Спосіб виявлення бактерій роду erysipelothrix, виду erysipelothrix rhusiopathiae у біоптатах або патологічному матеріалі, або кормах, або об’єктах зовнішнього середовища

Спосіб виявлення бактерій роду Erysipelothrix, виду Erysipelothrix rhusiopathiae в біоптатах або Корисна модель відноситься до ветеринарної медицини, зокрема ветеринарної бактеріології, і може бути використана для виготовлення інактивованих бактеріальних вакцин та концентратів інактивованих бактеріальних вакцин проти бактеріальних хвороб тварин. Бактерія роду Erysipelothrix, виду Erysipelothrix rhusiopathiae є збудником інфекційної хвороби бешихи, яка характеризується при гострому перебігу - серцемією та загальною еритемою шкіри, а при хронічному - ендокардитом та артритами. Бешисі властиві сезонність, стаціонарність, ензоотичність прояву. Збудник бешихи досить поширений в природі і протягом останніх років кількість випадків, що реєструються, змінюється незначно. Лабораторна діагностика бактерій бешихи, з моменту посіву дослідного матеріалу на живильні середовища і закінчуючи визначенням їх культуральних, серологічних та біохімічних властивостей триває близько 4 днів. В зв'язку з цим звертає на себе увагу розробка більш ефективного і швидкого методу детекції збудника, В основу корисної моделі, що представлена, поставлено задачу, використовуючи метод полі патологічному матеріалі, або кормах, або об'єктах зовнішнього середовища, що включає виявлення в досліджуваних зразках специфічних фрагментів нуклеїнових кислот за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовують штучно синтезовані олігонуклеотидні праймери з наступною послідовністю нуклеотидів: ER 1-5' - CGATTATATTCTTAGCACGCAACG-31 ER 2-5' - TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACT-3'. меразної ланцюгової реакції, створити новий спосіб виявлення бактерій роду Erysipelothrix, виду Erysipelothrix rhusiopathiae у патологічному матеріалі, кормах або об'єктах зовнішнього середовища, який дозволить швидко та ефективно виявляти бактерії бешихи. Принцип методу полімеразної ланцюгової1 реакції був розроблений американським біохіміком фірми "Cetus" Кєри Мюллісом [Mullis K.B., Falona F.A., Scharf S. et al. // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. - New York, 1986. - P.263273]. Правильний вибір олігонуклеотидних праймерів визначає ефективність і відтворюваність полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Поставлена задача досягається тим, що в досліджуваних зразках виявляємо специфічні фрагменти нуклеїнових кислот (ДНК) за допомогою полімеразної ланцюгової реакції-ПЛР - ферментативної реакції і двох штучно синтезованих олігонуклеотидів (праймерів), які дозволяють багаторазово копіювати специфічні ділянки ДНК інфекційних агентів при температурних і часових параметрах та кількості циклів; табл. CO CO 10834 Таблиця № циклу 1 2 3 4 5 Температура Час 94°С 94°С 52°С 72°С 94°С 50°С 72°С 72°С 10°С 4хв 1хв 1хв 1хв 0,5хв 0,5хв 0,5хв 5хв Зберігання Кількість ЦИКЛІВ 1 5 35 1 Праймери мають послідовність: ER 1-5' - CGATTATATTCTTAGCACGCAACG-3' ER 2-5' - TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACT - З' Приклад Пробу (біоптат шкіри людини або тварини, або суглобову рідину, або біомасу, або гомогенат патологічного матеріалу, або корм, тощо) в кількості 1 гр помішують у пластикову пробірку ємністю 1,5мл і додають 500мкл дистильованої води. Су Комп'ютерна верстка А. Рябко міш зтрушують і центрифугують, після чого проводять виділення ДНК набором реагентів для виділення ДНК. Отриману чисту ДНК (3-5мкл) помішують у пробірку ємністю 0,5мл і додають 15мкл ПЦР-буфера, 2,5мкл dNTP, по 2,5мкл праймерів, 0,25мкл Tag-полімерази та 1 краплю мінерального масла. Вміст пробірки струшують і центрифугують, а потім переносять в термоциклер з активною регуляцією температури, наприклад 'Терцик" (Росія), якому задають вищевказану програму. Аналіз результату ПЛР проводять в 1,5%-ному гелі агарози з барвником - бромистим етщієм. В лунки агарозного геля вносять 10-12мкл ампліфікованої суміші. Після проведення електрофорезу фрагменти ДНК згруповуються в смужки, які виявляють флуоресцентно при опроміненні ультрафіолетом. Результат ПЛР може бути оцінений візуально по наявності смужок, що відповідають продуктам реакції. Промислове застосування - для виявлення бактерій роду Erysipelothrix, виду Erysipelothrix rhusiopathiae в бюптатах, патологічному матеріалі, кормах, об'єктах зовнішнього середовища, тощо. Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601