Спосіб потенціювання індукції диференціювання мезенхімальних стовбурових клітин in vitro за остеогенним напрямком

Реферат: Спосіб потенціювання індукції диференціювання мезенхімальних стовбурових клітин in vitro за остеогенним напрямком включає культивування МСК у остеогенному середовищі при 37 °C в 5 % атмосфері СО2. Перед додаванням остеогенного середовища проводять сумісне культивування МСК тимусу з тимоцитами протягом однієї доби з подальшим їх вилученням з культури. UA 106592 U (12) UA 106592 U UA 106592 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології та медицини, зокрема клітинної біології, імунології і може бути застосована для моделювання клітинних взаємодій мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) та гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК) з метою дослідження їх функціонального зв'язку в тимусних нішах та на периферії, в лабораторіях клітинного та тканинного культивування, ортопедичній медичній практиці та фармакології. Відомий спосіб біологічної стимуляції остеогенного диференціювання стовбурових клітин, який полягає у виконанні експлантації ділянки малогомілкової кістки з окістям, виділенні з біоптату прогеніторних клітин окістя з подальшим їх культивуванням у чашці Петрі до субконфлуентної культури. Культивовані МСК та культивовані прогеніторні клітини окістя об'єднують у один культуральний флакон у співвідношенні 3:1 та культивують у поживному середовищі протягом не менше двох тижнів зі зміною поживного середовища кожну третю добу (с, МПК C12N 5/00; заявл. 09.06.2009; опубл. 10.12.2009). Проте, в даному випадку використовують клітини з іншого джерела, сумісне культивування клітин забезпечує саме індукцію остеогенного диференціювання, тоді як в нашому способі клітинна взаємодія виступає додатковим стимулом при подальшій індукції, тобто забезпечує потенціювання МСК. Прототипом нашого способу вибрано метод індукції остеогенного диференціювання МСК, котрий полягає у культивуванні клітин в середовищі, що містить DMEM/F12 з додаванням 10 % ембріональної телячої сироватки (ETC), 10 мМ L-глютаміну, та остеогенного домішку: 50 мкг/мл L-аскорбінової кислоти, 10 мМ β-гліцерофосфату, 0,1 мкМ дексаметазону та по 100 МО/мл пеніциліну та стрептоміцину (далі остеогенне середовище) в СО 2-інкубаторі при 37 °C і 5 % СО2. [Prockop D.J. Mesenchymal stem cells: methods and protocols / DJ. Prockop, D.G. Phinney, B.A. Bunnell. - Totowa, NJ: Humana Press, 2008. - 192 p.]. Недоліками прототипу є низька швидкість процесу диференціювання, що ускладнює накопичення клітин, тоді як для створення препаратів необхідно мати якомога більше клітин, що продукують матрикс. В основу даної корисної моделі поставлена задача розробити спосіб потенціювання індукції диференціювання мезенхімальних стовбурових клітин in vitro за остеогенним напрямком, шляхом сумісного культивування клітин з тимоцитами, що дозволить змоделювати близький до фізіологічного процес взаємодії МСК і ГСК для вивчення його впливу на функціонування досліджуваних клітин та пришвидшити накопичення необхідної кількості остеобластів для подальшого використання. Поставлена задача вирішується тим, що в способі, який полягає в культивуванні МСК у остеогенному середовищі при 37 °C в 5 % атмосфері СО2, згідно з даною корисною моделлю, перед додаванням остеогенного середовища проводять сумісне культивування МСК тимусу (МСКт) з тимоцитами протягом однієї доби з подальшим їх вилученням з культури для потенціювання індукції диференціювання МСКт. До даного рішення автори прийшли досліджуючи як лінійне диференціювання МСКт, так і контактну взаємодію МСК та ГСК. Так, доведено, що сумісне культивування з тимоцитами в безпосередньому контакті протягом 24 годин потенціює лінійне диференціювання МСК за остеогенним напрямком, пришвидшуючи накопичення необхідної кількості остеобластів. Спосіб виконується наступним чином. МСКт отримують з тимусу мишей лінії C57BL методом експлантатів. Для нарощування клітини культивують в середовищі DMEM / F12 (1:1) з додаванням 10 % ETC, 10 мМ L-глутаміну (майже всі реактиви тут і далі - Sigma, США) і по 100 ОД/мл пеніциліну і стрептоміцину при 37 °C в 5 % атмосфері СО2. Потенціювання індукції диференціювання МСКт за остеогенним напрямком проводять їх сумісним культивуванням з тимоцитами. Для цього на 8-12 пасажі МСКт вносять в лунки 244 6 лункового планшету по 4×10 . Через добу до утвореного моношару вносять тимоцити (10 на лунку) мишей лінії C57BL, які видаляють через добу. Ще через добу до МСКт додають остегенне диференціювальне середовище: DMEM/F12 з додаванням 10 % ембріональної телячої сироватки (ETC), 10 мМ L-глютаміну, та остеогенного домішку: 50 мкг/мл L-аскорбінової кислоти, 10 мМ β-гліцерофосфату, 0,1 мкМ дексаметазону та по 100 МО/мл пеніциліну та стрептоміцину. Контролем використовують культури з поживним середовищем або остеогенним середовищем, до яких тимоцити не вносили. Через 10 днів культури МСКт фарбують 1 % алізариновим червоним на солі кальцію. Стан культур оцінюють морфологічно. Для кількісної оцінки інтенсивності процесів диференціювання МСКт барвники екстрагують 10 % розчином оцтової кислоти. Оптичну густину розчинів вимірюють при 520 нм в 200 мкл в лунках 96лулкового планшету. Далі наведено в таблиці: 1 UA 106592 U МСКт в середовищі Статистичні показники поживному Μ 0,022 ±m 0,003 n 5 min 0,018 max 0,034 p(t) p(t) p(t) 5 10 15 20 остеогенному 0,344 0,013 6 0,299 0,384