Спосіб кількісного визначення днк

Спосіб визначення ДНК, що передбачає при Корисна модель відноситься до аналітичної хіми, зокрема до люмінесцентного визначення бюлопчно-активної речовини дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) Лантанідні комплекси широко вживають в якості люмінесцентних міток для визначення органічних сполук (зокрема лікарських препаратів), нуклеїнових кислот та в імунофлуоресцентному аналізі Люмінесценція у цих комплексах є результатом ефективної внутрішньомолекулярної передачі енергії від органічної частини молекули до юну лантаніду Ці комплекси випромінюють вузькі емісійні смуги, мають велике Стоксове зміщення та тривалість часу життя, що пояснює зменшення впливу сигналу від біологічної матриці Основними вимогами до комплексних сполук лантанідів для їх вживання в якості міток в бюаналізі є високий квантовий вихід, висока кінетична стабільність, добра розчинність у воді та оптимальне фізіологічне значення рН Нуклеїнові кислоти (дезоксирибонуклеїнова кислота -ДНК, рибонуклеїнова кислота -РНК) відіграють важливу роль у процесах ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ, тому їх вивчення та визначення є актуальним При опромінюванні світлом нуклеїнові кислоти проявляють власну люмінесценцію У зв'язку з низькою ефективністю збудження, інтенсивність такої люмінесценції не дуже велика, що не дозволяє використовувати й для високочутливого визначення нуклеїнових кислот Тому стоїть задача підвищення чутливості визначення нуклеїнових кислот завдяки застосуванню люмінесцентних зондів (ІОНІВ металів, органічних барвників, комплексів металів), люмінесценція готування проби для аналізу, взаємодію й з розчинами хлориду тербію і органічного реагенту при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції, який відрізняється тим, що як органічний реагент використовують пдрохлорид амінобутиламіду-1,8-диметилен-2-оксо-4-пдроксихінолін-3карбонової кислоти при рН 8,5-9,5, а опромінювання ПРОВОДЯТЬ УФ-СВІТЛОМ При Азбудж = 340 НМ котрих значно змінюється при взаємодії з нуклеїновими кислотами (сенсибілізується або гаситься) Відомий спосіб визначення ДНК із застосуванням гасіння люмінесценції комплексу тербію з 1,6біО'-феніл-З'-метил-б'-пірозолон^-гексан-дюном (БФМПГД) в присутності цетилтриметиламонію броміду (ЦТМАБ) при додаванні ДНК (Wu Xia, Yang Jinghe, Huang Fang, Wang Mm, Sun Limei, Xu Guiying // Anal Lett, 1999, v 32, N12, p 2417-2425) Спосіб передбачає додавання компонентів у наступній ПОСЛІДОВНОСТІ ІОНІВ ТЬ 3+ (1x10 5 моль/л), БМФПГД (3,6x10 5моль/л), ЦТМАБ (1x10 3 моль/л), ДНК (0,04-10 мкг/мл) і Трис-буфер (рН=5,5), далі цю суміш залишають на двадцять хвилин і реєструють інтенсивність люмінесценції (Ілюм) при Хетс = 545 нм, межа виявлення 0,009 мкг/мл До недоліків даного способу відносяться використання додаткового сенсибілізатора - міцелярного середовища (ЦТМАБ), що призводе до ускладнення системи, не фізіологічне значення рН=5,5, а також недостатня стабільність комплексу, у зв'язку з чим визначення ІЛЮм необхідно вести при фіксованому часі - 20 хвилин (за 20 хвилин люмінесценція комплексу зростає до максимальної, а після 40 хвилин починає зменшуватись) Відомий також спосіб, який полягає у сенсибілізації люмінесценції комплексу європію з окситетрацикліном (ОТ) у присутності Трис-буферу (рН=7,5-9,0) при додаванні ДНК (Rutao Liu, Jinghe Yang, Xia Wu // J Luminescence, 2002, v 96, p 201-209) Спосіб передбачає додавання компонентів у наступній ПОСЛІДОВНОСТІ ІОНІВ EU 3 + (1x10"6 CM ю о 4952 моль/л); ОТ (1x10 моль/л); ДНК (0,03-5,0 мкг/мл) і Трис-буфер (рН=7,5-9,0), далі цю суміш залишають на десять хвилин і потім реєструють Ілюм при Хешс = 612 нм, межа виявлення 0,015 мкг/мл. До недоліків даного способу відносяться велика залежність люмінесцентного сигналу від полярності розчинників (запропонований розчинник вода - не є оптимальним для даної системи), а також від солевого фону, який понижує електростатичну взаємодію в системі Еи3+-ОТ-ДНК. Найбільш близьким є спосіб люмінесцентного визначення ДНК (Yun - Xiang Сі, Yuan-Zong Li, Wen-bao Chang // Analytica Chimica Acta, 1991, v. 248, p. 589-594), в якому до розчину хлориду тербію (4x10"5 моль/л) додають фенантролін (ФЕН) (8x10"5 моль/л), ДНК (РНК) (0,5-50 мкг/мл), Трисбуфер рН=7,0, перемішують, залишають на 20-30 хвилин, записують смугу люмінесценції при м та Х е м ю = 543,5 нм . Інтенсивність люмінесценції комплексу тербію з фенатроліном збільшується у 3-12 разів в присутності ДНК та РНК. Межа виявлення ДНК в цьому способі становить 0,1 мкг/мл, а РНК - 0,2 мкг/мл. Даний спосіб обрано прототипом: Прототип та спосіб, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - приготування проби; - взаємодію ДНК з розчинами комплекса хлориду тербію з відповідним органічним реагентом при заданому рН водного середовища; - опромінювання утвореного потрійного комплексу тербію УФ світлом; - вимірювання інтенсивності люмінесценції розчину при А,емю = 545 нм . Але спосіб за прототипом вимагає попереднього відокремлення білків, які значно гасять люмінесценцію даної системи, а також має недостатню чутливість (межа виявлення ДНК - 0,1 мкг/мл), тому що вживається комплекс тербію з фенантроліном, який характеризується низькою інтенсивністю флуоресценції. Ця система також не є селективною і наявність РНК (більш, ніж 10% мас.) перешкоджає визначенню ДНК. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб, в якому шляхом використання більш ефективного органічного реагенту, ніж фенантролін, забезпечити зниження межі виявлення ДНК. Поставлена задача вирішена в способі визначення ДНК, що передбачає приготування проби для аналізу, взаємодію її з розчинами хлориду тербію і органічного реагенту при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції, тим, що як органічний реагент використовують гідрохлорид амінобутиламіду-1,8-діметилен-2-оксо-4гідроксихінолін-3-карбонової кислоти (R) при рН 8,5-9,5, а опромінювання проводять УФ світлом При ^збудж = 545 НМ . Новим у корисній моделі, що заявляється, є наявність наступних ознак: - як органічний ліганд використовують гідрохлорид амінобутиламіду-1,8-діметилен-2-оксо-4гідроксихінолін-3-карбонової кислоти; - використання розчину комплексної сполуки тербію з наведеним органічним лігандом, який характеризується високим квантовим виходом (Q = 0,34), що дозволяє знизити межу виявлення ДНК; - зниження межі виявлення ДНК (0,003мкг/мл); - опромінювання утвореної системи Tb-R-ДНК УФ-світлом з А,3будЖ = 340 н м • Зниження межі виявлення стало можливим завдяки використанню нового люмінесцентного зонду - комплексу тербію з новим лігандом гідрохлоридом амінобутиламіду-1,8-діметилен-2-оксо4-гідроксихінолін-З-карбонової кислоти. Це можна пояснити наступним. Органічний ліганд - гідрохлорид амінобутиламіду-1,8-діметилен-2-оксо-4гідроксихінолін-3-карбонової кислоти - відноситься к похідним 2-оксо-4-гідрокси-хінолінкарбонової кислоти і має таку структурну формулу: °Н ° -неї о Обробка стандартного розчину солі тербію водним розчином реагенту також, як і у випадку прототипу, підсилює люмінесценцію тербію, але значно більше (в десятки разів). Цей реагент має в ультрафіолетовій області спектру смуги поглинання при ;ц=237нм та Х2=292нм (є 1 = 72500 л х моль"1 х см~1 ; є 2 =29600 лхмоль~ 1 хсм~ 1 , відповідно), що обумовлює ефективне поглинання енергії збудження. Ця енергія передається з триплетного рівня ліганду (Е= 21000 см"1) на енергетичний рівень ТЬ3+(Е=20500см"1), що призводить до значного зростання Ілюм тербію. Це надає можливість досягнути зниження межі виявлення ДНК у ЗО разів на відміну від прототипу. Взаємодія ДНК з люмінесцентним зондом - комплексом Tb-R відбувається при рН 4,0-11,0, максимум люмінесценції спостерігається при рН 8,5-9,5 (Фіг.1). У запропонованому способі для утворення оптимального рН розчину використовується Трис-буфер (рН=9,0). Максимальне збільшення сигналу спостерігається при співвідношенні Tb:R = 1:1, оптимальна концентрація ТЬ +=5х10"7 моль/л (Фіг.2). І л ю м тербію в комплексі Tb-R-ДНК максимальна при опромінюванні утвореного комплексу УФ-світлом с Х,3буДЖ = 340 нм . Інтенсивність люмінесценції тербію в системі Tb-RДНК прямо пропорційна в інтервалі концентрацій ДНК 0,01-1,20 мкг/мл (Фіг.З). Суттєво, що в інтервалі концентрацій ДНК (Сднк) 0-01-0,1 мкг/мл залежність інтенсивності тербію від Сднк має більший кутовий коефіцієнт нахилу (АІ = 3,49 + 2 7 3 , 5 х С д н к ; R=0,992), ніж в інтервалі концентрацій ДНК (ДІ = 16,56 +87,43 х С д н к ; 0,1-1,2 R=0,997). мкг/мл Тому для практичного використання краще застосовувати більш чутливий інтервал залежності аналітичного сигналу від концентрації ДНК. 4952 Приклад Визначення ДНК проводили на модельних розчинах шляхом введення відомої кількості ДНК. Для цього у 5 пробірок вміщували по 0,02 мл (0,1 мл, 0,5мл, 1,0 мл) стандартного розчину ДНК (10 мкг/мл), у кожну пробірку додавали по 0,5 мл стандартного розчину хлориду тербію з концентраці5 єю 1x10" моль/л, по 0,5мл стандартного розчину ліганду - гідрохлориду амінобутиламіду-1,8діметилен-2-оксо-4-гідроксихінолін-3-карбонової 5 кислоти з концентрацією 1х10" моль/л, по 1,0 мл Трис-буферу (рН 9,0) і доводили об'єм до 10 мл водою. Паралельно готували розчин холостої проби, яка містить усі компоненти, крім ДНК. Проби перемішували, вимірювали інтенсивність люмінесценції при ^ е м І С = 545 нм. Межа виявлення ДНК, яка визначена намодельних розчинах з використанням стандартних розчинів ДНК, складає 0,003мкт/мл. Кількісне визначення ДНК проводили по калібрувальному графіку, який будують таким чином: у пробірки вносять відому концентрацію ДНК (3 паралельних виміри) від 0,01 мкг/мл до 1,20 мкг/мл у пробі, додають усі реагенти, як зазначено вище. Вимірюють інтенсивність люмінесценції при Хешс = 545 нм, у кожній точці віднімають ІЛЮм холостої проби (АІ). За отриманими результатами будують калібрувальний графік залежності ІЛюм від концентрації ДНК в модельних пробах. Точність і достовірність визначення ДНК у розчинах перевірені методом "введено - знайдено". При п=5; Р=0,95 величина відносного стандартного відхилення 0,026-0,065. Таким чином, спосіб дозволяє підвищити чутливість визначення ДНК в ЗО разів у порівнянні з прототипом. Таблиця Результати визначення ДНК методом "введено - знайдено" (п=5; Р=0,95) Введено, мкг/мл 0,02 0,1 0,50 1,00 Знайдено, мкг/мл 0,022 0,097 0,475 0,988 Sr 0,065 0,058 0,041 0,026 100 80 40 20 05 10 в 11 12 ФІГ. 1 Залежність інтенсивності люмінесценції (відн,од.) системи Tb-R-ДНК від рН розчину (С ть3+==5хШ"7 моль/л; CR =5x10" 7 МОЛЬ/Л, СДНК=0,5 МКГ/МЛ). 4952 105 -, 10095 ^4O P S so "ffl 80 Q 3 8 5 H 75 ~ 706560 -6,5 -7,0 -6,0 -5,5 .5,0 TbJ Фіг. 2 Залежність інтенсивності люмінесценції (відн.од.) системи Tb-R-ДНК від концентрації тербію ( CR =5ЧІО" 7 МОЛЬ/Л» СДНКН?^ МКГ/М, рН=*9,0, нм, Х^даг1340 нм). 140-і Lmcar Regression for Datal_B 1201008060402000,0 0,2 0,6 0,4 0,6 1,0 1,2 Фіг.З Калібрувальний графік для визначення ДНК (С іь^=5хІ0' 7 моль/л, CR~5xlQ-7 моль/л,, pH-9,0, Комп'ютерна верстка А Крулевский Підписне им). Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ-42, 01601