Спосіб визначення кількості живих сперміїв в еякулятах бугаїв

МПК5:А6ІД7/02 СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ КІЛЬКОСТІ ЖИВИХ СПЕРМІЇВ V Л- Галузь техніки до якої належить винахід. Винахід належить до сільського господарства, зокрема до тваринництва, а саме до способів визначення кількості живих сперміїв у свіжоотриманих еякулятах бугаїв і може бути використаний при оцінці якості сперми. 2. Рівень техніки. Відповідно до "Інструкції по організації і технологи роботи станцій і підприємств по штучному осіменІнню сільськогосподарських тварин"(М.,1984 с.) якість сперми бугаїв оцінюють за об'ємом, концентрацією і густиною сперміїв . При тому проводиться візуальна оцінка кількості живих сяерміїа і встановлюється процент статевих клітин з прямолінійним поступальним рухом. Для уточнення кількості живих сперміїв у свіжоотриманих еякулятах запропоновано ряд способів, які грунтуються на здатності барвників проникати ( або не проникати) в пошкоджені спермії і, відповідно, їх диференційовано зафарбовувати (Яблонський В.А. Некоторые показатели обмена веществ в сперйе быка: автореф. длс. канд.биолог.наук-Львов,1962. -19с; Хеякетт А., Макферсон Дж. Некоторые способы окрашивания сперматозоидов //Канадский ветеринарный журнал - 1965.- т.6. -N3. -С.55-62). Однак, дані способи суб'єктивні і трудомісткі, оскільки залежать від якості мазка, співвідношення барвників та кваліфікації працівника, який проводить визначення. Тому, запропоновані інструментальні методи, які усувають суб'єктивні фактори і підвищують точність досліджень. Так, "Спосіб визначення пошкоджень сперміїв шляхом визначення активності сукцинатдегідрогенази" (Piece С. Розробка проби пошкодження сперматозоїдів шляхом вимірювання активності сукцинатдегідрогенази //Збірник експериментальної ветеринарної медицини. 2 Лейпціг, 1988. - т.42.№5. -С.769-775) грунтується на непроникливості цілих мембран сперміїв для сукцинату. Прн пошкодженні мембран статевих клітин і внесенні в досліджуванні проби сукцинату підвищується активність сукцинатдегідрогенази. Приріст активності ферменту в пробах з добавкою сукцинату з порівнянні до контролю відповідає кількості живих сперміїв. Недоліком даного способу є те, що його використання вимагає спеціальних досліджень, дефіцитних реактивів, дорогих приладів, тривалого часу визначення. Як прототип використаний полярографічний метод оцінки енергетичної •системи і стану мембран сперміїв внесенням сукцлнату калію і 2,4 - дннітрофенолу (Мороз Л.Г., Корбан Н.Б., Шапиев И.Ш. "Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков низкотемпературной консервации" -Л.,1980. 60с). Метод грунтується натому, що в непошкоджені спермії сукцинат не проникає і не підвищує інтенсивність поглинання кисню. При пошкодженні плазматичної мембрани статевих клітин добавлення сукцинату підвищує швидкість поглинання кисню. Сперма з високою чутливістю до сукцинату для використання не придатна. Недоліком даного способу є те, що в процесі досліджень констатується факт пошкодження мембран, і не визначається кількість живих сперміїв. Крім того він розрахований на дослідження сперми кнурів, фізіологічною особливістю яких, на відміну від бугаїв, є великий об'єм еякулятів, що дозволяє використовувати для досліджень більшу кількість сперми. Запропонований нами спосіб визначення кількості живих сперміїв передбачає використання полярографічного методу досліджень з використанням інгібітора кінцевої ланки ланцюга дихання - азида натрію і усуває недоліки прототипу. При цьому, спосіб забезпечує скорочення часу визначення кількості живих сперміїв у дварази порівняно з іншими і є об'єктивним. 3.1. Суть винаходу і суттєві ознаки. В основу винаходу покладено завдання створити об'єктив ний, доступний і швидкий спосіб визначення кількості живих сперміїв у свіжоотриманих еякулятах бугаїв. Технічний результат, досягають використанням азида нагрію з інгібітора кінцевої ланки ланцюга дихання і швидким підрахунком кількості живих сперміїв за інтенсивністю поглинання кисню до та після його внесення. Спосіб грунтується на здатності азиду натрію лроиикати через пошкодже-нні мембрани сперміїв, пригнічувати активність цитохромоксидази, що викликав зменшення інтенсивності поглинання кисню. На підставі визначення кількості поглинутого кисню до, і після внесення азиду проводиться розрахунок кількості живих і мертвих сперміїв. При цьому, відношення між інтенсивністю поглинання кисню після додавання азида натрію до швидкості дихання без інгібітора, виражена а процентах - кількість живих сперміїв. 3.2. Відомості що розкривають суть винаходу. При проведенні заявником патентно-інформаційного пошуку знайдено технічне рішення в якому є ряд суттєвих ознак спільних із заявленим (Мороз Л.Г., Корбан Н.Б., Шапиев И.Ш. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков низкотемпературной консервации -Л., -1980. -61с). використання методу полярографії для визначення швидкості поглинання кисню . Однак, даних суттєвих ознак не достатньо для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого способу визначення кількості живих сперміїв не знайдено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію "новизна". В джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено відомостей про способи визначення кількості живих сперміїв які б містили ознаки, що відрізняють заявлений винахід від прототипу: використання інгібітора кінцевої ланки дихального ланцюга азида натрію (додавання 0,09-0,13 мл 1,6% водного розчину азида натрію до 0,9 мл сперми, розбавленої 1:8 стандартним розріджувачем), з наступним розрахунком кількості живих сперміїв (%) за відношенням (СЬаз/О2)*100%, де: О2 - кількість поглинутого кисню до,внесення, а О2аз - після внесення азиду натрію. 4 Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого рішення критерію "винахідницький рівень". Заявлений спосіб може бути використаний у галузі тваринництва, а саме штучному осіменінні тварин, зокрема для об'єктивної оцінки якості еякулятів бугаїв і тому відповідає критерію "промислова придатність". Таким чином заявлене технічне рішення є новим промнсловопридатним і має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентної спромож'ності винаходу відповідно до статті 6 розділу II Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" (№ 3687-ХІІ). 4.0 Відомості, що підтверджують можливість здійснення винаходу. Для реалізації заявленого винаходу необхідно стандартне обладнання: полярограф, полярографічна камера з електродом Кларка, магнітна мішалка, самопишучий потенціометр КСЇЇ-2, водяний термостат ІТЖ -0-03, дві піпетки ємкістю ОД мл і І мл. В полярографічну камеру, з'єднану з водяним термостатом, вносять 0,8 мл стандартного розріджувача і ОД мл досліджуваної сперми. Визначають інтенсивність дихання сперміїв на протязі 2-3 хв. вносять 0,09 - 0Д1мл 1,6% разчину азида натрію, продовжуючи визначення 2-Зхв. Вимірюють ШВИДКІСТЬ ди хання шляхом визначення зміни струму (в поділках шкали самописця) або в нгатом О2/0Д мл сперми захв. Кількість живих сперміїв (%) вираховують за відношенням (О2аз/О2) * 100%, де: О2 - кількість поглинутого кисню до, а О;аз після внесення азиду натрію. 4.1. Приклади конкретного виконання. Приклад І Для встановлення оптимальної дози азида натрію свіжоотрнмані еякуляти ДІЛИЛИ на частини - перша (контрольна) - кількість живих сперміїв визначали в мазках зафарбованих еозин-нігрозином за В.А.Лблонським (1962), друга 5 (прототип) вносили сукцинат (СУКЦ.ДмМ/мл), а в інші - дослідні - вносили 1,6% розчин азида натрію в дозах, відповідно, 0,05 мл, 0,09мл, ОД0 мл, 0,11мл, і 0Д5мл в 0,9 мл сперми, розбавлено'і 1:8 стандартним середовищем. Аналіз одержаних результатів свідчить, що використання сукцинату не забезпечує можливість визначення кількості живих статевих клітин в еякуляті (табл. 1). Проте, встановлено сильний зв'язок (г=0 т69-0,70) між кількістю живих сперміїв визначених підрахунком в мазках і полярографічним способом при внесенні 0,09-ОДІмл 1,6% розчину азида натрію. При дозах інгібітора 0,05 і 0Д5мл - коефіцієнт кореляції' нижчий, відповідно, г = 0,15 і 0,60. Отже, оптимальною добавкою азйда натрію, яка забезпечувала високий коефіцієнт кореляції є 0,09 - ОДІмл 1,6% розчину на 0,9 мл сперми, розбавленої 1:8 стандартним розріджувачем. Таблиця 1 Залежність між кількістю живих сперміїв і дозою азида натрію (М±ш) Показник п Прототип НОВИЙ спосіб Конт- Q роль» % (нг-атом О/10 сперміїв Ог Сукц. Доза азиду натрію в пробі (мл) 0,05 Кількість жи 14 15,5 19,1 ±3,88 вих 69,8 ±1,28 ±1,60 0,09 78,5 62,1 одо 60,2 і} ^ ±5,48 ±3,12 ОДІ 0Д5 60,2 31,8 ±3,81 ±2,49 сперміїв (%) Коефіцієнт 0Д5 0,69 0,70 0,69 0,60 кореляції (г) Приклад II Для визначення оптимального проміжку часу, за який встановлюються прямопропорційні зміни швидкості поглинання кисню і можлив ий підрахунок кількості ЖИВИХ сперміїв, були проведені вимірювання інтенсивності дихання статевих клітин на протязі 5 хв., з інтервалом досліджень - 1 хв. (табл.2). Таблиця 2 Залежність між інтенсивністю поглинання кисню Тривалість ви і тривалістю дослідження (М±т) Поглинання кисню (нг-атом О2/0,1 мл сперми захв.) мірювань, хв. 1 до внесення азиду Na після внесення азиду Na 12,1*2,62 5,7*1,23 2 15,5*1,28 10,0*1,05 3 15,6*1,12 10,2*0,99 4 15,5*1,18 10Д±1,07 5 15,5*1,22 10,0*1,10 Встановлено, що оптимальним проміжком часу, за який пропорційно змінюється швидкість поглинання кисню є 2-3 хв. При тому, даний проміжок ' часу необхідний для встановлення стабільної інтенсивності дихання і визначення кількості живих сперміїв. Вимірювання через 1 хв. не достатнє для встановлення прямопропорційно! зміни швидкості дихання після внесення як сперми так і азида натрію. Різниця при визначенні швидкості дихання в оптимальний час (2-3 хв.) і через 1 хв. складала- до внесення азида натрію 22% і після внесення - 43%, відповідно розрахункової кількості живих сперміїв 17,4%. Проведення досліджень більше 4 хв. відтворює результати, отримані в оптимальний проміжок часу (2-3 хв.). Приклад III . . .. Для перевірки нового способу визначення кількості живих сперміїв на протязі липня - листопада 1997 проведено дослідження 126 свіжоотриманих еякулятів бугаїв, які належали Львівському підприємству по племінній справі у тваринництві. Кожен еякулят розділяли на дві частини - контрольну (прототип) - визначали кількість живих сперміїв шляхом підрахунку в мазках зафарбованих еозин-нігрозином, і дослідну - визначали інтенсивність дихання сперміїв до га після внесення азида натрію (табл.З). Таблиця З Кількість живих сперміїв при оцінці свіжоотриманих еякулятів (М±т) "Дата проведення п досліджень Кіль кість жи ви х сперміїв ( %) конртоль (прототип) г новий спосіб 4-6.07.97 41 58,8±U3 59,3±1,41 0>90 5-6.08.97 28 67,1*1,93 69,1±1,19 0,92 16-17.08.97 10 70,3±2,38 70,5±2,39 0,74 14-15.09.97 17 65,7*4,25 65,7±3,02 0,74 28-29.10.97 ЗО 60,6±2,30 63,7±3,04 0,83 За період дослі джень — , ------- — , , І26 64,5±2,44 65,7±2,37 0,83 Розрахунок кількості живих сперміїв (%) проводили за відношенням * 100%? де; О2 - кількість поглинутого кисню до , а О 2аз - після внесення азнду натрію. В результаті досліджень встановлено, що між визначеннями кількості живих сперміїв шляхом підрахунку в мазках і полярографічним способом існує сильний кореляційний зв'язок - г^+СЗЗ, коливання при дослідженні в різні дні г +0,74 -+0,92. При тому, тривалість визначення кількості живих сперміїв новим способом 8-Ю хв, а підрахунком в мазках(без виготовлення мазка) -15-20хв. Крім того, використання приладів і інгібітора дихального ланцюга-азида натрію, усувають дії субєктивного фактора і забезпечують об'єктивність досліджень.