Спосіб моделювання бактероїдного абсцесу

Спосіб моделювання бактероідного абсцесу шляхом підшкірного введення мишам капсульного варіанта культури бактероїдів групи фрапліс в живильному напіврідкому агаровому середовищі, який відрізняється тим, що заздалегідь на 2-6 годин накладають джгут на гомілку задньої лапки дослідної тварини, а інфект вводять в подушечку задньої лапки не раніш, ніж за ЗО хвилин до зняття джгута в дозі 200-500 млн мікробів Винахід відноситься до експериментальної медицини, зокрема до розділу моделювання локалізованих анаеробних неклостридіальних патологічних процесів м'яких тканин, що може бути використане для вивчення імунологічної реактивності макроорганізму та особливостей патогенезу процесів, які спричинені анаеробними аспорогенними бактеріями Відтворення локалізованої бактероідної інфекції в інтактних тварин має значні труднощі Наявні способи моделювання бактероіда-абсцесів мають низьку здатність до відтворення типового інфекційного процесу Відомий спосіб моделювання абсцесу [1] шляхом введення суміші 4-х музейних штамів бактероїдів групи меланшогенікус на рідкому поживному середовищі в об'ємі 1,0мл морським свинкам під лопатку підшкірно Поряд з позитивними моментами цього способу /простота і відсутність генералізації інфекції/, слід ВІДМІТИТИ, що інфекційний процес відтворюється примірно в 70% випадків /за даними авторів/ Крім того, через великий об'єм шокуляту, який вводять, часто виникають розривання шкіри, що приводить до контамінації абсцесу іншою мікрофлорою, що порушує чистоту моделі моноінфекцм Другий спосіб [2], обраний як прототип, здійснюється шляхом введення патогенетичного штаму бактероїдів групи фрапліс /капсульний варіант/ Мишам підшкірно внутріпахвинно вводять 0,5мл напіврідкого поживного середовища, в якому є 2 109 добової культури бактероїдів На 4-у добу після введення формується підшкірний абсцес діаметром 5мм, який до 10-і доби досягає 15 20мм Абсцеси виникають /за даними авторів/ у 80% випадків, в 10% випадків при маніпуляціях інфікування мишей, процес пошпарується на черевну порожнину, що веде до генералізації інфекції і швидкої загибелі тварин У 30% тварин, в яких сформувалися абсцеси на 4 - 5 добу абсцеси прориваються через шкіру у вогнище запалення і тоді проникають мікроорганізми з оточуючих ділянок шкіри Отже запальний процес у вигляді бактероідної моноінфекцм має перебіг лише у 50% тварин Задачею винаходу є підвищення відтворення абсцесу індукованого бактероїдами Поставлена задача досягається тим, що при даному способі моделювання абсцесу заздалегідь на 2 - 6 годин накладають джгут на гомілку задньої лапки дослідної тварини, а інфект вводять в подушечку задньої лапки не раніш ніж за ЗО хвилин до зняття джгута в дозі 200 - 500млн мікробів Компресійна ішемія КІНЦІВКИ І введення бактероїдів в подушечку створює сприятливі умови для розвитку анаеробних бактерій в наслідок гіпоксії тканин, порушення мікроциркуляцм крові і зниження окисно відновного потенціалу тканин лапки, це забезпечує високе відтворена патологічного процесу Створення компресійної ішемії лапки та введення в її подушечку при моделюванні бактероідноі локалізованої інфекції використано вперше Порівняння способу, який заявляється зі способом-прототипом, де вводили бактероїди в інтактну пахвину, дозволяє зробити висновок про наявність критерію "новизна" ВІДМІННОЮ ознакою способу, який заявляється, є також попереднє накладання жгута на гомілку (О 00 ю (О 46586 ня ЦІК в сироватці відповідало важкості інфекційного процесу Отже, наведені результати морфологічного /ГІСТОЛОГІЧНОГО/, мікробіологічного і імунологічного досліджень вказують на розвиток запального процесу, що спричиняється бактероїдами Експозиція ішемізацм лапки повина бути від 2 до 6 годин При зменшенні експозиції до 2 годин не виявляють достовірні ознаки змін запалення у лапці, а збільшення м більше 6 годин приводить до необоротних змін, з самоампутаціею лапки наступної доби Трьох годинна ішемізація лапки без введення бактероїдів спричиняє набряк зниження температури шкіри та и блідість Ці явища проходять через 4 - 6 годин після зняття джгута У мишей, яким вводили бактероїди в подушечку лапки без попередньої и ішемізацм, на 5-у добу ознаки запалення були ледве ПОМІТНІ Відмічалося деяке збільшення КІЛЬКОСТІ сполучнотканинних клітин на межі дерми і підшкірно-жирової клітковини /фіг 2/ Не виявлялась різниця і за масою репонарних лімфовузлів інтактних і інфікованих лапок у цих тварин В групах тварин яким бактероїди вводили в інтактні тканини підшкірне в пахвину чи в подушечку лапки показники стану монощитарнофагоцитарной системи, системи комплементу, реакція бласт-трансформацм лімфоцитів селезінки В період максимального розвитку запалення і КІЛЬКІСТЬ циркулюючих імунних комплексів в синаростали показника бласттрансформацм роватці крові достовірно не відрізнялись від показСпосіб моделювання, який пропонується, здійників контрольних тварин на протязі всього періснюється наступним чином мишам на гомілку заоду спостереження /3 тижні/, за винятком дньої лапи накладають джгут з марлевою піл клакороткотривалого підвищення поглинальної активдкою Через 2,5 години в подушечку цієї лапки ності фагоцитів периферичної крові в перші дні вводять 0,05мл напіврідкого агаризованого живипісля введення бактероїдів льного середовища, де є 0,2 - 0,5 109 мікробних клітин чотирьох добової капсульної культури бакМікробіологічні дослідження лапки в які вводитероїдів виду фрапліс Через півгодини після ввели мишам бактероїди не виявили особливої актидення бактероїдів джгут знімається вності інфекційного процесу/Приклад 1/ Запальний процес перебігає так на кінець 1 КІЛЬКІСТЬ шокуляту, який вводили, визначаєть2-х діб після введення бактерій розвивається вися максимальний об'ємам, який можна ввести в ражена запальна реакція, що проявляться набряподушечку лапки миші ком і гіперемією, порушенням функції лапки Під Оптимальною дозою інфекту для відтворення 9 кінець 3 - 4-діб формується абсцес, набряк пошиабсцесу є 0,2 - 0,5 10 мікробів При дозі більше 9 рюється до коліна Починаючи з 12 - 14 діб набряк 0,5 10 мікробів розвивається генералізована іні гіперемія поступово зменшуються і до 24-і доби фекції, що приводить до загибелі тварин /приклад абсцес організується /шкапсулюється/, запальні 2/, а при введені менше 0,2 109 бактероїдів хоча й явища проходять і функції КІНЦІВКИ ВІДНОВЛЮЄТЬСЯ виникають ознаки запалення, але абсцеси формуються лише в окремих випадках /приклад З/ З абсцесу виділяли бактероїда фрапліс до 14 годин При бактеріологічному дослідженні внутріПРИКЛАД 1 Мишам лінії СВА вагою 18,5г шніх органів /нирки, печінка, селезінка/ і крові ні/після обробки етанолом/ в подушечку правої задяких бактерій не виявлено ньої лапки /без попередньої ішемізацм/ вводять 0,05мл напіврідкого агаризованого середовища, в У досліджених тварин від 6 до 15 діб виявляякому було 0,6 109 мікробний клітин 4-хдобовоі лось достовірне збільшення ПІДКОЛІННИХ лімфовукапсульної культури бактероїдів фрапліс Через 24 злів на лапці де був сформований абсцес /6,3 ± години у тварин з'являвся набряк і гіперемія лапки, 0,5, р0,05/, а в інтактній лапці /3,4 ± 0,8/ Починаюмиші залишались активними, поведінка їх не змічи з 12 - 14 доби в сироватці крові дослідний минювалась До третьої доби гіперемія шкіри лапки шей виявлялись специфічні до використаних для зберігалась, а набряк збільшувався У окремих інфікування бактерій антитіл які виявляли в реакції тварин було видно деякі порушення функції цих непрямої імунофлюоресценцм Також наростала лапок На наступні 4 - 6 діб прояви запалення зниКІЛЬКІСТЬ циркулюючих імунних комплексів /ЦІК/ кали і функція лапок повільно відновлялась На 7-у Аналогічні прояви імунологічних реакцій сподобу тварин забивали, маса ПІДКОЛІННИХ лімфовустерігали і у хворих людей з локалізованими запазів як дослідних так і контрольних лапок була прильними процесами м'яких тканин, які спричинялимірна однакова /2,5 - 3,5мг/ ся некпостридіальними анаеробними бактеріями У ПРИКЛАД 2 Миші ЛІНІЇ СВА масою 19,0г на цих людей такі зміни проявляються і в системах гомілку правої задньої лапки /на 4-х шарову марфагоцітозу і клітинної ланки імунітету, а збільшензадньої лапки тварини і введення бактероїдів є подушечку цієї лапки Використання джгута з метою створення ішемії тканин для вивчення різних аспектів, як ішемії так і стану який м супроводжує Вивчення ГІСТОЛОГІЧНИХ препаратів показало, що в ДОСЛІДНІЙ груп мишей не 5 добу виявляються ознаки запалення в м'яких тканинах КІНЦІВОК, де Торгувалися абсцеси У сполучнотканинній основі шкіри відмічалося значне скупчення лейкоцитів /фіг 1/, не рідко виявлялись масивні інфільтрати, що вказувало на наявність активного запального процесу Ознакою розвитку інфекційного пронесу були і зміни в показниках стану неспецифічної резистентності Виявлялися фазні зміни стану моноцитарно-фагоцитарної системи і системи комплементу після короткочасного /2 - 4-а доба після інфікування/ знижалась поглинальна і киснево залежна бактерицидна активність фагоцитів периферійної крові, а на 5-у добу /виражена місцева реакція/ спостерігалося підвищення відсотку НСТ і середнього ЦИТОХІМІЧНОГО коефіцієнту Паралельно збільшувалась гемолітична активність комплементу сироватки крові в основному за рахунок Сз і Сє компонентів Починаючи з 12-і доби /зворотній розвиток місцевої реакції/ наведені показники поверталися до вихідного рівня 46586 леву підкладку/ накладали джгут Через 2,5 години ПРИКЛАД 4 Миші ЛІНІЇ СВА масою 18,5 - 19,0г в подушечку цієї лапки вводили 0,05мл напіврідкона праву задню лапку /на 4-х шарову марлеву підго агарового поживного середовища, що містить кладку/ накладають джгут Через 2,5 години в по0,6 10 мікробів 4-х добової капсульної культури душечку цієї ж лапки вводятьО,05мл напіврідкого бактероїдів фрапліс Через 0,5 годин після ввеагарового поживного середовища, що вістить 9 дення бактерій джгут знімали Під кінець другої 0,310 клітин мікробів 4-х добової капсульної доби, проявляються ознаки запального процесу культура бактероїдів фрапліс Через ЗО хвилин гіперемія, інфільтрація і набряк, які поширюються джгут знімають На кінець доби на інфікованій ладо колінного суглоба, Порушується функції лапки пці з'являються ознаки гіперемії і набряку, які проПід кінець 4-і доби формується абсцес у МІСЦІ введовжують збільшуватися, на 2 - 3 добу вони пошидення, який поширюється наступної доби на всю рюються до колінного суглобу, функція лапки лапку, абсцес проривається через шкіру, миша порушується, тварини кволі на п'яту добу в нижній тягне уражену лапку На 5 - 6 добу розвивається частині лапки під шкірою утворюється абсцес На гнійно-некротичне розпадання м'яких тканин лап1 4 - 1 5 добу запальний абсцес спадає, але лапка, ки, мишки гинуть При бактеріологічному дослізалишається збільшеною, абсцес зберігається, з дженні внутрішніх органів /нирки, печінка/ виділянього виділяються бактероїді На 21 - 22 добу тваються бактероїди фрапліс рин вбивали, у них ще зберігається організований абсцес на нижній ДІЛЯНЦІ лапки Контрольні бактеПРИКЛАД 3 Мишам лінії СВА масою 18,5 ріологічні посіви кусоки тканин внутрішніх органів 19,0г на праву задню лапку /на 4-шарову марлеву /нирки, печінка, селезінка/ та крові дали негативні підкладку/ накладають джгут Через 2,5 години в наслідки Маса ПІДКОЛІННИХ лімфовузлів правого подушечку цієї лапки вводять 0,05мл напіврідкого /дослід/ - 6,8мг, лівого /контроль/ - 4,2мг агарового поживного середовища, що містить 0,15 109 мікробів 4-х добової капсульної культури Такий спосіб ми використовували на протязі 2бактероїдів фрапліс Через ЗО хвилин після ввех років в експериментальних дослідженнях Передення бактероїдів джгут знімають На другу добу вірено цей спосіб на 140 мишах, а для контролю спостерігається гіперемія і набряк в нижній частині ми паралельно використовували модель без ішелапки На третю добу гіперемія зберігається, намізацм при введенні бактероїдів в пахвину /спосіббряк збільшується, тварини активи але проявляпрототип/ ється порушення функції лапки На протязі 5 - 7 Наслідки власних досліджень наведені в табдіб всі утворені порушення зменшуються і на волиці, де група №1 це миші, яким після ішемізацм сьму добу все зникає, лапка має нормальний вивводили в подушечку лапки 0,15 109 клітин капсугляд і функція м повністю відновлюється Мишей льних бактероїдів фрапліс в 0,05мл напіврідкого вбивають, з подушки лапки мікроорганізмі не видіагарового середовища, П група - це доза бактероляються, маса ПІДКОЛІННИХ лімфатичних вузлів 3,0 їдів була - 3,2мг в обох лапках Таблиця Формування підшкірного абсцесу , спричинений введенням бактероїдів фрапліс КІЛЬКІСТЬ тварин, у КІЛЬКІСТЬ яких сформувався № тварин у абсцес груп групі шт % КІЛЬКІСТЬ тварин, КІЛЬКІСТЬ тварин з які загинули від генералізації прориванням абсцесу шт % шт КІЛЬКІСТЬ тварин, у яких абсцес зберігався до 10 діб % шт % 1 35 18 51,4 15 42,9 2 35 35 100,0 19 54,3 6 17,1 10 28,6 3 35 34 97,2 1 2,9 1 2,9 32 91,4 4 35 19 54,3 13 37,1 5 35 26 74,3 4 11,4 10 28,6 16 45,7 6 20 0,6 10 мікробів, a III група - 0,3 10 мікробів, IV групі мишам вводили 0,6 109 бактероїдів в 0,05мл напіврідкого агарового середовища в подушечку задньої лапки але без попередньої и ішемізацм V група - це спосіб-прототип, де 2 109 капсульної культури бактероїдів групи фрапліс вводили в 0,5мл напіврідкого поживлого середовища підшкірне в пахвину VI група контрольна, де мишам без попередньої ішемізацм вводили в подушечку зад ньої лапки 0,6 10 бактероїдів убитих нагріванням в 0,05мл напіврідкого агара Наведені дані одержані в цих дослідах показують переваги способу, який заявляється, де відтворення становить 90% в порівняні з 50% в способі-прототипі Крім того, слід навести ще ряд переваг способу, який заявляється локалізація запалення в подушечці лапки дозволяв візуально контролювати розвиток цього процесу в динаміці та оцінювати реакцію репонар 8 46586 дня інфікування, а динаміка розвитку імунологічних вузлі и них реакцій корелює з аналогічними показниками Спосіб, що заявляється забезпечує розвиток хворих з локалізованими анаеробними неклострипатологічного процесу, ближче наближається до діальними процесами м'яких тканин перебігу патологічного процесу який спричиняєтьВідсутність проривів абсцесів через шкіру нася бактероїдами у людей Зміни, які виникають в зовні та відсутність генералізованої інфекції і загиішемізованих тканинах /порушення мікроциркулябелі тварин під час маніпуляції з тваринами Споцм, зниження рівня кисню в тканинах, ГІПОКСІЯ, ацисіб, який заявляється є більш економічним і доз і зниження окисно-відновного потенціалу/ призабезпечує чистоту моделі моноінфєкцм в порівводить до зниження місцевої резистентності і нянні з прототипом створює умови для розвитку анаеробної неклостридіальної інфекції м'яких тканин Це частіше споВикористані джерела інформації стерігається у хворих з порушеннями мікроцирку1 MacDonald J В, Socransky S S , Gibbone К J ляцм крові в кінцівках, травмах з розвитком гіпоксії, Pathogonesis of mixed anaerobic infections J dent оперативних втручаннях при використанні синтеRes , Suppl I V 42, 1965, p 538 - 544 тичних протезів і ін 2 Walker С В , Willcins T D Use of semisohd agar Розвиток запального процесу у тварин перебіfor mtistion of pure Bacteroides fragihs infection in гає важче ніж при використанні способу-прототипу, mice Infection and Jnmmity, 1976, v14, No 3, p 721 організація абсцесу настає на кінець 21 доби бід -725 ФІГ. 2 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71