Спосіб відтворення біоплівок мікроорганізмів

Спосіб відтворення біоплівок мікроорганізмів, що включає первинну інкубацію ізолятів, змивання 3 тним буфером, додають 96° етиловий спирт (200 мкг/комірку), результати реєструють на рідері (Тец Г. В. Биопленки возбудителей уроинфекций и использование фторхинолонов /Тец Г. В., Артеменко К. Л., Заславская Н. В. // [Електронний ресурс]: бібліотека і доступність інформації у сучасному світі: електронні ресурси науки, культури та освіти. Режим доступу до журн.: http:www/solvay-pharma. ru.; Заславская Н. В., Артеменко Н. К., Чижевская М. М., Тец. В. В. Особенности выживаемости бактерий в микробных сообществах / /Клин, микробиол., антимикроб., химиотер. - 2000. - № 2. - С. 219.). Відома також модель, що використовується для відтворення біофільму мікроорганізмів, яка виконується наступним чином: бактеріальні культури вирощують у рідкому або агаризованому середовищі Luria-Bertani (LB) при t=37 °C. Тестування штамів на здатність формування біоплівки проводять у пластикових планшетах для імуноферментного аналізу. Нічні культури штамів, що тестуються, розводять свіжим поживним середовищем 1:100. Здобуті суспензії стерильно вносять по 150 мкл у комірки планшетів. Для контролю вносять поживне середовище, в якому інкубували культури. Планшету ставлять в термостат на 24 години. Оптичну щільність планктонних клітин визначають на рідері iEMS Reader MF «Labsystems» при довжині хвилі 540 нм. Потім вміст лунок видаляють й заповнюють їх 150 мкл дистильованої води й 15 мкл 1 % спиртового розчину кристаллвіолету. Інкубують при кімнатній температурі протягом 45 хвилин. Потім барвник видаляють й комірки промивають 3 рази дистильованою водою. У відмиті комірки вносять по 250 мкл етилового спирту й інкубують 45 хвилин при кімнатній температурі. Інтенсивність забарвлення спирту у комірках планшету оцінюють на фотометрі при 540 нм. (Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella typhimurium / Ю. М. Романова, Н. В. Алексеева, А. Л. Гинцбург и др. // Журнал микробиологии. - 2006. - №4. - С.38-42.). Відома модель, згідно з якою біоплівки бактерій відтворюють наступним чином. Кількість бактеріальних клітин в інокуляті становить 107 кл/мл. Досліди проводять у скляних флаконах ємністю 50 мл, в які вносять попередньо підготовлений інокулят. Флакони закривають гумовими пробками і культивують при температурі 28 °С. Динаміку формування біоплівки визначають з періодичністю у 3 години. Після закінчення певного терміну експозиції відповідний флакон вилучають з досліду, зразок виймають і переносять у фосфатний буферний розчин, рН 7,6. Клітини біоплівки, що прикріпилися до пластини, знімають. Розвиток мікробного угрупування оцінюють за накопиченням у клітинах біоплівки білка за методом Лоурі (Пуріш Л. М. Динаміка сукцесійних змін у сульфідогенній мікробній асоціації за умов формування біоплівки на поверхні сталі / Пуріш Л. М., Асауленко Л. Г. // Мікробіологічний журнал. - 2007. - Т.69, №6. - С.19 - 25.). Найбільш точним способом відтворення біоплівок є модель, згідно з якою процес утворення біоплівок вивчають за допомогою визначення зда 47944 4 тності штамів бактерій до адгезії на поверхні 96 коміркової полістеролової панелі. Штами вирощують на L-агарі "Difco" при 30 °С на протязі 24 або 48 годин (в залежності від умов культивування мікроорганізмів). Здобуті культури висівають у Lбульйоні й інкубують при 30 °С. Готують розведення нічної культури 1:100, 1:1000 та інокулюють у комірки панелі дозатором по 150 мкл у 4 повторюваннях. У якості негативного контролю вносять по 150 мкл L-бульйону. Кількість інокульованих планктонних клітин підраховують на спектрофотометрі при довжині хвилі 540 нм й виражають в умовних одиницях оптичної щільності. Планшет закривають кришкою й інкубують при 30°С протягом доби у вологому контейнері. Через 24 години інкубації проводять підрахунок кількості клітин. З комірок панелі вилучають планктонні клітини й забарвлюють плівки. Для цього у комірку вносять 150 мкл дистильованої води і 20 мкл 1 % кристаллвіолету й інкубують 45 хвилин при кімнатній температурі. Після триразового промивання дистильованою водою у комірки для екстракції фарби з плівки додають 200 мкл 96 % етанолу й вимірюють оптичну щільність цього розчину при довжині хвилі 540 нм. Інтенсивність забарвлення вмісту комірок відповідає ступеню плівкоутворення. Кількісним вираженням ступеня утворення біоплівки є значення оптичної щільності, що виміряна на спектрофотометрі (Шагинян И. А. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик / Шагинян И. А., Данилина Г. А., Чернуха М. Ю. // Журнал микробиологии. - 2007. - №1. - С. 3 - 9.). Даний спосіб відтворення біоплівок мікроорганізмів є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю та результатом, який може бути досягнутим, тому його обрано за прототип. Основними недоліками відомих способів експериментального моделювання біоплівок мікроорганізмів, в тому числі і прототипу, є їх недостатня ефективність, обумовлена тим, що вони не враховували початкову концентрацію мікроорганізмів. У зв'язку з вище викладеним, в основу корисної моделі покладено задачу підвищення ефективності способу відтворення біоплівок мікроорганізмів шляхом підвищення точності визначення вмісту бактеріальних клітин в інокулюмі. Задачу, яку покладено в основу корисної моделі, вирішують тим, що у відомому способі відтворення біоплівок мікроорганізмів, що включає первинну інкубацію ізолятів, змив інокуляту, розведення вихідної бактеріальної суспензії до необхідної концентрації мікроорганізмів в одиниці об'єму, вимірювання мутності інокуляту, інкубацію бактеріальної суспензії, фарбування біоплівки та вимірювання її щільності, згідно з корисною моделлю, змив штамів виконують суспензійним середовищем, вимірювання концентрації мікробних клітин у мілілітрі рідини виконують в два етапи: на мутномері з повторним вимірюванням на рідері з додаванням стандартів. Технічний ефект корисної моделі, а саме підвищення ефективності відтворення біоплівок мікроорганізмів, обумовлена тим, що в якості рідини 5 для змиву штамів використано суспензійне середовище, а вимірювання концентрації мікробних клітин виконано в два етапи: на мутномері з повторним вимірюванням на рідері з додаванням стандартів. Спосіб виконують наступним чином: утворення біоплівок вивчають за допомогою визначення здатності штамів бактерій до адгезії на поверхні 96 коміркових полістиролових планшетів для імуноферментного аналізу. Штами вирощують за загальноприйнятими у мікробіології методами на рекомендованих для кожної родини бактерій середовищах та умовах культивування. Здобуті культури змивають суспензійними середовищами, які індивідуальні для кожної родини бактерій. Вимірюють оптичну щільність вихідної (початкової) бактеріальної суспензії на "Densi-La-Meter" й доводять її концентрацію відповідно до ступенів за McFarland, яка неоднакова для різних родин мікроорганізмів (наприклад, для ентеробактерій IMcF, для стрептококів - 3McF, для стафілококів, анаеробів й неферментерів - 2McF) за допомогою суспензійного середовища. Для більш точного вимірювання оптичної щільності та її корекції бактеріальну суспензію, що відповідає певному ступеню за McFarland, інокулюють у комірки панелі дозатором по 200 мкл у 4 повтореннях. У якості негативного контролю вносять 200 мкл поживного бульйону або суспензійного середовища. Стандарти мутності готують з ВаСl2х2Н2О й H2SO4 за методикою «Pliva-Lachema» та виробниками «Densi-LaMeter», що використовуються для контролю якості роботи прибору: 1 ступінь за McFarland - 0,1 мл 1% розчину ВаСl2х2Н2О й 9,9 мл 1% розчину H2SO4; 2 ступінь за McFarland - 0,2 мл 1 % розчину ВаСl2х2H2О й 9,9 мл 1% розчину H2SO4; 3 ступінь за McFarland - 0,3 мл 1 % розчину ВаСl2х2Н2О й 9,9 мл 1% розчину H2SO4. Кількість інокульованих планктонних клітин підраховують на фотометрі «Multiskan EX 355» при довжині хвилі 540 нм й виражають в умовних одиницях оптичної щільності. Здобута середня математична оптична щільність (з 4 комірок) не повинна відрізнятися від необхідної нам концентрації мікроорганізмів більш ніж 10%. При корекції оптичної щільності мікроорганізмів у початковій бактеріальній суспензії користуються суспензійним середовищем. Після одержання бактеріальної суспензії з необхідною концентрацією мікроорганізмів у комірки планшета інокулюють по 200 мкл даної суспензії з відповідним поживним середовищем у 4 повтореннях з подальшою інкубацією згідно умовам для кожної родини бактерій у вологому контейнері під закритою кришкою планшета. Через 24-48 годин (в залежності від умов культивування мікроорганізмів) інкубації проводять підрахунок кількості клітин на рідері. З комірок панелі вилучають планктонні клітини й забарвлюють плівки. Для цього у комірку вносять 200 мкл фосфатного буферу (або дистильованої води) й 15 мкл 1 % спиртового розчину кристаллвіолету та інкубують 45 хвилин при кімнатній температурі. Після триразового промивання фосфатним буфером (або дистильованою водою) у комірки для екстракції фарби з плівки додають 250 мкл 96 етилового спирту та інкубують ще 45 47944 6 хвилин при кімнатній температурі й вимірюють оптичну щільність цього розчину при довжині хвилі 540 нм. Інтенсивність забарвлення вмісту комірок (спирту у комірках) відповідає ступеню плівкоутворення. Кількісним вираженням ступеня утворення біоплівки є значення оптичної щільності, що виміряні на спектрофотометрі при 540 нм. Спосіб ілюструють наступні приклади: Приклад 1. Для поставлення експерименту референтний штам Streptococcus pyogenes IBC (TICK 130001, одержаного з інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України), був засіяний у сироватковий агар. Засіви інкубували при 37 °С протягом 24. Здобуті культури змивали фізіологічним розчином. Вимірювали оптичну щільність на "Densi-La-Meter": за McFarland - 3 ступінь, що відповідало 9,0x109 клітин/мл за шкалою відповідності показників оптичної щільності мікробних суспензій (у одиницях McFarland) концентрації мікробних клітин (КУО/мл) та інокулювали у комірки панелі дозатором по 200 мкл у 4 повтореннях. В якості негативного контролю вносили 200 мкл поживного середовища, на якому вирощували біоплівку. В якості стандартів використовували розчини ВаСl2х2Н2О й H2SO4 різної мутності. Кількість інокульованих планктонних клітин підраховували і корегували на фотометрі «Multiskan ЕХ 355» при довжині хвилі 540 нм й виражали в умовних одиницях оптичної щільності. Мікроорганізми необхідної концентрації у сироватковому бульйоні інокулювали у планшет (у 4 комірки), закривали кришкою й інкубували при 37 °С протягом доби у вологому контейнері. Через 24 години інкубації проводили підрахунок кількості клітин на рідері. З комірок панелі вилучали планктонні клітини й забарвлювали плівки. Для цього у комірку вносили 200 мкл фосфатного буферу й 15 мкл 1 % спиртового розчину кристаллвіолету та інкубували 45 хвилин при кімнатній температурі. Після триразового промивання фосфатним буфером у комірки для екстракції фарби з плівки додавали 250 мкл 96° етилового спирту та інкубували 45 хвилин при кімнатній температурі й вимірювали оптичну щільність розчину при довжині хвилі 540 нм. Інтенсивність забарвлення вмісту комірок відповідала ступеню плівкоутворення. Кількісним вираженням ступеня утворення біоплівки є значення оптичної щільності, що виміряні на спектрофотометрі при 540 нм. Приклад 2. Для проведення досліду з референтним Escherichia coli ATCC 25922 (NCDC F50, одержаного з інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України), штам був засіяний у LB-середовище. Засіви інкубували при 37 °С протягом 24 годин. Здобуті культури змивали суспензійними середовищами для ентеробактерій. Вимірювали оптичну щільність на "Densi-La-Meter": за McFarland - 1 ступінь, 8 що відповідало 3,0х10 клітин/мл за шкалою відповідності показників оптичної щільності мікробних суспензій (у одиницях McFarland) концентрації мікробних клітин (КУО/мл) та інокулювали у комірки панелі дозатором по 200 мкл у 4 повтореннях. У якості негативного контролю вносили 200 мкл LBсередовища, в якості стандартів використовували 7 47944 розчини ВаСl2х2Н2О й H2SO4 різної мутності. Кількість інокульованих планктонних клітин підраховували й корегували на фотометрі «Multiskan EX 355» при довжині хвилі 540 нм й виражали в умовних одиницях оптичної щільності. Мікроорганізми необхідної концентрації з LB-середовищем інокулювали у планшет, закривали кришкою й інкубували при 37 °С протягом доби у вологому контейнері. Через 24 години інкубації проводили підрахунок кількості клітин на рідері. З комірок панелі вилучали планктонні клітини й забарвлювали плівки. Для цього у комірку вносили 200 мкл фос Комп’ютерна верстка І.Скворцова 8 фатного буферу й 15 мкл 1 % спиртового розчину кристаллвіолету та інкубували 45 хвилин при кімнатній температурі. Після триразового промивання фосфатним буфером у комірки для екстракції фарби з плівки додавали 250 мкл 96° етилового спирту та інкубували 45 хвилин при кімнатній температурі й вимірювали оптичну щільність розчину при довжині хвилі 540 нм. Інтенсивність забарвлення вмісту комірок відповідала ступеню плівкоутворення. Кількісним вираженням ступеня утворення біоплівки є значення оптичної щільності, що виміряні на спектрофотометрі при 540 нм. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601