Фармацевтична сполука для стимулювання ангіогенезу (варіанти), фармацевтична сполука для інгібування ангіогенезу (варіанти) та спосіб модулювання ангіогенезу з їх використанням

1. Фармацевтична сполука для стимулювання ангіогенезу у тканині-мішені ссавців, яка містить терапевтичну кількість вірусного вектора експресії, що містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично припустимий носій або наповнювач; причому вищевказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує Src-білок (тирозинкіназу), а вищевказаний Src-білок має будь-який 2 (19) 1 3 75565 4 12. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 9, яка не застосування включає внутрішньовенне ввехарактеризується тим, що додатково містить ліподення разової дози. сому. 23. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказа13. Фармацевтична сполука для інгібування ангіоний Src-білок є активним Src-білком, і вищевказане генезу у тканині-мішені ссавців, яка містить терамодулювання є стимулюванням ангіогенезу. певтичну кількість невірусного вектора експресії, 24. Спосіб згідно з пунктом 23, у якому вищевказащо містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично ний активний Src-білок є Src A. припустимий носій або наповнювач; причому ви25. Спосіб згідно з пунктом 23, у якому вищевказащевказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклена тканина має поганий кровообіг. їнової кислоти, який кодує Src-білок, у якому відсу26. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказатня кіназна активність. ний Src-білок є неактивним Src-білком, і вищевка14. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 13, зане модулювання є інгібуванням ангіогенезу. яка характеризується тим, що вищевказаний Src27. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказабілок є неактивним Src-білком. ний неактивний Src-білок є Src 251 aбo Src K295M. 15. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 14, у 28. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказаякій вищевказаний неактивний Src-білок є Src 251 на тканина знаходиться в стані запалення, і вищеабо Src K295M. вказаний стан захворювання є артритом або рев16. Фармацевтична сполука згідно з пунктом 13, матичним артритом. яка характеризується тим, що додатково містить 29. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказаліпосому. на тканина є солідною пухлиною або метастазами 17. Спосіб модулювання ангіогенезу у тканині, посолідної пухлини. в'язаній із станом захворювання, який включає 30. Спосіб згідно з пунктом 29, у якому вищевказазастосування до цієї тканини фармацевтичної не застосування здійснюють разом з хіміосполуки, що містить терапевтичну кількість вектотерапією. ра експресії, який містить нуклеїнову кислоту, яка 31. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказакодує Src-білок. на тканина є ретинальною тканиною, і вищевказа18. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказаний стан захворювання є ретинопатією, діабетичний вектор експресії є ретровірусним вектором ною ретинопатією або дистрофією жовтої плями експресії. сітківки. 19. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказа32. Спосіб згідно з пунктом 26, у якому вищевказаний вектор експресії є невірусним вектором ексна тканина знаходиться у місці коронарної пластипресії. чної операції на судинах, і вищевказана тканина 20. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказазнаходиться під ризиком виникнення рестенозу. на фармацевтична сполука додатково містить лі33. Лікарський засіб для модулювання ангіогенезу посому. у тканині-мішені ссавців, який містить фармацев21. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказатичну сполуку згідно з пунктами 1-16, розміщену в не застосування включає застосування внутрішупаковці з етикеткою, на якій вказано, що ця фарньовенним, крізьшкірним, внутрішньочеревним, мацевтична сполука може бути застосована для внутрішньом'язовим або пероральним шляхом. лікування станів захворювання шляхом модулю22. Спосіб згідно з пунктом 17, у якому вищевказавання ангіогенезу. У цій заявці заявлений ефект винаходу, описаного у попередній заявці [на патент США з серійним номером 60/087,220, поданій 29 травня 1998p.], яка включена до опису винаходу шляхом посилання, як і всі інші посилання, що згадуються тут. Цей винахід в основному стосується галузі медицини і зокрема способів та сполук для модулювання ангіогенезу тканин з використанням протеїну тирозинкінази Src, різновидів Src та нуклеїнових кислот, що їх кодують. Ангіогенез (розвиток кровоносних судин – прим. перекладача) є процесом васкуляризації тканин, пов'язаним з вростанням новоутворених кровоносних судин у тканину, який також іноді називають неоваскуляризацією. Цей процес викликається інфільтрацією ендотеліальних клітин і клітин гладких м'язів. Вважається, що цей процес відбувається одним з трьох шляхів: судини можуть відростати від судин, які існували раніше, розвиток нових судин може виникати від клітин попередників (васкулогенез), або існуючі невеличкі судини можуть збільшуватися в діаметрі [Blood et al., Bioch. Biophys Acta, 1032:89-118(1990)]. Ангіогенез є важливим процесом при зростанні новонароджених, але він є важливим також при загоєнні ран і при патогенезі величезної кількості клінічних захворювань, включаючи запалення тканин, артрит, зростання пухлин, діабетичну ретинопатію, переродження плям на роговиці при неоваскуляризації сітківки і подібні стани. Ці клінічні прояви, пов'язані з ангіогенезом, одержали назву ангіогенних захворювань [Folkman et al., Science, 235:442-447 (1987)]. Ангіогенезу звичайно немає в дорослих або зрілих тканинах, хоча він все-таки відбувається при загоєнні ран та у циклі зростання жовтого тіла. [Див, наприклад, Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990)]. Було припущено, що інгібування ангіогенезу може виявитися корисною терапією для обмеження зростання пухлин. Було запропоновано здійснювати інгібування ангіогенезу шляхом: (1) інгібу 5 75565 6 вання звільнення "ангіогенних молекул", наприкорисним при лікуванні ураженої тканини там, де клад, таких, як оФРФ (основний фактор росту фібвідбувається шкідлива неоваскуляризація. Прикробластів), (2) нейтралізації ангіогенних молекул, ладові тканини включають запалені тканини, твернаприклад, шляхом використання анти-β-οΦΡΦ ді пухлини, метастази, тканини, у яких відбуваєтьантитіл, (3) використання інгібіторів рецептора ся рестеноз, і подібні їм тканини. вітронектину ανβ з, та (4) інгібування реакції ендоПосилення є корисним при лікуванні пацієнтів теліальних клітин на ангіогенні стимули. Цей з ішемічними кінцівками, у яких спостерігається останній підхід привернув увагу, і [Folkman et al., погана циркуляція у кінцівках, викликана діабетичCancer Biology. 3:89-96 (1992)] описали кілька інгіними або іншими станами. Пацієнти з хронічними біторів реакції ендотеліальних клітин, включаючи ранами, що не загоюються і для яких, отже, моінгібітор колагенази, інгібітори відновлення базажуть виявитися корисними збільшення проліферальної мембрани, ангіостатичні стероїди, отримані з ції клітин судин та неоваскуляризація, можуть тагрибків інгібітори ангіогенезу, тромбоцитарний факож бути вилікувані. ктор 4, тромбоспондин, ліки від артриту, наприНайкращим є використання Src-білка, що місклад, такі, як D-пеніциламін та тіомалат золота, тить модифікований ланцюжок амінокислоти, який аналоги вітаміну D3, альфа-інтерферон та інші, які описується тут. Тут описані кілька особливо кориможуть бути використані для інгібування ангіогесних модифікованих Src-білків та їхня експресія. незу. Про додаткові запропоновані інгібітори ангіоТаким чином, у цьому винаході розглядається генезу [див. Blood et al., Bioch. Biophys Acta, фармацевтична сполука для стимулювання ангіо1032:89-118 (1990); Moses et al., Science, 248:1408генезу в тканині-мішені ссавців, яка містить вірус1410 (1990); Ingber et al., Lab Invest. 89:44-51 ний або невірусний вектор переносу генів, який (1988) та патенти США №№5 092 885, 5 112 946, 5 містить нуклеїнову кислоту та фармацевтично 192 744, 5 202 352, 5 753 230 та 5 766 591]. Жодпридатний носій або наповнювач, причому вищений з інгібіторів ангіогенезу, описаних у попередніх вказана нуклеїнова кислота має сегмент нуклеїнопосиланнях, не пов'язаний з Src-білками. вої кислоти, який кодує Src-білок, а вищевказаний Щоб відбувся ангіогенез, ендотеліальні клітиSrc-білок має залишок будь-якої амінокислоти в ни повинні спочатку деградувати та взаємодіяти з кодоні 527, за винятком тирозину, серину або требазальною мембраною кровоносних судин подібно оніну. тому, як це роблять клітини пухлин під час інвазії Також описується фармацевтичний препарат та утворення метастаз. для інгібування ангіогенезу в тканині-мішені ссавРаніше винахідники повідомляли про те, що ців, який містить вірусний або невірусний вектор ангіогенез залежить від взаємодії між васкулярнипереносу генів, що містить нуклеїнову кислоту та ми інтегринами та білками позаклітинного матрикфармацевтично придатний носій або наповнювач, су [Brooks et a., Science, 264:569-571 (1994)]. Крім причому вищевказана нуклеїнова кислота має того, повідомлялося про те, що запрограмована сегмент нуклеїнової кислоти, який кодує білок Sic. смерть (апоптоз) ангіогенних васкулярних клітин у якому відсутня активність кінази. викликається взаємодією, яка може бути інгібоваНа кресленнях, які складають частину цього на певними антагоністами васкулярного інтегрину опису: ανβ3 [Brooks et al., Cell, 79 1157-1164 (1994)]. ЗоФіг.1 є послідовністю кДНК C-Src курчати, яка всім нещодавно винахідники повідомили про те, є повною кодованою послідовністю з видаленими що зчеплення металопротеїнази-2 матриксу (мПМінтронами, що вперше було описано [Takeya et al., 2) з рецептором вітронектину (ανβ3) може бути інгіCell, 32:881-890 (1983)]. Цю послідовність можна боване шляхом використання антагоністів ανβ3, знайти під інвентарним номером J00844 генного що, отже, інгібує ферментативну функцію протеїбанку. Послідовність містить 1759 нуклеотидів, а нази [Brooks et al., Cell, 85:683-693 (1996)]. кодуюча частина білка починається та закінчуєтьЦей винахід спрямований на модулювання анся відповідно в положеннях нуклеотидів 112 та гіогенезу у тканинах за допомогою тирозинкінази 1713. Src, яка тут у загальному вигляді називається Src. Фіг.2 є кодованою послідовністю залишку аміРозглядаються сполуки та способи модулюнокислоти c-Src курчати кодуючої послідовності, вання ангіогенезу в тканині, пов'язаній з якимпоказаної на Фіг.1. небудь захворюванням. Тканину, яку необхідно Фіг.3 є послідовністю кДНК c-Src людини, впевилікувати від захворювання, обробляють сполурше описаною [Braeuninger et al., Proc. Natl. Acad. кою, що містить кількість Src-білка, достатню для Sci., USA, 88:10411-10415 (1991)]. Цю послідовмодулювання ангіогенезу. Сполука, що містить ність можна знайти під інвентарним номером Src-білок, може містити очищений білок, біологічно Х59932 Х71157 генного банку. Послідовність місактивні білкові фрагменти, отриманий рекомбінутить 2187 нуклеотидів, а кодуюча частина білка ванням Src-білок або фрагменти білків або злиті з починається та закінчується відповідно в полоних білки, або вектори експресії генів/нуклеїнової женнях нуклеотидів 134 та 1486. кислоти для експресії Src-білків. Фіг.4 є кодованою послідовністю залишку аміКоли Src-білок інактивується або пригнічуєтьнокислоти c-Src людини кодуючої послідовності, ся, модулювання являє собою інгібування ангіогепоказаної на Фіг.3. незу. Коли Src-білок є активним або активується, На Фіг.5 показана активація ендогенного Src за модулювання являє собою посилення ангіогенезу. допомогою оФРФ або ФРСЕ (фактору росту суТканина, яку буде піддано лікуванню, може будинного ендотелію - прим. перекладача), описана ти будь-якою тканиною, для якої є бажаним модув прикладі 4. У верхній частині фігури показані лювання ангіогенезу. Інгібування ангіогенезу є результати аналізу кінази in vitro із згорнутою ак 7 75565 8 тивацією ендогенного c-Src за допомогою оФРФ трансфікованих клітинах у порівнянні з контрольабо ФРСЕ. У нижній частині фігури приведений ною обробкою. відбиток аналізу кінази, досліджуваний за допомоНа Фіг.9 показані результати ретровірусної догою анти-Src антитіла як контролю навантаження ставки ЗРВСП-Src 251 до пухлини людини. Фіг.9А для еквівалентного вмісту Src та імуноглобуліну. є мікрофотознімком, на якому показаний фрагмент На Фіг.6 показаний вплив ретровірусної генної медулобластомної пухлини людини, інфікований експресії c-Src А на ангіогенез у хоріоналантоїсній ЗРВСП-ЗФБ (ЗФБ - зелений флуоресцентний промембрані (ХАМ) курчати, описаний у прикладі 4. теїн). експресія ЗФБ у якій відбувається виключно ХАМ дев'ятидобових курчат піддавали впливу в кровоносних судинах пухлини (розмірна стрілка), ЗРВСП-Src А (активно мутованого c-Src) (ЗРВСП як було виявлено при оптичному розсіченні за доздатний до реплікації вірус саркоми птахів, прим, помогою співфокусного лазерного сканувального перекладача), або контрольних ретровірусів мікроскопа "Bio Rad" (смуга =500мкм). На Фіг.9В ЗРВСП-ЗФБ (ЗФБ - зелений флуоресцентний бізображені дані досліджень пухлин, оброблених лок; флуоресцентний белок-індикатор), або буфешляхом місцевої аплікації ретровірусу, яким було ра протягом 72г. Рівень ангіогенезу був визначедозволено зростати протягом від 3 до 6 днів, після ний так, як це показано на Фіг.6А, причому чого вони були резектовані, і була визначена їхня репрезентативні мікрофотознімки (з чотириразоволога вага. Дані подані як середня зміна ваги вим збільшенням) на Фіг.6В, які відповідають кожпухлин (від початкової ваги пухлини 50 міліграмів) ному етапу лікування, були зроблені за допомогою +/- СЗП з 2 реплікацій. стереомікроскопа. На Фіг.9С зображений репрезентативний мікНа Фіг.7 показана ретровірусна експресія c-Src рофотознімок медулобластомних пухлин, вилучеА при активації фосфорилування васкулярної акних з ембріонів хірургічним шляхом (смуга тивованої мітогеном протеїнкінази (АМП кінази). =350мкм). Нижні панелі є сильно збільшеними На Фіг.7А показані екстракти тканин ХАМ 10видами кожної пухлини, що детально показують денних курчат, які піддавали впливу ФРСЕ або судинну мережу кожної пухлини (смуга =350мкм). ФМА (форболміристатацетату) протягом 30 хвиРозмірна стрілка вказує на руйнацію кровоносних лин або інфікували ретровірусом C-Src A протягом судин у пухлинах, оброблених ЗРВСП-Src 251. 48 годин. ВЛ означає відсутність лікування. ІмуноФіг.10 є діаграмою, що ілюструє карту векторпреципітат Src утворили з еквівалентних кількосної обмежувальної конструкції ЗРВСП-ВР тей загального екстракту протеїну та піддали іму(ЗРВСП). нокомплексному аналізу кіназної активності in vitro А. Визначення з використанням злитого білка ΚΦΑ-Γ-S-T (де КФА Амінокислотний залишок: Амінокислота, утво-кіназа з фокальною адгезією, а Γ-S-T - глютатіонрена при хімічному перетравленні (гідролізі) полі5-трансфераза, прим, перекладача) як субстрат, пептиду по його пептидних зв'язках. Амінокислотні піддавали електрофорезу та переносили до нітрозалишки, що описуються тут, знаходяться перевацелюлози. Аліквоти вищевказаних лізатів цілих жно в ізомерній формі L. Проте залишки в ізомертканин також вимірювали на ендогенне фосфориній формі D можуть бути заміщені будь-якими Lлування ПРСК (позаклітинної регульованої сигнаамінокислотними залишками, якщо пептидом збелом кінази) за допомогою імуноблотингу з антирігається бажана функціональна властивість. NH2 фосфо-ПРСК антитілом. позначає вільну аміногрупу, яка присутня на аміноНа Фіг.7В показані 10-денні ХАМ, які були інфікінці поліпептиду. СООН позначає вільну карбокковані контрольними ЗРВСП або ЗРВСП, що міссильну групу, яка присутня на карбокси-кінці політили Src А. Через два дні ХАМ препарували, зберіпептиду згідно зі стандартною номенклатурою погали при кріогенній температурі у кріоконсерванті ліпептиду [що описано в J.Biol.Chem., 243:3552-59 ОСТ та розділяли на частини по 4мкм. Частини (1969) та прийнято в 37 Кодексі федеральних ноофарбили з використанням імунної мітки антирмативних актів, §1. 822(b)(2)]. фосфорилованим антитілом ПРСК ("Нью Інгліш Слід зазначити, що всі послідовності амінокиБайолабз"), промили та визначили за допомогою слотних осадів представлені тут формулами, ліві протикролячого кон'югованого з ФІТЦ (ФІТЦ - флута праві орієнтації яких знаходяться в умовному оресцеїн ізотіоціанат, прим, перекладача) вториннапрямку від аміно-кінця до карбокси-кінця. Крім ного антитіла цапа. Флуоресцентні образи були того, слід зазначити, що тире на початку або кінці зафіксовані камерою на охолоджуваних приладах послідовності амінокислотних осадів вказує на із зарядовим зв'язком ("Принстон Інст."). пептидний зв'язок з наступною послідовністю одНа Фіг.8 показані вибіркові вимоги до активноного або більш амінокислотних осадів. сті Src під час ангіогенезу, викликаного ФРСЕ, але Поліпептид: позначає лінійну групу амінокисне оФРФ. ХАМ дев'ятиденних курчат піддавали лотних осадів, пов'язаних один з одним пептиднивпливу ЗРВСП-Src 251 або контрольних ЗРВСПми зв'язками між альфа-аміногрупами та карбоксиЗФБ ретровірусів, або буфера протягом 20 годин, групами суміжних амінокислотних осадів. а потім інкубували протягом ще 72 годин при Пептид: у його використанні в цьому описі пооФРФ або ФРСЕ або у їх відсутності. Рівень ангіозначає лінійну групу з не більш ніж 50 амінокислогенезу вимірювали на Фіг.8А, як це було описано тними осадами, пов'язаними один з одним, як у вище, та стереомікроскопом були зроблені репреполіпептиді. зентативні мікрофотознімки (з шестиразовим збіЦиклічний пептид: позначає сполуку, яка має льшенням), як показано на Фіг.8В. кільцеву структуру, що включає кілька амідних На Фіг.8С показана пляма, зондована Анти-Src зв'язків, як у типовому пептиді. Циклічний пептид антитілом для підтвердження експресії Src 251 у може являти собою гомодетичний циклічний пеп 9 75565 10 тид, сполучений "головою до хвоста", або може розглядається лікування хворих з хронічними рамістити гетеродетичну кільцеву структуру, у якій нами, які не загоюються і для яких, отже, може кільце замикається дисульфідними мостами. лакбути корисним підвищення проліферації клітин тамними мостами, тіоефірами, тіоамідами, гуанісудин та неоваскуляризація. динами і подібними зв'язками. Способи згідно з цим винаходом є частково Білок: позначає лінійну групу з більш ніж 50 ефективними, оскільки лікування t високо вибіркоамінокислотними осадами, пов'язаними один з вим для ангіогенезу, але не для інших біологічних одним, як у поліпептиді. процесів. Злитий білок: позначає поліпептид, який місЯк було описано вище, ангіогенез включає ряд тить принаймні два різних поліпептидних домени, процесів, пов'язаних з неоваскуляризацією у ткаоперативно сполучених типовим пептидним зв'язнині, включаючи "пророщення", васкулогенез або ком ("злитих"). причому ці два домени відповідазбільшення судин, причому на всі ці процеси ангіоють пептидам, які в природі в злитій формі не зугенезу впливає Src-білок. Вважається, що більстрічаються. шість процесів ангіогенезу пов'язані з процесами Синтетичний пептид: позначає отриманий хізахворювань, за винятком лікування травматичних мічним способом ланцюг амінокислотних осадів, ран, утворення жовтого тіла та ембріогенезу, отже, пов'язаний пептидними зв'язками, який внаслідок ці терапевтичні методи є вибірковими щодо захвоцього вільний від білків, які зустрічаються в прирорювання і не мають шкідливих побічних ефектів. ді, та їхніх фрагментів. С. Src-білки В. Загальний аналіз Білок тирозинкіназа Src, який використовуєтьЦей винахід в основному стосується відкриття ся у цьому винаході, може бути різним в залежнотого, що ангіогенез опосередкованим чином висті від передбачуваного використання. Терміни кликається протеїном тирозинкіназою Src, і що "Src-білок" або "Sic" використовуються для познаангіогенез можна модулювати шляхом забезпечення різноманітних форм білків тирозинкінази чення активних або неактивних білків Src для поSrc, що описуються тут, як в активній, так і в неаксилення або пригнічення ангіогенезу, відповідно. тивній формі. Це відкриття є важливим внаслідок тієї ролі, "Активний Src-білок" позначає будь-яку форму яку ангіогенез, або утворення нових кровоносних з ряду форм Src-білків, яка посилює ангіогенез. судин, грає в різноманітних процесах захворюТут описані дослідження з вимірювання посилення вань. Якщо тканини, пов'язані зі станом хвороби, ангіогенезу, які не варто тлумачити як обмежувапотребують ангіогенезу для свого зростання, то льні. Білок вважається активним, якщо рівень ангібажано інгібувати ангіогенез і, таким чином, інгібуогенезу більше принаймні на 10%, краще на 25%, і вати зростання уражених тканин. Якщо ушкоджена ще краще на 50%, ніж контрольний рівень, при тканина потребує ангіогенезу для свого зростання якому в досліджувану систему не добавляли Src. та загоєння, то бажано посилювати ангіогенез або Найкращим дослідженням для вимірювання посисприяти йому і, таким чином, сприяти загоєнню та лення є дослідження ХАМ з використанням вірусзростанню тканини. ного вектора ЗРВСП, як це описано в Прикладах, у Якщо зростання нових кровоносних судин є яких індекс ангіогенезу обчислюється шляхом підпричиною патології або сприяє патології, пов'язарахунку точок розгалуження. У кращому випадку ній з ураженою тканиною, то інгібування ангіогенеактивний Src-білок проявляє також тирозинкіназну зу знижує шкідливий ефект захворювання. Шляактивність. Зразкові активні Src-білки описані в хом інгібування ангіогенезу можна втручатися у хід Прикладах та включають Src-A. захворювання, покращувати симптоми, а в деяких "Неактивний Src-білок" позначає будь-яку фовипадках і виліковувати захворювання. рму з ряду форм Src-білків, яка інгібує ангіогенез. Приклади тканин, пов'язаних з захворюванням Тут описані дослідження з вимірювання інгібуванта неоваскуляризацією, для яких буде корисним ня ангіогенезу, які не варто тлумачити як обмежуінгібуюче модулювання ангіогенезу, включають вальні. Білок вважається неактивним, якщо рівень тканини, уражені ревматоїдним артритом, діабетиангіогенезу менше принаймні на 10%, краще на чною ретинопатією, запальними захворюваннями, 25%, і ще краще на 50%, ніж контрольний рівень, рестенозом і тому подібними захворюваннями. при якому в досліджувану систему не добавляли Якщо зростання нових кровоносних судин є потріекзогенний Src. Найкращим дослідженням для бним для підтримання зростання шкідливої тканивимірювання інгібування є дослідження ХАМ з вини, то інгібування ангіогенезу знизить кровопостакористанням вірусного вектора ЗРВСП. як це опичання в тканині і, таким чином, сприятиме сано в Прикладах, у яких індекс ангіогенезу обчисзниженню маси тканини, яка залежить від кроволюється шляхом підрахунку точок розгалуження. У постачання. Приклади включають зростання пухкращому випадку неактивний Src-білок проявляє лин у тих випадках, коли неоваскуляризація є постакож знижену тирозинкіназну активність. Зразкові тійною умовою зростання пухлини в товщину на неактивні Src-білки описані в Прикладах та вклюдекілька міліметрів та для утворення твердих мечають Src-251. тастаз пухлини. Src-білок, який є корисним для цього винахоЯкщо зростання нових кровоносних судин ду, може бути отриманий будь-яким з ряду спососприяє загоєнню тканини, і о стимулювання ангіобів, включаючи виділення з природних джерел, генезу допомагає в лікуванні. Приклади включають включаючи тканини, одержання шляхом експресії лікування хворих з ішемічними кінцівками, у яких рекомбінантної ДНК та очищення тощо. Src-білок спостерігається погана циркуляція в кінцівках, виможна також одержати in situ шляхом уведення кликана діабетами або іншими станами. Також системи генної терапії до тканини, яка нас ціка 11 75565 12 вить, яка потім зробить експресію білка у тканині. або фрагмент нуклеїнової кислоти, незалежно від Ген, який кодує Src-білок, може бути виготовтого, чи є він полірибонуклеотидом або полідезоклений рядом способів, відомих у цій галузі техніки, сирибонуклеотидом, тобто РНК або ДНК, або їхніі цей винахід не слід тлумачити як обмежувальний ми аналогами. У найкращих варіантах реалізації у цьому відношенні. Наприклад, широким відомим цього винаходу молекула нуклеїнової кислоти знає те, що природна історія Src-білка містить ряд ходиться у формі сегмента дуплексної ДНК, тобто гомологів ссавців, птахів, вірусів та інших видів, і фрагменту ДНК, хоча в деяких методологіях молеген може легко бути клонований з використанням кулярної біології найкращими вважаються одноламетоду клонування кДНК з будь-якої тканини, що нцюгові ДНК або РНК. експресує білок. Найкращим білком Src для викоСегменти ДНК отримують рядом засобів, ристання у винаході є клітинний білок, такий, як включаючи методи хімічного синтезу та рекомбігомологи ссавців або птахів, позначені c-Src. Найнантні підходи, краще шляхом клонування або кращим у деяких випадках є c-Src людини. ланцюгової реакції полімерази (ЛРП). Фрагменти D. Молекули рекомбінантної ДНК та системи ДНК, які кодують частини Src-білка, легко можуть експресії для експресії Src-білка. бути синтезовані хімічними засобами, наприклад, У винаході описано кілька особливо корисних фосфотриефірним методом [Matteucci et al., J. Am. для цього винаходу послідовностей нуклеотидів. Chem. Soc, 103:3185-3191, 1981], або з викорисЦі послідовності включають такі послідовності, які танням автоматизованих методів синтезу. Крім кодують Src-білок, корисний для цього винаходу, того, великі сегменти ДНК можна легко приготувата різноманітні сегменти ДНК, молекули рекомбіти за допомогою добре відомих методів, таких, як нантної ДНК (рДНК) та вектори, сконструйовані синтез групи олігонуклеотидів, що визначають для експресії Src-білка. сегмент ДНК, за яким слідує гібридизація та лігуМолекули (сегменти) ДНК згідно з цим винаховання олігонуклеотидів для побудування повного дом, отже, можуть містити послідовності, які кодусегмента. Альтернативні методи включають видіють цілі структурні гени, фрагменти структурних лення кращого сегмента ДНК шляхом ЛРП пари генів і одиниці транскрипції, як це тут буде описано олігонуклеотидних праймерів, використаних з бібдалі. ліотеки кДНК, що, як вважається, містить члени, Кращим сегментом ДНК є нуклеотидна посліякі кодують Src-білок. довність, яка кодує Src-білок, як це було визначено Безсумнівно, за допомогою хімічного синтезу тут, або його біологічно активний фрагмент. будь-які необхідні модифікації можуть бути отриПослідовність амінокислотних залишків та нумані лише шляхом заміни відповідних основ на ті, клеотидна послідовність найкращого білка c-Src які кодують нативну послідовність амінокислотних описані в Прикладах. залишків. Цей метод добре відомий і може бути Кращий сегмент ДНК кодує послідовність амілегко застосований для одержання різних інших нокислотних залишків, яка є значною мірою такою "модифікованих" Src-білків, описаних тут. самою, як послідовність амінокислотних залишків Більш того, сегменти ДНК, які складаються гоабо її частини, що відповідають описаному тут Srcловним чином з структурних генів, які кодують Srcбілку, і переважно в основному складається з неї. білок, можуть бути згодом модифіковані, як при Репрезентативні та найкращі сегменти ДНК далі сайт-специфічному або випадковому мутагенезі, описані в Прикладах. для впровадження будь-яких необхідних заміщень. Послідовність амінокислотних залишків білка 1. Клонування гена Src або поліпептиду безпосередньо пов'язана через Ген Src може бути клонований з придатного генетичний код з послідовністю дезоксирибонукледжерела геномної ДІЖ або матричної РНК (мРНК) їнової кислоти (ДНК) структурного гена, що кодує різноманітними біохімічними методами. Клонуванбілок. Таким чином, структурний ген або сегмент ня цих генів може бути здійснено згідно з загальДНК може бути визначений на підставі послідовними методами, описаними у Прикладах, і так, як ності амінокислотних залишків, тобто білка або відомо у цій галузі техніки. поліпептиду, який він кодує. Джерела нуклеїнових кислот для клонування Важливою і добре відомою особливістю генегена Src, придатні для використання у способах тичного коду є його надмірність. Тобто, для більзгідно з цим винаходом, можуть містити геномну шості амінокислот, що використовуються для ДНК або матричну РНК (мРНК) у вигляді бібліотеки утворення білків, більш, ніж один кодуючий нуклекДНК, з тканини, яка, як вважається, експресує ці отидний триплет (кодон) може кодувати конкретбілки. Найкращою тканиною є тканина легенів люний амінокислотний залишок або позначати його. дини, хоча можна використовувати і будь-яку іншу Отже, ряд різних нуклеотидних послідовностей придатну тканину. може кодувати конкретну послідовність амінокисКращий метод клонування включає готування лотних залишків. Такі нуклеотидні послідовності бібліотеки кДНК з використанням стандартних мевважаються функціонально еквівалентними, оскітодів та виділення нуклеотидної послідовності, що льки вони можуть призводити до утворення однієї і кодує Src, шляхом посилення ЛРП з використантієї ж самої послідовності амінокислотних залишків ням пари олігонуклеотидних праймерів на підставі у всіх організмах. Іноді до складу наданої нуклеоописаних тут нуклеотидних послідовностей. В інтидної послідовності може входити метильований шому варіанті бажані клони кДНК можуть бути ідерізновид пурину або піримідину. Проте такі метинтифіковані та виділені з кДНК або геномної біблілування ніяк не впливають на відносини кодуванотеки звичайними методами гібридизації ня. нуклеїнової кислоти з використанням зонда гібриНуклеїновою кислотою є будь-який нуклеотид дизації на підставі описаних тут послідовностей 13 75565 14 нуклеїнової кислоти. Інші методи виділення та монд, Каліфорнія, pRSET, який можна отримати в клонування придатних нуклеїнових кислот, які ко"Інвітроген" ("Invitrogen"), Сан-Дієго, Каліфорнія, а дують Src, є достатньо очевидними для спеціалістакож pPL та рKK223, які можна отримати в "Фартів у цієї галузі техніки. масія" ("Pharmacia"), Піскатавей, Нью-Джерсі. 2. Вектори експресії Вектори експресії, сумісні з еукаріотичними Молекула рекомбінантної ДНК (рДНК), яка місклітинами, краще - сумісні з хребетними клітинами, тить сегмент ДНК, що кодує Src-білок, може бути також можуть бути використані для утворення моотримана так, як описується тут. Зокрема, експрелекул рекомбінантної ДНК згідно з цим винаходом. сована рДНК може бути отримана шляхом операВектори експресії еукаріотичних клітин добре вітивного (у рамці та експресивного) зчеплення векдомі у цій галузі техніки і можуть бути отримані з тора з сегментом ДНК, що кодує Src. Таким чином, кількох промислових джерел. Звичайно такі вектомолекула рекомбінантної ДНК є гібридною молери поставляються з вмістом зручних сайтів ресткулою ДНК, що містить принаймні дві нуклеїнові рикції для вставки бажаного сегмента ДНК. Типокислоти з нуклеотидних послідовностей, які звивими такими векторами є pSVL та pKSV-10 чайно в природі разом не зустрічаються. ("Фармасія") ("Pharmacia"), pBPV-1/pML2d ("ІнтерВибір вектора, з яким оперативно зчіплюється нешнл Байотекнолоджіз, Інк.") (International сегмент ДНК, безпосередньо залежить, як відомо Biotechnologies, Inc), pTDTl (Американська колекв цій галузі техніки, від бажаних функціональних ція типових культур, №31255). pRc/CMV ("Інвітровластивостей, наприклад, експресії білків, та кліген, Інк.") (Invitrogen, Inc), кращий вектор, який тини-хазяїна, яку слід трансформувати. Вектор, описаний в Прикладах, і подібні еукаріотичні векякий є придатним для використання при реалізації тори експресії. цього винаходу, є принаймні спроможним до Найкраща система для експресії генів в конспрямовування реплікації, а також краще до екстексті цього винаходу містить компонент доставки пресії структурного гена, включеного до сегментів гена, тобто можливість доставки гена до тканини, ДНК вектору, з якими він оперативно зчіплюється. яка нас цікавить. Придатними є "інфекційні" вектоВектори як прокаріотичної, так й еукаріотичної ри, наприклад, такі, як віруси рекомбінантної ДНК, експресії знайомі будь-якому фахівцю з середнім вектори аденовірусів або ретровірусів, що дозворівнем знань у галузі векторних конструкцій і опиляють інфікувати попередньо вибрані тканинисані [Ausebel et аl., в Current Protocols in Molecular мішені. Найкращим є вірус спроможної до реплікаBiology, Wiley and Sons, Нью-Йорк (1993) і ції саркоми птахів (СРСП), описаний тут. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Можна створити системи клітин ссавців, які Manual, "Колд Спрінг Хабор Лебореторі" ("Cold використовують рекомбінантні віруси або вірусні Spring Harbor Laboratory"), (1989)]. У цих посиланелементи для спрямовування експресії. Напринях також описано багато загальних методів рекоклад, при використанні аденовірусних векторів мбінантної ДНК, на які тут є посилання. експресії кодуюча послідовність поліпептиду може В одному з варіантів реалізації винаходу прибути лігована з комплексом управління транскрипдатний вектор містить прокаріотичний реплікон, цією/трансляцією аденовірусу, наприклад, остантобто послідовність ДНК, яка має здатність спряній промотор та трійчаста лідерна послідовність. мовувати автономну реплікацію і підтримання моЦей химерний ген може потім бути вставлений у лекули рекомбінантної ДНК позахромосомно в геном аденовірусу шляхом рекомбінації in vitro або прокаріотичній клітині-хазяїні, такій, як бактеріальin vivo. Наслідком вставки в несуттєву область на клітина-хазяїн, трансформованій за її допомовірусного геному (наприклад, область Е1 або Е3) гою. Такі реплікони є добре відомими у цій галузі буде виникнення рекомбінантного вірусу, який є техніки. Крім того, ті варіанти реалізації винаходу, життєздатним та спроможним до експресії поліпеякі включають прокаріотичний реплікон, також птиду в інфікованих хазяїнах [наприклад, див. включають і ген. експресія якого надає лікарську Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3655стійкість до бактеріального хазяїна, трансформо3659 (1984)]. Іншим чином, можна використовуваваного за його допомогою. Типові бактеріальні ти промотор вірусу коров'ячої віспи 7.5К [напригени лікарської стійкості - це ті, які дають стійкість клад, див. Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA. до ампіциліну або тетрацикліну. 79:7415-7419 (1982); Mackett et al., J. Virol., 49:857Ті вектори, що містять прокаріотичний реплі864 (1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci., кон, можуть також містити прокаріотичний промоUSA, 79:4927-4931 (1982)]. Особливий інтерес тор, спроможний спрямовувати експресію (транскпредставляють вектори, засновані на вірусі бичарипцію і трансляцію) структурного гена в чої папіломи, яку мають здібність до реплікації як бактеріальній клітині-хазяїні, наприклад, такій, як екстрахромосомні елементи [Sarver et al., Моl. Cell. Е. соlі,. трансформованій за його допомогою. ПроВіоl., 1:486 (1981)]. Безпосередньо після введення мотор - це керуючий елемент експресії, утворений цієї ДНК у клітині-мішені плазміда реплікує прибпослідовністю ДНК, який дозволяє відбуватися лизно від 100 до 200 копій на клітину. Транскрипзв'язуванню РНК полімерази і транскрипції. Посліція введеної кДНК не потребує інтеграції плазміди довності промоторів, сумісні з бактеріальними хадо хромосому клітини-хазяїна, що, таким чином, зяїнами, звичайно утворюються в плазмідних векзабезпечує високий рівень експресії. Ці вектори торах, які містять зручні сайти рестрикції для можуть бути використані для стійкої експресії шлявставки сегмента ДНК згідно з цим винаходом. хом включення селектованого маркера в плазміду, Такими типовими плазмідними векторами є pUC8б наприклад, ген neo. В іншому варіанті геном ретpUC9, pBR322 та pBR329, які можна отримати в ровірусу може бути модифікований для викорис"Байорад Лебораторіз" ("Bioiad Laboratories"), Річтання як вектор, спроможний впроваджувати та 15 75565 16 спрямовувати експресію нуклеотидної послідовнозамість гістидину [Hartman et al., Proc. Natl. Acad. сті, що кодує поліпептид, в клітині-хазяїні [Cone et Sci., США, 85:804 (1988)]; та ОДК (орнітиндекарбоal., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81:6349-6353 (1984)]. ксилаза), яка надає стійкість до інгібітору орнітинЕкспресії високого рівня можна також досягти декарбоксилази, 2-(дифторметил)-DL-орнітину, шляхом використання індукованих промоторів, ДФМО (McConlogue L., в кн.: "Сучасні системи певключаючи промотор llА металотіонін і промотори редачі в молекулярній біології", під ред. "Колд теплового шоку, але не обмежуючись лише ними. Спрінг Харбор Лебораторі" ("Cold Spring Harbor Останнім часом вивчалося довгострокове виLaboratory") (1987)]. живання промотору цитомегаловірусу (ЦМВ) у Основні вектори, розглянуті для генної терапії порівнянні з стимульованою промотором вірусу людини, виводять з ретровірусних джерел [Wilson, саркоми Руса (ВСР) генною терапією тимідинкіна1997, Clin. Exp. Immunol., 107 (Додаток 1 ):31-32; зою (ТК) у "голих" мишей, заражених раком яєчниBank et al., 1996, Bioessays, 18(12):999-1007; ків людини. Було виявлено, що ефективність вбиRobbins et al., 1998, Pharmacol. Ther., 80(1):35-47]. вання клітин стимульованого промотором ЦМВ Терапевтичний потенціал переносу генів та десенаденовірусного простого герпесу в порівнянні з сибілізуючої терапії стимулював розвиток багатьох генною терапією ТК у 2-10 рази перевищує ефеквекторних систем для лікування ряду тканин (сутивність терапії, стимульованої ВСР [Tong et al., динної мережи, [Stephan et al., 1997, Fundam. Clin. 1999, Hybridoma. 18(1):93-97]. Також була описана Pharmacol., 11(2):97-110; Feldman et al., 1997, модель химерних промоторів для застосування в Cardiovasc. Res. 35(3):391-404; Vassalli et al., 1997, генній терапії, для яких потрібна експресія низькоCardiovasc. Res., 35(3):459-69; Baek et al., 1998, го рівня, за якою слідує експресія високого рівня Circ. Res.. 82(3)295-305]; нирки, [Lien et al., 1997, [Suzuki et al., 1996, Human Gene Therapy, 7:1883Kidney Int. Suppl., 61.585-8]; печінки, [Ferry et al., 1893]. 1998, Hum Gene Ther, 9(14): 1975-81]; м'язів, Для довгострокового високопродуктивного поMarshall et al., 1998, Curr. Οpn. Genet. Dev., будування рекомбінантних білків віддають перева8(3):360-5]. Крім цих тканин, важливою мішенню гу стабільній експресії. Замість того, щоб викорисгенної терапії людини є рак, як сама пухлина, так і товувати вектори експресії, які містять вірусні пов'язані з нею тканини [Runnebaum, 1997, початки реплікації, клітини-хазяїни можуть бути Anticancer Res., 17(4В):2887-90. Spear et al., 1998, перетворені кДНК, регульованою відповідними J. Neurovirol., 4(2): 133-47]. елементами контролю експресії (наприклад. посНижче стисло описуються конкретні приклади лідовності промотору та енхансеру, термінатори векторних систем вірусної генної терапії, які легко транскрипції, сайти поліаденілування тощо) і селепристосовуються для використання в способах ктованим маркером. Як згадувалося вище, селекзгідно з цим винаходом. Перенос ретровірусних тований маркер у рекомбінантній плазміді надає генів був нещодавно проаналізований Federspiel стійкість до селекції і дозволяє клітинам стабільно та Hughes [1998, Methods in Cell Biol., 52:179-214], інтегрувати плазміду до своїх хромосом та зростаякі, зокрема, описали сім'ю ретровірусів вірусу ти, створюючи осередки, які. в свою чергу, можуть лейкозу птахів (ВЛП) [Federspiel et al., Proc. Natl. бути клоновані та перетворені у лінії клітин. Acad. Sci., США, 93:4931 (1996); Federspiel et al., Наприклад, після введення чужорідної ДНК Proc. Natl. Acad. Sci., США, 91:11241 (1994)]. Ретсконструйованим клітинам може бути дозволено ровірусні вектори, включаючи ВЛП і вірус лейкемії зростати протягом 1-2 днів у збагачених середомишей (ВЛМ), пізніше були описані Svoboda [1998, вищах, після чого їх переспрямовують у вибірні Gene, 206:153-163]. середовища. Можна використовувати ряд систем Модифіковані системи ретровірусселекції, включаючи (але не обмежуючись лише ної/аденовірусної експресії можуть бути легко приними) гени тимідинкінази вірусу простого герпесу стосовані для реалізації способів згідно з цим ви[Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)], гіпоксантиннаходом. Наприклад, системи вірусу лейкемії гуанін-фосфорибозілтрасферази [Szybalska et al., мишей (ВЛМ) [розглянуті Karavanas et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., США, 48:2026 (1962)] та адеCrit. Rev. in Oncology/Hematology, 28:7-30]. Систенінфосфорибозилтрансферази [Lowy et al., Cell, ми аденовірусної експресії розглянуті Von Seggern 22:817 (1980)], які можна використовувати в клітита Nemerow у кн.: "Системах експресії генів" [під нах tk, hgprt та apit відповідно. Крім того, як основу ред. Фернандеза та Хофлера, "Академік Пресе". для селекції можна використовувати гени("Academic Press"), Сан Діего, Каліфорнія, 1999, антиметаболіти, які надають стійкість; наприклад, гл.5, стор.112-157]. гени для dhfr, що надає стійкість до метатрексату Було продемонстровано, що системи експресії [Wigler et al, Proc. Natl. Acad. Sci., США, 77:3567 білків можуть бути ефективно використані як in (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci., США, vivo, так і in vitro. Наприклад, був описаний ефек78:1527 (1981)]; gpt, що надає стійкість до мікофетивний перенос генів у лускатоклітинну пухлину нолової кислоти [Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. людини амплікон-вектором вірусу простого герпеSci., США, 78:2072 (1981)]; neo, що надає стійкість су (ВПГ) типу 1 [Carevv et al., 1998, Am. J. Surg., до аміноглікозиду G-418 [Colberre-Garapin et al., J. 176:404-408]. Вірус простого герпесу використовуМоl. Biol., 150:1 (1981)]; та hygro, що надає стійють для переносу генів у нервову систему [Goins кість до гігроміцину [Santerre et al., Gene, 30:147 et al., 1997, J. Neurovirol., 3 (Додаток 1 ):580-8]. (1984)]. Нещодавно були описані додаткові селе'кСпрямовані суїцидальні вектори з використанням товані гени, а саме trpB, який дозволяє клітинам ВПГ-ТК були протестовані на твердих пухлинах використовувати індол замість триптофану; hisD, [Smiley et al., 1997, Hum. Gene Ther., 8(8):965-77]. який дозволяє клітинам використовувати гістинол Вектор вірусу простого герпесу типу 1 використо 17 75565 18 вували для генної терапії раку на клітинах карцивеликими клітинами [Schuler et al., 1998, Human номи ободової кишки [Yoon et al., 1998, Ann. Surg., Gene Therapy, 9:2075-2082]. Цей же вид раку був 228(3):366-74]. Гібридні вектори були удосконалені об'єктом терапії заміщенням гена р53 за допомодля збільшення періоду трансфекції, включаючи гою векторів аденовірусів [Roth et al, 1998. Semin. гібриди (ВПГ/ААВ) (аденоасоційований вірус) для Oncol., 25 (3 Додаток 8):33-7]. Генний перенос р53 лікування гепатоцитів [Fraefel et al., 1997, Моl. за допомогою аденовірусівінгібує диференціацію Med., 3(12):813-825]. ендотеліальних клітин та ангіогенез in vivo [Riccioni Вірус коров'ячої віспи був удосконалений для et al., 1998, Gene Ther., 5(6):747-54]. Була також генної терапії людини завдяки своєму великому описана викликана аденовірусами експресія антигеному [(Peplinski et al., 1998, Sura. Oncol. Clin. N. гену меланоми gp75 як імунотерапія метастатичAm., 7(3):575-88]. Було описане використання віної меланоми [Hirschowitz et al., 1998, Gene русу коров'ячої віспи з видаленою тимідинкіназою Therapy. 5:975-983]. Аденовірус полегшує інфікуз експресією пуринової нуклеозидпірофосфорилавання клітин людини екотропічним ретровірусом зи як вектору генної терапії, спрямованої на пухта підвищує ефективність ретро вірусної інфекції лину [Puhlman et al., 1999, Human Gene Therapy, [Scott-Taylor et al., 1998, Gene Ther, 5(5):621-9]. 10:649-657]. Вектори аденовірусів використовували для генноБуло описане використання аденоасоційоваго перенесення до васкулярних клітин гладких ного вірусу 2 (ААВ) в генній терапії людини, проте м'язів [Li et al., 1997, Chin. Med. J. (Engl.), ААВ потребує допоміжного вірусу (наприклад, 100(12):950-4], клітин плоскоклітинного раку аденовірусу або вірусу герпесу) для оптимальної [(Goebel et al., 1998, Otolarynol Head Neck Surg., реплікації та упаковування в клітинах ссавців. 119(4):331-6], клітин раку стравоходу [Senmaru et [Snoeck et al., 1997, Exp. NephroL, 5(6):514-20; al., 1998, Int. J. Cancer, 78(3):366-71], мезангіальRabinowitz et al., 1998, Curr. Οpn. Biotechnol., них клітин [Nahman et al., 1998, J. Investig. Med., 9(5):470-5]. Проте було описане упаковування in 46(5):204-9], гліальних клітин [Chen et al.. 1998, vitro інфекційного рекомбінантного ААВ, що, тим Cancer Res., 58(16):3504-7] та до суглобів тварин самим, зробило цю систему значно більш перспек[Ikeda et al., 1998, J. RheumatoL 25(9): 1666-73]. тивною [Ding et al., 1997, Gene Therapy, 4:1167Зовсім нещодавно було продемонстроване пери1172]. Було показано, що викликана ААВ передача кардіальне генне перенесення за допомогою катекДНК екотропічного ретровірусного рецептора тера, викликане векторами AcV [March et al., 1999, уможливлює екотропічну трансдукцію ретровірусу Clin. Cardiol., 22(1, Додаток 1): 123-9]. Маніпулюсталих та початкових клітин людини [Qing et al., вання системою аденовірусів відповідними регу1997, J. Virology, 71(7):5663-5667]. Була продемонлюючими генетичними елементами уможливлює стрована генна терапія раку з використанням векрегульовану цілеспрямовану генну експресію за тора ААВ, що експресував р53 людини природного допомогою аденовірусу in vivo [Burcin et al., 1999, типу [Qazilbash et al., 1997, Gene Therapy, 4:675PNAS (USA), 96(2)355-60]. 682]. Також було показано передачу гена в судинні Вектори альфа-вірусів були вдосконалені для клітини з використанням ААВ векторів [Maeda et застосування в генній терапії людини з лініями al., 1997, Cardiovascular Res., 35:514-521]. ААВ був клітин упаковування, придатними для трансфорпоказаний як придатний вектор для генної терапії, мації касетами експресії. придатними для викорисспрямованої на печінку [Xiao et al, 1998, J. Virol., тання з вірусом Сіндбіс та векторами вірусного 72(12): 10222-6]. Були описані вектори ААВ для походження Семліки Форест [Polo et al., 1999, застосування в генній терапії тканин мозку та Proc. Natl. Acad. Sci., США, 96:4598-4603]. Були центральної нервової системи [Chamberlin et al., також розроблені флавівірусні репликонові систе1998, Brain Res., 793(1-2): 169-75; During et al., ми на основі РНК, які не відносяться до захворю1998, Gene Therapy, 5(6):"820-7]. Також вектори вання клітин [Varaavski et al., 1999, Virology, ААВ були порівняні з аденовірусними векторами 255(2):366-75]. Вектори вірусу сінбіс, які містять (АдВ) для генної терапії легенів та передавання до ген-самогубець ВПГ-ТК, використовувалися для клітин епітелію людини з міхуровим фіброзом спрямовування до конкретних клітин пухлини [Teramoto et al., 1998, J. Virol, 72(11):8904-12). [Iijima et al., 1998, Int. J. Cancer, 80(1): 110-8]. Векторні системи генної терапії химерними Ретровірусні вектори на основі пінистого віруаденовірусами та ретровірусами включають корису людини (ПВЛ) є також перспективними як вексні властивості кожного вірусу для створення неінтори генної терапії [Trobridge et al., 1998, Human тегрованого аденовірусу, який стає функціонально Gene Therapy. 9:2517-2525]. Вектори пінистих віінтегрованим за допомогою проміжного утворення русів були сконструйовані для терапії генамиретровірусної клітини-продуцента [Feng et al., самогубцями [Nestler et al., 1997, Gene Ther., 4(11): 1997, Nat. Biotechnology, 15(9):866-70: Bilbao et al., 1270-7]. Рекомбінантний цитомегаловірус мишей 1997, FASEB J., 11(8):624-34]. Це могутнє нове та системи промоторів також використовувалися покоління векторів генної терапії було пристосоваяк вектори для експресії високого рівня [Manning et но для цілеспрямованої генної терапії раку [Bilbao al., 1998, J. Virol. Meth., 73(l):31-9; Tong et al., 1998, et al., 1998, Adv. Exp. Med. Biol, 451:365-74]. РазоHybridoma, 18(1):93-7]. ва ін'єкція аденовірусу з експресією р53 інгібувала Доставка генів до клітин, які не діляться, стала зростання вузликів підшкірної пухлини знесилених здійсненною завдяки утворенню векторів на основі ракових клітин людини [Asgari et al., 1997, Int. J. вірусу Сендай [Nakanishi et al., 1998, J. Controlled Cancer, 71(3):377-82]. Було описане генне перенеRelease, 54(1):61-8]. сення натурального р53. викликане аденовірусаВ інших спробах уможливити трансформацію ми, у пацієнтів з пізньою стадією раку легенів з соматичних клітин, що не діляться, були дослі 19 75565 20 джені лентивірусні вектори. Була описана генна тивними для генної доставки є комплекси вектора терапія фіброзно-кістозної дегенерації з викорисна основі хітозану та ДНК [Erbacher et al., 1998, танням вектора на основі вірусу імунодефіциту Pharm. Res., 15(9): 1332-9]. Був описаний невіруслюдини (ВІЛ) з відсутністю реплікації [Goldman et ний вектор доставки ДНК на основі триплексної al., 1997, Human Gene Therapy, 8:2261-2268]. Була системи [Kim et al., 1998, 53(1-3): 175-82]. Комплетакож продемонстрована тривала експресія генів, кси ліпосом, покритих частками вірусів, також виякі доставляються в печінку та м'язи лентивірускористовувалися для здійснення генного переносу ними векторами [Kafri et al., 1997, Nat. Genet., [Hirai et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 17(3)314-7]. Проте переважає турбота про безпеку, 241(1): 112-8]. і розробка удосконалених векторів йде швидкими Була продемонстрована генна терапія раку темпами [Kim et al., 1998, J. Virol., 72(2):994-1004]. прямими ін'єкціями в пухлину невірусного вектора Дослідження LTR-послідовності (довгого кінцевого Т7, який кодує ген тимідинкінази [Chen et al., 1998, повтору) ВІЛ і білка Tat надає важливу інформацію Human Gene Therapy, 9:729-736]. Готування плазпро структуру геному для розробки векторів мідної ДНК є важливим для генного переносу пря[Sadaie et al., 1998, J. Virol., 72(2):994-1004]. Таким мими ін'єкціями [Horn et al., 1995, Hum. Gene Ther., чином, зараз є краще зрозумілими генетичні вимо6(5):656-73]. Модифіковані плазмідні вектори були ги до ефективного вектора на основі ВІЛ (Gasmi et пристосовані конкретно для прямих ін'єкцій al., 1999, J. Virol., 73(3): 1828-34]. Були описані [Hartikka et al., 1996, Hum. Gene Ther., 7(10): 1205вектори, які самоінактивуються, або умовні лінії 17]. клітин упаковування [наприклад, Zuffery et al., Таким чином, у цій галузі техніки відомий ши1998, J. Virol., 72(12):9873-80; Miyoshi et al., 1998. рокий ряд векторів та конструкцій генного переноJ. Virol., 72(10):8150-7; Dull et al., 1998, J. Virol., су/генної терапії. Ці вектори можна легко присто72(11):8463-71; та Kaul et al., 1998, Virology, 249(1): сувати для використання в способах згідно з цим 167-74]. Була продемонстрована ефективна транвинаходом. Шляхом відповідного маніпулювання з сдукція лімфоцитів людини і клітин CD34+ вектовикористанням технологій рекомбінантної рами ВІЛ [Douglas et al., 1999, Hum. Gene Ther., ДНК/молекулярної біології для вставки оперативно 10(6):935-45; Miyoshi et al., 1999, Science, зчепленого Src (як активного, так і неактивного) в 283(5402):682-6]. Була описана ефективна трансобраний вектор експресії/доставки можна утворити дукція клітин людини, які не діляться, лентивірусбагато еквівалентних векторів для реалізації цього ними векторами вірусу імунодефіциту кішок (ВІК), винаходу. яка мінімізує турботи про безпеку при використанні Е. Способи модулювання ангіогенезу векторів на основі ВІЛ [Poeschla et al, 1998, Nature Цей винахід забезпечує спосіб модулювання Medicine, 4(3):354-357]. Було продемонстровано ангіогенезу у тканині, пов'язаній з процесом або продуктивне інфікування мононуклеарних клітин станом захворювання, за допомогою чого в тканині крові людини векторами ВІК [Johnston et al., 1999, здійснюються ті процеси, що залежать від ангіогеJ. Virol. 73(3):2491-8]. незу. Взагалі цей спосіб включає застосування до Оскільки з багатьма вірусними векторами важтканини, пов'язаної з процесом або станом захвоко поводитися, і спроможність до вставки ДНК обрювання, сполуки, яка містить достатню для модумежена, дослідження були спрямовані на ці обмелювання ангіогенезу кількість Src-білка або вектоження та недоліки. Наприклад, крім спрощених ра нуклеїнової кислоти, шо здійснює експресію вірусних ліній клітин упаковування, для полегшенактивного або неактивного Src. ня маніпулювання генетичним матеріалом та Як описано тут, в будь-якій з ряду тканин або створення вірусних векторів були розроблені мініорганів, що складаються з органічних тканин, може вирусні вектори, отримані з вірусу герпесу людини, бути підтриманий ангіогенез в станах захворюванвірусу простого герпесу типу І (ВПГ-1) та вірусу ня, включаючи шкіру, м'язи, кишки, сполучну ткаЕпштейна-Барра (ВЕБ) [Wang et al., 1996, J. нину, суглоби, кістки і подібні тканини, у яких моVirology, 70(12):8422-8430]. Раніше було продеможуть виникати кровоносні судини при впливі нстровано, що адапторні плазміди спрощують ангіогенних стимулів. вставку чужорідної ДНК у ретровірусні вектори, Краще, якщо пацієнт, якого лікують згідно з незалежні від вірусів-помічників [1987, J. Virology. цим винаходом у багатьох варіантах його реаліза61(10):3004-3012]. ції, є людиною, хоча слід розуміти, що основні Вірусні вектори не є єдиним засобом здійсненпринципи винаходу вказують на те, що винахід є ня генної терапії, оскільки було також описано кіефективним стосовно всіх ссавців, які, як передлька невірусних векторів. Було продемонстровано, бачається, повинні бути включені до терміну "паціщо результатом дії спрямованого невірусного векєнт". У цьому контексті розуміється, що до поняття тора генної доставки на основі використання полі"ссавець" включені усі види ссавців, для яких є сплетення епідермального фактора росту (ЕФР) та бажаним лікування тканини, пов'язаної з захворюДНК (ЕФР/ДНК) є ефективна та конкретна доставваннями, з якими пов'язаний ангіогенез, зокрема, ка генів [Cristiano, 1998, Anticancer Res., 18:3241види сільськогосподарських та свійських ссавців. 3246]. Була продемонстрована генна терапія суТаким чином, цей спосіб включає прописувандинної мережі та ЦНС з використанням катіонних ня пацієнту терапевтично ефективної кількості ліпосом [Yang et al., 1997, J. Neurotrauma, фізіологічно придатної сполуки, що містить Src14(5):281-97] Була також здійснена короткочасна білок або вектор ДНК для експресії Src-білка для генна терапія панкреатиту з використанням катіреалізації способів згідно з цим винаходом. онних ліпосом [Denham et al., 1998, Ann. Surg., Дози для прописування Src-білка змінюються в 227(6):812-20]. Було продемонстровано, що ефекзалежності від форми білка та його ефективності, 21 75565 22 як тут описується далі. Кількість дози є достатньо дення, залежить від думки спеціаліста та є індивівеликою для забезпечення бажаного ефекту, при дуальною для кожного пацієнта Проте придатні якому ангіогенез та симптоми захворювання, подіапазони дози для систематичного застосування в'язані з розвитком кровоносних судин, поліпшутут розкриті і залежать від шляху введення. Приються. Проте дози не повинні бути настільки велидатні режими введення також різноманітні, але кі, щоб викликати несприятливі побічні ефекти, типізовані за початковим введенням, після якого наприклад, синдроми підвищеної грузькості, наслідують повторні введення доз з інтервалом в 1 бряк легенів, закупорку серцевих судин тощо. Взаабо більш годин шляхом наступної ін'єкції або інгалі, доза залежить від віку, статі. стану пацієнта, шого виду введення. В альтернативному варіанті ступеня розвитку хвороби пацієнта і може бути розглядаються постійні внутрішньовенні вливання, легко визначена спеціалістом у цій галузі. У випаддостатні для підтримання концентрації в крові в ку будь-яких ускладнень доза також може регулюмежах, зазначених для лікування in vivo. ватися особистим лікарем. 1. Інгібування ангіогенезу. Терапевтично ефективна кількість складає таІнгібування ангіогенезу є важливим при різноку кількість Src-білка або нуклеїнової кислоти, яка манітних захворюваннях, які називаються ангіокодує (активний або неактивний) Src-білок, достагенними захворюваннями. Такі захворювання тній для здійснення помітного модулювання ангіовключають, не обмежуючись лише цим, запальні генезу у тканинах, підданих лікуванню, тобто кільрозлади, наприклад, алергічне і неалергічне запакість, достатню для модулювання ангіогенезу. лення, хронічний суглобний ревматизм та псоріаз, Модулювання ангіогенезу може бути обмірено розлади, пов'язані з невідповідною або невчасною аналізом ХАМ, як тут описано, або будь-якими інвазією судин, наприклад, діабетичну ретинопаіншими методами, відомими спеціалісту у цій галутію, неоваскулярну глаукому, рестеноз, капілярну зі техніки. проліферацію в атеросклеротичних бляшках та Src-білок або вектор нуклеїнової кислоти, який остеопороз, і розлади, пов'язані з раком, наприекспресує Src-білок, можна назначати парентераклад, тверду пухлину, метастази твердої пухлини, льним способом шляхом ін'єкції або шляхом посангіофіброми, ретролентальну фіброплазію, гематупового вливання протягом часу. Хоча звичайно нгіоми, саркому Капоші і подібні ракові захворютканина тіла, яка потребує лікування, може бути вання, які потребують неоваскуляризації для підтдоступна шляхом систематичного лікування, і, римання зростання пухлини. отже, частіше усього обробляється шляхом внутТаким чином, методи, які інгібують ангіогенез у рішньовенних вливань терапевтичних сполук, розтканині, пов'язаній із станом захворювання, покглядаються й інші тканини та засоби доставки. ращують симптоми захворювання і, в залежності Таким чином, сполуки згідно з цим винаходом мовід захворювання, можуть сприяти лікуванню хвожуть бути введені внутрішньовенним, внутрішньороби. В одному варіанті реалізації у винаході розгчеревним, внутрішньом'язовим, підшкірним, внутлядається інгібування ангіогенезу, по суті, у тканирішньопорожнинним та крізьшкірним шляхом і ні, пов'язаній із станом захворювання. Ступінь можуть бути доставлені перистальтичними засоангіогенезу у тканині, а отже, і ступінь інгібування, бами. досягнутий за допомогою сучасних методів, може Терапевтичні сполуки, які містять Src-білок або бути оцінений рядом способів. вектор нуклеїнової кислоти, який експресує SrcТак, в одному з варіантів реалізації винаходу білок, звичайно можна ввести внутрішньовенним тканиною, яку необхідно вилікувати, є запалена шляхом, як, наприклад, при ін'єкції разової дози. тканина, і ангіогенезом, який необхідно інгібувати, Термін "разова доза" стосовно до терапевтичної є ангіогенез запаленої тканини там, де спостерігасполуки згідно з цим винаходом позначає фізично ється неоваскуляризація запаленої тканини. У дискретні одиниці, які є придатними як одиничні цьому класі спосіб розглядає інгібування ангіогедози для суб'єкта, причому кожна одиниця містить незу в артричних тканинах, наприклад, у пацієнтів заздалегідь визначену кількість активного композ хронічним суглобним ревматизмом, в алергічних нента, визначеного для одержання бажаного тета неалергічних запаленнях тканин, у псоріатичних рапевтичного ефекту у поєднанні з необхідним тканинах тощо. розріджувачем; тобто носієм або наповнювачем. В іншому варіанті реалізації винаходу тканиВ одному з кращих варіантів реалізації цього ною, яку необхідно вилікувати, є тканина сітківки винаходу реагент вводиться єдиною дозою внутпацієнта з захворюванням сітківки, наприклад, рішньовенним шляхом. Локальне введення може діабетичною ретинопатією, виродженням плям бути здійснене шляхом прямої ін'єкції або шляхом або неоваскулярної глаукоми, та ангіогенезом, використання анатомічно ізольованих відділів, які який необхідно інгібувати, є ангіогенез тканини ізолюють мікроциркуляцію систем органа-мішені, сітківки там, де спостерігається неоваскуляризація реперфузію системи циркуляції, або тимчасову тканини сітківки. закупорку на основі катетера областей-мішеней У додатковому варіанті реалізації винаходу судинної мережі, пов'язаної з хворими тканинами. тканиною, яку необхідно вилікувати, є тканина пуСполуки водяться способом, сумісним з форхлини пацієнта з твердою пухлиною, метастазами, мулою дози та в терапевтично ефективній кількосраком шкіри, раком грудей, гемангіомою або ангіті Кількість та час введення залежить від об'єкта, офібромою, та подібними видами раку, і ангіогенеякий піддається лікуванню, спроможності систем зом, який необхідно інгібувати, є ангіогенез тканиоб'єкта до вживання активного інгредієнта та стуни пухлини там, де спостерігається пеню бажаного терапевтичного ефекту. Точна кінеоваскуляризація тканини пухлини. Типові тканилькість активного інгредієнта, необхідна для ввени твердої пухлини, які піддаються лікуванню за 23 75565 24 допомогою сучасних методів, включають тканини лізації методів лікування захворювань, пов'язаних легенів, підшлункової залози, грудей, товстої кишіз ангіогенезом, включає контакт тканини, у якій ки, гортані, яєчників і подібні тканини. Інгібування відбувається ангіогенез, або яка знаходиться під ангіогенезу тканин пухлини є найкращим варіанризиком виникнення ангіогенезу, із сполукою, що том реалізації винаходу внаслідок важливої ролі, містить терапевтично ефективну кількість інактияку відіграє неоваскуляризація у зростанні пухливованого Src-білка або вектора експресії цього ни. При відсутності неоваскуляризації тканин пухбілка. лини тканина пухлини не одержує необхідних жиІнгібування ангіогенезу і регресія пухлини відвильних речовин, уповільнює зростання, припиняє бувається через 7 днів після початкового контакту додаткове зростання, регресує і, в кінцевому рахуз терапевтичною сполукою. Додаткова або більш нку, перетворюється на некротичну, що призвотривала взаємодія з інактивним білком Src краще дить до загибелі пухлини. триває протягом від 7 днів до 6 тижнів, краще від Іншими словами, у цьому винаході передбаче14 до 28 днів. ний спосіб інгібування неоваскуляризації пухлини 2. Посилення ангіогенезу шляхом інгібування ангіогенезу пухлини згідно з У випадках, в яких бажано підтримувати або сучасними методами. Аналогічним чином у винастимулювати ангіогенез, корисно призначати до ході передбачений спосіб інгібування зростання тканини активний Src-білок. Засоби та час признапухлини шляхом реалізації методів інгібування чення сумісні з методами. описаними вище для ангіогенезу. інгібування ангіогенезу. Ці способи також особливо ефективні проти F. Терапевтичні сполуки створення метастаз внаслідок того, що (1) їхнє У цьому винаході розглядаються терапевтичні утворення потребує васкуляризації первинної пухсполуки, корисні для реалізації описаних тут тералини, щоб метастатичні клітини рака могли покипевтичних методів. Терапевтичні сполуки згідно з нути первинну пухлину та (2) їхнє утворення в поцим винаходом містять фізіологічно придатний вторному осередку потребує неоваскуляризації носій разом з білком Src або вектором, здатним до для підтримання зростання метастаз. експресії Src-білка, як описано тут, розчиненим В одному з варіантів реалізації цього винаходу або розподіленим у ньому як активний компонент. у ньому передбачена реалізація способу разом з У кращому варіанті реалізації винаходу терапевіншими методами лікування, наприклад, традиційтична сполука не є імуногенною при призначенні ною хіміотерапією, спрямованою проти твердої ссавцям або людям у терапевтичних цілях. пухлини і призначено, для контролю утворення При використанні тут терміни "фармацевтично метастаз. Застосування інгібітору ангіогенезу звиприпустимий", "фізіологічно придатний" та їхні чайно здійснюється під час або після хіміотерапії, граматичні варіанти у відношенні сполук, носіїв, хоча бажано інгібувати ангіогенез після режиму розчинників та реагентів використовуються взаєхіміотерапії в той час, коли тканина пухлини буде мозамінним чином і означають, що ці матеріали реагувати на токсичну атаку стимулюванням ангіоможна призначати ссавцям без виникнення небагенезу для відновлення шляхом подачі крові та жаних фізіологічних ефектів, таких, як нудота заживильних речовин до тканини пухлини. Крім того, паморочення, розлад шлунка тощо. бажано призначати способи інгібування ангіогенеГотування фармакологічної сполуки, що місзу після хірургічного втручання, при якому тверда тить активні інгредієнти, розчинені або розподілені пухлина була видалена як профілактика проти в неї, є добре відомим у цій галузі техніки і не потметастаз. ребує обмеження на основі формули. Звичайно Оскільки ці сучасні методи використовуються такі сполуки готують у вигляді ін'єкцій рідин або для інгібування неоваскуляризації пухлини, їх мосуспензій, проте можна приготувати і тверді форжна також застосовувати і для інгібування зросми, придатні для розчинення або суспензування в тання тканин пухлини, для інгібування утворення рідині перед використанням. Препарат можна таметастаз пухлини і для регресії утворених пухлин. кож емульгувати або представити у вигляді ліпоРестеноз є процесом міграції клітин гладкої сомноі сполуки. мускулатури (КГМ) та проліферації в тканину в Активний інгредієнт можна змішати з наповмісці підшкірної транспорожнинної коронарної нювачами, які є фармацевтично прийнятними і пластичної операції на судинах, що утрудняє досясумісними з активним інгредієнтом, і в кількостях, гнення успіху при пластичній операції на судинах. придатних для використання в описуваних тут теМіграцію та проліферацію КГМ під час рестенозу рапевтичних методах. Придатними наповнювачаможна розглядати як процес ангіогенезу, який моми є, наприклад, вода, соляний розчин, декстроза, жна інгібувати за допомогою сучасних методів. гліцерин, етанол або подібні їм наповнювачі та їхні Отже, у винаході також розглядається інгібування комбінації. Крім того, при необхідності сполука у пацієнта рестенозу шляхом інгібування ангіогеможе містити незначні кількості допоміжних речонезу згідно з сучасними методами, за яким слідувин, наприклад, агентів, що змочують або емульють процедури операції на судинах. Для інгібувангують, рН-буферних агентів і тому подібних речоня рестенозу звичайно призначають інактивовану вин, що посилюють ефективність активного тирозинкіназу після процедури операції на судинах інгредієнта. внаслідок ризику рестенозу для стінок коронарних Терапевтична сполука згідно з цим винаходом судин, звичайно протягом від 2 до 28 днів, а більш може містити фармацевтично припустимі солі з звичайно - протягом перших 14 днів після операції. будь-яких солетворних компонентів. ФармацевтиЦей метод інгібування ангіогенезу у тканинах, чно припустимі солі включають солі з додаванням пов'язаних із станом захворювання, а. отже, і реакислот (утворені вільними аміногрупами поліпеп 25 75565 26 тиду), які утворюються такими неорганічними кисцію, яка може знадобитися для продажу. Пакувалотами, як, наприклад, соляна або фосфорна кисльний матеріал може включати контейнер(и) для лоти, або такими органічними кислотами, як, назберігання фармацевтичного агента. приклад, оцтова, винна, мигдальна тощо. Солі, При використанні в цьому описі терміном "паутворені вільними карбоксильними групами, мокувальний матеріал" позначають такий матеріал, жуть бути також отримані з неорганічних основ, як скло, пластмаса, папір, фольга та подібні матенаприклад, таких, як гідроксиди натрію, калію, ріали, які можуть утримувати фіксувальними засоамонію кальцію або заліза, та органічних основ, бами фармацевтичний агент. Таким чином, напринаприклад, таких, як ізопропіламін, триметиламін клад, пакувальний матеріал може бути 2-2-етиламіноетанол, гістидин, прокат тощо. пластмасовою або скляною пробіркою, багатошаФізіологічно придатні носи для активних інгреровою обгорткою і подібними контейнерами, викодієнтів добре відомі в цій галузі техніки. Зразковиристовуваними для утримання фармацевтичної ми рідкими носіями є стерильні водяні розчини, які сполуки, яка містить фармацевтичний агент. не містять ніяких інших речовин, крім активних У кращих варіантах реалізації винаходу пакуінгредієнтів та води, або містять буфер, наприклад вальний матеріал включає етикетку, яка є реальфосфат натрію з фізіологічним значенням рН, фіним описом вмісту виробу та використання фарзіологічний соляний розчин або обидва наприклад, мацевтичного агента, який міститься в ньому. у вигляді фосфат-буферного соляного розчину. Приклади Крім того, водяні носії можуть містити більш однієї Наступні приклади, які відносяться до винахобуферної солі, а також такі солі, як хлориди натрію ду, є ілюстративними і, звичайно, не повинні тлута калію, декстроза, поліетиленгліколь та інші розмачитися як такі, що зокрема обмежують винахід. чини. Більш того, такі варіації винаходу, що відомі зараз Рідкі сполуки можуть також містити рідкі фази або будуть розроблені пізніше і які знаходяться в крім води або замість її. Прикладами таких додатмежах компетенції спеціаліста у цій галузі техніки, кових рідких фаз є гліцерин, рослинні олії, наприповинні розглядатися як такі, що знаходяться в клад, бавовняна олія, та водомасляні емульсії. межах цього заявленого нижче винаходу. Терапевтична сполука містить достатню для 1. Готування конструкцій експресії c-Src модулювання ангіогенезу кількість Src-білка згідно Для приготування конструкції експресії, корисз цим винаходом або достатнього вектору експреної при моделюванні ангіогенезу за допомогою сії рекомбінантної ДНК для експресії ефективної способів згідно з цим винаходом здійснюють манікількості Src-білка, і звичайно має такий склад, що пулювання кДНК c-Src та її вставку в конструкмістить принаймні 0,1 вагових відсотка Src-білка цію/вектор експресії. від ваги всієї терапевтичної сполуки. Ваговий відПослідовність кДНК, яка кодує натуральний соток є ваговим співвідношенням Src-білка та всієї (наприклад, ендогенний) c-Src курчат, показана на сполуки. Таким чином, наприклад, 0,1 вагових відФіг.1 (ідент. № посл.: 2), а кодована послідовність сотка складає 0,1г Src-білка на 100г всієї сполуки. амінокислотних залишків показана на Фіг.2 (ідент. Для векторів експресії ДНК призначувана кількість № посл.: 3). Кодовану білкову послідовність транзалежить від властивостей вектора експресії, ткаслюють з нуклеотидних положень кДНК 112 до нини, яку треба піддати лікуванню, і подібних мір1713. Послідовність нуклеїнової кислоти, яка відкувань. повідає послідовності нуклеїнової кислоти людсьG. Виріб кої кДНК c-Src (ідент. № посл.: 4), і кодовані посліУ винаході також розглядається виріб, який є довності амінокислотних залишків (ідент. № посл.: маркірованим контейнером для забезпечення Src5) показані на Фіг.3 і 4 відповідно. Для білкової білка згідно з цим винаходом. Виріб включає пакупослідовності людини кодуюча послідовність повальний матеріал, забезпечений відповідним марчинається в нуклеотидному положенні 134 до 1486 кіруванням із вказівкою стана захворювання, який кДНК. потрібно вилікувати, і фармацевтичним агентом, Були приготовлені натуральні, а також ряд вищо міститься всередині пакувального матеріалу. дозмінених кДНК c-Src. Видозмінені конструкції cФармацевтичний агент у виробі є будь-якою зі Src були приготовлені шляхом сайт-специфічного сполук згідно з цим винаходом, придатною для мутагенезу, як це було [описано Kaplan et al., забезпечення Src-білка та виготовленою у вигляді EMBO J., 13:4745-4576(1994)]. Видозмінені консфармацевтично припустимої форми, як описано трукції c-Src для кодування видозмінених білків cтут, відповідно до викладених показань. Таким Src для використання у способах згідно з цим вичином, сполука може містити Src-білок або моленаходом [описані у Kaplan et al., там же. Kaplan et кулу ДНК, яка має спроможність до експресії Srcal.] описують різноманітні видозмінені конструкції білка. Виріб містить кількість фармацевтичного c-Src і кодовані білки, корисні для реалізації цього агента, достатню для використання у лікуванні винаходу. [Наприклад, Kaplan et al., описують кільзазначеного на упаковці стана, як в разових, так і в ка алелів c-Src курчат на їхній Фіг.1, включаючи багатократних дозах. Src А і Src251. Пакувальний матеріал містить етикетку, на У цьому винаході описані дві категорії функції якій зазначене використання фармацевтичного c-Src для модулювання ангіогенезу. Як було опиагента, що міститься у ньому, наприклад, для лікусано раніше, одна категорія містить молекули Src, вання станів, яким може сприяти інгібування або які посилюють ангіогенез і завдяки цьому вважапосилення ангіогенезу, та подібних викладених на ються активними білками. У цьому винаході проній станів. Етикетка може, крім того, включати індемонстровано, що натуральні Src разом з різнострукції з використання і іншу пов'язану інформаманітними мутаціями стимулюють ангіогенез. 27 75565 28 Однією кращою мутацією натурального c-Src, яка c-Src + активний стимулює функціонує в цьому контексті щодо його спроможSrcA (T527F) + активний стимулює ності стимулювати зростання кровоносних судин і, Src 527 (крапковий) + активний стимулює таким чином, підвищує вагу пухлини in vivo, є муSrc 251 неактивний інгібує тант Src А, який має крапкову мутацію в положенні Src (зрізаний) неактивний інгібує 527 амінокислотного залишку, яка змінює тирозин Src (K295M) неактивний інгібує 527 на фенілаланін. Цей сайт є звичайно сайтом Src 295 (крапковий) неактивний інгібує негативного регулювання кіназою c-Src, називаною тут кіназою CSK. Коли CSK фосфорилює аміОднією кращою конструкцією експресії для винокислоту 527 у натуральному Src, білок інактивукористання в цьому винаході (конструкція ЗРВСПється. Проте у видозміненому Src А регулятивний ВР(А) (ідент. № посл.: 1). Цей вектор експресії тирозин перетворився на фенілаланін, таким чизаснований на ряді здатних до реплікації вірусів ном, зробивши білок конститутивно (тобто постійсаркоми птахів з посиленою полімеразою Бріана но) активним білком, який не піддається інактива(ПБ) для поліпшеного титру і є характерним для ції фосфорилуванням. глікопротеїну оболонки типу А, експресованого на Було також продемонстровано, що мутації Src нормальні клітини птахів [розглянуто в "Методах мають протилежний модулюючий вплив на ангіоклітинної біології", 52:179-214 (1997). див. також генез і інгібують ангіогенез замість його стимулюHughes et al., 1987, J. Virol., 61:3004-3012; Fekete вання. Такі мутації називаються неактивними мута Cepko, 1993, Моl. Cellulai Biol., 13(4):2604-2613; таціями Src. Білки, які мають мутацію, що надає їм Itoh et al., 1996, Development, 122:291-300; та Stott інгібуючу дію, також називаються домінантними et al., 1998. BioTechniqiues, 24:660-666]. Повна негативними Src-білками, оскільки вони інгібують послідовність ЗРВСП-ВР(А) (ідент. № поел. 1) неоваскуляризацію, як в результаті ендогенної приведена в доданому переліку послідовностей, а активності Src, так і в результаті підвищеної активрестрикційна карта конструкції зображена на ності Src внаслідок стимулювання фактора росту. Фіг.10 і називається тут ЗРВСП. Таким чином, певні мутації натурального c-Src Вихідна конструкція Src 251 була субклоновазгідно з цим винаходом також можуть діяти як дона доктором Пем Шварцберг в Національному мінантні негативні білки щодо їхньої спроможності інституті охорони здоров'я в лабораторії доктора блокувати зростання кровоносних судин і, наприХерольда Вармуса. Якщо стисло, то клонування клад, внаслідок цього зменшувати вагу пухлини in послідовності кДНК Src було здійснено шляхом vivo. вставки лінкера, який містить сайта рестрикції Not Такий найкращий інгібуючий білок c-Src вклюI-BstB1-Not І, у єдиний центр Not І у кінці 5' Src 251. чає Src 251, у якому лише перші 251 амінокислот Src має єдиний сайт Cla І у кінці 3'. Шляхом перетSrc піддаються експресії. У цій конструкції відсутравлення Src 251 з BstB1 та Сlа І був утворений ній весь домен кінази, і тому її називають Srcфрагмент BstB1-Сlа І, який був потім лігований у білком "з мертвою кіназою". Друга конструкція є сайт Cla І на ЗРВСП-ВР(А). Виступ BstB1 уможлимутацією Src (K295М), у якій лізиновий амінокисвлює лігування з виступом Сlа І, який не можна лотний залишок 295 мутує в метіонін. Ця крапкова вдруге відрізати Сlа І. Конструкції Src, придатні мутація в домені кінази запобігає зв'язуванню адедля використання при реалізації цього винаходу, нозинтрифосфату, а також блокує залежні від кіможна легко одержати у вищевказаному векторі нази функції Src, пов'язані з сигналізуванням та спочатку шляхом перетравлення вектора ЗРВСП, проліферацією васкулярних клітин і клітин пухякий містить Src 251 з Not І та Сlа І (у аденінметилини. лазі ДНК + фон), щоб уможливити вставку перетНаприклад, для мутації в залишку 527, якщо равленої подібним чином кДНК Src. Отже, ця вихіодержуваний в результаті залишок видозміненої дна конструкція ЗРВСП-ВР(А), яка містить Src 251, амінокислоти не є тирозином, серином або треонідалі використовувалася для субклонування всіх ном, в цьому винаході передбачається, що реінших конструкцій Src, [як це було описано вище і у зультатом присутності альтернативної амінокисKaplan et al., (1994, The EMBO J., 13(20):4745лоти в необхідному положенні є утворення Src4756)] у ЗРВСП-BP(A) через фрагмент Not I-Cla І, білка з необхідною активною модулюючою дією, утворений через конструкцію Src. Для одержання яка сприяє ангіогенезу. необхідних мутацій c-Src у кДНК були використані Щодо крапкових мутацій будь-яка мутація, рестандартні процедури сайт-специфічного мутагезультатом якої є необхідна інгібуюча або стимунезу, знайомі спеціалісту в цій галузі техніки з селююча активність, розглядається для використанреднім рівнем знань. Праймери ЛРП, сконструйоня у цьому винаході. Також розглядаються вані для введення необхідних мутацій, також були конструкції злитих білків, які комбінують необхідсконструйовані з сайтами рестрикції для полегний Src-білок (його мутацію або фрагмент) з ексшення наступних етапів клонування. Цілі сегменти пресованими кінцями амінокислот, антигенними кодуючих послідовностей нуклеїнової кислоти Src детермінантами, флуоресцентним білком або видаляють з конструкції нуклеїнової кислоти за будь-яким іншим білком або пептидами. якщо збедопомогою технологій ампліфікації ЛРП, засноварігається необхідний моделюючий вплив Src-білка. них на відомих послідовностях кДНК курчат, люТаблиця 1 Src/Мутація Функція Src Вплив на ангіогенез дини та подібних гомологів Src і наступному утворенні нових конструкцій. В одному варіанті реалізації цього винаходу праймер 3' ЛРП, використовуваний для ампліфікації нуклеїнових кислот Src, також кодує послідов 29 75565 30 ність у рамці. Використання цього праймера добалупі з боку, прямо протилежного повітряному мівляє кінець антигенної детермінанти 9Е10-тус до шечку, був зроблений невеличкий отвір за допомокарбоксильного кінця наступної конструкції Src. гою невеличкого промислового свердла (фірми Наступні амінокислоти були додані після амі"Дремель", підрозділу компанії "Емерсон Електнокислоти 251 Src для утворення векторних консрик", Расін, Вайомінг). Другий отвір був просвердтрукцій, що містять кінець антигенної детермінанти лений на широкій стороні яйця в ділянці, вільній 9Е10-mус: VDMEQKLIAEEDLN (ідент. № посл.: 6). від кровоносних судин ембріона, попередньо виДля кожної конструкції були проведені дві окремі значеній просвічуванням. До першого отвору був ЛРП, і були отримані подібні результати. Всі консприкладений негативний тиск, який призвів до відтрукції-мутанти, сконструйовані ЛРП, були також тягування ХАМ (хоріоналантоїсної мембрани) від упорядковані ЛРП для закріплення прогнозованої мембрани шкаралупи та створення несправжньою послідовності ДІІК клонів. Натуральні та мутовані повітряного мішечка над ХАМ. Було прорізано кДНК Src для використання в системах експресії квадратне вікно 1 1см у шкаралупі над опущеною згідно з цим винаходом також можна одержати в ХАМ з використанням невеличкого модельного "Апстейт Байотек Лебораторіз" ("Upstate Biotech точильного кола (фірми "Дремель"). Це невеличке Laboratories"), Лейк Плесід, Нью-Йорк, яка продає вікно дозволило здійснити безпосередній доступ Src птахів та людини і кілька мутованих форм з до ХАМ, що лежить нижче. мертвою кіназою та активованих форм. Утворений в результаті препарат ХАМ був виАльтернативні вектори експресії для викорискористаний або після 6 днів ембріогенезу, стадії, тання при експресії Src-білків згідно і цим винахояка характеризується активною неоваскуляризацідом також включають аденовірусні вектори, як це єю, без додаткового обробляння ХАМ, як модель [описано в патентах СШA №№4,797,368, для оцінки впливу на ембріональну неоваскуляри5,173,414, 5,436,146, 5,589,377 та 5,670,488]. Альзацію, або після 10днів ембріогенезу, коли ангіотернативні способи доставки модулюючих Srcгенез припинився. Таким чином, останній препарат білків включають доставку кДНК Src за допомогою був використаний у цьому винаході для індукуванневіру спої векторної системи, [описаної в патенті ня відновленого ангіогенезу у відповідь на обробСША №5,675,954], та доставку самої кДНК як деляння цитокіном або контакт з пухлиною, як опипротеїнизованої ДНК, [описану в патенті США сано нижче. №5,589,466]. Доставка конструкцій згідно з цим 3. Аналіз ангіогенезу ХАМ винаходом також не обмежується локальним заА. Ангіогенез, викликаний факторами росту стосуванням вірусного вектора, як описується для Було показано, що ангіогенез може бути висистеми аналізу ХАМ нижче. Наприклад, препаракликаний цитокінами або факторами росту. ти вірусних векторів також упорскують внутрішАнгіогенез був викликаний шляхом розміщенньовенним шляхом для систематичної доставки в ня пластини фільтра Ватману 5 5мм (фільтруварусло судини. Ці вектори також можуть бути спряльний папір Ватману №1), змоченої збалансовамовані на центри підвищеної неоваскуляризації ним соляним розчином Хенкса (ЗСРХ) ("ПБКО", шляхом локалізованої ін'єкції, наприклад, в пухГренд Айленд, штат Нью-Йорк) або ЗСРХ, що міслину. тить 2 мікрограма/мілілітр (мкг/мл) рекомбінантноЕкспресовані in vitro білки також розглядаютьго основного фактора росту фібробластів (оФРФ) ся для їх доставки після експреси та очищення або фактору росту судинного ендотелію (ФРСЕ) обраного Src-білка за допомогою способів, корис("Гензім", Кембридж, штат Масачусетс) на ХАМ 9них для доставки білків або поліпептидів. Один з або 10-денного ембріона курчати у ділянці, віддатаких способів включає системи доставки ліпосом, леній від кровоносних судин, і наступного запечанаприклад, такі, які були [описані в патентах США тування вікон стрічкою. Інші концентрації факторів №№4,356,167, 5,580.575, 5,542,935 та 5,643.599]. росту також ефективні для індукування зростання Інші системи доставки векторів та білків добре кровоносних судин. У спостереженнях, у яких інгівідомі спеціалістам у цій галузі техніки і середнім бування ангіогенезу оцінюється внутрішньовенним рівнем знань для використання для експресії введенням антагоністів, анпогенез спочатку індута/або доставки Src-білків згідно ї цим винаходом. кується 1-2мкг/мл оФРФ або ФРСЕ у середовищі 2. Характеризування необробленої хоріоаланросту фібробластів. Ангіогенез спостерігали за тоїсної мембрани (ХАМ) курчат допомогою фотомікроскопа через 72 годин А. Приготування ХАМ В. Ангіогенез ембріона Ангіогенез може бути стимульований в хоріоаПрепаратом ХАМ для оцінювання впливу інгілантоїсній мембрані (ХАМ) курчат після того, як біторів ангіогенезу на природне утворення нових внаслідок нормального зародкового ангіогенезу судин ембріона є 6-денний ембріон курчати, як відбулося утворення зрілих кровоносних судин. було описано вище. На цій стадії розвитку кровоБуло продемонстровано, що ангіогенез може бути носні судини проходять зростання de novo і, таким стимульований у відповідь на характерний цитокічином, забезпечують корисну систему для оцінюнез або фрагменти пухлини, як це [описано вання модулювання ангіогенезу Src-білками згідно Leibovich et al., Nature, 329:630 (1987) та Ausprunk з цим винаходом. Систему ХАМ готують так, як et al., Am. J. Pathol., 79:594 (1975). ХАМ були приописано вище, з тим винятком, що аналіз здійсготовлені з ембріонів курчат для наступного індунюють на 6-й день ембріонального розвитку, а не кування ангіогенезу та його інгібування. Десятина 9-й або 10-й день. денні ембріони курчат були отримані з 4. Модулювання ангіогенезу, виміряне у досліптахофабрики "Макінтайр" (Лейксайд, Каліфорнія), дженні ХАМ інкубувалися при 37°С та вологості 60%. У шкараДля оцінювання впливу Src-білка на ангіогенез 31 75565 32 були проведені наступні дослідження препаратів буферному розчині – прим. перекладача) та виХАМ 10-денного курчати. П'ять мкг конструкцій значені за допомогою повторного флуоресціюючоЗРВСП. приготовлених так, як описано в Прикладі го антитіла. 1, були піддані трансфекції в іморталізовану лінію А. Стимуляція ендогенного Src за допомогою фібробластів курчат DF-1 (дарунок Дуга Фостера, оФРФ та ФРСЕ Університет Мінесоти). Ця лінія клітин, а також Для оцінювання впливу факторів росту на акпервинні фібробласти ембріона курчати були тивність Src у модулюванні анпогенезу були проспроможні до утворення вірусу, проте лінія клітин ведені такі дослідження. Були розкладені екстракDF-1 утворила більші титри. Плаваючі на поверхні ти тканини ХАМ 10-денних курчат, які були піддані віруси були зняті зі злитих ліній клітин-продуцентів впливу оФРФ або ФРСЕ (2мкг/мл) протягом 2 гоDF-1 у цитозольподібному середовищі, вільному дин Ендогенний Src-білок був імунопреципітовавід сироватки [склад: основне середовище F-10, ний з еквівалентної кількості загального білка та доповнене диметилсульфоксидом. фолієвою киспідданий імунокомплексному кіназному дослілотою, глутаміновою кислотою і MEM вітамінний дженню in vitro з використанням злитого білка розчин]. Тридцять п'ять мл суспензії вірусів були ΚΦΑ-Γ-S-T як субстрату, підданий електрофорезу концентровані шляхом ультрацентрифугування та перенесений на нітроцелюлозу. при 4°С протягом 2 годин на швидкості Результати дослідження приведені на Фіг.5, на 22000об./хв. Ці концентровані вірусні гранули були якій очевидним є збільшення активності Src в збізнову суспензовані в об'ємі 1/100 від початкового льшеній густині гелю, обробленого оФРФ або об'єму цитозольподібного середовища. вільного ФРСЕ у порівнянні з необробленими (контрольнивід сироватки, розділені на аліквоти та зберігалися ми) зразками, які вказували на базову активність при температурі -80°С. Титр був оцінений серійним Src-білка у дослідженні ХАМ. Обробляння і оФРФ, розчиненням контрольного вірусного вектора, який і ФРСЕ призводить до збільшення присутньої в має нуклеотидну послідовність, що кодує зелений ХАМ ендогенної активності Src-білка приблизно в флуоресціюючий білок (ЗФБ). який називається два рази. Згадане вище кіназне дослідження бляЗРВСП-ЗФБ, зараження на первинних фібробласшки також було проведено з використанням антитах ембріона курчати, що були інкубовані протягом Src антитіла як контролю вмісту еквівалента Src та 48-72 годин. Титри вірусних ліній, які були отримаімуноглобуліну. ні після концентрації, регулярно перевищували 108 B. Вплив ретровірусної генної експресії Src А міжнародних одиниць на мл. Для дослідження на ангіогенез ХАМ курчат ХАМ з використанням вірусних ліній були підготоНаступне дослідження було проведено для влені протягом 30 хвилин у 3мг/мл ацетату кортиоцінювання впливу видозмінених Src-білків на анзону в 95% етанолу фільтрувальні пластини Ватгіогенез в препараті ХАМ. Для цього дослідження ману діаметром 6мм. змочені ацетатом кортизону. ХАМ 9-денних курчат були піддані впливу ЗРВСППластини були висушені у витяжній шафі з ламіSrc А або ЗРВСП-ЗФБ, що експресують ретровірунарним потоком, а потім вимочені протягом 10 си, або буфера протягом 72 годин після описаної хвилин у 20мл вірусної лінії на кожну пластину. Ці вище процедури. пластини були притиснуті до ХАМ 9- або 10Результати цього дослідження приведені на денних ембріонів курчат і запечатані целофаноФіг.6А, у якому рівень ангіогенезу був визначений вою стрічкою та інкубовані при 37°С протягом 18так, як було описано вище. Характерні мікрофото24 годин. Потім у концентрації 5мкг/мл до ХАМ в знімки (з чотириразовим збільшенням) були зробоб'ємі 20мкл відповідної вірусної лінії добавляли лені стереомікроскопом, як показано на Фіг.6В. контрольний фосфатний буферний розчин (ФБР) Основна лінія активності ендогенного Src має ангіабо фактори росту як додаткову підтримку вірусу в огенний показник приблизно 50. Навпаки, ХАМ. тканині ХАМ. Після 72 годин ХАМ були зібрані та оброблені експресованим ретровірусним вектором перевірені на предмет зміни ангіогенного показниЗРВСП-Src А, який має крапкову мутацію у позиції ка, як визначено подвійним сліпим перерахову527 амінокислотного залишку від тирозину до феванням числа точок розгалуження в ХАМ, розтанілаланіну, що призвело до підвищення (індукушованій під пластиною. Для кіназних досліджень вання) ангіогенного показника ангіогенезу приблитканина, розташована під пластиною, була зібрана зно до 90. Підвищення ангіогенезу, викликаного для радіоімунопреципітаційного аналізу (РІПА), Src-A, також можна бачити на фотографіях, покагомогенізована на моторизованому млині та Srcзаних на Фіг.6В. імунопрециштовані з еквівалентної кількості всього C. Ретровірусна експресія Src А активує субілка та піддана кіназному дослідженню in vitro з динне активоване мітогеном протеїнкінази (АМП) використанням злитого білка кінази з фокальною фосфорилування адгезією та глутатіон-S-трансферази (ΚΦΑ-Γ-S-T) Вплив Src А в порівнянні з фактором росту як субстрату. Для імунофлуоресцентного вивчення ФРСЕ та ФМА на судинне AMΠ фосфорилування тканина ХАМ. яка знаходилася під пластинами, також було оцінено після процедур дослідження, була заморожена в кріоконсерванті ОСТ, розділеописаних вище у цьому описі. Екстракти тканин на по 4мкм зафіксована в ацетоні протягом 1 хвиХАМ 10-денного курчати, піддані впливу ВЭФР або лина, інкубована в 3% звичайній козячій сироватці ФМА (другий мітоген у порівняній концентрації) протягом 1 години, після чого інкубована в перпротягом 30 хвилин, порівнювалися з екстрактами винному антифосфорильованому антитпі ПРСК тканин, які зараджувалися ретровірусом, що екс(позаклітинної регульованої сигналом кінази) кропресує Src-A, протягом 48 годин. Потім Src був ля, як було описано вище [ЕІїсеїп et al., J. Cell Biol., імунопреципітований з еквівалентної кількості за140:1255-1263 (1998)], відмиті у ФБР (фосфатному гального екстракту білка та підданий імунокомпле 33 75565 34 ксному кіназному дослідженню in vitro з викорисУ цьому винаході розглядаються застосування танням злитого білка ΚΦΑ-Γ-S-T як субстрату, підSrc-білків згідно з цим винаходом в інших моделях дані електрофорезу та перенесені на нітроцелюангіогенезу, описаних нижче у Прикладах. лозу. 5. Регресія зростання тканин пухлини модуляРезультати цього дослідження приведені на торами Src, виміряна шляхом аналізу моделі ока Фіг.7А, де необроблені ХАМ (ВЛ) проявляли фоскролика in vivo форилування судинної АМП кінази за допомогою Вплив модуляторів Src на ангіогенез, стимуендогенного Src основної лінії. І ФРСЕ, і ФМА прильований фактором росту, можна спостерігати в зводять приблизно до дворазового збільшення у природних прозорих структурах, прикладом яких є порівнянні з основною лінією. Навпаки, Src-A підроговиця ока. Нові кровоносні судини ростуть від вищував активність приблизно у від 5 до 10 разів у ободка роговиці, до якого йде велика притока кропорівнянні з необробленими зразками. ві, до центру роговиці, до якого звичайно притоки Аліквоти вищезгаданих лізатів цілих тканин такрові немає. Стимулятори ангіогенезу наприклад, кож були виміряні для ендогенного фосфорилуоФРФ, при застосуванні до роговиці викликають вання ПРСК шляхом імуноблотингу антифосфозростання нових кровоносних судин від ободка ПРСК антитілом, як показано на Фіг.7В. Для цього роговиці. Антагоністи ангіогенезу при застосуванні оцінювання ХАМ 10-денних курчат інфікували кондо роговиці інгібують зростання нових кровоносних трольними ЗРВСП або ЗРВСП, які експресували судин від ободка роговиці. Таким чином, у роговиці Src А. Через два дні ХАМ препарували, піддали відбувається ангіогенез за допомогою проникнензаморожуванню в ОСТ та розрізали на частини ня ендотеліальних клітин від ободка роговиці до 4мкм. Частини офарбили з використанням імунної жорсткої колагенової тканини роговиці, що можна мітки антифосфорилованим антитілом ПРСК добре бачити. Аналіз моделі ока кролика, отже, ("Нью Інгліш Байолабз"), промили та розпізнали за дає модель in vivo для прямого спостереження за допомогою протикролячого кон'югованого з ФІТЦ стимулюванням та інгібуванням ангіогенезу після вторинного антитіла цапа. Флуоресцентні образи введення сполук безпосередньо до роговиці ока. були зафіксовані камерою на охолоджуваних приА. Аналіз моделі ока кролика in vivo борах з зарядовим зв'язком (фірми "Прінстон Ін1) Ангіогенез, стимульований факторами росту ст."). На мікрофотознімках показана підвищена Ангіогенез стимулюється в аналізі моделі ока імунофлуоресценція препаратами, обробленими кролика in vivo факторами росту оФРФ або ФРСЕ Src А, у порівнянні з контрольними препаратами. та описується у наступних розділах. D. Вибіркові вимоги до активності Src під час а) Готування таблеток гідрону, що містять фаангіогенезу, викликаного ВФРЕК, а не оФРФ ктор росту та моноклонові антитіла Для оцінювання впливу модулюючої активносТаблетки полімеру гідрон, які містять фактор ті Src на стимульований фактором росту ангіогеросту, готують так, як це було [описано D'Amato et нез були зроблені такі аналізи. ХАМ дев'ятиденних al., Proc. Natl. Acad. Sci., США, 91:4082-4085 курчат піддали впливу ретровірусного векторного (1994)]. Окремі таблетки містять 650нг факторів препарату, який здійснював експресію домінуючої росту, по окремості пов'язаних з сукральфатом негативної мутації Src, називаної Src 251 або Src (компанії "Марафет, Марион Меррелл Доу КорпоK295M, як було описано вище. Ретровіруси рейшн") для стабілізації фактора росту та забезЗРВСП-Src 251 або контрольні ЗРВСП-ЗФБ або печення його повільного звільнення до навколишбуферні ХАМ обробляли протягом 20 годин, а поньої тканини. Крім того, таблетки гідрону готують із тім інкубували ще протягом 72 годин при наявності вмістом необхідного ретровірусу, що експресує або відсутності оФРФ або ВФРЕК. Src, як було описано вище. Таблетки відливають у Рівень ангіогенезу, виміряний так, як було спеціально виготовлених тефлонових стрижнях, описано вище, показаний на Фіг.8А Репрезентатиякі мають просвердлену в поверхні серцевину в вні мікрофотознімки (з шестиразовим збільшен2,5мм. Приблизно 12мкл матеріалу для виливки ням), показані на Фіг.8В. були зроблені за допомопоміщають у кожний стрижень і полімеризують гою стереомікроскопа. На Фіг.8С показана пляма, протягом ночі в стерильному ковпаку. Потім табзондована анти-Src антитілом для підтвердження летки стерилізують ультрафіолетовим випромінюекспресії Src 251 у трансфекцірованих клітинах у ванням. Вплив Src-білків потім оцінюють так, як це порівнянні з контрольним оброблянням. було описано вище. Результати аналізу, описаного вище, вказують 6. Регресія in vivo зростання тканин пухлин на те, що як ХАМ, оброблені оФРФ. так і ХАМ, обмодуляторами Sic, виміряна шляхом аналізу хироблені ФРСЕ при контрольних ЗРВСП-ЗФБ стимери миша/людина мулювали ангіогенез у порівнянні з викликаним Src Модель химерної миші/людини in vivo утвобазовим ангіогенезом, який спостерігався в контрюють шляхом заміщення частини шкіри миші рольних або необроблених препаратах ХАМ. ЕксМТКІ (миші з тяжким комбінованим імунодефіципресований домінантний негативний мутант Src том - прим, перекладача) крайньою плоттю ново251 був ефективний при інгібуванні викликаного народжених. Модель химерної миші/людини in vivo ФРСЕ ангіогенезу до базових рівнів, але не ефекготують в основному так, як це [описано Yan et al., тивний при інгібуванні ангіогенезу, викликаного J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993)]. Якщо описати це оФРФ. Мікрофотознімки, показані на ФІГ.8В, наочстисло, то у миші МТКІ (6-8-тижневого віку) видано підтверджують дані, показані на Фіг.8А. Таким ляють хірургічним шляхом шматочок шкіри 2см2 і чином, ретровірусно експресований Src 251 є ефезаміщають його крайньою плоттю людини. Мишу ктивним інгібітором ангіогенезу, коли ангіогенез знеболюють, і з кожної сторони бічної абдомінальвикликаний ФРСЕ. ної області на ділянці 5см2 збривають шерсть. Два 35 75565 36 круглих прошарки для прищеплювання розміром шляхом використання ретровірусу ЗРВСП, харак2см2 готують шляхом видалення шкіри на всю тотерного для птахів. вщину аж до фасції. Шматочки шкіри для прищепНа Фіг.9 зображені результати, які вказують на лювання повної товщини такого ж розміру, отрите, що ретровірусна доставка ЗРВСП-Src 251 у мані з крайньої плоті новонароджених, поміщають людські пухлини, які зростають на ХАМ курчат, на місця ран і пришивають на це місце. Пересаперетворює зростання пухлини на її регресію. На джену тканину накривають пов'язкою "Бенд-Ейд" Фіг.9А показані медулобластоми людини, які були ("Band-Aid"), яку пришивають до шкіри. На рану вирощені на ХАМ ембріонів курчат, як це було також накладають мікропористу тканинну стрічку. описано вище. Ретровірус, який містить ЗРВСПДля утворення твердих пухлин людини на пеЗФБ або ЗРВСП-Src 251, місцево застосовували ресадженій мишам МТКІ людській шкірі викорисдо попередньо утворених пухлин, вага яких не товують лінію клітин меланоми людини M21-L або перевищувала 50мг. На репрезентативному міклінію клітин раку грудей MDA 23.1 (Американська рофотознімку фрагмента пухлини медулобластоколекція типових культур, Банк пухлин людини, 26, ми, інфікованого ЗРВСП-ЗФБ, що експресує ЗФБ, αΝβ3, негативні у відношенні імунореактивності показана вся експресія в кровоносних судинах частин тканин mAb LM609). Однократну клітинну пухлин (розмірна стрілка), визначена шляхом оптичного пошарового аналізу конфокальним сканусуспензію 5 106 клітин M21-L або MDA 23.1 упорсвальним лазерним мікроскопом "Bio Rad" ("Bio кують підшкірним шляхом у пересаджену шкіру Rad") (смуга =500мкм). На Фіг.9В показані резульлюдини. Потім у мишей протягом 2-4 тижнів спотати описаного вище лікування пухлин, яким достерігали зростання вимірних людських пухлин. зволили зростати протягом 3 або 6 днів, після їхПісля утворення вимірної пухлини у вену в ньої резекції та вимірювання вологої ваги. Дані хвості миші вводили ретровірусні препарати згідно виражені як середня зміна ваги пухлини (у порівз цим винаходом або ФБР. Через 2-3 тижні пухлинянні з початковою вагою пухлини 50мг) +/- СЗП 2 ну вирізали та проаналізували за вагою та гістолореплікатів. ЗРВСП-Src 251 мав значний вплив на гією. Потім оцінили вплив експресованих Src-білків зростання пухлини через 3 дня (*, Р