Спосіб одержання антипротейної плазми

ДЛЯ СЛУЖЕБНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ ЭКЗ № я г4 л л Г СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК 1536980 А1 (51)5 G 01 N 33/531 . ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬГГИЯМ ПРИ ГННТ СССР к (21) 4234420/28-14 (22) 24.04.87 .1 "" L '(71) Киевский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови и Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных болезней (72) Л.В.Назарчук, С.И.Бидненко, Е.А'.Федоровская, О.Ь.Лютко и Л.В.Опенько (53) 615.373(088.8) (56) Левина Л.А. и др. Превентивные свойства сывороток крови людей, вакцинированных протейной вакциной из растворимых антигенных комплексов. Микробиология, эпидемиология и иммунология, 1986, К 4, с. 84-87. * Изобретение относится к медицине и может быть использовано в трансфуэиологии. Цель изобретения - упрощение способа, расширение диапазона получаемых ' антител и повышение стабильности целевого продукта. Способ осуществляется следующим образом. У донора забирают кровь, отделяют пробу объемом 3-5 мл, отделяют сыворотку , которую исследуют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) микроме тод ом, применяя НО-поливалентный протейный эритроцитсфный диагностикум . Диагностикум для РПГА готовят из формалинизированиых и типизированных 2-90 **•* С54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИПРОТЕЙНОЙ ПЛАЗМЫ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано в трансфузиологии. Цель - упрощение способа, расширение дилпазона получаемых антител, повышение стабильности целевого продукта. Способ осуществляют, получая плазму неиммуниэированных доноров, которую скринируют на наличие антипротеинных антител, относящихся к IgG, используя НО-эритроцитарный поливалентный протейный диагностикум. Целевой продукт лиофилиэируют. Полученный продукт обладает стабильными свойствами в течение 5-6 лет и большим диапазоном содержащихся антител. Использование полученной предлагаемым способом плазмы имеет выраженный клинический антипротейный эффект. обычным способом эритроцитов барана, сенсибилизированных поливалентным протейным антигеном из расчета 0,080,1 мг лиофилизированного или 0,1 мл' жидкого антигена на 1 мл 3%-ной взвеси эритроцитов барана в фосфат— но-буферном растворе натрия хлорида і с рН 6,4. Поливалентный протейный антиген ' готовят из высокоподвижных культур P.mirabilis, принадлежащих к сероварам 03:Н1, 033:Н2, О6:НЗ. При таком подборе штаммов И—антигены, включенные в препарат, позволяют регистрировать в сыворотке крови антитела к 42 наиболее часто встречающимся Серова— Ирам P.mirabilis и P.vulgaris, состав'ляющим " 1 % от всех сероваров протеев, О) СО 00 1536980 при 4°С в стеклянной посуде под новой пробкой. Срок сохранения не менее 1 года. В микрометоде РИГА используют диагностикум ex temporae, разведенный таким же раствором до 1%—Й концентрации эритроцитов. Выявляемые диагностикумом Н-антитела в гипериммунных кроличьих сыворотках и в сыворотках экспериментально зараженных животных с 7-8 дня принадлежат к иммуноглобулинам класса G, что доказано результатами исследования сывороток в динамике наблюдения от 2-3 дня до 3 месяцев с помощью "фракционирования их на сефадексе , пробы с цистеином, реакции Манчини с антииммуноглобулиновыми коммерческими сыворотками. Отбор серий крови, пригодных для получения целевого продукта, производят скрннированием антипротейных антител в образцах сывороток крови одноразовых доноров крови, не иммунизированных активно каким-либо бактериальОзвученную взвесь центрифугируют ным -антигеном, в РИГА с помощью придважды при 5-6 тыс. об/мни по 30 мин готовленного диагностикума. Выбор для удаления бактериальных клеток и данного контингента доноров обоснован их обломков. Полученные из трех штамрезультатами предварительно проведенмов экстракты соединяют в равных ного сравнительного исследования по объемах, перемешивают и используют 30 выявлению антипротейных антител в сыдля сенсибилизации эритроцитов в раворотках одноразовых доноров и донобочей дозе. Поливалентный антиген выров, иммунизированных стафилококковым являет в гомологичных по Н-антигену анатоксином, показавшими, что повышенгипериммунных кроличьих сыворотках ные уровни (>1:80) антипротейных анантитела в РИГА в титрах 1:20400-1: тител в крови одноразовых доноров, :40960. Активность антигена сохраняособенно с 0(1), В ( И 1 ) и А(11) групется до 6 мес. при содержании в замопами крови, обнаруживаются в 1,5-2 рароженном виде и более 4-5 лет в лиофиза чаще и в более высоких титрах, чем лизированной форме, полученной с поу неиммунизированных доноров. При этом мощью сублимационной установки при подогреве препарата до 38 С в тече- 40 антипротейные антитела принадлежат преимущественно к классу G, о чем свиние 48 ч. детельствуют результаты пробы с цисФормалинизированные тонизированные теином, полученные на 143 образцах эритроциты барана (3%-ная взвесь) сывороток крови доноров (средний титр сенсибилизируют поливалентным анти45 до обработки 1:187» после обработки геном в фосфатно-буферном растворе 1:161). NaCl (pH 6,4) на водяной бане при в Из серий крови с уровнем антипро45 С в течение 1 ч, перемешивая . тейных антител У/ 1:180 выделяют плазму взвесь каждые 15 мин. За 15 мин до и подвергают лиофилизации общеприняокончания сенсибилизации добавляют 50 тым способом. Активность лиофилиэироформальдегид до 1%-ной концентрации. ванной плазмы по сравнению со свежеПосле сенсибилизации эритроциты 3заготовленной не снижается в процессе 4 раза отмывают 0,4-0,5%—ным раствохранения в течение 2 лет (срок наблюром нормальной кроличьей сыворотки дения) , что свидетельствует о высокой в 0,85%-ном растворе NaCl, центрифу55 стабильности препарата. гируя 10 мин при 1 тыс. об/мин. ДиагП р и м е р. Готовят поливалентный ностикум сохраняют в виде 3%-ной выделяемых от людей. Бактериальную массу каждого из 3 штаммов выращивают на свежеприготовленном 2%—ном мясопептонном агаре 18-20 ч при 37 С н затем до 24 ч при 20-22°С, что обеспечивает максимальное развитие жгутиков. Массу смывают с пгара 0,85%-ным раствЪром NaCl, однократно промывают этим же раствором, центрифугируя при 10 5-6 тыс. об/мнн в течение 30 мин. Готовят взвесь клеток из расчета 50мг влажной массы в 1 мл такого же раствора. Взвесь обрабатывают ультразвуком в аппарате при частоте 44 кГц, 2 15 мощности на выходе 200 Вт/см и 15а 18 С в течение 3-4 мин. Щадящая обработка ультразвуком позволяет одновременно извлекать в жидкую фазу мини мально травмированные Н- и 0-антигенные компоненты и обеспечивает необходимое их количество в препарате с превалированием Н-антигенного компонента . взвеси эритроцитов в таком же растворе с добавлением формальдегида до 12 НО-протейный эритроцитарный диагностикум. Образцы сывороток крови неим 1536980 мунизированных доноров А,В и С развоПри экспериментальной генерализодят 0,85%-ным раствором натрия хлорианной протейной инфекции белых мыда 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320 в ей плазма проявляет лротективную микротнтраторе (типа Такачи) в объеме , эффективность, характеризующуюся 0,05 мл. В каждое разведение сыворотиндексами 3,3 - 6,0. ки добавляют 0,025 мл НО-диагностикуПредлагаемый способ позволяет по!ма П-ной концентрации. Контролем слулучить плазму крови с титрами антител жат параллельные разведения сыворот1:80-1:320, которые выявляются у эдоки 1:20 и 1:40 с добавлением несенси- (0 ровых взрослых (неиммунизированных доноров) 5-6 - 20% от их общего числа, билизированных формалинизировэнных эритроцитов той же серии. Результаты і позволяет получить стабильный препареакции учитывают через 2-3 ч экспорат в течение Ь-6 лет. зиции при комнатной температуре (предИспользование целевого продукта, варительно) и через Ь-6 ч (оконча5 полученного предлагаемым способом тельно) . В сыворотке крови донора А в клинических условиях, оказывает уровень выявленных антипротейных выраженное антипротейное действие. антител составляет 1:160, донора В 1:80 и донора С 1:40. Плазму крови Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я доноров А и В подвергают лиофильному 20 высушиванию и используют в лечении Способ получения антипротейной 1 больных как препарат антилротейной плазмы путем забора крови у доноров, направленности. выделения плазмы, тестирования специ** Р фическим эритроцитарным диагностикуПредлагаемый способ более прост по сравнению с известным, позволяет полу-25 мом, выявления специфических антител чить антипротейную плазму сухой фори отбора образцов плазмы, о т л имы, характеризующуюся уровнем анти— ч а ю щ и й с я тем, что, с целью протейных антител 1:80-1:320 расшиупрощения способа, расширения диапарениого антигенного диапазона за счет г зона получаемых антител и повышения содержания Н-антител против 81% всех зО/стабильности целевого продукта, исклинически значимых сероваров P.roira*~ --~^ пользуют плазму неиммунизированных bills и P.vulgaris, а также характеризуюіцуюся преимущественным содержанием IgG. Содержание основных классов иммуно35 глобулинов в сухой антипротейной Іплазме приведено в таблице. Количество обследованных образцов доноров, при этом тестирование плазмы осуществляют НО-эритроцитарным протейным поливалентным диагностикумом и при выявлении антител, относящихся к IgG, осуществляют отбор плазмы и лиофильное высушивание. Показатели (Him), г/л IgG IgA IgM ±0,45 2,72± + 0,17 1,81 і 0,07