Спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини

Спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини за допомогою біологічно активного препарату природнього походження, який відрізняється тим, що як діюча речовина використовується антиретикулярна цитотоксична сироватка Богомольця (АЦС). (19) (21) 97062685 (22) 06.06.1997 (24) 15.11.2000 (33) UA (46) 15.11.2000, Бюл. № 6, 2000 р. (72) Співак Микола Якович, Карпов Олександр Вікторович, Антоненко Свєтлана Василівна, Барбашева Олена Віталіївна, Квєлєнкова Ксенія Ігоровна, Волощенко Юрій Васильович 29770 В умовах множинності інфікування клітин МТ-4 штамом ВІЛ-1/BRU (0,1 Іg ТЦД50/кл), яку ми використовували при моделюванні гострої інфекції, в контрольних культурах вже на 4 добу спостереження реєструвалась загибель до 50% клітин. При одночасному з зараженням внесенні в поживне середовище АЦС була виявлена здатність препарату до захисту клітин від цитодеструктивної дії вірусу, при цьому ефективність останньої залежала від концентрації АЦС. Встановлено, що на 4 добу після інфікування клітин вірусом найбільш високу захисну дію АЦС справляє в розведеннях від 1:160 до 1:640 (до 55%). До 8-ї доби культивування клітин МТ-4, інфікованих штамом ВІЛ-I/BRU, захисний ефект препарату підвищувався до 75-80%. Загальне підвищення кількості життєздатних клітин в інфікованих культурах під дією АЦС до 8 доби культивування може бути пов'язане як з раннім пригніченням реплікації вірусу і, як наслідок, з проліферацією неінфікованої популяції клітин в заражених культурах, так і з тим, що АЦС безпосередньо перешкоджає зв'язуванню та проникненню ВІЛ в незаражені клітини. Приклад 3. Суттєвим показником ВІЛ-інгібуючої дії препаратів є також зменшення рівня синтезу антигену р24 (результати дослідження приведені на фігурі). Як видно, додання АЦС в розведенні 1:160 значно знижує синтез даного антигену. Слід особливо підкреслити, що інгібуючий вплив АЦС на даний параметр активності реплікації вірусу більш виражений в випадку моделі ВІЛ-1/ІІІВ (хронічна інфекція). Таким чином, в результаті проведених досліджень запропоновано спосіб пригнічення репродукції вірусу імунодефіциту людини за допомогою біологічно активного препарату природного походження, який відрізняється тим, що як діюча речовина використовується антиретикулярна цитотоксична сироватка Богомольця (АЦС). Джерела інформації 1. Polі G., Orensten J.M., Kinter A. et al. Interferon-a, but not AZT suppresses HIV expression in chronically infected cell lines. // Science - 1989 Vol. 244, № 4904 - p. 575-577. 2. Носик Н.Н., Носик Д.Н., Кузнецова И.В. Ингибирующее действие индукторов интерферона на размножение вируса иммунодефицита человека // Вопр. вирусол. - 1992 - № 2. - С. 92-94. 3. Дранник Г.Н., Гриневич Ю.А., Дизик Г.М. Иммунотропные препараты, Киев, Здоров'я, 1994. С. 103-105. 4. Богомолец А.А. Избранные труды. Киев, 1957. - Т. 2. - С. 30-33. 5. Мягкая И.П. Антиретикулярная цитотоксическая сыворотка А.А. Богомольца как средство патогенетической терапии различных заболеваний // Патолог. физиология и эксперим. терапия – 1981. - Вып. 2 - С. 39-46. Лабораторні штами ВІЛ-І ІІІВ та BRU отримані від проф. K.J.E. Krohn (Університет м. Тампере, Фінляндія). Визначення дії препаратів в умовах гострої ВІЛ-інфекції проводили на культурі клітин МТ-4, яку інфікували ВІЛ-I/BRU в вигляді культуральної рідини, що містить вірус, множинність інфекції при цьому складала 0,1 Іg ТЦД50/кл. Після адсорбції вірусу клітини відмивали і вміщували в поживне середовище в концентрації 0,5 млн. кл./мл з одночасним додаванням досліджуваних препаратів. Для моделювання хронічної ВІЛ-інфекції використовували хронічно інфіковану культуру клітин Н-9/ІІІВ. Препарати вносили в культуральне середовище одночасно з виконанням чергового пасажу культури. Подальше культивування ВІЛ-інфікованих клітинних культур проводили на протязі 1020 діб зі зміною поживного середовища і одночасним обліком стану культур по 4-денному циклу. Анти-ВІЛ активність препаратів оцінювали за такими критеріями, як показники життєздатності клітин, активність сінцитієутворення та рівень вмісту антигену р24 ВІЛ-І в культуральному середовищі. Ступінь захисту клітин від цитодеструктивної дії ВІЛ-1 визначали за формулою [2]: А -В % захисту = ´ 100, К -В де А - кількість життєздатних клітин в дослідній культурі; В - те ж в інфікованій культурі (контроль вірусу); К - те ж в контрольній неінфікованій культурі. Рівень вмісту антигену р24 ВІЛ-І в культуральних рідинах визначали методом ІФА на тестсистемах фірми "Abbott" (США) згідно рекомендації фірми-виробника. Вирішення поставленої задачі пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Аналізували токсичність препаратів АЦС в різних розведеннях відносно культур клітин, що використовували в дослідах. Рівень токсичності оцінювали згідно двох параметрів – щільності клітинної суспензії та її життєздатності (табл. 1 і 2 відповідно). Виявилося, що АЦС в розведеннях від 1:160 та 1:1280 не виказує токсичного впливу на фізіологічний стан клітин. В випадку дії препарату в менших розведеннях (1:20) цитопатичний ефект спостерігався, що відобразилося на 3 день спостереження як на щільності клітинної суспензії, так і на життєздатності клітин (зниження показників на 60% та 45% відповідно). Слід відмітити, що АЦС в розведеннях 1:160 та 1:320 має на 30% менш виражену цитопатичну дію, ніж АЗТ в дозі 50 мкг/мл. Приклад 2. Порівняльне дослідження захисної дії АЦС проводили на моделях гострої і хронічної ВІЛ-інфекції. Противірусну активність АЦС порівнювали з дією АЗТ - відомого анти-ВІЛ агента, що має клінічне застосування. Результати наведені в табл. 3. 2 29770 Таблиця 1 Вплив різних доз АЦС на щільність суспензії клітин МТ-4 Розведення АЦС 1 доба 0,72±0,04 0,54±0,06 0,60±0,08 0,65±0,15 0,66±0,08 0,68±0,05 0,74±0,12 0,72±0,06 0,75±0,15 0,55±0,05 Контроль 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 АЗТ (50 мкг/мл) Щільність клітинної суспензії (млн кл/мл) 2 доба 1,01±0,09 0,52±0,12 0,49±0,07 0,60±0,10 0,74±0,12 0,85±0,15 0,91±0,13 1,01±0,17 0,92±0,08 0,67±0,09 3 доба 1,82±0,09 0,56+0,12 0,59±0,07 0,64±0,06 0,80±0,10 1,85±0,05 1,96±0,18 1,72±0,11 1,68±0,26 0,84±0,22 Таблиця 2 Вплив різних доз АЦС на життєздатність суспензії клітин МТ-4 Контроль 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 АЗТ (50 мкг/мл) 96,3±1,6 48,2±4,2 53,2±2,0 67,1±4,3 81,5±2,5 84,7±3,3 93,1±5,7 94,4±9,8 97,2±8,4 82,3±3,7 97,1±1,1 42,2±3,6 50,2±4,2 65,8±1,0 75,1±2,7 82,5±7,5 95,4±8,2 93,5±7,5 96,3±5,9 78,6±2,3 95,2±1,4 53,5±2,5 56,1±3,7 71,2±4,2 80,9±6,9 86,7±5,3 96,0±9,7 95,2±8,4 94,4±6,2 80,1±1,9 Таблиця 3 Захисна дія АЦС в культурі клітин МТ-4, інфікованій ВІЛ-I/BRU Препарат та його дози (розведення) АЦС 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 АЗТ 50 мкг/мл Ступінь захисту, (%) 4 доба 8 доба Т.Д.* 5,01±0,03 31,05±0,05 52,31±0,23 55,16±0,34 49,19±0,77 34,25±0,45 Т.Д.* 14,18±0,22 42,09±0,03 78,33±0,27 80,17±0,63 71,08±0,24 57,01±0,87 62,18±0,14 73,56±0,44 Т.Д. - токсична дія 3 29770 Вплив АЦС та референтних препаратів на вміст р24 антигену ВІЛ-1/BRU в культуральному середовищі клітин МТ-4 g - контроль вірусу; D - сироватка коней (1:160); n - АЦС (1:160); - АЗТ (50мкг/мл); - контроль клітин Фіг. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4