Спосіб одержання фертильних амфідиплоїдних міжвидових гібридів гречки

Спосіб одержання фертильних амфідиплоідних міжвидових гібридів гречки, що включає виділення незрілих гібридних зародків із простерилізованого плоду, перенесення їх на тверде живильне середовище з основою по Мурасіге-Скуга (МС) та культивування калусних клітин, одержаних із гібридних зародків в контрольованих умовах, який відрізняється тим, що використовують модифіковане живильне середовище МС, яке додатково містить фітогормони, мг/л бензиламшопурин (БАЛ) в концентрації від 0,2 до 0,6 мг/л, індолілмасляну кислоту (ІМК) - від 1 до 3 мг/л та нафтилоцтову кислоту (НОК) - від 2 до 4 мг/л, культивування морфогенного калусу проводять протягом 12-16 діб О Винахід відноситься до сільського господарства, а саме до способів одержання міжвидових фертильних рослин стійких проти стресових чинників середовища, здатних до самозапилення, стійких проти хвороб і ШКІДНИКІВ, та біотехнологм - культивуванню тканин рослин in vitro - регенерації рослин із калусних тканин гібридних зародків шляхом папнового морфогенезу, що дозволяє одержувати амфідиплоідні генотипи внаслідок спонтанної поліплоїдії в культурі in vitro, і може бути використаний в селекції, біотехнологм, насінництві, фізіологи, генетиці 1 КЛІТИННІЙ біологи рослин Відома обмежена КІЛЬКІСТЬ методів одержання міжвидових гібридів гречки Ряд проведених робіт по штучному схрещуванню різних видів не дали очікуванних результатів оскільки існують бар'єри міжвидової несумісності гибель незрілих зародків та стерильність гібридів першого покоління (Morns М R Cytogenetic studies on buckwheat // J Heredity - 1952 -N42 - P 85-89 , Гришина ЕЕ Несовместимость при межвидовых скрещиваниях у гречихи // Генетика, селекция, семеноводство и возделывание гречихи М - 1976 - С 37-42 , Ruszkowski M The possibility of changing the yield ing of buckwheat by breeding the homostyle varieties //Symp on Buckwheat, Ljubljana, Yugoslavia -1980 - P 78-85, Adachi T Is it possible overcome the low yieldi of buckwheat by means of biotechnology Some trials in plant genetic manipulation // 2 rd, International Symp on Buckwheat,Pulawy, Poland 712 July, 1986 - P 99-108, Samimy С Barrier to interspecific crossing of Fagopyrum esculentum with F tatancum I Site of poll en-tube arrest II Organogenesis from immature embryos of F tatancwn // Euphytica 54 1991 -P 215-219 Застосування методу культури тканин in vitro дозволяє в значній мірі ці вади подолати , забезпечуючи гібридні зародки необхідними елементами харчування після виділення та культивування їх на живильному середовищі в умовах in vitro Після використання методу дорощування зародків в асептичних умовах, були виділені Румянцевою (Румянцева Н И , Сергеева Н В , КиямоваР Г, Сметанина И А Перекресная совместимость различных видов гречихи и возможность доращивания гибридных зародышей in vitro// Тез докл конф мол ученых " Изучение, охрана и рациональное использование природных О о> (О ю 51690 ного плоду, перенесення їх на тверде живильне середовище з основою по Мурасіге-Скуга (МС) та культивування калусних клітин, одержаних із гібридних зародків в контрольованих умовах, який відрізняється тим, що використовують модифіковане живильне середовище МС , яке додатково містить фітогормони, мг/л бензіламшопурш (БАП) в концентрації 0,2 до 0,6мг/л, індолілмасляну кислоту (ІМК) - від 1 до Змг/л та нафтилоцтову кислоту (НОК) - від 2 до 4мг/л, культивування морфогенного калусу проводять на протязі 12-16 діб Дія умов культивування, складу поживного середовища (в основному ЦИТОКІНІНИ та ауксини), часу вирощування калусної культури в асептичних умовах спричинила появу клітин з тетраплоідним набором хромосом У зв'язку із здатністю рослинАмериканські вчені отримали МІЖВИДОВІ гібриних клітин до тотіпотентності з таких клітин регеди (22%) між F esculentum і F tatancum після кульнерують рослини, які є тетраплоідними Одержантивування в асептичних умовах гібридного насіння таких рослин дає змогу подолати суттєвий нєвого зачатку з якого одержували ембрюїди, які бар'єр міжвидової несумісності у гречки - стерильдорощували до інтактних рослин Гібриди були ність гібридів першого покоління Рослини є ферамфігаплоідними (Samimy С, Bjorkman T, тильними Sintunga D , Blanchard L Overcoming the barrier to interspecific hybndiation of Fagopyrum esculentum Аутентичність гібридів доводять методом ізоwith F tatancum // Euphytica 91 - 1996 - P 323ферментного аналізу, а тетраплоідний набір хро330) мосом у амфідиплоідних рослин підтверджують цитогенетичним методом, після підрахунку числа Основним недоліком цих методів є низький хромосом у МІТОЗІ процент виходу гібридних рослин, які у більшості випадків стерильні Опис засобу Єдиним успіхом у подоланні стерильності у Приклад 1 Рослини районованого сорту Айстміжвидових гібридів гречки є робота Кротова і ра запилюють пилком дикого виду татарської гречДраненка (Кротов А С , Драненко ЕТ Амфидипки підвиду к-17 На 12-14 день після запилення лоид гречихи // Бюллетень ВИР -1973 -Вып ЗО плоди зривають і стерилізують - 1 хвилину в 96% С 41-44), які отримали гібрид F giganteum етиловому спирті і 12 хвилин в 10%-ному хлораміамфідиплоїд, після схрещування двох диких видів ні Після трьохразового промивання їх дистильогречки F cymosum (2x=32) і F tatancum (2x-32) Рованою водою виділяють із плодів незрілі зародки, слини татарської гречки, після застосування колхіякі переносять на живильне середовище з осноцину, вони перевели з дип-лоідних (2х=1б) у тетвою по МС та домішками 0,Змг/л БАП, 1,5мг/л ІМК раплоідні (2х=32) та провели штучне запилення з та 2,5мг/л НОК по 20шт на чашку Петрі У гібридF cymosum (2x=32) і одержали фертильний гібрид них зародків спостерігають на протязі 16 днів активне наростання морфоген-ного калусу, процес Відомий спосіб подолання стерильності у міжрегенерації рослин із якого відбувається шляхом видових гібридів після отримання амфідиплоідних органогенезу з утворенням бруньок а потім панорослин-шляхом культивування гібридних стерилінів з 2-3 листочками, які переносять на середовизованих незрілих зародків в умовах in vitro та реще МС без домішок фітогормонів генерація із них рослин Він розроблений для міжвидових гібридів конюшини (Фирсова Э К, Приклад 2 Рослини районованого сорту АйстМезенцев А В , Рубцов М й Межвидовая гибридира запилюють пилком дикого виду татарської гречзация клевера с использованием культуры зароки підвиду к-21 Умови проведення досліду аналодышей // Селекция и семеноводство - 1980 - N1 гічні тим, що описані в прикладі 1 Відзначають С 272-277), пшениці з житом ( Банникова В П , 31,32% утворення амфідиплоїд них рослинМайстров П Д , Барабанова Е А , Кравец Е А , Корегенерантів гречки після культивування морфолючая ГС Повышение эффективности отдаленгенного калусу на протязі 14 днів на середовищі з ной гибридизации у злаков методом эмбриокульосновою по МС та домішками 0,2мг/л БАП, 2,5мг/л туры // Цитол и Генет-1990 т 24, М5-С 25-28) і ІМК та 3,5мг/л НОК (Таблиця 4) вибраний нами як прототип Згідно даному спосоПриклад 3 Рослини форми Гомостилійна забу застосовують асептичну культуру для виділенпилюють пилком дикого виду к-17 Умови провеня стерильних гібридних незрілих зародків та дення досліду аналогічні тим, що описані в прикультивування із них на твердому середовищі Мукладі 1 Спостерігають утворення 58,13% расіге-Скуга морфогеного калусу, з якого регенеамфідиплоідних рослин-регенерантів гречки - пісрують амфідиплоідні рослини ля культивування морфогенного калусу на протязі 14 днів на середовищі з основою по МС та домішЗадачею винаходу являється одержання ферками 0,Змг/л БАП, 1,5мг/л ІМКта2,5мг/л НОК тильних міжвидових гібридів між культурною та диким видом татарської гречки, після застосування Приклад 4 Рослини форми Донор Білоруський методу культивування калусних тканин, отриманих запилюють пилком дикого виду к-17 Умови провеіз гібридних зародків дення досліду аналогічні тим, що описані в прикладі 1 Відзначають вихід (21,03%) амфідиплоідЗадача досягається тим, що включає виділенних рослин-регенерантів гречки після ня незрілих гібридних зародків із простерилізоваресурсов" -Уфа -1987 - 105с) 6-10-денні гібридні зародки гречки різних комбінацій схрещувань, але на штучних живильних середовищах вони не проростали напевно тому, що не було підібрано оптимального для них складу поживного середовища, 3 допомогою даного методу, після вдосконалення умов культивування та складу поживного середовища, були одержані МІЖВИДОВІ гібриди (3%) між диким видом татарської та культурною гречкою, але вони виявились незбалансованими аллотетраплоідами (Тараненко Л К, Шаповал А Й , Левенко Б А , Булах А А Некоторые аспекты межвидовой гибридизации гречки // Генет , селек , семеноводство и возделывание крупяных культур Кишенев, 1987-С 53-61) 51690 культивування морфогенного калусу на протязі 16 днів на середовищі з основою по МС та домішками 0,5мг/л БАП, 1,5мг/л ІМКта 3,5мг/л НОК Отже, розроблений склад живильного середовища при культивуванні гібридних зародків на якому, одержано високі проценти утворення морфогенного калусу (Таблиця 1) та регенерації Із нього рослин для всіх дослідних комбінацій схре 6 щувань (Таблиця 2), експериментальне визначено вік гібридних зародків для максимального одержання із них морфогенного калусу (Таблиця 3), встановлений оптимальний час культивування морфогенного калусу, необхідний для одержання амфідиплоідних гібридних рослин-регенерантів гречки (Таблиця 4) Таблиця 1 Ефективність утворення морфогенного калусу із гібридних зародків гречки на живильному середовищі з основою по МС та домішками фітогормонів № п/п Концентрації фітогормонів (мг/л) КІЛЬКІСТЬ виса джених in vitro зародків з морфогенним калусом Ефективність морфогенезу % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0,1 БАП+ 0,5 ІМК+ 1,5 НОК 0,2 БАП + 1,0 ІМК+2.0НОК 0,3 БАП + 1,5 ІМК+2.5НОК 0,4 БАП+ 2,0 ІМК+З.ОНОК 0,5 БАП+ 2,5 ІМК+3.5НОК 0,6 БАП+ 3,0 ІМК+4.0НОК 0,7 БАП+ 3,5 ІМК+4.5НОК 0,8 БАП+ 4,0 ІМК+5.0НОК 0,9 БАП+ 4,5 ІМК+5.5НОК Контроль (МС без гормонів) 150 150 150 148 149 148 150 150 150 150 11 32 93 34 26 17 14 8 6 7,33 21,33 62,83 22,66 17,33 11,48 9,33 5,36 4,00 Таблиця 2 Регенерація рослин із морфогенного калусу, отриманого з гібридних зародків гречки № п/п Комбінації схрещ 1 2 3 4 5 КІЛЬКІСТЬ зародків з морвисаджених фо ген кал усом Айст х к-17 Айст х к-21 Ге хк-17 Д Б хк-17 Зел х к-17 50 50 50 50 50 % регенернерацм (Х±т) КІЛЬКІСТЬ рос лин регенерантів 76,0±0,75 42,0±1,41 88,0±1,87 38,0±0,43 68,0±0,69 38 21 44 19 34 Примітки Айст - сорт Айстра, Г с - Гомостилійна, Д Б -Донор Білоруський, Зел - Зеленоквіткова форма, підвиди татарської гречки к -17 (v rotundatum), к-21 (v tuberculatum) 48 26 94 21 41 Коефіцієнт регенерації 126,30 123,80 213,63 110,52 120,58 Коефіцієнт регенерації визначали, як відношення КІЛЬКОСТІ отриманих рослин-регенерантів, до КІЛЬКОСТІ зародків, які дали морфогенний калус Таблиця З Залежність утворення морфогенного калусу від віку зародків № п/п 1 2 3 4 5 6 7 Вік зародків (ДНІ) КІЛЬКІСТЬ Висаджених зародків 6 8 10 12 14 16 18 - 8 - 10 - 12 - 14 - 16 - 18 - 20 Із них з морфогенним калусом 150 147 146 150 149 150 150 14 26 44 126 68 34 11 Ефективність морфогенезу (X ± т) 9,33+0,64 17,68+0,88 30,13+1,84 84,00+1,36 44,96+1,73 22,66+0,83 7,33+0,51 51690 Таблиця 4 Залежність утворення амфідиплоідних рослин-регенерантів міжвидових комс надій схрещувань гречки від часу культивування морфогенного калусу № Дні культивування п/п морфогенного калусу 1 10 2 12 3 14 4 16 5 18 6 20 Вихід амфідиплоідних рослин - регенерантів (%) Комбінації міжвидових схрещувань Айстх к-17 Айстх к-21 Г с х к-17 ДБхк-17 2,11 3,14 14,24 9,51 28,50 14,11 42,28 31,32 58,13 36,31 38,43 24,01 46,00 21,03 4,22 9,39 1,45 Зелх к-17 19,71 48,14 32,15 7,12 Примітки Айст - сорт Айстра, Г С - Гомостилійна, Д Б -Донор Білоруський, Зел - Зеленоквіткова форма, підвиди татарської гречки к-17 (tundaturn), к-21 (vtuberculatum) ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71