Фотополімеризаційна колагенова композиція на основі метиленбісакриламіду

Фотополімеризаційна колагенова композиція на основі метиленбісакриламіду, що містить колаген, триетаноламін і метиленовий блакитний, яка відрізняється тим, що містить метиленбісакриламід формули: 2 3 метиленбісакриламід відіграє роль реакційно здатної сполуки, яку можна використати як активний мономер. Оскільки однією з найважливіших стадій старіння сполучної тканини є процес утворення зшивок внаслідок виникнення подвійних активних зв'язків С=С , які моделюються через поглинання колагеном шкіри акриламіду, то слід з'ясувати кінетичні закономірності цих процесів для визначення оптимальних умов проведення експерименту, а також активність структуру вального агенту. Останнє можна з'ясувати у зіставленні молекулярних параметрів створеної системи. Найбільш важливими характеристиками колагену у структуруванні є спектральні показники, які визначаються морфологічними особливостями об'єкта і специфічністю фотобіохімічних реакцій. Суть корисної моделі пояснюється конкретними прикладами виконання. Приклад. Заявлену композицію одержували наступним чином. Першочергова стадія отримання матеріалу зводилася до приготування колагенових шарів і нанесення їх на скляні основи. Фотополімеризаційна колагенова композиція, що містить колаген, триетаноламін і метиленовий блакитний згідно з винаходом, як структурувальний агент вводять метиленбісакриламід формули при такому співвідношенні компонентів: водний розчину колагену (масова частка 14%) триетаноламін (масова частка 0,01%) метиленовий блакитний (масова частка 0,0001%) метиленбісакриламід (масова частка 0,01%) Для цього наважку колагену (14,0г) поміщали у хімічний стакан і додавали 95мл води. Суміш набухала протягом 24год. Після цього склянку з розчином переносили у термостат і інкубували 2год при 70°С, постійно помішуючи. Потім гарячий розчин фільтрували через фільтр Шотта у колбу Бунзена під вакуумом водоструменевого насосу. Для видалення бульбашок повітря розчин витримували в термостаті впродовж 12год, охолоджували до 40°С і за допомогою устаткування (фігура 1) отримували плівки на скляних основах "методом витягування". Розчин колагену (1) у склянці переносили в термостат (Т), нагрівали до 40°С. Скляні основи (2) закріплювали на фіксуючому устаткуванні (3), яке підвішувалося на капроновому шнурі (4) через блок (5). Піднімальний механізм складався з електромотора (М), редуктора (Р) і барабана (Б). Для нивілювання вібрацій з метою отримання однорідних шарів усі елементи встановлювали і монтували на масивній металевій плиті (6), яка лежить на основі з поліуретану. Скляні основи очищували в насиченому розчині Na2CО3, промивали водою, витримували в хромовій суміші, знову промивали у воді, етанолі, сушили у боксі. Оброблені таким чином основи закріплювали попарно (3) занурювали у розчин колагену, 28652 4 нагрітого до 40°С і через 5хв їх виймали, при цьому на поверхні скла залишався рівномірний шар колагену товщиною близько 20мкм. Плівки витримували в боксі одну добу до висушування, після чого піддавали термічному твердінню в сушильній шафі протягом 15-20хв, при 150°С. Наступний синтез сполучнотканинних середовищ являв собою трьохстадійну хімічну обробку термічно отверділих колагенових плівок. Спочатку основи з плівками занурювали в розчин метиленбісакриламіду і витримували у термостаті при 40°С протягом 20хв. Після такої обробки плівки занурювали у водний розчин метиленового блакитного на 30 - 40 с і у водний розчин триетаноламіну на 1-2хв. Після видалення крапель розчину (приблизно через 15хв) комплексне біополімерне середовище готове до лазерохімічного структурування. Для генерації лазерного опромінення використовувалось устаткування, в якому джерелом був гелій-неоновий лазер (1) з l = 633нмі потужністю 10-3 Вт. Екстракцію колагену І типу зі шкіри людини здійснювали за методом, запропонованим Strom [1]. Нативну шкіру відсепаровували від підшкірної клітковини і відмивали дистильованою водою до чистих промивних вод. Матеріал вносили у 0,1 Μ розчин оцтової кислоти (300мл на 1г матеріалу) і залишали при постійному перемішуванні на 48год при 4°С. Суспензію відфільтровували на скляному фільтрі, а фільтрат розводили бідистильованою водою до об'єму 6,0 літрів. Залишки оцтової кислоти видаляли за допомогою роторного випарювача протягом 48год. Висушування проводили у чашках Петрі при 37°С до постійної маси. Композицію готували на основі 14%-го водного розчину колагену (масова частка 14%) з додаванням триетаноламіну (масова частка 0,01%), метиленового блакитного (масова частка 0,0001%), а також метиленбісакриламіду - масова частка 0,01%. У діапазоні 400-4000см-1 ІЧ-спектри знімали на спектрофотометрах Nexus 470 фірми "Nicolet" (США) та Pye-Unicam SP3-300 (США) в діапазоні 200-600см-1. Для генерації лазерного опромінення використовували устаткування, в якому джерелом був гелій-неоновий лазер (1) з λ=633нм і потужністю 10-3 Вт. Для вивчення процесів фотобіохімічних реакцій окремо знімалися ІЧспектри метиленбісакриламіду, співвідношення частот якого наведено в таблиці. 5 Вивчення ІЧ-спектрів дозволило дослідити процес поглинання колагеновими біоматрицями метиленбісакриламіду при обробці перших розчином активного мономера (масова частка 1%) протягом 20хв при 40°С. Аналіз ІЧ-спектра (фігура 2, а) вказує на те, що даний спектр є суперпозицією спектрів колагену та метиленбісакриламіду. На фоні широких смуг колагену з'являються характеристичні смуги метиленбісакриламіду: позаплощинні деформаційні коливання зв'язків =СН2 (825см-1) та =СН (970-1000см-1). Однак найбільш чітко смуги активного мономера (структурувального агента) проявляються в ІЧ-спектрах таких систем, які зняті відносно колагену (фігура 2, б): смуги в ділянці 825, 970-1000см-1 проявляються виразніше, а також виявляються коливання зв'язку =СН-С при 1080см-1. З аналізу ІЧ-спектра композиції (до опромінення) видно, що він є суперпозицією ІЧспектрів тонкої колагенової плівки і метиленбісакриламіду (фігура 3). Після лазерного опромінення композиції в її ІЧ-спектрі спостерігаються зміни (фігура 3, курсив). Відсутня смуга при 485см-1, яка відповідає крутильному коливанню групи NH метиленбісакриламіду. Спостерігається зниження інтенсивності широкої смуги, яка відповідає деформаційним коливанням груп колагену ОН та NH (500-750см-1). Суттєво знижуються інтенсивність двох дублетних піків (825-845см-1, 970-1000см-1), які відповідають за наявність вінільних груп у молекулі метиленбісакриламіду. В ділянці 1450см-1 знижується інтенсивність смуги поглинання, яка відповідає як валентному коливанню зв'язку C-N метиленбісакриламіду, так і симетричному деформаційному коливанню групи колагену NH. Незначно знижується інтенсивність смуги при 1670см-1, де виявляється валентне коливання групи С=О обох компонентів . У ділянці 27903400см-1 зникають обертони (2790, 2870см-1), а також знижується інтенсивність смуг у ділянці 3080, 3340, 3970см-1. При цьому виникає загальне сплощення смуги. У цій ділянці з'являються симетричні та асиметричні коливання NH-зв'язку метиленбісакриламіду, але найбільше - валентні коливання груп колагену NH і ОН. 28652 6 Оскільки вивчення біофотопроцесів у реальних колагенових матрицях за рахунок малої їх товщини (20-25мкм) не дозволяє з'ясувати особливості фотоструктурних перетворень, дослідження проводили за допомогою структурування у рідкій фазі. Більш чітко процес розкривання подвійних зв'язків у метиленбісакриламіді спостерігається при зіставленні ІЧ-спектрів композиції відносно чистого колагену. З фігури 4 видно, що в результаті лазерного опромінення знижуються інтенсивність смуг, які відповідають деформаційним коливанням груп =СН2 (825см-1) і СН = (970-1000см-1), а також валентним коливанням групи =СН-С (1080см-1), що збігається з даними [3]. Проведений аналіз ІЧ-спектрів дає змогу зробити висновок, що в процесі лазерохімічного структурування колагену за участю метиленбісакриламіду беруть участь аміно- та гідроксильні групи макроланцюгів колагену, а також вінільні групи зшивального агента. Джерела інформації 1. Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова.- М.: Медицина, 1996.- 544с. 2. Верещака В.В. Фотополімеризаційні процеси у колагені шкіри при навантаженні гелійнеоновим лазером.- Спорт, медицина.- 2007.- №1.С.10-17. 3. Сильверстейн Р., Басслер Г., Моррил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений. - М.: Мир, 1977.- 592с. 7 28652 8