому що вони мають здатність імітувати ліганд Далі, легко контролювати ріст будь-якої тканини, трансплантованої на САМ, наприклад, пухлинної a vb 5, включений у функціональну взаємодію рецептора і ліганду шля хом блокування домену рецептканини. Нарешті, це дослідження особливо коритора, що зв'язує ліганд, і в такий спосіб пригнічувасно, тому що в цій системі існує вн утрішній контти нормальну функцію. В альтернативному роль токсичності. Ембріон курчати піддається впливу будь-якого варіанті a vb 5 антагоніст може бути міметиком ререагенту тесту. Так що стан здоров'я ембріона є цептора, а не його ліганду. показником токсичності. Міметиком може бути будь-яка молекула, відДругий аналіз, за допомогою якого вимірюють мінна від антитіла або від пептиду, отриманого на ангіогенез, є модель ока кролика in vivo, і він назиоснові ліганду, який виявляє вищеописані властивається аналіз за допомогою ока кролика. Цей вості. Це може бути синтетичний аналог пептиду, аналіз детально був описаний і потім був викориссполука, якій придана форма зв'язуючої «кишені», таний для виміру й ангіогенезу і неоваскуляризації відповідній формі вищеописаного домену, що в присутності ангіогенних інгібіторів, таких як таліобумовлює зв'язування, або інша молекула. Кращі домід. [Див. D'Amato et al., Proc. Natl. Acad. Sci., міметики даного винаходу являють собою молекуUSA, 91: 4082-4085 (1994)]. ли органічної природи, і тому вони називаються Аналіз за допомогою ока кролика - добре віорганічними міметиками. Найкращі органічні мімедома модель для дослідження ангіогенезу in vivo, тики, які діють як a vb 5 антагоністи, будучи міметиоскільки неоваскуляризаційний процес, ілюстроками ліганду avp5, це сполуки 7, 9, 10, 12, 14, 15, ваний тим, як зростають кровоносні судини від 16, 17 і 18, як описано в Прикладі 10. краю рогівки усередину її, легко візуалізується Структура a vb 5 міметика може бути досліджучерез природно прозору рогівку ока. Крім того, і вана будь-яким із безлічі методів аналізу структудовжина, і ступінь стимуляції або інгібування неори, відомих у даній області для вивчення структуваскуляризації або регресії неоваскуляризації мори молекул, включаючи молекулярне же бути легко контрольована в часу. моделювання, аналіз на основі двомірного ядерНарешті, кролик піддається впливу будь-якого ного магнітного резонансу (2-М ЯМР), рентгенореагенту, застосовуваного в тесті, так що стан кристалографію, випадковий скринінг пептиду, здоров'я кролика є показником токсичності реагенпептидного аналога або інших хімічних полімерних ту теста. бібліотек і аналогічні методи, використовувані при Третій аналітичний метод вимірює інгібування створенні лікарських засобів. прямого зв'язування природного ліганду, вітронекЧерез те, що в даному визначенні наданий дотину с a vb 5, і кращий варіант детально описується статній доказ структури, це показує, що a vb 5 антав Прикладах. За допомогою цього аналізу звичайгоніст може бути невеликим пептидом, моноклоно вимірюють ступінь інгібування або зв'язування, нальним антитілом або органічною молекулою, природного ліганду, такого як вітронектин, із видііснують різні хімічні структури, які беруть участь у леним a vb 5 твердофазним методом ELISA, інгібупрояві функціональної властивості селективного 31 84665 32 перевіряли на здатність взаємодії з імуногеном і вання якого обумовлено a vb 5 -специфічним інгібупотім охарактеризували, як описані в нижченавеванням. У такий спосіб, цей метод аналізу може бути дених Прикладах. 2. Характеристика специфічності моноклонатакож застосований для того, щоб ідентифікувати сполуки, які виявляють специфічність стосовно льних антитіл проти a vb 5 і використання в картуa vb 5 і не інгібують зв'язування природних лігандів з ванні розподілу експресії a vb 5 у тканині іншими інтегринами. Аналіз специфічності здійсА. Специфічність до вітронектину нюється за допомогою паралельно проведених Було показано, що моноклональні антитіла Р5Н9, отримані в Прикладі 1 за способом [Wayner аналізів типу ELISA, де і a vb 5, і інші інтегрини одet al., J. Cell Bid., 113: 919-929 (1991]) блокують ночасно піддаються скринінгу в окремих комірках у приєднання клітин карциноми UCLA-P3 до вітровідношенні відповідної здатності кожного зв'язувати природний ліганд, а для випробуваної сполуки нектину, не впливаючи на приєднання клітин до колагену або фібронектину. Ім унопреципітацією інгібувати відповідні здатності інтегринів зв'язувати попередньо обраний ліганд. гетеродимеру, що складається з a-ланцюга Приклади. (160kD) і b-ланцюга (95 kD) при невідновлюючих Наступні приклади даного винаходу є ілюстраумовах було також показано, що ті самі клітини тивними і не повинні, звичайно, розцінюватися, містять тільки a v b 5 ві тронектиновий рецептор і зокрема, як такі, що обмежують його. Більш того, немає жодного, який був би специфічний до a vb 5. такі зміни винаходу, відомі зараз або удосконалені Було також показано, що визначений за допомопізніше, які будуть у компетенції фахівця в даній гою Р5Н9 a vb 5 рецептор бере участь у зв'язуванні галузі, повинні бути розцінені як такі, що підпадаклітин меланоми М21 і клітин карциноми Н2981 із ють під обсяг винаходу, який заявлено в даній завітронектином. Моноклональні антитіла PIF6 маявці.. ють таку ж імуноспецифічну спрямованість. Одержання моноклональних антитіл, специфіВ. Імунофлуоресценція з антитілами до рецепчних до a vb 5 тора інтегринів Моноклональні антитіла, PIF6 і Р5Н9, були При загоєнні ран мембрани основ кровоносних отримані за допомогою стандартних гібридомних судин виробляють декілька адгезивних білків, методів імунізацією RBF/DnJ миші клітинами карвключаючи чинник Вілебранда, фібронектин і фібциноми легені А549, як описане [Wayner et al., J. рин. Крім цього, деякі члени родини інтегринових Cell Biol., 113: 919-929 (1991)], відкриття якого тут рецепторів адгезії виділяються на поверхні клітин приведене як посилання. У імунізованих мишей гладкого м'яза, що культивуються, і клітин ендотевидаляли селезінки і зливали з клітинами мієломи лію. [Див.: Cheresh, Proa Natl. Acad. Sci., USA, 84: Ns-I/FOX-N Y. Гібридоми, що продукують антитіла, 6471 (1987); Janat et al., J. Cell Physiol., 151: 588 які спрямовані до рецепторів вітронектину клітин (1992); Cheng et al., J. Cell Physiol., 139:275 (1989)]. карциноми, скринігували специфічним інгібуванНа додаток до структури і функції субодиниці ням UCLA-P3 адгезії на поверхнях, що містять b 5інтегрину був описаний розподіл її в тканині за вітронектин, як описано Wayner et al., і клонували допомогою картування з використанням інших мопри обмеженні розведення в шарах живильника ноклональних антитіл до b 5 [Pasquallini et al., J. тимоцитів. Cell Sci., 105:101-111 (1993)], на що тут вказано Було показано, що моноклональні антитіла і посиланням. PIF6, і Р5Н9 специфічно взаємодіють із a v b 5 комВищезгадані моноклональні антитіла, специплексом і не взаємодіють із субодиницею a v, із фічні до субодиниці b 5, подібні тим, що описані в субодиницею b 5 або з іншими інтегринами. МонокПрикладі 1, виділялися гібридомами, що були лональні антитіла PIF6 комерційно доступні від отримані з використанням клітин селезінки миші, Gibco BRL (Life Technology, Inc., Gaithersbug., MD), імунізованої клітинами лінії карциноми легені люа моноклональні антитіла Р5Н9 можуть бути отридини А549. Гібридоми виділяли при позитивному мані від Fred Hutchinson Cancer Research Institute, фарбуванні поверхні клітин А549 із супернатанту Seattle, WA. культури гібридоми і імунопреципітацією a vb 5Інші моноклональні антитіла, специфічні до комплексів з екстрактів поверхнево-мічених А549. a vb 5, для використання в цьому винаході можуть Моноклональні антитіла потім використовували бути отримані подібним чином і охарактеризовані, для картування розподілу b 5-субодиниці в тканияк тут описано. Крім того, a vb 5 специфічні монокнах нормального тимуса, шкіри і нирки людини лональні антитіла одержують злиттям клітин селеЗразки товщиною 4 мікрони були отримані зрізанзінки, виділеної з мишей, яких імунізовали рецепням із заморожених тканинних блоків при кріостаттором a vb 5 У неочищеній або очищеній формі. ній мікротомії для наступного фарбування стрепОбчищення a vb 5 - процедура, добре знайома будьтавідін - біотин імунопероксидазою у присутності якому кваліфікованому фа хівцю у сфері біології антитіл, специфічних до b 5-інтегринів, отриманих, інтегринів, була також описана [Smith et al., J. Biol. як описано в посиланні на Pasqualini et al. Chem., 265: 11008-11013 (1990)], робота якого Результати фарбування зрізів тимусу показаприведена тут як посилання. Очищений виділений ли розподіл b 5 на кровоносних судинах, корпускурецептор готують як імуноген для імунізування лах Hassal'a, кортикальних і медулярних клітинах мишей, як описано в Розділі Е2 і, в основному, строми і мембранах основ. Результати на зрізах відповідно до того, як описано [Kohler and Milstein, шкіри показали b 5 на базальному шарі епідермісу і Nature, 256: 495-497 (1975)], робота яких тут прина стінках інших дермальних кровоносних судин, а ведена як посилання. Отримані гібридомні клони результати на зрізах нирки показали фарбування 33 84665 34 гломерулярних частин, сполучених гломерулярних визначення місцезнаходження розміщення інтегорганів, близько розташованих звитих і об'єднаних рина й антитіл, специфічних до кровоносних судин. трубочок. У такий спосіб, розподіл b 5 є неоднорідПроби, отримані на основі здорових очей або ним і стосовно різних типів клітин, включаючи, що від пацієнтів з атрофічними мембранами без кроособливо важливо, клітини капілярів ендотелію, воносних судин, що активно проліферують, покарезультати фарбування яких відповідали резульзали при імунофлуоресценції негативну реакцію татам фарбування клітин ендотелію пупочної вени, які культивувались. на інтегрин a vb 3. C. Імунофлуоресценція ретинальної людської Паралельно ті ж самі тканини аналізували імутканини пацієнтів із захворюванням очей з антитіногістологічним методом на присутність і розподіл лами до рецептора інтегринів avp5 за допомогою моноклональних антитіл PIF6, Очна неоваскуляризація - найбільш поширена імуноспецифічних до a vb 5, описаного в Прикладі 1. зміна, що спостерігається у переважній більшості Фарбування показало, що a vb 5 був присутній захворювань очей, яка приводить до катастрофічна кровоносних судинах, і його місцезнаходження ної втрати зору. Ріст нових кровоносних судин із визначалося по розподілу чинника Вілебранда. вже існуючих хороїдальних, ретинальних або паОднак для неваскулярних тканин також виявляларалюмбальних судин може приводити до набряку, ся недостатня флуоресценція з PIF6 антитілами, геморагії й утворенню фіброваскулярних мембран, a vb 5, що показують більш велике поширення. Це що приводять до руйнування нормальних анатоміконтрастувало з даними a vb 3, який обмежувався чних зв'язків ока і супутній втраті нормальної функровоносними судинами. кції зору. При порівнянні даних імунофлуоресцентного При фізіологічних умовах ангіогенез у сильнофарбування мембран для a vb 3 і a vb 5 з антитілами му ступені контролюється і, як було показано, акLM609 і PIF6, відповідно, зразок фарбування стінтивується специфічними ангіогенними цитокінами, ки кровоносної судини був фактично ідентичний такими як основний чинник росту фібропластів тому, що і a vb 3, і a vb 5 виявлялися на поверхні зно(bFGF) і чинник некрозу пухлини a(TNF-a). Як опиву проліферуючи х кровоносних судин людини при сано [Brooks et al., Science, 264: 569-571 (1994)], неоваскулярних очних захворюваннях, таких як було показано, що моноклональні антитіла до a vb 5 діабетична ретинопатія. блокують ангіогенез, викликаний і bFGF і TNF-a, у Описані тут результати показують, у такий модельній системі, що включає Сам-модель, описпосіб, що a vb 5 інтегриновий рецептор вибірково сану нижче. Як описано в Прикладах 4-6, монокекспресується в специфічних типах тканини, у яких лональні антитіла, специфічні до a vb 5, блокують протікає ангіогенез відповідно до того, як це було особливий шлях ангіогенезу, особливо той, що видно за допомогою неоваскулярних мембран від індукований васкулярним ендотеліальним чиннипацієнтів із гострим проліферативним неоваскуляком ріст a (VEGF), чинником росту a(TGF-a), що рним захворюванням. Ці тканини, поряд із тканитрансформує, і епідермальним чинником росту нами, не захищеними у відношенні спеціальних (EGF). чинників росту, що описані нижче в Прикладах 4-6, У такий спосіб, як описано тут у відношенні забезпечують ідеальні мішені для терапевтичних даного винаходу, два шляхи ангіогенезу визначааспектів цього винаходу. ються різними інтегринами, a vb 3 і a vb 5. Для дослі3. Одержання синтетичних пептидів дження експресії і ролі цих інтегринів при захвоЦиклічні поліпептиди, використовувані в пракрюваннях очей людини були отримані тиці способів даного винаходу, були синтезовані з епіретинальні неоваскулярні мембрани і субретивикористанням стандартних методик твердофазнальні неоваскулярні мембрани en bloc при вітрекного синтезу, як це описано, наприклад, [Merriтомії відхворих проліферативною діабетичною field, Adv. En zymol., 32: 221-296 (1969); Fields G.B. ретинопатією (PDR). Ці хворі були клінічно обстеand Noble R. L., Int. J. Peptide Protein Res., 161-214 жені і відібрані для гістологічного дослідження на (1990)]. базі активного проліферативно-васкулярного заДва грами (г) BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe хворювання, зареєстрованого при клінічному об(SEQ ID No. I) були спочатку розчинені в 60 мілілістеженні і fundus fluorescein ангіографією. Отритрах (мл) метанолу, до якого був доданий 1,5мл ману тканину негайно заморожували в Tissue Tek 2N розчин гідроксиду натрію до утворення суміші. кріо-запобіжнику і секціонували. Потім суміш перемішували протягом 3 годин при Коли тканини цих пацієнтів досліджували за 20 градусах C (20°C). Після випарювання залишок допомогою імунофлуоресценції, кровоносні судини переносили у воду і підкислювали розведеною HCI давали позитивну реакцію на інтегрин a vb 3, як подо рн 3, екстрагували етилацетатом. Екстракт виказане імуноспецифічністю моноклональних антисушували над Na2SO4, знову, випарювали й отритіл миші LM609. Розподіл інтегрину, як видно, обманий BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (SEQ ID No. межувався кровоносними судинами і відповідав 2) перемішували при 20°C в плин 2 години із 20мл фарбуванню кровоносних судин за допомогою 2N HCI у діоксані. Отриману суміш піддавали вимаркера, чинника Вілебранда, що картувалось за парюванню до одержання H-Arg-Gly-Asp-D-Pheдопомогою кролячих антитіл до цього чинника імуVal-OH (SEQ ID No. 3), який згодом розчиняли в носпецифічності візуалізувались або кон'югантом суміші 1800мл дихлорметану і 200мл диметилфородаміну з антимишиним імуноглобуліном, або рмаміду (DMF), після чого охолоджували до 0°C. кон'югантом флуоресцеїну з антикролиним імуноДалі 0,5г циклогексилкарбодиіміду (DCCI), 0,3г 1глобуліном, використання обох забезпечувало гідроксибензотриазолу (HOBt) і 0,25г N 35 84665 36 метилморфоліну добавляли послідовно при переГідронові полімерні гранули, що містять чинмішуванні. ник росту і моноклональні антитіла (mAbs) готуваОтриману суміш стр ушували наступні 24 годили за методом D'Amato et a!., Proc. Natl. Acad. Sd., ни при 0°C і потім при 20°C ще 48 годин. Розчин 91: 4082-4085 (1994). Окремі гранули (пелети) місконцентрували й обробляли різнорідним іонообтили 750нг чинника росту (називаного також цитомінником на підкладинці для видалення солей. кіном) , особливо - bFGF або VEGF, зв'язані із сукПісля того, як на закінчення смола була віддаралфатом (carafate) (Carafet, Marion Merrell Dow лена фільтрацією, очищений розчин випарювали і Corporation, Cincinnati, OH) для стабілізації цитокізалишок очищували хроматографією, що завернів і забезпечення їхнього слабкого виділення в шалася виділенням цикло (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val), навколишню тканину. Крім того, були приготовлені позначеного також окремим буквеним кодом як cгідронові гранули, що містять або 40mг mAb P1F6 RCDf V(SEQ ID No.4). Маленькими літерами в пеп(анти- a vb 5) або контрольні антитіла LM609 (антитиді позначені амінокислоти в D-формі, а великиa vb 3), у ФСБ. ми - у L-формі. Усі випробувані mAbs виділяли з асцитної ріЦиклічний контрольний пептид, цикло (Arg-Alaдини добре відомими способами з використанням Asp-D-Phe-Val) (також позначений окремим буквеафінної хроматографії на колонці з Протеїн-А Сеним кодом як RADf) (SEQ ID No 5) був о триманий, фарозою СІ-4В. Елюрований імуноглобулін був як описано вище. Попередньо було показано, що діалізований проти ФСБ і оброблений Detoxi-гелем циклопептид c-RADfV (SEQ ID No. 5) інгібує зв'язу(Pierce Chemicals, Rockford, IL) для видалення вання фібриногену з інтегрином a vb 3 і не інгібує ендотоксину. Було показано, що ендотоксин є позв'язування фібриногену з інтегрином а a 11bb 3 або тенційно ангіогенним і стимулює запалення. Моноклональні антитіла тому перевірялися на присутa 5b 1 [Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269: 20233-20238, 1994)] ність ендотоксину за допомогою методу Інші пептиди, що є специфічними інгібіторами хромогенного limulus амебоцитного лізату (Bio зв'язування природних лігандів із avps, одержують Whittaker, Walker-sville, MD) і для дослідження моподібним способом і перевіряють на специфічність делі ока кролика використовувалися тільки ті і міру активності, як описується в наступних приmAbs, у яких не виявлявся ендотоксин. кладах Вони включають наступні пептиди, отримаГранули поміщали в спеціально приготовлені ні аналогічно: цикло(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) тефлонові стрижні, що були на 2мм просвердлені (SEQ ID No. 6) і цикло(Arg-Gly-Asp-Phe-D-VaI) усередину. Приблизно 12mл формувального мате(SEQ ID No. 7). Пептиди, що мають амінокислотні ріалу було поміщено усередину кожного стрижня і послідовності Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-Gln-Valпіддано полімеризації протягом ночі в стерильній Thr-Arg-Gl y-Asp-Val-Phe (SEQ ID No. 8) і цикло(Argкамері. Потім гранули стерилізували ультрафіолеGly-Asp-D-Phe-Asn-MeVaI) (SEQ ID No. 9) також товим опроміненням. були синтезовані. У SEQ ID No. 9 частка «Me» у Групи по 8 тварин були використані для ексMe VaI означає, що валін у положенні 6 є метильопериментів на парах очей, кожній тварині вводили ваним. гідронові частки, що містили призначений цитокін 4. Інгібування ангіогенезу, викликане чинником із призначеним антитілом або контрольним імуноросту в присутності a vb 5 антагоністів, виміряне глобуліном. Зокрема, кожному кролику в одну рогіметодом моделі ока кролика in vivo вку хірургічно імплантувалась гідронова гранула, що містить або bFGF, або VEGF у сполученні з Дію анти- a vb 5 антагоністів на ангіогенез, виmAb PIF6, а інша оброблялася bFGF, або VEGF у кликаний чинником росту, спостерігали в природно сполученні з mAb LM609. Окремі гранули імпланпрозорих стр уктурах, прикладом чого є рогівка ока. тували усередину хірур гічно створених «кишень», Нові кровоносні судини зростають по ободку рогівутворених проміжною стромою рогівки кролика в ки, яка має багате кровопостачання, у напрямку до центру рогівки, у якому як правило відсутні кровостерильній техніці з використанням Wild model M691 діючого мікроскопа, оснащеного променероносні судини. Стимулятори ангіогенезу, такі як зсіювачем і оснащеного камерою для фотографуVEGF і TGF-a у застосуванні до рогівки, викликавання окремих рогівок. У стромі рогівки була сфоють ріст кровоносних судин від ободка до центру. рмована «кишеня» 3мм´5мм за допомогою 69 Антагоністи ангіогенезу в застосуванні до рогівки Beaver Blade насічкою розміром 3мм до половини інгібують ріст нових кровоносних судин від ободка. товщини рогівки. Строма була розсічена по периУ такий спосіб, рогівка перетерплює ангіогенез за ферії з захопленням райдужки і гранулу імплантудопомогою інвазії ендотеліальних клітин від ободвали усередину її краю по окружності на відстані ка рогівки в щільно заповнену колагеном тканину 2мм від диску. Протягом наступних 12 днів цитокірогівки, який легко побачити. Метод моделі ока ни і mAbs дифундували з імплантованих гранул у кролика тому забезпечує in vi vo модель для прянавколишню тканину, впливаючи тим самим на мого спостереження стимуляції й інгібування ангіоангіогенез від ободка рогівки. генезу в результаті введення сполук безпосередЛіву і праву рогівки відповідно позначили як ньо в рогівку ока. OS і OD. Потім здійснювали спостереження за А. Метод -in vivo моделі ока кролика рогівками протягом 12 днів. На 10 день після опе1) Ангіогенез, індукований чинниками росту рації були зроблені фотографії, коли неоваскуляАнгіогенез був індукований чинниками росту in ризація максимальна. Отримані на фотографіях vi vo методом моделі ока кролика й описується результати вищеописаних експериментів по обронижче. бці сукупністю цитокін/mAb показані на Фігурах 1Aа. Приготування гідронових гранул, що містять 1D. Паралельний розрахунок mAb інгібування цичинник росту і моноклональні антитіла 37 84665 38 токін-індукованого ангіогенезу показаний на Фігу5. Ангіогенез із препаратом хоріоалантоїсноТ рах 2А і 2В. На Фігура х 1 А і 1D, коли рогівки були мембрани курчати (САМ) піддані дії відповідно комбінацій bFGF/PlF6 і А. Характеристика вихідного САМ VEGF/L M609, ангіогенез із набряками помітний, як 1) Одержання САМ це показано великими стрілками. Тому антитіла до Ангіогенез може бути індукований у хоріоалантоїсній мембрані курчати (САМ) після того, як норa vb 5, PIF6, не інгібували bFGF-індукований ангіомальний ембріонічний ангіогенез привів до утвогенез ефективно. Аналогічно, антитіла до a vb 3 рення первинних кровоносних судин. Було LM609, не інгібували ефективно VEGF-індукований показано, що ангіогенез розвивається як реакція ангіогенез. на специфічні цитокіни або фрагменти пухлини, як Коли ж у моделі кролика, використовували описане [Leibovich et al., Nature, 329-630 (1987); комбінації bFGF/LM609 і VEGF/PIF6, викликаний Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79: 597 (1975)]. САцитокіном ангіогенез, навпроти, був інгібований Ми го тували з ембріона курчати з наступними інантитілами, як показано на Фігурах 1B i 1С відподукуванням ангіогенезу і його інгібуванням, як опивідно. На цих Фігурах показано, що нормальні сано нижче й у Прикладі 6 із a vb 5 антагоністами кон'юнктивальні лімбальні судини, показані маледаного винаходу. нькими стрілками, демонструють ефективність Десятиденні ембріони курчат були отримані інтегринових антитіл при інгібуванні одного типу від Mc lntyre Poultry (Lakeside, CA) і інгібувались ангіогенезу, викликаного цитокіном. при 37°C і 60% вологості. Невеликий отвір було Вплив імуноспецифічності специфічних до інпророблено в шкаралупі безпосередньо над повіттегрину mAb на вищеописаний ангіогенез, виклиряним мішечком за допомогою маленького вправканий цитокіном, також кількісно показаний на Фіного свердла (Dremel, Division of Emerson Electric гура х 2А і 2В. Ангіогенез стимулювали bFGF, або Co. у Racine, Wl). Другий отвір було зроблено на VEGF, як показано відповідно на Фігурах 2 А і 2В. широкому кінці яйця в районі, вільному від кровоПіддані обробці очі були сфотографовані оператиносних судин ембріона, попередньо визначеному вним мікроскопом Wild' а, оснащеним камерою перевіркою яйця на світло. До початкового отвору Nikon. був застосований вакуум, що привів до відриву Фотографії були зроблені на плівці для слайСАМ (хоріоалантоїсної мембрани) від мембрани дів Kodak Ektachrom 64T, і зображення були перешкаралупи і створенню фальшивого повітряного кладені на комп'ютер-асистуєме зчитування з вимішка над САМ. Вікно площею 1,0 сантиметр (см) користанням Biorad's Molecular Analyst 1.1 Software х 1,0см було вирізано через шкаралупу над опапісля acquisition. Модель GS670, являє собою денлою САМ із використанням маленької моделі шліситомер. Гістограми, що іллюструють значення фувального колеса (Dremel). Маленьке віконце неоваскулярна площа +/-- стандартна помилка дозволяло безпосередній доступ до нижчележачої (n=8 для кожної з двох серій) після витримки з САМ. Отриманий препарат САМ був потім викориmAbs PlF6 і LM609. станий через 10 днів ембріогенезу, при додаткоЯк показано на Фігурі 2А, L M609 зменшували вому розвитку ангіогенезу. Препарат використовувикликаний bFGF-ангіогенез на 86% (р